बायोटिनिलाटेड सेल सतह प्रोटीन की शुद्धि

Published 7/23/2017
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Biochemistry

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Summary

एक संशोधित घनत्व केन्द्रापसारक ढाल-आधारित पद्धति का उपयोग रिप्चिफ्ल्यस मायक्रोप्लस आंत ऊतक से उपकला कोशिकाओं को अलग करने के लिए किया गया था। भूतल-बाध्य प्रोटीन बायोटिनिलाटेड थे और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों में उपयोग के लिए स्ट्रेक्टिविडिन चुंबकीय मोतियों के माध्यम से शुद्ध थे।

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Karbanowicz, T. P., Lew-Tabor, A., Rodriguez Valle, M. Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells. J. Vis. Exp. (125), e55747, doi:10.3791/55747 (2017).

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Abstract

Rhipicephalus microplus - पशु टिक - पशुधन पर आर्थिक प्रभाव के संदर्भ में कई रोगजनकों के एक सदिश के रूप में सबसे महत्वपूर्ण एक्टोपैरासाइट है। टीक पेट के उपकला कोशिकाओं की सतह पर स्थित बीएम 86 जैसे वैक्सीन उम्मीदवारों की खोज पर ध्यान देने के साथ, अपने विकृति प्रभाव को कम करने के लिए पशु टिक नियंत्रण को समर्पित किया गया है। वर्तमान शोध सीडीएनए और जीनोमिक पुस्तकालयों के इस्तेमाल पर केंद्रित है, अन्य टीसी उम्मीदवारों के लिए स्क्रीन पर। टिक आंत कोशिकाओं के अलगाव को सतह के प्रोटीन की संरचना की जांच में एक महत्वपूर्ण लाभ होता है जो टिक आंत कोशिका झिल्ली पर होता है। इस पत्र में उपकला कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक उपन्यास और व्यावहारिक विधि का गठन होता है, अर्ध-संक्रमित आर। माइक्रोप्रलस की टिक पेट सामग्री से यह प्रोटोकॉल टीसीईपी और ईडीटीए का उपयोग करता है जो उपकलाशोथ समर्थन ऊतकों से उपकला कोशिकाओं को जारी करता है और एक असंतत घनत्व केन्द्रापसारक ग्रेडिअन्य सेल प्रकारों से उपकला कोशिकाओं को अलग करने के लिए NT एफएसीएस या एलसी-एमएस / एमएस-विश्लेषण में डाउनस्ट्रीम एप्लीकेशंस के लिए अनुमति देने वाली स्ट्रेक्टिविडिन से जुड़े चुंबकीय मोती का उपयोग करते हुए, सेल की सतह प्रोटीन बायोटिकिनिलाटेड और टिक आंत उपकला कोशिकाओं से पृथक थे।

Introduction

उष्णकटिबंधीय और उप-उष्णकटिबंधीय क्षेत्रों के मवेशी उद्योग पर आर्थिक प्रभाव के संदर्भ में, रिप्शिफ्लस माइक्रोप्रलस , पशु टिक, सबसे महत्वपूर्ण एक्टोपैरासाइट है, क्योंकि यह वाइटर बोवाइन टिक फिवर (बैलिओसिस), एनाप्लाज्मोसिस और इक्वाइन पिरोप्लाज्मोसिस 1 , 2 , 3 , 4 । हानिकारक प्रभाव को कम करने के लिए, पशुओं के नियंत्रण को नियंत्रित करने के लिए प्रयास किया गया है, हालांकि रासायनिक एड़ारिकाइड्स के उपयोग के रूप में पारंपरिक तरीकों में अंतर्निहित कमियां हैं, जैसे कि दूध और मांस में रासायनिक अवशेषों की उपस्थिति और रासायनिक प्रतिरोधी टिक्ल्स के प्रसार में वृद्धि 5 , 6 , 7 नतीजतन, टिक नियंत्रण के वैकल्पिक तरीकों का विकास किया गया है, जैसे कि प्राकृतिक प्रतिरोधी मवेशी, जैविक नियंत्रण (बायोपेस्टीसाइड) और वैक्सीन का उपयोगइनस 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9

वैक्सीन उम्मीदवारों के रूप में उपयोग किए जाने वाले सक्षम प्रोटीनों की खोज में, वर्तमान शोध में टिक पेट पर ध्यान केंद्रित किया गया है। मिडगुत की दीवार पतली बेसल लैमीना पर आराम कर रहे उपकला कोशिकाओं की एक परत से बनाई गई है, जिसमें बेसल लैमीना के बाहर मांसपेशियों के एक नेटवर्क का निर्माण होता है। लाइट और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप अवलोकनों से पता चलता है कि मिडगुट में तीन प्रकार के कोशिकाएं हैं: आरक्षित (undifferentiated), स्राट्री, और पाचन शारीरिक प्रकार की संख्या के आधार पर सेल प्रकार की संख्या काफी भिन्न होती है। सेक्रेटरी और पाचन कोशिकाओं दोनों रिजर्व कोशिकाओं से उत्पन्न 18 , 1 9 , 20

