Metabolsk Glycoengineering Sialic syre med N-acyl-endret Mannosamines

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Sialic syre er en typisk enkle sukkerarter-enhet i glycoconjugates. Det er involvert i en overflod av mobilnettet og molekylære interaksjoner. Her presenterer vi en metode for å endre celle overflaten sialic acid uttrykket i metabolske glycoengineering med N- acetylmannosamine derivater.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wratil, P. R., Horstkorte, R. Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines. J. Vis. Exp. (129), e55746, doi:10.3791/55746 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Sialic acid (Sia) er en svært viktig bestanddel av glycoconjugates, som N- og O- glykaner eller glycolipids. På grunn av sin beliggenhet ved jernbanestasjonen termini ikke-reduserende av oligo - polysakkarider, samt sin unike kjemiske egenskaper, er sialic acid involvert i en rekke forskjellige reseptor-ligand interaksjoner. Ved å endre uttrykk for sialic syre på cellens overflate, vil sialic acid-avhengige interaksjoner derfor bli påvirket. Dette kan være nyttig å undersøke sialic acid-avhengige interaksjoner kan påvirke visse sykdommer på en gunstig måte. Via metabolske glycoengineering (MGE), kan være modulert uttrykk for sialic syre på cellens overflate. Her, behandlet celler, vev eller hele dyr med C2-endret derivater av N- acetylmannosamine (ManNAc). Disse amino sukker som sialic acid forløper molekyler og derfor metaboliseres til tilsvarende sialic acid arter og uttrykt på glycoconjugates. Bruk denne metoden gir spennende effekter på ulike biologiske prosesser. For eksempel det kan drastisk redusere uttrykk for polysialic syre (polySia) i behandlet neuronal celler og dermed påvirker dannes hemmer nevronal vekst og differensiering. Her viser vi syntese av to av de vanligste C2-endret N- acylmannosamine derivater, N- propionylmannosamine (ManNProp) og N- butanoylmannosamine (ManNBut), og ytterligere vise hvordan disse ikke-naturlige amino sukker kan brukes i cellekulturer eksperimenter. Uttrykk for endret sialic acid arter er kvantifisert ved Væskekromatografi (HPLC) og ytterligere analysert via massespektrometri. Effekten på polysialic syre uttrykk er belyst via Western blot bruke et kommersielt tilgjengelig polysialic syre antistoff.

Introduction

Sialic syre er en enkle sukkerarter som vanligvis finnes på de ikke-reduserende termini av glycoconjugates, som N- og O- glykaner eller glycolipids. Blant alle monosaccharides har sialic acid noen unike kjemiske egenskaper. Den har en 9 C-atom ryggrad, en karbonoxylsyre gruppe i C-1 posisjon, som er deprotonated og dermed negativt ladde under fysiologiske forhold, og en aminosyre funksjon i C-5 posisjon. Selv om over 50 naturlig forekommende varianter av sialic acid har vært preget til dato1er den dominerende formen av sialic syre funnet i mennesker N- acetylneuraminic syre (Neu5Ac). Andre pattedyr uttrykker også høyere mengder N- glycolylneuraminic acid (Neu5Gc)2,3.

På grunn av sin utsatte beliggenhet i glycoconjugates, er sialic acid involvert i en overflod av reseptor-ligand interaksjoner, f.eks hemagglutinin avhengige binding av influensavirus til verten cellene4. En sialic acid epitope med viktige biologiske funksjoner, spesielt i embryogenesis og i nervesystemet, er polysialic syre. Polysialic syre er en polymer av opptil 200 alpha 2,8 knyttet sialic syrer. Den store protein polysialic syre er nevrale celle vedheft molekyl (NCAM). Polysialic syre uttrykk modulerer selvklebende tilhører NCAM polysialic syre uttrykk reduserer vedheft og øker plastisitet med nervesystemet5.

Endringer i uttrykket (poly) sialic syre, til slutt påvirker en rekke ulike biologiske interaksjoner. Dette kan brukes til å studere kjent sialic acid avhengige prosesser på molekylært nivå, avdekke romanen glycoconjugate vekselsvirkningene, eller utforske mulige terapeutiske metoder. Det finnes ulike metoder tilgjengelig som kan være modulert uttrykk for sialic syre på cellens overflate, for eksempel behandling med sialic acid bestemte glycosidases (sialidases), hemming av enzymer som er involvert i sialic acid biosyntesen6 ,7,8, eller banket ned eller endre uttrykk for viktige enzymet sialic acid biosyntesen9.

En annen allsidig metode å modulere sialic acid uttrykk er MGE (også kjent som metabolske oligosaccharide engineering, MOE). Her, behandlet celler, vev eller selv dyr med ikke-naturlige derivater av ManNAc som bærer C2-amino modifikasjoner. Å være forløperen molekyler for sialic syre, etter mobilnettet opptak, disse ManNAc analogs er enveis metabolisert til ikke-naturlige sialic syrer og kan uttrykkes ved sialylated glycoconjugates. Cellene behandlet med ManNAc derivater bærer alifatisk C2-modifikasjoner, som ManNProp eller ManNBut, innlemme N- propionylneuraminic syre (Neu5Prop) eller N- butanoylneuraminic syre (Neu5But) i sine glycoconjugates10 , 11. ved funksjonelle grupper introdusert til C2-stillingen ManNAc forekommer ikke-naturlige sialic syrer kan kombineres, f.eks via Staudinger hemorroider eller azide alkine cycloaddition, med fluorescerende fargestoffer og derfor visualisert på celle overflaten12.

Uttrykket av disse ikke-naturlige sialic syrer har spennende effekter på mange biologiske prosesser, herunder patogen infeksjoner, vedheft og migrering av kreftceller, generelle celle vedheft, samt endometrial blodkar og differensiering (til gjennomgang se: Wratil et al. 13). interessant MGE med N-acyl endret mannosamines kan også brukes til å påvirke uttrykket av polysialic syre. Polysialic syre genereres av to ulike polysialyltransferases (ST8SiaII og ST8SiaIV). Det har blitt demonstrert, den polysialyltransferase ST8SiaII er hemmet av unaturlig sialic acid forløpere, som ManNProp eller ManNBut14,15. Dessuten, har det blitt demonstrert i menneskelig neuroblastom celler som ManNProp eller ManNBut også reduserer sialylation i totalt15.

MGE med N-acyl endret mannosamines er en enkel å bruke metoden som har blitt brukt, ikke bare i pattedyr og bakterier cellekultur men også i hele dyr av ulike arter, som Caenorhabditis elegans16, sebrafisk17eller mus18,19,20,21. Spesielt ManNAc derivater bærer alifatisk endringer, inkludert ManNProp og ManNBut, er negligibly cytotoksiske, selv på millimolar konsentrasjoner i celle kultur medium eller blodplasma. Videre, de er relativt lett å syntetisere.

Her gir vi detaljer om hvordan du bruker MGE med N-acetylen endret mannosamines. Først er syntese av to av de mest brukte ManNAc derivater i dette feltet, ManNProp og ManNBut, forklart. Deretter viser vi hvordan MGE kan bli brukt i et eksperiment i vivo . Som et eksempel, neuroblastom celle linjen Kelly ble valgt til å demonstrere redusert uttrykk for polysialic epitope Western blot etter behandling med ManNAc derivater. Ikke-naturlige sialic syrer på cellens overflate ble kvantifisert ved HPLC og ytterligere analysert via massespektrometri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse av buffere og reagenser