सीडीएनए पुस्तकालयों का निर्माणटिकटिक पेट की संरचना की जांच के लिए संभावित बीजाणु उम्मीदवारों 2 , 3 , 4 के रूप में बीएम 86 जैसे एंटीजेनिक प्रोटीनों की पहचान करने के लिए प्रेरित किया गया है। ग्लाइकोप्रोटीन बीएम 86 को टिक आंत कोशिकाओं की सतह पर स्थानांतरित किया जाता है और टीके लगाए गए मवेशियों में पशु टिक ( आर। माइक्रोप्रलस ) के खिलाफ एक सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रेरित करता है। प्रतिरक्षित मेजबान द्वारा उत्पादित एंटी-बीएम 86 आईजीजी टिकटिक द्वारा निगमित होते हैं, टिक एट कोशिकाओं की सतह पर इस एंटीजन को पहचानते हैं, और बाद में टिक पेट टिशू फ़ंक्शन और अखंडता को परेशान करते हैं। Bm86 एंटीजन पर आधारित टीके संख्या, वजन और महिलाओं को संतुष्ट कर, बाद में टिक पीढ़ियों 4 में एक कम लार्वा संक्रमण में जिसके परिणामस्वरूप की प्रजनन क्षमता को कम करके, आर microplus और Rhipicephalus annulatus के प्रभावी नियंत्रण से पता चला है। हालांकि, बीएम 86 आधारित टीके सभी टिक चरणों के खिलाफ प्रभावी नहीं हैं औरआर माइक्रोप्र्लस के कुछ भौगोलिक उपभेदों के खिलाफ असंतोषजनक प्रभाव का प्रदर्शन किया, फलस्वरूप बीफ़ और डेयरी उद्योगों ने इन टीकों को 2 , 4 को खराब तरीके से अपनाया है।

टिक गट से उपकला कोशिकाओं को अलग करने की क्षमता एक महत्वपूर्ण नवीनता है जो विभिन्न पर्यावरणीय परिस्थितियों में आकारिकी और शरीर विज्ञान सहित प्रोटीन झिल्ली संरचना को निर्धारित करने के लिए अनुसंधान की प्रगति को सक्षम करेगा। यहां वर्णित विधि उप-उपकला समर्थन ऊतक 10 से एपिथेलियम को रिलीज करने के लिए चेलेटिंग एजेंट एथिलीनएमीनियानेटेट एसिड एसिड (ईडीटीए) और कम करने वाला एजेंट ट्राइस (2-कार्बोक्सीथाइल) फॉस्फ़िन (टीसीईपी) का इस्तेमाल करता है। पेसोल में ऊतक के यांत्रिक विघटन के बाद एपिथेलियम को ठीक किया जाता है, इसके बाद पेरोल में असंतत ढाल केन्द्रापसारक होता है। इस पत्र में टिक गट एपी के अलगाव के लिए एक व्यावहारिक और उपन्यास तकनीक का वर्णन किया गया हैद कोशिकाएं इन उपकला कोशिकाओं की सतह से अलग biotinylated सेल की सतह प्रोटीन, बाद में एफएसीएस और / या एलसी-एमएस / एमएस-विश्लेषण जैसे डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों में विश्लेषण किया जा सकता है।

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Protocol

1. आर। माइक्रोप्रलस से आंत एपिथेलियम का विच्छेदन

  1. प्रयोग के दिन मवेशियों से अर्ध-संक्रमित टिकी लीजिए। मेजबान से हटाने के बाद 24 घंटे के भीतर टिक्सेस काट लें।
  2. 92 मिमी x 16 मिमी पेट्री डिश के नीचे डक्ट टेप की एक पट्टी का पालन करें। टेप को सुपर गोंद की एक बूंद जोड़ें सुपर गोंद पर टिक, ऊतक पक्ष नीचे रखें, 2 मिनट के लिए सूखने की अनुमति दें
  3. पेट्री डिश में 100 मिलीलीटर फॉस्फेट बुफ़र खारा (पीबीएस) डालो, या जब तक टिक पूरी तरह से डूबे हुए न हो।
  4. एक आकार 11 स्केलपेल का इस्तेमाल करते हुए, टिक के दोनों किनारों पर, आँखों के ऊपर से नीचे के त्योहारों में कट जाता है।
  5. बाँझ संदंश का प्रयोग, आंतरिक अंगों को उजागर करने के लिए, स्कूटम और आलोकक्यूम को पूरी तरह से हटा दें।
  6. संदूषण को रोकने के लिए ठीक सफेद धागे की तरह अंगों (ट्रेकिआ) और अन्य झिल्ली निकालें।
  7. ऊपरी क्षेत्र को छानकर और से खींचकर संदंश का उपयोग कर पेट को निकालेंशव। किसी भी शेष ऊतकों को निकालें, यह सुनिश्चित करें कि कोई अन्य ऊतक विच्छेदित नहीं किया गया है।
  8. कैल्शियम क्लोराइड और प्रोटीनस-अवरोधक कॉकटेल (पीआईसी) के साथ मैग्नीशियम सल्फेट के बिना बर्फ-ठंड हांक के बैलेंस्ड नमक समाधान (एचबीएसएस) में स्टोर पेट। स्नैप सूखा बर्फ में हिम्मत फ्रीज और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
    नोट: आंत विच्छेदन और टिक आंतरिक अंगों के विवरण के साथ सहायता करने के लिए D सोनेनशाइन, 19 "Ticks के जीवविज्ञान" के अध्याय 3.1 का संदर्भ लें।

2. उपकला सेल डिसोसिएशन

  1. एक 50 एमएल ट्यूब के अंदर 70 माइक्रोन सेल झरनी पर विच्छेदित आंत डालो।
  2. जब तक समाधान ठीक नहीं चलता और 50 मिनट में 50 एमएल बर्फ ठंडे एचबीएसएस के साथ पेट ऊतक को फ्लश करें, तब तक एक सफेद / स्पष्ट उपस्थिति पर झटके लगते हैं।
  3. पीआईसी के साथ 30 मिलीलीटर बर्फ के ठंडे एचबीएसएस में हिम्मत फिर से निलंबित करें, धीरे-धीरे और सेंटीफ्यूज को 500 डिग्री सेल्सियस पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए पेट को पैलेट करें। सतह पर तैरनेवाला निकालें और धोने की प्रक्रिया को तीन बार दोहराएं।
  4. एक 250 सुक्ष्ममापी सेल झरनी के माध्यम से निलंबन फ़िल्टर करें, प्रवाह के माध्यम से भंवर और 70 माइक्रोन सेल झरनी शेष प्रवाह-माध्यम का संग्रह के माध्यम से फिल्टर।
  5. 500 xg पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए एकल कोशिकाओं गोली के लिए निलंबन अपकेंद्रित्र।

3. घनत्व केन्द्रापसारक ढाल का उपयोग कर एकल उपकला कोशिकाओं का अलगाव

  1. एपी 15 प्री-फ़िल्टर्ड पेपर के माध्यम से छानने के द्वारा घनत्व सेंट्रीफ्यूगेशन ग्रेडिएन्ट ( उदाहरण के लिए , पेरकोल) तैयार करें। 4% और 20% Percoll को एमक्यूएच 2 0 (वी / वी) में तैयार करें और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 1 घंटा पहले ढाल लेयर के लिए ठंडा करें।
  2. एक पिस्टलास्टिक का उपयोग करनापंप न्यूनतम गति पर सेट, परत 3 एमएल 40% घनत्व सेंट्रीफ्यूगेशन ढाल 16 एमएल ultracentrifuge ट्यूब में, यह 15 मिनट के लिए बर्फ पर बसने के लिए अनुमति देता है। पंप की गति एक <1 एमएल प्रति मिनट प्रवाह दर तक लेनी चाहिए।
  3. ट्यूब को 45 डिग्री के कोण पर झुकाव, 40% परत के ऊपर 20% घनत्व केन्द्रापसारक ढाल को परत के लिए पेस्टलास्टिक पंप का उपयोग करें। पंप की गति <1 एमएल प्रति मिनट प्रवाह दर तक लेनी चाहिए परतों को 15 मिनट के लिए बर्फ पर व्यवस्थित करने की अनुमति दें
  4. 20-40% घनत्व केन्द्रापसारक ढाल पर टिक आंत कोशिकाओं वाला डीएमईएम माध्यम की परत 3 एमएल के लिए प्रति मिनट की दर से 1 मिली लीटर पर इस्टेटस्टिक पंप का प्रयोग करें।
  5. अधिकतम त्वरण और न्यूनतम मंदी के लिए अपकेंद्रित्र कार्यक्रम 600 मिनट में 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र डीएमईएम के बीच इंटरफेस लीजिए: 20% घनत्व केन्द्रापूर्णता ढाल, और 20%: उपकला एकल कोशिकाओं को अलग करने के लिए 40% घनत्व केन्द्रापसारक ग्रेडियंट। बाद के विश्लेषण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित इंटरफ़ेस स्टोर करें।

4. सेल अलगाव का आकलन

  1. hemacytometer
    1. शराब के साथ हेमिसिटोमीटर स्लाइड साफ करें
    2. कोशिकाओं को धीरे-धीरे ऊपर और नीचे pipetting द्वारा कोशिकाओं को फिर से निलंबित। सेल निलंबन के 100 μL पिपेट और एक 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ़्यूज ट्यूब में जगह।
    3. 400% μL 0.4% ट्राइपैन ब्लू जोड़ें। ट्यूब को फ्लेक्स करके धीरे मिश्रण करें
    4. पिपेट को हेमोसाइटेटोमीटर के दोनों कक्षों को धीरे-धीरे भरने के लिए ट्रिपन ब्लू-सेलिंग सेल निलंबन के 100 μL।
    5. एक 10x उद्देश्य के साथ हीमोसाइटोमीटर के ग्रिड लाइनों पर ध्यान केंद्रित करते हुए एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत हेमोसाइटेटोमीटर रखें।
    6. हाथ से आयोजित मिलान काउंटर का उपयोग करते हुए, 16 वर्गों के एक सेट के भीतर लाइव अस्थिर कोशिकाओं की गणना करें। एक ही वर्ग के भीतर, नीले मृत कोशिकाओं की गणना करें। 16 वर्गों के चार सेट गिना जाता है जब तक गिनती जारी रखें।
    7. सूत्र का उपयोग करके कुल कोशिकाओं प्रति एमएल की गणना करें:
      47eq1.jpg "/>
    8. सूत्र का उपयोग करके प्रतिशत सेल व्यवहार्यता की गणना करें:
      समीकरण 2
  2. सेल विज़ुअलाइज़ेशन पृथक करें
    1. 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ़्यूज ट्यूब में एचबीएसएस के 9 μL में अलग-अलग कोशिकाओं में 1 μL पतला। धीरे से मिश्रण करने के लिए microcentrifuge ट्यूब झटका।
    2. एक ग्लास स्लाइड के बीच में एचबीएसएस में पृथक कोशिकाओं के 5 μL पिपेट 4 ', 6-डायरीडिनो -2 फेनिलंडोल (डीएपीआई) के साथ बढ़ते माध्यम के तीन बूंदों को लागू करें।
    3. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर स्लाइड को सेते हैं सावधानी से तैयारी पर एक कवर पर्ची, हवा के बुलबुले से बचने जगह है।
    4. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत 460 एनएम पर उत्तेजना 360 एनएम और उत्सर्जन में डीएपीआई के साथ दाग वाले कोशिकाओं को विज़ुअलाइज़ करें।