  1. Utarbeidelse av 3 mM natrium methoxide løsning
    1. Løses 8.1 mg natrium methoxide i 50 mL metanol (3 mM) i en 100 mL glassflaske med rør bar. Lagre ved romtemperatur (RT) i flere uker.
  2. Utarbeidelse av Tris-HCl buffer
    1. Kombiner 8.766 g NaCl 157 mg Tris-HCl og 146 mg EDTA i en 100 mL glassflaske med rør bar og oppløse i 80 mL vann.
    2. Legge natriumhydroksid (1 M, i vann) eller HCl (20%, i vann) til gripende løsningen, mens observere pH med en pH-meter, og justere pH til 8.0.
    3. Legg volumet av vann som trengs for å oppnå en siste volum 100 mL. Filtrere løsningen ved å benytte en 0.22 µm sterilt filtersystem.
      Merk: 100 mL Tris-HCl buffer inneholder 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl og 5 mM EDTA (pH 8.0). Løsningen kan lagres på 4 ° C i flere uker.
  3. Utarbeidelse av aprotinin løsning
    1. Oppløse 10 mg aprotinin i 1 mL vann (1,54 mM). Aliquot den aprotinin løsningen i 10 x 1,5 mL-plast rør (100 µL hver). Lagre på 20 ° C i flere uker.
  4. Utarbeidelse av leupeptin løsning
    1. Oppløse 10 mg leupeptin i 2 mL vann (10 mM). Aliquot den leupeptin løsningen 10 x 1,5 mL-plast rør. Lagre på 20 ° C i flere uker.
  5. Utarbeidelse av phenylmethylsulfonyl fluor (PMSF) løsning
    1. Oppløse 34.8 mg PMSF i 2 mL etanol (100 mM). Aliquot den PMSF løsningen i 10 x 1,5 mL-plast rør. Lagre på 20 ° C i flere uker.
  6. Utarbeidelse av 1,2-diamino-4,5-methyldioxybenzol-dihydrochloride (DMB) løsning
    1. Kombiner 15.62 mg DMB 352 µL β-mercaptoethanol og 48 µL natrium bisulfite-løsning (39%), og legge til 9,6 mL vann (6,9 mM DMB, 500 mM β-mercaptoethanol og 0,19% natrium bisulfite). Aliquot DMB løsningen i 40 x 1,5 mL-plast rør (250 µL hver). Lagre beskyttet mot lyset på 20 ° C i flere uker.
  7. Utarbeidelse av 1 M trifluoroacetic syre (TFA) løsning
    1. Legge til 770.3 µL av 100% TFA til 9.23 mL vann i et 15 mL plastrør (1 M). Lagre på 4 ° C i flere uker.
  8. Utarbeidelse av 120 mM TFA løsning
    1. Legge til 92.4 µL TFA (100%) 9.91 mL vann (120 mM) i en 15 mL plastrør. Lagre på 4 ° C i flere uker.
  9. Utarbeidelse av 400 mM natriumhydroksid (NaOH) løsning
    1. Oppløse 160 mg NaOH i 10 mL vann (400 mM) i en 15 mL plastrør. Lagre på 4 ° C i flere uker.
  10. Utarbeidelse av Western blot lyseringsbuffer
    1. Oppløse 5.84 g NaCl, 0.1 g Tris (hydroxymethyl)-aminomethan (Tris), 0.1 g CaCl2, 0,95 g MgCl2og 1 g Triton-X100 i 100 mL vann og justere pH til 7,8. Butikken på 4 ° C. Legg 100 µL av hver protease hemmer (aprotinin, leupeptin og PMSF) før du bruker lyseringsbuffer.
  11. Utarbeidelse av natrium dodecyl sulfate polyakrylamid gel geleelektroforese (SDS-side) buffer
    1. Oppløse 0,3 g Tris, 1,5 g glysin og 0,1 g SDS i 100 mL vann og justere pH til 7.3. Butikken på RT.
  12. Utarbeidelse av Western blot buffer
    1. Oppløse 0,3 g Tris, 1.1 g glysin i 90 mL vann og tilsett 10 mL etanol. Butikken på RT.
  13. Utarbeidelse av blokkering løsning
    1. Oppløse 1 g gratis lettmelk strøm i 25 mL fosfat bufret saltvann (PBS). Alltid forberede frisk.

2. syntese av ManNProp og relaterte N-acyl-endret Mannosamines

  1. Oppløse 431.2 mg mannosamine hydroklorid i 10 mL 3 mM natrium methoxide løsning i en 50 mL glassflaske med rør bar.
  2. Avkjøle blandingen på is til 0 ° C. Gripende løsningen, sakte Legg dropwise 210 µL propionyl chloride (2,4 mmol) eller 248 µL butanoyl chloride (2,4 mmol) å syntetisere ManNProp eller ManNBut, henholdsvis. Inkuber gripende blandingen ved 0 ° C 4 h.
  3. Overføre løsningen til et 50 mL plastrør. POKE 4-8 hull inn i lokket på plast røret med en tynn nål. Raskt fryse løsningen med flytende nitrogen og senere lyophilize (fryse tørt) det i 48 timer eller til det har tørket helt.
  4. Bland 350 g silica gel 60 med 750 mL ethyl acetate/metanol/vann (15:2:1) (dette er en suspensjon). Fylle en glass kolonne (35 mm diameter og 70 cm lengde) med silica gel 60 suspensjon og vask forberedt kolonnen med en ekstra 100 mL ethyl acetate/metanol/vann (15:2:1) før bruk.
  5. Oppløse tørket produktene fra trinn 2.3 (5 g tørket produkt) i 10 mL etyl-acetate/metanol/vann (15:2:1) og laste dem ved hjelp av en pipette på silica gel kolonnen. Samle 4 mL fraksjoner etter 500 mL (for ManNProp). Merk: ManNBut vil elute fra kolonnen ca etter 700 mL.
  6. Overføre eluted fraksjoner i 15 mL plast rør. POKE 3-6 hull inn i lokket på plast røret med en tynn nål. Rask fryse løsningen med flytende nitrogen og senere lyophilize det før det har tørket helt.
    Merk: Lyofilisert produktene kan lagres i flere måneder på RT.
  7. Kontroller renheten av produktene av massespektrometri (se avsnitt 9).
    Merk: Alternativt renhet kan også verifiseres av 1H kjernefysiske magnetisk resonans (NRM).

3. celle kultur

  1. Kultur Kelly neuroblastom celler i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium som inneholder 10% fosterets bovin serum, 100 U penicillin, 100 mg streptomycin, 2 mM L-glutamin inneholder 5 mM ManNAc, 5 mM ManNProp eller 5 mM ManNBut, 37 ° C og 5% CO2.
    Merk: Celler kultivert i medium uten ManNAc eller analog brukes som en kontroll.
  2. Før mannosamines, løsne Kelly neuroblastom cellene av rugende dem i 10 min med trypsin/EDTA (0,25%, 0,02%, PBS) og telle ved hjelp av en Neubauer-kammer eller cellen teller. Ætt cellene på definerte tall basert på størrelsen på platen/parabolen.
    1. For å måle sialic syre monosaccharides, frø 1 x 105 celler i 500 µL medium i en 48-og vev kultur plate. For analyse av polysialic syrer, frø 1 x 106 celler i 3 mL medium på en 6 cm diameter celle kultur parabol. Ruge på 37 ° C og 5% CO2. Erstatt medium hver 24 h.
      Merk: Effekten av MGE øker den totale tiden for behandling. For høy metabolsk effektivitet Unn cellene for 5-7 dager.
  3. Etter behandling, Dekanter medium. Vask plater/retter med PBS. Koble cellene av rugende dem i 10 min med trypsin/EDTA (0,25%, 0,02%, PBS). Nøytralisere trypsin legger til samme volum av celle kultur medium i frittstående cellene. Overføre frittstående cellene til 15 mL plast rør. Sentrifuge prøvene i 3 minutter på 500 x g og kast nedbryting.
    1. Legge til 5 mL PBS og sentrifuger celler (se trinn 3.3). Gjenta vaskemaskin to ganger.
      Merk: Vasket celle pellet uten nedbryting kan lagres på 20 ° C i flere dager. Hvis uttrykket polysialic syre er å bli belyst fortsette til delen 10.

4. celle Lysis for såkalt HPLC-analyse

  1. Utarbeidelse av HPLC lyseringsbuffer
    1. Kombiner 5 mL Tris-HCl buffer, 5 µL aprotinin løsning, 20 µL leupeptin løsning og 50 µL PMSF løsning.
      Merk: 5 mL HPLC lyseringsbuffer inneholder 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 1,54 µM aprotinin, 40 µM Leupeptin, og 1 mM PMSF (pH 8.0). Denne bufferen bør alltid være forberedt frisk før cellen lysis.
  2. Nytt avbryte samlet celle pellets (trinn 3.3) hver 500 µL iskald HPLC-lyseringsbuffer og ultra-sonicate prøvene med en ultra-soniske prosessor nålen tre ganger for en periode på 30 s på middels høyt amplitudes. Cool prøvene på is minst 1 min mellom sykluser.