5. सेल सतह प्रोटीन बायोटिनिलेशन

  1. बायोटिन (प्रकार ए) संयोजन का उपयोग कर एकल कोशिका उपकला कोशिकाओं के 100 μL बायोटिनलाइट करेंकिट, निर्माता के निर्देशों के अनुसार 1: 1 सतह प्रोटीन के दाढ़ अनुपात में संयुग्मित करना
  2. सेल lysis के लिए, पीबीएस के 100 μL, 1% ट्राइटन एक्स -100, 10% ग्लिसरॉल, 100 माइक्रोन ऑक्सीकरण glutathione और बायोटीनियालाटेड कोशिकाओं को पीआईसी जोड़ें। हर 10 मिनट में कोमल मिश्रण के साथ 1 घंटे के लिए बर्फ पर सेते हैं
  3. बायोटिनिलाटेड कोशिकाओं को 20 डिग्री सेल्सियस पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए गोली अघुलनशील सामग्री पर अपकेंद्रित्र। साइटोप्लास्मिक युक्त सतह पर तैरनेवाला, और बायोटिनिलाटेड झिल्ली प्रोटीन लीजिए।
  4. ब्रैडफोर्ड परख का उपयोग करके प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण करें।

Biotinylated सतह प्रोटीन का 6. अलगाव

  1. एक 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में 50 μL स्ट्रेप्टिविन चुंबकीय मोती जोड़ें।
  2. एक चुंबकीय स्टैंड में ट्यूब रखें, ट्यूब के किनारे मोतियों को एकत्रित करना। निकालें और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  3. ट्यूब के 1000 μL, टीबीएस में 0.1%, टवीन -20 जोड़ें। धीरे से मिक्स करें और मोती को चुंबकीय स्टैन के साथ जमा करेंघ। निकालें और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  4. धोने वाले चुंबकीय मोती के साथ 1 ग्राम पीबीएस में 300 μL के लिए पतला बायोटिनिलाटेड सेल की सतह प्रोटीन के 40 ग्राम को मिलाएं। आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए सेते हैं।
  5. एक चुंबकीय स्टैंड से मोती लीजिए, सतह पर तैरनेवाला को निकालने और त्याग दें।
  6. ट्यूब के 300 μL, ट्यूब में 0.1% टिन -20 जोड़ें, धीरे से मोतियों को फिर से निलंबित करने के लिए मिश्रण। माला लीजिए, निकालें और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। इस वॉश चरण को दो बार दोहराएं।
  7. 0.1 एम ग्लाइसीन पीएच 2.0 के 100 μL को चुंबकीय मोतियों तक जोड़ें और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं। माला लीजिए और सतह पर तैरनेवाला युक्त बायोटिनिलाटेड सतह प्रोटीन को हटा दें।
  8. 4-20% Tris-MOPS एसडीएस-पेज जेल पर पृथक सतह प्रोटीन का विज़ुअल करें।

7. बायोटिनिलाटेड सतह प्रोटीन का आकलन

  1. डॉट ब्लाट
    1. नाइट्रोकेल्यूलोज़ झिल्ली के एक 7 सेमी x 3 सेमी की पट्टी काटें।
    2. 10 μg कुल टिक GU लागू करेंटी सामग्री (ऊपर 1.8 से), और 10 माइक्रोग्राम बायोटिनिलाटेड सतह प्रोटीन झिल्ली तक। कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सुखाने की अनुमति दें
    3. अवरोधक बफर के 100 एमएल में एक कंटेनर और डुबकी में स्थानांतरण करें। एक घंटे के लिए आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर सेते हैं। बफर अवरुद्ध करना छोड़ें
    4. आंदोलन के साथ 100 μL पीबीएस, 0.05% ट्विन -20 में 5 मिनट के लिए नाइट्रॉसेल्यूलोज झिल्ली को धोएं। धोने के बफर को त्यागें और तीन बार धोएं।
    5. 100 μL पीबीएस में 1/5000 स्ट्रेप्टिविडिन-हॉर्सडाश पेरोक्साइड (एचआरपी) में सेते हैं, 0.05% ट्विल -20 के लिए 2 घंटे के साथ कमरे के तापमान पर आंदोलन और किसी भी शेष समाधान को त्याग दें।
    6. आंदोलन के साथ 5 मिनट के लिए पीबीएस के 100 μL, 0.05% ट्विन -20 में नाइट्रोसेल्यूलोज़ झिल्ली को धोएं। वॉश बफर त्यागें और तीन बार धो लें।
    7. पता लगाने के लिए, 4-क्लोरो-1-नेपथोल के 1 मिलीलीटर को 10 मिलीलीटर बर्फ ठंड मेथनॉल में भंग कर देना चाहिए। 4 एमएल ऑफ़ मेथनॉल स्टॉक को 20 एमएल ऑफ टीबीएस में जोड़ें। ताजा 30% हाइड्रोजन पेरोक्साइड और इमेमिडिया के 10 μL जोड़ेंनाइट्रो सेल्यूलोज झिल्ली पर लागू होते हैं
    8. जब तक सब्सट्रेट एक अघुलनशील नीले अंत उत्पाद का उत्पादन नहीं करता तब तक कमरे के तापमान पर आंदोलन से सेते हैं। यह 2-15 मिनट के बीच ले सकता है
    9. पता लगाने का समाधान त्यागें और झिल्ली को तीन बार 100 μL एमक्यूएच 2 ओ में धो लें।
  2. एलिसा परख
    1. प्रत्येक नमूने के 200 एनजी को 400 एमएल का 100 एमएम कार्बोनेट कोटिंग बफर और एलिसा प्लेट (फ्लैट तल कुएं) की पहली पंक्ति (ए #) के कोट 2 लेन के साथ पतला करें
    2. 100 एमएम कार्बोनेट कोटिंग बफर के 100 μL को अन्य सभी संबंधित कुओं को पंक्तियों (बीएच) में जोड़ें।
    3. पंक्ति में हर अच्छी तरह से 100 μL pipetting द्वारा प्रत्येक नमूने के धारावाहिक dilutions तैयार करें, और पंक्ति में स्थानांतरित बी बी pipetting द्वारा धीरे से मिश्रण और बुलबुले उत्पादन से बचें। हर पंक्ति में हर अच्छी तरह से अंतिम 100 μL को हटाना, प्रत्येक पंक्ति में dilutions दोहराएं।
    4. प्लेटफिल्म के साथ प्लेट को कवर करें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर सेवन करें।
    5. प्लेट को धो लेंई 200 μL पीबीएस, 0.05% बीच -20 प्रति अच्छी तरह से तीन बार।
    6. 200 μL अवरुद्ध बफर को लेपित कुओं में जोड़ें, पैराफिल्म के साथ कवर करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात में भरें।
    7. अवरुद्ध बफर में 1 / 15,000 स्ट्रेप्टिविडिन-एचआरपी को पतला करें और प्लेट के प्रत्येक कुएं में 100 μL जोड़ें। Parafilm के साथ कवर और 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर सेते हैं।
    8. 200 μL पीबीएस में प्लेट धो लें, 0.05% ट्विन -20 प्रति पांच बार अच्छी तरह से करें।
    9. पता लगाने के लिए, 100 एमएल प्रति टीएमबी अभिकर्मक प्रति अच्छी तरह से जोड़ें। पर्याप्त रंग के विकास के बाद, आमतौर पर 10-15 मिनट के बीच, प्रतिक्रिया को रोकने के लिए 1 एम फॉस्फोरिक एसिड के 100 μL जोड़ें।
    10. Λ = 450 एनएम पर प्रत्येक अच्छी तरह से शोषक पढ़ें।

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Representative Results

चित्रा 1 में प्रस्तुत योजनाबद्ध के अनुसार उपकला कोशिकाओं को आर। माइक्रोप्रलस के पेट ऊतकों से पृथक किया गया था। इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर तैयार टिक आंत उपकला कोशिकाओं का प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी इमेजरी चित्र 2 ए में दिखाया गया है और 2 बी चूंकि सेल अलगाव अर्ध-स्फूर्त आर माइक्रोप्रलस पर किया जाता है, कोशिकाओं को एकवचन, गोलाकार, चिकनी सतह आकारिकी और नमूने भर में एक सुसंगत आकार के रूप में दिखाई देता है। आकार और प्रकार के आंत सेल आबादी में अंतर, अधिक स्पष्ट रूप से एक बार टिकट पूर्ण होने वाली वयस्कों बनने के लिए निकलता है।

डीएपीआई के साथ पृथक उपकला कोशिकाओं के नाभिक के फ्लोरोसेंट धुंधला कोशिकाओं को कल्पना करने में सहायता करता है। अपरिवर्तनीय पृथक्करण में अपरिवर्तनीय अवस्थाओं को शामिल करने के लिए गरीब अलगाव की कल्पना की गई हैअलग-अलग सेल आकार और आकारिकी ( चित्रा 2 सी और 2 डी ) के माध्यम से अलग-अलग सेल आबादी वाली एलीअल कोशिकाओं