5. skille brøken membran

  1. Sentrifuge lysed celle prøvene for 2t på 20.000 x g og 4 ° C. Skille nedbryting (ca 480 µL), som representerer cytosolic proteiner, 1,5 mL plast rør. Bestemme protein konsentrasjonen av disse fraksjoner bruker, f.eksBradford eller bicinchoninic syre (BCA) analysen.
    Merk: Protein konsentrasjonen (ca 1 mg/mL) av cytosolic fraksjoner kan senere knyttes til målt mengder respektert sialic acid arter. Pellet representerer membran delen, som brukes i trinnet 6.1.

6. surt hydrolyse

Merk: Oligo- og polysakkarider i cellemembraner er hydrolyzed til monosaccharides. Videre, mulig O-endringer i monosaccharides er hydrolyzed, også. Dette er nødvendig for kvantitative såkalt HPLC-analyse, fordi det overveldende flertallet av sialic syrer i membranen fraksjoner er naturlig innlemmet i glycoconjugates og kan muligens bære O-acetyl eller O- lactolyl modifikasjoner.

  1. Legge til 150 µL 1 M TFA-løsning atskilt membran fraksjoner (pellet fra seksjon 5). Inkuber prøvene 4 h på 80 ° C med skjelvende på 200-600 rpm.
  2. Sentrifuge prøvene i ca 30 min på 20.000 x g og 21 ° C med 0,5 mL filter rør med 3 kDa utelukkelse membraner, til øvre fase volumet er mindre enn 20 µL.
    Merk: Dette trinnet er viktig å disponere høyere molekylær rusk.
  3. Overføre de lave faser som inneholder mindre molekyler, inkludert sialic acid arter, i 2 mL plast rør. POKE 2-4 hull inn i caps plast rør med en tynn nål. Rask fryse prøvene med flytende nitrogen og deretter lyophilize dem over natten.
    Merk: Tørket prøvene kan lagres i flere dager på RT. erstatte en cap uten hull for lengre lagring.

7. fluorescerende merking

  1. Nytt suspendere tørket prøvene i 10 µL 120 mM TFA løsning og legge til 50 µL DMB løsning. Overføre prøver til mørk 1,5 mL rør å beskytte dem mot ultrafiolett lys.
  2. For standarder, oppløse 1 µL Neu5Ac (60 ng/mL, i vann) eller 1 µL Neu5Gc (60 ng/mL, i vann) i 10 µL 120 mM TFA løsning i mørke 1,5 mL rør. Legge til 50 µL DMB løsning.
  3. Inkuber cellemembranen prøvene og standarder for 1,5 t på 56 ° C beskyttet mot lyset. Etter inkubasjon legge 4 µL 400 mM NaOH løsning til hver prøve å stoppe merking reaksjonen.

8. såkalt HPLC-analyse

Merk: Merket prøver analyseres på en såkalt HPLC systemet utstyrt med en C18 RP kolonne (110 Å, 3 µm partikkelstørrelse, 4.6 x 150 mm), en fluorescens detektor og en brøkdel samler. Løsemidler brukes er metanol, acetonitrile og vann. Pass på å degas alle løsemidler før målingene, hvis HPLC systemet mangler en intern degasser.

  1. Temperaturen i kolonnen til 40 ° C og konfigurerer fluorescens detektoren med 373 nm for eksitasjon og 448 nm for utslipp, henholdsvis. Injisere 10 µL eksempel volum og separat sonder i 50 min på 0,5 mL/min infusjonshastigheten med metanol/acetonitrile/vann (6:8:86) som eluent. For massespektrometri analyse, samle toppene av interesse.
    Merk: Neu5Gc er ventet å eluate etter 6-8 min, Neu5Ac etter 9-12 min, Neu5Prop etter 17-23 min og Neu5But etter 38-44 min. Fraksjonert prøvene kan lagres i flere h på 4 ° C beskyttet mot lyset.
  2. Etter måling hver prøve, vask kolonnen for 7,5 min på 1,0 mL/min strømningshastighet (≈ 1,5 kolonnen volumer) med metanol/acetonitrile/vann (6:25:69) og nytt equilibrate systemet for 7,5 min på 1,0 mL/min gjennomstrømningshastighet metanol/acetonitrile/vann (6:8:86).
  3. Kvantitativ analyse, beregne området under kurven av sialic acid toppene rundt bruker operativsystemet programvare av de respektive HPLC-system22.
    Merk: Innhentet data kan knyttes til Neu5Ac eller Neu5Gc standard og de målte protein konsentrasjonene i cytosolic fraksjoner (se pkt. 5.1).

9. massespektrometri analyse av Sialic Acid Monosaccharides

Merk: HPLC oppbevaring topper rundt kan videre analyseres av flytende kromatografi (Langbane) electrospray-ionisering massespektrometri (ESI-MS), for å verifisere unaturlig sialic acid arter.

  1. For massespektrometri analyse, injisere 20 µL av samlet prøve i et LC/masse selektiv detektor (MSD) system med 79.9% metanol, 20% isopropylalkohol og 0,1% maursyre som eluent, 0,5 mL/min strømningshastighet, 4 kV kapillær spenning og 350 ° C kapillær temperatur 22 , 23.
  2. Prøveversjonen av programvaren av respektive LC/MSD systemet, Velg toppen av interesse i den totale ion chromatogram. Vis mass spekteret av løst toppen. Vis positive masse/lade forholdet mellom 300 og 700.
    Merk: DMB merking av sialic syrer fører til en økning i molekylær masse 116.2 g/mol. DMB-merket sialic acid arter har følgende molekylær massene: DMB-Neu5Ac = 424.2 g/mol, DMB-Neu5Gc = 441.8 g/mol, DMB-Neu5Prop = 436.2 g/mol, DMB-Neu5But = 453.2 g/mol. felles addukter er acetonitrile, natrium eller isopropyl alkohol.

10. Western Blot analyse av Polysialic syre i Kelly neuroblastom celler

  1. Utarbeidelse av cellen lysates
    1. Legge til 1 mL Western blot lyseringsbuffer celle pellets fra trinn 3.3 og vortex. Inkuber i 30 min på is. Vortex hver 5 min. Sentrifuge prøvene for 1,5 t på 20.000 x g og 4 ° C. Samle nedbryting inneholder proteiner fra lysed cellene.
    2. Bestemme protein konsentrasjonen av protein fraksjoner, f.eks, Bradford eller BCA analysen. Fortynne prøvene å en protein konsentrasjon på 1,5 µg/µL i lyseringsbuffer.
    3. Forberede prøvene SDS-siden ved å legge 10 µL Laemmli eksempel buffer til 90 µL protein fraksjon (1,5 µg/µL) og kok utvalget for 5 min24.
  2. Immunoblotting
    1. Bruk 8% SDS-akrylamid gels med 20-30 µL lommer og 0,75 eller 1 mm tykkelse. Kjøre gel på 25 mA for 2t på RT.
    2. Fjern forsiktig glass dekselet fra gel. Klippe ut og kast den øvre delen av gel inneholder lasting lommer. Plass gel på en nitrocellulose membran (0,2 µm), tidligere fuktet i Western blot buffer. Overføre proteiner til nitrocellulose etter anbefaling av systemet (f.eks 250 mA 1t på 4 ° C).
    3. Fjerne nitrocellulose membranen fra blotting systemet. Stain blot med Ponceau rød å visualisere proteiner. Overføre nitrocellulose membranen i en plast kammer og legge 10 mL blokkerer løsning. Inkuber 1t på RT eller over natten på 4 ° C.
    4. Dekanter blokkerer løsningen og legge monoklonale anti-polySia 735 antistoff (1 µg/mL) i PBS. Inkuber membranen 1t på RT eller over natten på 4 ° C. Inkubasjon vaskes membranen minst tre ganger i 5 min med PBS.
    5. Legg polyklonale anti-musen IgG sekundære antistoff (1 µg/mL) kombinert pepperrotperoksidase (HRP) eller en fluorescerende etikett i PBS. Inkuber membranen 1t på RT. Inkubasjon vaskes membranen minst tre ganger i 5 min med PBS.
    6. Overføre membranen på en tallerken med en passende imager. Gjenkjenne i henhold til produsentens instruksjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

HPLC chromatograms av fluorescerende merket Neu5Ac og Neu5Gc-standardene er avbildet i figur 2. Med metoden her beskrevet elutes DMB-merket Neu5Gc vanligvis mellom 7-9 min elueringsrør tid, og DMB-Neu5Ac mellom 10-12 minutter. Flere mindre toppene i chromatogram vises vanligvis mellom 2-6 min. Disse toppene representerer Ureagert DMB og reaksjon mellomprodukter25.