इस प्रोटोकॉल का उपयोग, 50 टिक गट विच्छेदन से लगभग 1.2 x 10 7 सेल प्रति / एमएल, 75-80% व्यवहार्यता के साथ आर। माइक्रोप्रलस टिक आंत से सफलतापूर्वक पृथक किया गया था। मेजबान प्रोटीन ( चित्रा 3 ए ) से क्रॉस-संदूषण कम से कम किया जा सकता है, जब तक कि उनके पास एक सफेद उपस्थिति न हो, जब तक कि एक सफेद / स्पष्ट पेर्क्ल ग्रेडिएंट ( चित्रा 3 बी )।

सतह-बाध्य प्रोटीन सतह-बाध्य प्रोटीन के बायोटिनिलेशन के माध्यम से अलग थे, सेलुलर झिल्ली का विनाश और चुंबकीय स्ट्रेप्टिविडिन मोती वाले बायोटिनिलाटेड सतह प्रोटीन की शुद्धि। कुल 20-24 माइक्रोग्राम शुद्ध बायोटिन्नीलेपित सतह प्रोटीन को डाउन-स्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए पृथक किया जा सकता है, जो कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए 50x टिक की शुरुआती विच्छेदन से है। एसडीएस पृष्ठ ( चित्रा 4 ए ), रजत का दाग ( चित्रा 4 बी ), डॉट ब्लाट ( चित्रा 5 ) और एलिसा ( चित्रा 6 ) द्वारा प्रोटीन की तुलना इंगित करता है कि वर्णित कार्यप्रणाली आर। माइक्रोप्रल टिक से पृथक उपकला कोशिकाओं से बायोटिनिलाटेड सतह प्रोटीन को सफलतापूर्वक शुद्ध करती है आंत।

आकृति 1
चित्रा 1 : आर microplus midgut कोशिकाओं की सतह में मौजूद बायोटिनिलेटेड प्रोटीन को अलग करने के लिए योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व कृपया सीएलइस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2 : डीएपीआई के साथ दाग़ आर। माइक्रोप्रलस मिडगुत उपकला कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी दृश्य (100x) सॉफ्टवेयर प्रतिदीप्ति ओवरले आयोजित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। ए एंड बी) आर। माइक्रोप्र्लस मिडगट से सफलतापूर्वक पृथक उपकला कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करें। सी / डी) एपिथेलियल कोशिकाओं को आर। माइक्रोप्र्लस पेट से अलग किया जाता है जो बड़े टिक ऊतकों से दूषित होता है।

चित्र तीन
चित्रा 3 : डीएमईएम वाले पेर्सोल ढाल: 20% पर्सोल: 40% पर्सोल। एपिथेलियल सेल परतें डीएमईएम के बीच बनाई गईं: 20% पीएरोक्ल और 20: 40% पेरोल ( ) पर्याप्त वॉश चरण के बिना टिक आंत विच्छेदन। ( बी ) पर्याप्त वॉश चरण के साथ टिक आंत विच्छेदन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4 : बायोटिनिलाटेड सतह प्रोटीन के इलेक्ट्रोफोरेटिक पृथक्करण का इस्तेमाल 4-20% ट्राइस-मोप्स जेल पर किया जाता है, जिसका उपयोग 140 मिलीग्राम 55 मिनट पर किया जाता है जिसमें 10 मिलीग्राम का उपयोग किया जाता है। (एल) पेजरुलर प्रोस्टेन सीढ़ी (1) अनिलबेल आर। माइक्रोप्र्लस पूरे पेट नमूना (2) आर बायोटीनिलेटेड प्रोटीन चरण 6 के अनुसार आर। माइक्रोप्र्लस पूरे पेट से निकाला गया (3) अनबैबल्ड आर माइक्रोप्रलस पेट से निकाले गए उपकला कोशिकाओं से प्रोटीन (4 ) आर माइक्रोप्र्लस से निकाले गए बायोटिनेलाटेड प्रोटीनचरण 6 के अनुसार उपकला कोशिकाओं। ( ) कॉमसी ब्लू ( बी ) रजत का दाग द्वारा दाग़ एसडीएस पेज।

चित्रा 5
चित्रा 5 : डॉट ब्लोट विश्लेषण। स्ट्रेप्टिविडिन-एचआरपी संयुग्मित पतला 1/5000 ( ) कुल 10 माइक्रोग्राम कच्चे टिक आंत प्रोटीन निकालने ( बी ) बायोटिनिलाटेड सतह प्रोटीन जिसे शुद्ध उपकला कोशिकाओं (10 माइक्रोग्राम) से निकाला गया।

चित्रा 6
चित्रा 6 : एलिसा का उपयोग बायोटिनिलाटेड सतह प्रोटीन व्यवहार्यता का आकलन स्ट्रिप-एचआरपी संयुग्मित एंटीबॉडी द्वारा बायोटिनिलेटेड टिक के अलग-अलग सांद्रता के खिलाफ 1 / 15,000 पतला सतह प्रोटीन की एलिसाके पेट प्रोटीन (0.7 एनजी से 100 एनजी तक)। अनलेबेटेड टिक गोट प्रोटीन और गोजातीय सीरम एल्बूमिन (बीएसए) को एलिसा के नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