Figur 3 viser representant chromatograms av celle lysates. Sammenlignet med chromatograms av DMB-merket (figur 2), disse chromatograms mange udefinert topper, vises. Dette er mest sannsynlig på grunn av den interne urenhet cellen lysates og det faktum at DMB ikke bare reagerer med sialic acid arter, men også med andre α-keto syrer stede i celle lysates, inkludert pyruvate og succinate α-ketoglutarate26. Tilstedeværelsen av små mengder sialic syrer bærer O-acetyl endringene ikke har blitt kløyvde av eddiksyre hydrolyse kan også bli diskutert som årsak til disse udefinert topper23. Chromatograms fra lysed ubehandlet celler er sammenlignet med chromatograms fra celler som tidligere har blitt behandlet med ManNAc eller dens analogs. Som vist her, fører behandling med ManNAc ofte til en nesten hele uttømming av Neu5Gc på cellens overflate. Chromatograms av lysed-cellene behandles med Neu5Prop eller Neu5But, topper, vises som ikke vises i chromatograms av ubehandlet celler. Disse toppene (ManNProp behandlet celler på omtrent 19 min elueringsrør tid og ManNBut behandlet celler 42 minutter) angir utseendet på tilsvarende ikke-naturlige sialic syrer, Neu5Prop og Neu5Gc. Som beskrevet i delen 8.3 protokollen, kan HPLC-chromatograms bli analysert for å kvantifisere beløpene for ulike sialic acid arter i celle lysates.

Det faktum at forskjellige HPLC oppbevaring topper tilsvarer enkelte sialic acid arter ble bekreftet via massespektrometri. Representant ESI-MS data fra samlet HPLC topper rundt er avbildet i Figur 4: spekteret av samlet DMB-Neu5Ac oppbevaring toppen i øvre venstre panel, DMB-Neu5Gc i øvre høyre felt, og de to ikke-naturlige sialic acid artene, DMB-Neu5Prop og DMB-Neu5But i nedre venstre og høyre panelene. Reaksjon med DMB fører til en økning i molekylær masse 116.2 Da, sammenlignet med de sialic acid artene som ikke merkes med dette fargestoffet. De masse spectra, ved positive masse/lade forholdet injisert prøvene mellom 300 og 700, flere topper vises. Dette skyldes adduct dannelsen av respekterte DMB-merket sonden. Foruten protonerte ion [M + H]+, natrium addukter [M + Na]+ og [M + 2Na-H]+ vises. Som acetonitrile (ACN) finnes under LC analysen, det kan finnes som en adduct i de masse spectra (vises for DMB-Neu5Gc, Figur 4: øvre høyre panel). På grunn av fragmentering skyldes collisional decompensation aktiveringer generert i regionen electronspray transport mellom av kapillær og første skimmer, dehydrert sialic acid arter [M + H]+-H2O kan også observeres (vises for DMB-Neu5Ac, Figur 4: øvre venstre panel)23,27. I LC stilling elutes DMB-Neu5Gc kort tid etter Ureagert eller delvis reagert DMB-arter. Derfor kan samlet DMB-Neu5Gc proben inneholde urenheter forårsaket av disse reaksjon intermediater. Dette fungerer som en forklaring på utseendet av udefinert topper i mass spekteret av DMB-Neu5Gc (Figur 4: øvre høyre panel).

Behandling av Kelly neuroblastom celler med ManNProp eller ManNBut fører til redusert uttrykk for polysialic syre på NCAM, som vist ved Western blot analyse av cellemembranen fra lysed celler (figur 5). Polysialic syre fremstår som en smear til sin heterogenitet og ansvar for (≈ 200 kDa). Behandling med ManNAc analogs fører til reduksjon av polysialic syre på celler overflaten: jo lenger alifatisk N-acyl side kjede, jo sterkere reduksjon28.

Figure 1
Figur 1: Generelle prinsippet om MGE med N-acyl endret mannosamines. Etter behandling med N-acyl endret mannosamines, disse ManNAc analogs én retning metabolisert (intracellulær metabolisme) til tilsvarende ikke-naturlige sialic syrer. Disse er transportert til Golgi, overføres til de respektive oligosaccharide acceptor ved sialyltransferases, og uttrykkes på cellens overflate sialosides (her, en glykoprotein). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Representative chromatograms DMB-merket sialic acid standarder. DMB-merket Neu5Ac (øvre panel) og Neu5Gc (nedre panel) ble analysert av HPLC. Oppbevaring ganger (stiplet linje) og topp områder av både sialic syrer var bestemt etter sprøytebruk 10 ng av respekterte DMB-merket arter i HPLC systemet. I de her vist representant chromatograms, DMB-Neu5Gc elut etter omtrent en 8 min tiden og DMB-Neu5Ac på 11 min, henholdsvis. Flere mindre toppene i chromatogram vises vanligvis mellom 2-6 min, som representerer Ureagert DMB og reaksjon intermediater. En liten brøkdel av DMB-merket Neu5Ac vises som en mindre urenhet i DMB-Neu5Gc-standarden (nedre panel). Dette tallet er endret fra referanse22. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: karakterisering av membran-bundet sialic syrer av DMB-HPLC. Cellene ble kultivert i fravær (ubehandlet, øvre panel) eller tilstedeværelse med 5 mM ManNAc (andre panel fra toppen), ManNProp (tredje panel fra toppen), eller ManNBut (nedre panel), henholdsvis i 7 dager. Mediet ble endret hver 24 h. celler ble høstet og membran brøker var forberedt, merket med DMB og analyseres av HPLC. Sammenliknet med chromatograms av DMB-merket sialic acid (figur 2), ble topper på tid mellom 8-9 min identifisert som DMB-Neu5Gc og toppene mellom 10-11 min som DMB-Neu5Ac. Sammenlignet med toppene fra sprøytebruk DMB-merket sialic acid standarder, viser chromatograms fra celle lysates ekstra, udefinert topper. Dette er den interne urenhet sonder, samt det faktum at DMB kan reagere ikke bare med sialic syre i celle lysates, men også med andre α-keto syrer stede i celle lysates, inkludert pyruvate, succinate og α-ketoglutarate. Topper som bare vises i chromatograms med prøver fra celler kultivert i nærvær av N-acyl endret mannosamine analogs angi tilsvarende DMB-merket ikke-naturlige sialic syrer. Dette tallet er endret fra referanse22. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: masse spektra av DMB-merket sialic acid arter finnes i celle lysates. HPLC oppbevaring topper rundt (se fig. 3) ble samlet og deretter analysert av ESI-MS. 20 µL av de innsamlede retentions topper ble injisert i LC-MSD systemet. Reaksjon med DMB fører til en økning i molekylær masse 116.2 Da sammenlignet med tilsvarende Ureagert sialic acid arter. Positive masse/kostnader forhold spectrograms fra forskjellige sialic acid arter er avbildet (DMB-Neu5Ac: øvre venstre panel, DMB-Neu5Gc: øvre høyre panel, DMB-Neu5Prop: nedre venstre panel, DMB-Neu5But: nedre høyre panel). Grunn til adduct dannelse er flere topper synlige. Foruten protonerte ion [M + H]+, natrium addukter [M + Na]+ og [M + 2Na-H]+ vises. Acetonitrile, som finnes under LC analysen, finnes også som en adduct (øvre høyre panel). Dehydrert DMB-Neu5Ac, som er generert av fragmentering i apparatet [M + H]+-H2O kan observeres (øvre venstre panel). Samlet DMB-Neu5Gc proben kan inneholde urenheter skyldes Ureagert DMB, samt reaksjon mellomprodukter som mer udefinert topper (øvre høyre panel). ACN, acetonitrile; H, hydrogen; Na, natrium. Dette tallet er endret fra referanse22. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: analyse av polysialylation av NCAM. Kelly neuroblastom celler ble kultivert i fravær eller tilstedeværelse av 5 mM ManNAc, ManNProp eller ManNBut i 7 dager. Cellene ble høstet og proteiner var atskilt på 8% SDS-akrylamid gels og analysert ved Western blot bruke monoklonale anti-polySia antistoff 735. Merk at polySia vises som en smøre på grunn av sin heterogenitet i antall Sia, som resulterer i forskjellige størrelser og anklager om polySia.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hvis kjemisk syntetisk ManNAc derivater, ManNProp og ManNBut blir analysert via massespektrometri, bør bare riktig masse toppen for begge prøver identifiseres. Produktene kan derfor antas for å ha en renhet på over 99%. Små mengder Neu5Gc, som vanligvis ikke finnes i menneskeceller29, oppdages i membranen fraksjoner av lysed celler. Dette skjer sannsynligvis gjennom en restverdi sti som rekrutterer Neu5Gc fra fosterets bovin serum sialoglycoconjugates i media30. Behandling med naturlige forløperen til sialic acid biosyntesen, ManNAc, reduserer drastisk uttrykk for Neu5Gc epitope på cellens overflate.

Bruk av modifisert mannosamines er negligibly giftig for alle celler undersøkt så langt. Celler godta økt millimolar sukker konsentrasjoner i medium, som er nødvendig, siden det er ingen bestemt transportører for N- acylmannosamines. Det har blitt demonstrert at signaltransduksjon trasé er aktivert etter søknad av N- acylmannosamines, som kan påvirke celle vekst eller differensiering31,32. Om dette er på grunn av en endret sialylation mønster eller reflekterer direkte effekter på den endrede sialylation er ikke kjent så langt. Veksten av celler i nærvær av den C2-modifisert ManNAc analogs, ManNProp eller ManNBut resulterer i uttrykket av ikke-naturlig sialic acid arter bærer tilsvarende N-acyl substitusjon. Metabolsk effektiviteten av to testet N-acyl endret mannosamines varierer. Behandling med ManNProp fører vanligvis til uttrykk for det tilsvarende Neu5Prop på cellens overflate og et redusert uttrykk for Neu5Ac samt Neu5Gc. Andre N-acyl endret mannosamine analogs, som N- cyclopropylcarbamyl mannosamine, pleier å ha en enda høyere metabolsk effektivitet22.

Tidligere studier viste at sialic forløpere forstyrre polysialylation. Polysialic syrer uttrykkes nesten utelukkende på NCAM. Interessant, kan NCAM være polysialylated av to forskjellige polysialyltransferases i Golgi (ST8SiaII og ST8SiaIV). Det viste seg at ManNProp, ManNBut og andre N-acyl-modifisert mannosamines påvirke polysialylation, og at dette er hovedsakelig på grunn av interaksjon med ST8SiaII14. Dette sialyltransferase uttrykkes under utvikling og er viktig for utvikling av hjernen. Interessant, mange tumorer fra neuronal opprinnelse re-uttrykke ST8SiaII øke deres kreft og ytterligere gjøre dem undetectable immunsystem33. Derimot fører anvendelse av ManNAc til en økning av polySia, siden det fører til en økning av CMP-Neu5Ac, som er naturlig underlaget for begge polysialyltransferases.

MGE er en unik metode å introdusere romanen sialic syrer på proteiner av interesse (f.eks erytropoietin) og modulere dermed sin funksjon. Videre, det kan brukes å modulere cellen overflaten glykosylering, som kan være av interesse for mange sykdommer som kreft, siden mange kreftceller prøve å unnslippe immunforsvaret ved å uttrykke høye nivåer av sialic syre. Metoden som presenteres her: først utføre glycoengineering med cellekulturer og andre, til å analysere utviklet glykaner å bevise vellykket glycoengineering. Metoden er veldig robust og opp til nå, ingen fallgruver er rapportert; metoden har derimot blitt utvidet til å innføre kjemisk aktive grupper å utføre Klikk-kjemi på celler13.

Her presenterer vi to ManNAc analogs alifatisk N-acyl side kjede modifikasjoner som er relativt enkle å syntetisere, selv ved laboratorier med mindre utstyr og mindre erfaring i syntese. Grupper som er best kjent for organisk kjemi kan syntetisere andre ManNAc analogs med mer komplekse strukturer og bruke disse for MGE, inkludert den såkalte "bioorthogonal" analogs, som kan benyttes for eksempel til å visualisere sialylated GLYCOCONJUGATES. Det er review-artikler som gir en oversikt over N-acetylen-mannosamine derivater som har blitt syntetisert hittil13,34. N- azidoacetyl mannosamine (ManNAz), et stoff som brukes ofte, visualisere sialylated glykaner, er kommersielt tilgjengelig. På grunn av lav membran permeabilitet av ManNAc analogs, kan det være en fordel å bruke derivater av disse sukker med beskyttet hydroksyl-grupper, eksempelvis peracetylated ManNAc analogs. Etter innstigning cytoplasma, er beskytte gruppene kløyvde av cytoplasmatiske esterases, dermed slippe de aktive monosaccharides35,36,37. Men utsette peracetylated ManNAc analogs høyere cytotoksisitet sammenlignet med tilsvarende ubeskyttet derivater.

I dette manuskriptet valgte vi udødeliggjort neuroblastom celler for våre eksperimenter med MGE. Vanligvis kan MGE (spesielt med ManNProp og ManNBut) brukes i en rekke cellelinjer, inkludert udødeliggjort linjer (se Wratil et al. 13 eksempler) og primære celler38,39. Videre ble MGE vellykket benyttet for å endre sialylation i vivo i C. elegans40, sebrafisk17,41, musen19,20,42og rotta 43 , 44. behandling tid og konsentrasjonen av den ManNAc analogs MGE eksperimenter kan varieres for å påvirke metabolske effektiviteten av denne metoden. Fra vår erfaring tilsvarer lengre behandling og høyere konsentrasjoner bedre erstatning av naturlig forekommende sialic acid arter i glycoconjugates av modifisert Neu5R. Hvis svært høye konsentrasjoner av ManNAc derivater brukes, cytotoksisitet av behandlingen bør vurderes, f.eks MTT analysen eller resazurin reduksjon analysen.

I dette manuskriptet foreslår vi bruke ultra-sonication for celle homogenisering. Andre cellen lysis metoder ble testet i vårt laboratorium, inkludert douncing på isen (ca 250 slag) og fransk Trykk avbrudd (10.000 psi, 4 ganger) med sammenlignbare resultater angående mengden sialic syre i prøvene. Fordelen med ultra lyd homogenisering er at den trenger litt tid og ikke krever tillegg av DNAase til prøvene før lysis.

Vi fokuserte vår analyse på membran fraksjoner av celle lysates, fordi vi ønsket å vise endringer i sialylation av membran bundet glycoconjugates. Sialic acid derivater og konsentrasjonene kan også måles i stoffer av celler, etter membran brøken har blitt atskilt av høyhastighets sentrifugering, bruke samme metode som beskrevet ovenfor. Konsentrasjonen av sialic syre i stoffer er imidlertid opp til 100 x lavere sammenlignet med sialic acid uttrykk på cellemembranen7. Dermed for større mengder celler å generere pålitelige resultater. Utvalget av cytosolic, aktivert CMP-sialic syre kan måles indirekte ved å behandle pre cytosolic fraksjoner av celle lysates med natrium borohydride før hydrolyse7,45. For å hydrolyze sialic syre i glycoconjugates og sialic syre hydroksyl modifikasjoner, ble cellene inkubert med 1 M TFA. Andre syrlig løsninger kan brukes til hydrolyse, samt, f.eks 2 M propionsyre acid, 2 M eddiksyre eller 1 M HCl.