मवेशी टिक के उल्लंघन ने विश्व के उष्णकटिबंधीय और उपोष्णकटिबंधीय क्षेत्रों में पशु उद्योग के लिए एक बड़ी समस्या का गठन किया है, जो कि Acaricides 1 , 4 के उपयोग पर नियंत्रण के सबसे आम तरीका है। बीएम 86 को पहले बीएम 86 भौगोलिक अनुक्रम भिन्नता और नियमित रूप से बढ़ाने के लिए 4 की आवश्यकता के कारण एक टीका रणनीति के रूप में सीमित सफलता के साथ, आर। माइक्रोप्र्लस इन्फेक्शन 10 के खिलाफ सुरक्षात्मक प्रतिजन के रूप में टिक आंत उपकला सतह के भीतर पहचाना गया था।

पिछला प्रकाशन उपकला अलगाव के तरीकों पर ध्यान केंद्रित मुख्य रूप से कशेरुकी या कीड़े 9 , 11 , 12 , 13 , 14 प्रजातियों पर केंद्रित थे। उदाहरण के लिए, मिडगूट को अलग करने का प्रारंभिक विभाजनस्तनधारी तकनीकों का उपयोग करते हुए, यह पाया गया कि विभिन्न कोशिका संरचना और संगठनों की वजह से इसी पद्धति कीड़े को लागू नहीं किया जा सका 12 । इसके अलावा, स्तनधारी तकनीक कोशिका सेल जंक्शन प्रोटीन 9 , 13 को एंजाइमेटिक रूप से पचाने के लिए या तो डीपेस या कोलेजनेश के उपयोग पर निर्भर करती है। डिपेस और कोलेजनज़ कोशिका की सतह से बने प्रोटीन को काफी प्रभावित करते हैं, और इसलिए उनके उपयोग पर निर्भर तकनीक सेल-सतह प्रोटीन अध्ययन 15 के लिए उपयुक्त नहीं हैं। कीट midgut सेल अलगाव वर्तमान में दो तकनीकों पर ध्यान केंद्रित। पहली बार अल्ट्रासाउंड के माध्यम से मिडगुट के यांत्रिक विघटन का इस्तेमाल करता है, जिसके बाद एक निरंतर रैखिक सुक्रोज ग्रेडियंट 8 , 11 , 12 , 14 पर अलग हो जाता है । यह मैकेनिकल तकनीक एक नमूनों का उत्पादन करती है जो कि लगभग दूषित पदार्थों के बारे में स्पष्ट होते हैंवाइर माइक्रोवाइलार्ममेब्रन की कम उपज 14 उत्पन्न करता है दूसरी तकनीक, तंत्रिका के विघटन पर निर्भर करता है जो कि माइक्रोवेल्लर झिल्ली 8 रिलीज करता है।

इस पेपर के भीतर वर्णित तकनीक उपकला कोशिकाओं के अलगाव, सतह प्रोटीनों के बायोटिनिलेशन और उनके अलगाव 16 की अनुमति देता है, जो मास स्पेक्ट्रोमेट्री या एफएसीएस जैसे डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के माध्यम से और अध्ययन की अनुमति देता है। यहां वर्णित विधि चेलेटिंग एजेंट ईडीटीए और कम करने वाले एजेंट टीसीईपी का इस्तेमाल करते हैं। ईडीटीए कार्य कैल्शियम आयनों को अलग करने, अवरुद्ध कैडरिन, कैडरिन मध्यस्थता वाले सेल-सेल जंक्शनों को तोड़ते हैं, जबकि टीसीईपी डिल्साइड बांड को कम कर देता है जो कि ग्लाइकिन-अमीर बलगम जैसे पेरिट्रोफिक मैट्रिक्स की चिपचिपाहट प्रदान करता है जो एपिथेलियम से पेट ल्यूमन को अलग करता है। ऊतक के यांत्रिक विघटन के बाद उपकला को मिलाते हुए बरामद किया जाता है, इसके बाद घंटों में असंतत ढाल केन्द्रापसारकवाई सेंट्रीफ्यूगेशन ग्रेडियेंट उपकला कोशिकाओं को डीएमईएम के बीच अलग किया जाता है: 20% घनत्व केन्द्रापसारक ढाल, और 20%: 40% घनत्व केन्द्रापसारक ढाल परतें।

उपकला कोशिका के पृथक्करण के दौरान उच्च तापमान का उपयोग करने से पेट के ऊतकों को अलग होने से अलग हो जाता है, जिससे उपकला कोशिकाओं को अलग करने में विफलता होती है। यह सुनिश्चित करना कि उपकला कोशिका विस्थापन तुरंत विकृत विच्छेद के बाद किया जाता है; बर्फ के ठंडे बफ़र्स का उपयोग और उच्च केंद्रित गति की परिस्थिति जीवित व्यवहार्य कोशिकाओं को बनाए रखने में महत्वपूर्ण है। इसके बावजूद, बेसल लैमीना से बड़े कोशिकाओं का विलोपन कुछ संदूषण प्रदान कर सकता है। इसके अलावा, टिक के मिडगुट एपिथेलियम नाटकीय रूप से पिछले रक्त के भोजन 18 , 1 9 , 20 से समय पर निर्भर करता है।