En mulig støtt på problemer under såkalt HPLC-analyse er at topper rundt overlapper med udefinert topper. Dette er særlig problematisk når sialic syre i en prøve er skal beregnes av området under kurven av en viss topp. For å skille en topp av interesse fra en udefinert topp, acetonitrile konsentrasjonen i HPLC løsemiddelet kan justeres (± 3%). Vi foreslår med jevn løsemiddel konsentrasjoner for såkalt HPLC-analyse, gir fordelen av forbereder løsemiddel blandingen før kromatografi. Derfor våre metoden krever bare en såkalt HPLC pumpe og mulig for en rekke forskjellige HPLC systemer. Hvis flere pumpen er tilgjengelige i HPLC systemet, brukes en isocratic gradering med økende konsentrasjoner av acetonitrile, f.eks 4-9% i 35 min45. Med denne teknikken, vil tiden av visse HPLC topper endres betydelig. Denne strategien kan også bidra til å oppnå bedre separasjon av overlappende topper. Matrix-assistert laser desorpsjon ionization massespektrometri (MALDI-MS) ble opprettet for å kontrollere uttrykket av endret sialic acid arter på celle overflaten45, og dermed fungerer som tilsvarende metoden ESI-MS presenteres her .

Hydrophilicity av ManNAc analogs og mangel på bestemte transporter for opptaket av disse derivater46, er høye konsentrasjoner nødvendig MGE eksperimenter med disse forbindelsene. Derfor er skaleres opp eksperimenter, og spesielt i i vivo prøvelser, store mengder den respektive ManNAc analogs nødvendig viser en mulig begrensning av denne teknikken. På den annen side, avhengig av de cellen linjene som brukes, er visse minimalt antall behandlet celler nødvendig for å oppnå pålitelige resultater i såkalt HPLC-analyse. Fra vår erfaring er minimum rundt 100.000 tilhenger celler eller 150.000 suspensjon celler (1-2 wells av en 96-brønns plate med confluent celler) tilstrekkelig. Dette kan bli en flaskehals, hvis analysen er å bli forminsket, for eksempel i screening tilnærminger.

Med metodene i dette manuskriptet, kan sialic syre og dets derivater påvises i celle lysates. Men kan ikke struktur og sammensetning av glycoconjugates i cellene behandlet med ManNAc derivater vurderes med her beskrevet teknikken. Løse glycoconjugates, e.g.,N- og O- glykaner, krever vanligvis større erfaring og en glycomics anlegget47. Vi vet, så langt er ingen data tilgjengelig på forskjellige strukturen av glycoconjugates fra celler som har blitt behandlet med ManNAc analogs.

Western blot er polysialic syre en svært rask og enkel metode. Data innhentet av denne metoden er imidlertid ikke kvantitativ, siden oppdagelsen bruker antistoffer og chemiluminescence. Bruk av HPLC metoder er derfor en fordel over vestlige blotting. Imidlertid foreslår vi bruker immunoblotting metoden, siden det er enkelt å bruke og kjent for å fungere veldig pålitelig.

Uttrykk for sialic syre på cellens overflate kan endres også metoder enn MGE. Som beskrevet ovenfor, kan cellene behandles med sialidase, et enzym som innstiftet sialic acid rester fra glycoconjugates på en relativt uspesifikke måte. Sialidase behandling induserer følgelig hyposialylation i behandlet celler. Dessverre er sialidase behandling en ganske begrenset teknikk, som det er cytotoksisk, ikke mulig for lang tid behandling og gjelder ikke i vivo eksperimenter. En annen teknikk for å indusere hyposialylation i cellene er hemmere av sialic acid biosyntesen. En rekke hemmere finnes at enten målet nøkkel enzymet av sialic acid biosyntesen, UDP -N- acetylglucosamine-2-epimerase /N- acetylmannosamine-kinase (GNE/MNK) eller gruppen i sialyltransferases6, 7,8,48. En av disse forbindelsene, en C3-fluorholdige sialic syre analog, ble vist å senke uttrykk for sialic syre i levende mus49. Dyr behandlet med dette stoffet, men viste leveren verdifall, irreversible nyre dysfunksjon og manglende trives49. Disse resultatene bekrefter avgjørende rollen Neu5Ac i leveren og nyre funksjon og videre viser grensene for sialylation hemmere for i vivo eksperimenter. En tredje metode å generere celler med endrede cellen overflaten sialylation er ved å forstyrre uttrykket av enzymer som er avgjørende for sialic acid biosyntesen. En sammenleggbare av GNE/MNK i udødelighet celler, for eksempel ble vist å gjengi disse cellene hyposialylated 9. Muligheten til å relativt lett banke i og - ut gener i mobilnettet og i vivo bruker romanen og anerkjent CRISPR-Cas9-teknikken kan føre til nye oppdagelser vedrørende sialic acid biosyntesen og celle overflaten sialylation.

Fordelen med MGE sammenlignet med teknikkene som beskrives her, er at det er enkelt å bruke og tilpasningsdyktig et mylder av ulike eksperimenter, fra i vitro studier til celle basert analyser og eksperimenter i vivo . En alternativ metode for å måle uttrykk og konsentrasjoner av ulike sialic acid arter i cellen prøver er av høy ytelse anion exchange kromatografi (HPAEC) med pulserende elektrokjemiske oppdagelsen50. Ved hjelp av denne metoden, uttrykk for sialic acid måles direkte, og ikke etter merking med et fluorescerende farge. Fordelen med denne metoden er at det kan bli benyttet også analysere monosaccharides sialic syre og dets derivater i celle - og protein-prøver. Dessverre er følsomheten til HPAEC lavere sammenlignet fluorometric påvisning av DMB-sialic syre. Dermed er HPAEC begrenset til eksperimenter med tilgjengeligheten av stort utvalg beløp51.

Her beskrives metodene kan brukes å avsløre ukjent kjennetegner glycoconjugates. En rekke eksempler på bruk av MGE undersøke sialic acid avhengige interaksjoner allerede finnes13, viser muligheten for denne teknikken i sammenheng med en rekke eksperimentelle oppsett.

MGE med N- acetylmannosamines brukes i dag, hovedsakelig av forskere innen glycobiology. Vi håper at denne teknikken blir gjenkjent av et bredere publikum som et allsidig verktøy til å endre glycoconjugates. Andre felt, inkludert immunologi, virologi, nevrologi og onkologi vil ha nytte ved å tilpasse denne teknikken for egne formål. Slik krysset forskning kan aktivere oppdagelsen av ennå ukjent områder, og derfor gi en bedre forståelse av helse og sykdom. I studier, for eksempel ble denne teknikken brukt til å produsere glykoproteiner med endrede glykosylering, som senere tjene for i vivo vaksinasjon. I enkelte tilfeller behandling med slike glycoengineered vaksiner føre til produksjon av antistoffer som avanserte avidity og toksisitet til de respektive målene52,53. Andre brukt MGE for å utvikle en modell for målrettet tumor terapi i mus54. En annen studie viste at systemisk i vivo injeksjon av ManNProp fremmet nerven fornyelse55. Ved polySia, ble det vist at avtagende uttrykk for denne epitope i neuroblastom celler av metodene i dette manuskriptet øker følsomheten til disse kreftceller stråling eller behandling med anticancer narkotika56.

Mengder sialic acid målt innenfor prøver kan variere avhengig av metoden som brukes til koble behandlet cellene. I dette manuskriptet ble inkubasjon med trypsin brukt til å koble celler. Hvis andre teknikker brukes, for eksempel skraping cellene eller lang tid behandling med PBS + EDTA, avvike mengder sialic acid målt i prøvene. Selv tilpasser inkubasjon tiden med trypsin kan ha innvirkning på sialic acid konsentrasjonen målt senere. Fra vår erfaring, virkningen av cellen avdeling metoden på mengder sialic acid målt er under 15%, men hvis resultatene er normalisert og forhold, dette kan bli et viktig flaskehalsen. I tillegg kan metoden for lysis av celler påvirke utfallet av såkalt HPLC-analyse. Derfor anbefaler vi leseren å standardisere celle avdeling og lyseringsbufferen i sine eksperimenter.

For å oppnå skille brøken membran i celle lysates, brukte vi sentrifugering for 2t 20.000 x g og 4 ° C (pkt. 5.1). Andre sentrifugering protokoller kan påvirke separasjon og derfor mengder sialic syre i prøvene. Et viktig stoff i denne protokollen er DMB, fordi det er svært følsomme for lys og forringer over tid. Her bør vi aliquot små deler av DMB-løsning og lagre det som aksjer til - 20 ° C, beskyttet fra lys (avsnitt 1.6.1). Denne måten DMB-løsningen kan lagres i flere uker. Hvis resultatene fra DMB-såkalt HPLC-analyse viser redusere signaler for sialic acid arter eller øke signaler i den første 6 min HPLC måling, bør som representerer DMB og reaksjon produkter, nye DMB-løsning være forberedt. Ikke nytt fryse og gjenbruk DMB-løsning etter tining det. Etter DMB merking, skal alle prøver analyseres umiddelbart. Hvis større antall prøver (> 10) som skal analyseres, bør disse prøvene delt inn i mindre emblemer og gradvis merket med DMB. Begge merking reaksjonen tider samt DMB-merket sonder skal beskyttes fra lys på alle. Etter elueringsrør, bør DMB-merket sialic acid arten bli analysert umiddelbart av ESI-MS. direkte koblingen av HPLC med ESI-MS systemet (i et oppsett for LC-ESI-MS) er ikke nødvendig, men kan være en fordel å oppnå høyere kvalitet på massespektrometri analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi takker L. D. Nguyen korrekturlesing manuskriptet og fruktbart diskusjoner. Videre takker vi J. Dernedde og H. G. Nguyen for å hjelpe oss å forberede video skyte. De fleste ble av videoen filmet i laboratoriene av R. Tauber. Vi takker også Max Planck-instituttet for kolloider og grensesnitt, og for å gi oss gratis tilgang til deres massespektrometri anlegg. RH ble støttet av DFG (ProMoAge).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells Sigma-Aldrich 92110411
RPMI medium Sigma-Aldrich R8758
75 ml tissue culture flasks Greiner 690175
48-well plates Corning 3548
FCS PAA A15-102
Pen/Strep Gibco 15140-122
Trypsine Gibco 15400-054
EDTA Roth X986.1
Tris Serva 37190.03
SDS Roth 2326.2
SDS-PAGE equipment (tanks, glassware etc., machine VWR SDS Gel/Blot
Acrylamide Roth 3019.1
Protein ladder Fisher Scientific 267620
Nitrocellulose GE Healthcare 10600002
Ponceau red Roth 5938.2
Milk powder Roth T145.3
ECL Millipore WBLUF 0500
0.5 ml Centrifugal Filter Unit with 3 kDa membrane Merck-Millipore UFC500324
15 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich (Corning) CLS430791-500EA
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-10ML
2-Propanol Sigma-Aldrich 34965-1L HPLC gradient grade
4,5-Methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride Sigma-Aldrich D4784-50MG
48 well, flat bottom tissue culture plate Sigma-Aldrich (Corning) CLS3548-100EA
50 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich (Corning) CLS430829-500EA
Acetonitrile Sigma-Aldrich 34967-1L HPLC gradient grade
Aprotinin from bovine lung Sigma-Aldrich A1153-10MG lyophilized powder, 3-8 TIU/mg solid
Butyryl chloride Sigma-Aldrich 109614-250G
C18 RP column Phenomenex 00F-4435-E0 110 Å, 3 µm particle size, 4.6 x 150 mm
D-Mannosamine hydrochloride Sigma-Aldrich M4670-1G
Dulbecco`s Phosphate Buffered Salt Solution PAN Biotech P04-36500
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich E9884-100G
Formic acid Sigma-Aldrich 56302-50ML-GL
Hydrochloric acid solution Sigma-Aldrich H1758-100ML 36.5-38.0%, in water
Leupeptin Sigma-Aldrich L2884-10MG
Methanol Carl-Roth T169.2 HPLC gradient grade
N-Acetyl-D-mannosamine Sigma-Aldrich A8176-250MG
N-Acetylneuraminic acid Sigma-Aldrich A0812-25MG
N-Glycolylneuraminic acid Sigma-Aldrich G9793-10MG
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich P7626-250MG
Propionyl chloride Sigma-Aldrich P51559-500G
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, amber (light protection) Eppendorf 30120191
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, colorless Eppendorf 30120086
Sodium bisulfite solution Sigma-Aldrich 13438-1L-R-D 40%, in water
Sodium chloride Sigma-Aldrich 746398-500G-D
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 795429-500G-D
Sodium hydroxide solution Sigma-Aldrich 319511-500ML 1.0 M, in water
Sodium methoxide Sigma-Aldrich 164992-5G
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508-100ML-D
Tris hydrochloride Sigma-Aldrich T5941-100G
Trypsin 0.25 %/EDTA 0.02 % in PBS PAN Biotech P10-019100
Water Carl-Roth T905.1 HPLC gradient grade
Silica Gel 60 Carl-Roth 9779.1
HPLC Agilent
ESI-MSD-System Agilent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Angata, T., Varki, A. Chemical diversity in the sialic acids and related alpha-keto acids: An evolutionary perspective. Chem Rev. 102, 439-469 (2002).
  2. Schauer, R., Schoop, H. J., Faillard, H. On biosynthesis of glycolyl group of N-glycolylneuraminic acid. oxidation of N-acetyl group to glycolyl group. Hoppe-Seylers Zeitschrift Fur Physiologische Chemie. 349, (1968).
  3. Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A. The molecular basis for the absence of N-glycolylneuraminic acid in humans. J Biol Chem. 273, 15866-15871 (1998).
  4. Kelm, S., et al. Use of sialic acid analogues to define functional groups involved in binding to the influenza virus hemagglutinin. Eur J Biochem. 205, 147-153 (1992).
  5. Colley, K. J., Kitajima, K., Sato, C. Polysialic acid: Biosynthesis, novel functions and applications. Crit Rev Biochem Mol Biol. 49, 498-532 (2014).
  6. Rillahan, C. D., et al. Global metabolic inhibitors of sialyl- and fucosyltransferases remodel the glycome. Nat Chem Biol. 8, 661-668 (2012).
  7. Wratil, P. R., et al. A Novel Approach to Decrease Sialic Acid Expression in Cells by a C-3-modified N-Acetylmannosamine. J Biol Chem. 289, 32056-32063 (2014).
  8. Nieto-Garcia, O., et al. Inhibition of the key enzyme of sialic acid biosynthesis by C6-Se modified N-acetylmannosamine analogs. Chem Sci. 7, 3928-3933 (2016).
  9. Keppler, O. T., et al. UDP-GlcNAc 2-epimerase: A regulator of cell surface sialylation. Science. 284, 1372-1376 (1999).
  10. Kayser, H., et al. Biosynthesis of a nonphysiological sialic acid in different rat organs, using N-propanoyl-D-hexosamines as precursors. J Biol Chem. 267, 16934-16938 (1992).
  11. Keppler, O. T., et al. Biosynthetic modulation of sialic acid-dependent virus-receptor interactions of two primate polyoma viruses. J Biol Chem. 270, 1308-1314 (1995).
  12. Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. Imaging the glycome. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12-17 (2009).
  13. Wratil, P. R., Horstkorte, R., Reutter, W. Metabolic Glycoengineering with N-Acyl Side Chain Modified Mannosamines. Angewandte Chemie International Edition. 55, 9482-9512 (2016).
  14. Horstkorte, R., et al. Selective inhibition of polysialyltransferase ST8Siall by unnatural sialic acids. Exp Cell Res. 298, 268-274 (2004).
  15. Gnanapragassam, V. S., et al. Sialic Acid Metabolic Engineering: A Potential Strategy for the Neuroblastoma Therapy. PLOS ONE. 9, 10 (2014).
  16. Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A strain-promoted 3+2 azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of blomolecules in living systems. J Am Chem Soc. 126, 15046-15047 (2004).
  17. Dehnert, K. W., et al. Imaging the Sialome during Zebrafish Development with Copper-Free Click Chemistry. ChemBioChem. 13, 353-357 (2012).
  18. Prescher, J. A., Dube, D. H., Bertozzi, C. R. Chemical remodelling of cell surfaces in living animals. Nature. 430, 873-877 (2004).