जैसे, इस प्रोटोकॉल को आर माइक्रोप्रलस पर डिज़ाइन और एक्सेस किया गया है चित्रा 1 ) एक समान प्रकृति के हैं।

अंत में, इस अध्ययन में उपयोग किए गए तरीकों को आर। माइक्रोप्रलस की पूरी आंत से एपिथेलियल कोशिकाओं को सफलतापूर्वक अलग किया गया। आर। माइक्रोप्रलस उपकला कोशिकाओं की सतह से प्रोटीन आगे के विश्लेषण और अध्ययन के लिए प्राप्त किए गए थे। अंत में, विकसित प्रोटोकॉल ने टिक गट से उपकला कोशिकाओं की संभावित उपज और सेल की बायोटिनिलाटेड सतह प्रोटीन की दक्षता का प्रदर्शन किया है। विकसित प्रोटोकॉल का उपयोग किसी भी टिकटिक प्रजातियों में आर्थिक महत्व के लिए किया जा सकता है, जांच करने के प्रयास में: झिल्ली प्रोटीन कॉम का अध्ययन करके होस्ट इंटरैक्शनपेट की स्थिति

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgements

लेखकों वीडियो फिल्माने के साथ सहायता के लिए Rhipicephalus microplus के प्रावधान इस अध्ययन के लिए उपयोग किया ticks के लिए Biosecurity टिक कॉलोनी (कृषि एवं मत्स्य पालन, क्वींसलैंड विभाग ऑस्ट्रेलिया) का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, और लुकास Karbanowicz।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4% Trypan Blue ThermoFisher Scientific 15250061
1.5 mL microcentrifuge tube Eppendorf 3322
100mM Carbonate Buffer 3.03 g Na2CO3, 6.0 g NaHCO3 1000 ml distilled water pH 9.6
16 mL centrifuge tubes with sealing cap Thermo Scientific 3138-0016 Cool in ice prior to gradient
250 µM cell strainer Thermo Fisher 87791
3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA Sigma T0440 Stored at 4C
30% Hydrogen Peroxide Labscene BSPA5.500
4-20% Tris-MOPS Gel Gen Script M42015
4-Chloro-1-naphthol tablet Sigma-Aldrich C6788
50 mL Falcon Tube Corning Blue 30 x 115mm style. Polyproplyene conical tube.
70 µM cell strainer BD Falcon 352350
AP15 filter paper Millipore AO1504200
Biotin (Type A) Conjugation Kit Abcam Ab102865
Dissection microscope Olympus SZX7
DP Manager  Olympus 2.2.1.195 Cell imagery software
Duct Tape Home Handyman 48mm x 25mm Duct Tape
Dulbecco’s Modified Eagle Medium Gibco 11995-065 DMEM - ice cold for protocol
EDTA Amresco 0105-500G
F96 Maxisorp Immuno Plate Nunc 439454
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich 12003C FCS
Fluorescence microscope   Olympus  BX51
Fluoroshield with DAPI Sigma-Aldrich F6057-20ML DAPI
Forceps Dumont #9 Dumont - Switerzland
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 Glycerol for molecular biology >99%
Glycine Sigma-Aldrich 410225
Hand-Held Counter Officeworks JA0376230
Hank’s Balanced Salt Solution Sigma Life Sciences H9394 HBSS – ice cold for protocol
Hemacytometer Optik Lakor - -
L-Glutathione oxidized Sigma-Aldrich G4376
Magnetic Separation Stand Novagen - 4-Tube Magnetic Separation Rack
Methanol Sigma-Aldrich 179337
Milli-Q Water Millipore ZRXQ003WW Integral Water Purification System for Ultrapure Water
Nitrocellulose Membrane Life Sciences 66485 30cm x 3M pure nitrocellulose membrane
PageRuler Prestained protein Ladder Thermo-Fisher SM0671
PBS 1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4.0 g NaCl (500 ml distilled water) pH 7.4
Percoll Sigma-Aldrich P1644-500ML
Peristaltic Pump Masterflex 7518-10
Phosphoric Acid Sigma-Aldrich P6560
Pierce Protein-Free T20 PBS Blocking Buffer Thermo-Scientific 37573 Stored at 4C. Blocking Buffer
Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich P8215-5ML PIC – stored at -20 °C
Quick Start Bradford Dye Reagent 1x Biorad 500-0205 For Bradford Assay
Quick Start BSA Standards Biorad 500-0207 BSA standards for Bradford Assay
Scalpel Lab. Co Size 11 Scalpel
SilverQuest TM Staining Kit Invitrogen LC6070
Simply Blue TM Safe Stain  Invitrogen LC6060
Sorvall C6+ Ultracentrifuge Thermo Scientific 46910
Streptavidin (HRP) Abcam AB7403
Streptavidin Magnetic Beads New England Biolabs S1420S
Super Glue - Ultra Fast Mini UHU UHU Super Glue 1mg. Ultra Fast mini
Table-top Centrifuge Eppendorf 22331
TCEP Thermo Fisher 20490
Triton X-100 Biorad 161-0407
Tween-20 Sigma P2287-500ML
Vortex Mixer Ratek VM1
Water Bath Grant GD100

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References

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