  19. Neves, A. A., et al. Imaging sialylated tumor cell glycans in vivo. Faseb Journal. 25, 2528-2537 (2011).
  20. Vogt, J., et al. Homeostatic regulation of NCAM polysialylation is critical for correct synaptic targeting. Cell Mol Life Sci. 69, 1179-1191 (2012).
  21. Qiu, L., et al. A novel cancer immunotherapy based on the combination of a synthetic carbohydrate-pulsed dendritic cell vaccine and glycoengineered cancer cells. Oncotarget. 6, 5195-5203 (2015).
  22. Erikson, E., et al. Mouse Siglec-1 Mediates trans-Infection of Surface-bound Murine Leukemia Virus in a Sialic Acid N-Acyl Side Chain-dependent Manner. J Biol Chem. 290, 27345-27359 (2015).
  23. Klein, A., Diaz, S., Ferreira, I., Lamblin, G., Roussel, P., Manzi, A. E. New sialic acids from biological sources identified by a comprehensive and sensitive approach: liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry (LC-ESI-MS) of SIA quinoxalinones. Glycobiology. 7, 421-432 (1997).
  24. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during assembly of head of bacteriophage-T4. Nature. 227, (1970).
  25. Orozco-Solano, M. I., Priego-Capote, F., Luque de Castro, M. D. Ultrasound-assisted hydrolysis and chemical derivatization combined to lab-on-valve solid-phase extraction for the determination of sialic acids in human biofluids by µ-liquid chromatography-laser induced fluorescence. Analytica Chimica Acta. 766, 69-76 (2013).
  26. Hara, S., Takemori, Y., Yamaguchi, M., Nakamura, M., Ohkura, Y. Fluorometric high-performance liquid chromatography of N-acetyl- and N-glycolylneuraminic acids and its application to their microdetermination in human and animal sera, glycoproteins, and glycolipids. Anal Biochem. 164, 138-145 (1987).
  27. İzzetoğlu, S., Şahar, U., Şener, E., Deveci, R. Determination of sialic acids in immune system cells (coelomocytes) of sea urchin, Paracentrotus lividus, using capillary LC-ESI-MS/MS. Fish Shellfish Immunol. 36, 181-186 (2014).
  28. Wolf, S., et al. Chemical Synthesis and Enzymatic Testing of CMP-Sialic Acid Derivatives. ChemBioChem. 13, 2605-2615 (2012).
  29. Sonnenburg, J. L., Altheide, T. K., Varki, A. A uniquely human consequence of domain-specific functional adaptation in a sialic acid-binding receptor. Glycobiology. 14, 339-346 (2004).
  30. Oetke, C., et al. Evidence for efficient uptake and incorporation of sialic acid by eukaryotic cells. Eur J Biochem. 268, 4553-4561 (2001).
  31. Buttner, B., et al. Biochemical engineering of cell surface sialic acids stimulates axonal growth. J Neuro. 22, 8869-8875 (2002).
  32. Kontou, M., Weidemann, W., Bork, K., Horstkorte, R. Biological Chemistry. 390, 575 (2009).
  33. Tanaka, F., et al. Expression of polysialic acid and STX, a human polysialyltransferase, is correlated with tumor progression in non small cell lung cancer. Cancer Res. 60, 3072-3080 (2000).
  34. Cheng, B., Xie, R., Dong, L., Chen, X. Metabolic Remodeling of Cell-Surface Sialic Acids: Principles, Applications, and Recent Advances. ChemBioChem. 17, 11-27 (2016).
  35. Collins, B. E., Fralich, T. J., Itonori, S., Ichikawa, Y., Schnaar, R. L. Conversion of cellular sialic acid expression from N-acetyl- to N-glycolylneuraminic acid using a synthetic precursor, N-glycolylmannosamine pentaacetate: inhibition of myelin-associated glycoprotein binding to neural cells. Glycobiology. 10, 11-20 (2000).
  36. Schwartz, E. L., Hadfield, A. F., Brown, A. E., Sartorelli, A. C. Modification of sialic acid metabolism of murine erythroleukemia cells by analogs of N-acetylmannosamine. Biochimica Et Biophysica Acta. 762, 489-497 (1983).
  37. Jones, M. B., et al. Characterization of the cellular uptake and metabolic conversion of acetylated N-acetylmannosamine (ManNAc) analogues to sialic acids. Biotechnol Bioeng. 85, 394-405 (2004).
  38. Bayer, N. B., et al. Artificial and Natural Sialic Acid Precursors Influence the Angiogenic Capacity of Human Umbilical Vein Endothelial Cells. Molecules. 18, 2571-2586 (2013).
  39. Schmidt, C., Stehling, P., Schnitzer, J., Reutter, W., Horstkorte, R. Biochemical engineering of neural cell surfaces by the synthetic N-propanoyl-substituted neuraminic acid precursor. J Biol Chem. 273, 19146-19152 (1998).
  40. Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. In Vivo Imaging of Caenorhabditis elegans Glycans. ACS Chem Biol. 4, 1068-1072 (2009).
  41. Laughlin, S. T., Baskin, J. M., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish. Science. 320, 664-667 (2008).
  42. Chang, P. V., et al. Copper-free click chemistry in living animals. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 1821-1826 (2010).
  43. Gagiannis, D., Gossrau, R., Reutter, W., Zimmermann-Kordmann, M., Horstkorte, R. Engineering the sialic acid in organs of mice using N-propanoylmannosamine. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1770, 297-306 (2007).
  44. Rong, J., et al. Glycan Imaging in Intact Rat Hearts and Glycoproteomic Analysis Reveal the Upregulation of Sialylation during Cardiac Hypertrophy. J Am Chem Soc. 136, 17468-17476 (2014).
  45. Galuska, S. P., et al. Quantification of Nucleotide-Activated Sialic Acids by a Combination of Reduction and Fluorescent Labeling. Anal Chem. 82, 4591-4598 (2010).
  46. Harms, E., Reutter, W. Half-Life Of N-Acetylneuraminic Acid In Plasma-Membranes Of Rat-Liver And Morris Hepatoma 7777. Cancer Res. 34, 3165-3172 (1974).
  47. Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Curr Opin Chem Biol. 16, 214-220 (2012).
  48. Preidl, J. J., et al. Fluorescent Mimetics of CMP-Neu5Ac Are Highly Potent, Cell-Permeable Polarization Probes of Eukaryotic and Bacterial Sialyltransferases and Inhibit Cellular Sialylation. Angewandte Chemie-International Edition. 53, 5700 (2014).
  49. Macauley, M. S., et al. Systemic Blockade of Sialylation in Mice with a Global Inhibitor of Sialyltransferases. J Biol Chem. 289, 35149-35158 (2014).
  50. Jorge, P., Abdul-Wajid, A. Sialyl-Tn-KLH, glycoconjugate analysis and stability by high-pH anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD). Glycobiology. 5, 759-764 (1995).
  51. Lin, S. L., Inoue, Y., Inoue, S. Evaluation of high-performance anion-exchange chromatography with pulsed electrochemical and fluorometric detection for extensive application to the analysisof homologous series of oligo- and polysialic acids in bioactive molecules. Glycobiology. 9, 807-814 (1999).
  52. Pan, Y. B., Chefalo, P., Nagy, N., Harding, C., Guo, Z. W. Synthesis and immunological properties of N-modified GM3 antigens as therapeutic cancer vaccines. J Med Chem. 48, 875-883 (2005).
  53. Chefalo, P., Pan, Y. B., Nagy, N., Guo, Z. W., Harding, C. V. Efficient metabolic engineering, of GM3 on tumor cells by N-phenylacetyl-D-mannosamine. Biochemistry. 45, 3733-3739 (2006).
  54. Lee, S., et al. Chemical Tumor-Targeting of Nanoparticles Based on Metabolic Glycoengineering and Click Chemistry. ACS Nano. 8, 2048-2063 (2014).
  55. Koulaxouzidis, G., Reutter, W., Hildebrandt, H., Stark, G. B., Witzel, C. In vivo stimulation of early peripheral axon regeneration by N-propionylmannosamine in the presence of polysialyltransferase ST8SIA2. J Neural Transm. 1-9 (2015).
  56. Gnanapragassam, V. S., et al. Correction: Sialic Acid Metabolic Engineering: A Potential Strategy for the Neuroblastoma Therapy. PLOS ONE. 11, e0154289 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics