Biotinylated 세포 표면 단백질의 정제

Published 7/23/2017
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Biochemistry

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Summary

Rhipicephalus microplus gut tissue로부터 상피 세포를 분리하기 위해 modified density centrifugation gradient-based 방법을 사용 하였다. 표면 결합 단백질은 스트리타비딘 자성 비드를 통해 바이오 티 닐화되고 정제되어 하류 적용에서 이용되었다.

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Karbanowicz, T. P., Lew-Tabor, A., Rodriguez Valle, M. Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells. J. Vis. Exp. (125), e55747, doi:10.3791/55747 (2017).

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Abstract

Rhipicephalus microplus - 가축 진드기는 여러 병원균의 벡터 인 가축에 대한 경제적 영향 측면에서 가장 중요한 외부 기생충입니다. 진드기 장 상피 세포의 표면에 위치한 BM86과 같은 백신 후보 물질의 발견에 초점을 맞추어 유해한 영향을 줄이기위한 가축 진드기 관리에 전념했다. 현재 연구는 cDNA 및 게놈 라이브러리의 활용에 초점을 맞추고 다른 백신 후보 물질을 스크리닝합니다. 진드기 배아 세포의 분리는 진드기 배트 세포막에서 표면 단백질의 조성을 조사하는데 중요한 이점을 구성한다. 이 논문은 semi-engorged R. microplus 의 진드기 장 내용물로부터 상피 세포를 분리하기위한 새롭고 실현 가능한 방법을 구성한다 . 이 프로토콜은 TCEP와 EDTA를 사용하여 상피 세포를 상피 세포지지 조직과 불연속 밀도 원심 분리 그라데이션에서 분리합니다다른 세포 유형에서 상피 세포를 분리하는 것. FACS 또는 LC-MS / MS 분석에서 다운 스트림 응용 프로그램을 허용 streptavidin - 링크 마그네틱 비즈를 사용하여 세포 표면 단백질은 biotinylated 및 진드기 상피 세포에서 분리되었습니다.

Introduction

Rhipicephalus microplus 는 가축 진드기 (babineiosis), 아나 플라스마 증 및 말 피토 플라스마 증 1 , 2 , 3 , 4를 매개로하여 열대 및 아열대 지역의 소 산업에 대한 경제적 영향 측면에서 가장 중요한 외부 기생충이다. 화학 살비제의 사용과 같은 기존의 방법은 우유 및 육류의 화학적 잔류 물의 존재와 화학적 내성 진드기의 유행 증가와 같은 암시 적 단점을 가지고 있지만 해로운 진드기를 통제하기위한 노력이 해로운 영향을 줄이기 위해 노력해왔다 5 , 6 , 7 . 결과적으로, 자연 저항성 소, 생물학적 방제 (biopesticides) 및 백신의 사용과 같은 진드기 제어의 대안적인 방법의 개발이 연구되어왔다ines 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 .

백신 후보 물질로 활용 될 수있는 단백질을 추구함에있어 현재의 연구는 진드기 장에 초점을 맞추고있다. 중추의 벽은 얇은 기저 층 (basal lamina) 위에 놓여있는 단일 층의 상피 세포로부터 만들어지며, 기저 층의 바깥 쪽은 근육 네트워크를 형성합니다. 빛과 전자 현미경 관측에 따르면 중뇌는 예비 세포 (미분화), 분비 세포, 소화 세포의 3 가지 유형으로 구성되어 있습니다. 세포 유형의 수는 생리 학적 단계에 따라 상당히 다양합니다. 분비 세포와 소화 세포는 모두 예비 세포 18 , 19 , 20 에서 유래합니다.

cDNA 라이브러리의 구축진드기의 구성을 조사하여 장내 백신 후보 물질 2 , 3 , 4 로 Bm86과 같은 항원 단백질을 밝혀 냈습니다. 당 단백질 Bm86은 진드기 배아 세포 표면에 국한되어 백신 접종 된 소의 가축 진드기 ( R. microplus )에 대한 방어 면역 반응을 유도한다. 면역화 된 숙주에 의해 생성 된 항 -Bm86 IgG는 진드기에 의해 섭취되고, 진드기 장 세포의 표면에서이 항원을 인식하고,이어서 진드기 장 조직의 기능 및 완전성을 방해한다. Bm86 항원 기초 백신 횟수, 체중 및 후속 틱 4 세대 감소 유충 감염의 결과를 engorging 여성의 생식 능력을 감소시킴으로써, R.의 microplusRhipicephalus annulatus의 효과적인 제어를 보여준다. 그러나 Bm86 계 백신은 모든 진드기 단계에 효과적이지 않으며R.의 microplus의 일부 지리적 균주에 대한 불만족스러운 효과를 보여, 결과적으로 쇠고기와 낙농 산업은 가난, (4)이 백신 2를 채택했다.

진드기로부터 상피 세포를 분리하는 능력은 상이한 환경 조건 하에서 형태 및 생리를 포함한 단백질 막 조성을 결정하기위한 연구의 진행을 가능하게하는 중요한 혁신이다. 여기에 설명 된 방법은 킬레이트 화제 인 ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)와 환원제 트리스 (2- 카르복시 에틸) 포스 핀 (TCEP)을 사용하여 상피를 상피지지 조직 10 에서 방출합니다. 상피는 동요에 의한 조직의 기계적 파괴 후 Percoll에서의 불연속 그라디언트 원심 분리에 의해 회복된다. 이 논문은 진드기 창자의 분리를위한 실현 가능하고 참신한 기술을 설명한다.세포. 이러한 상피 세포의 표면에서 분리 된 Biotinylated 세포 표면 단백질은 FACS 및 / 또는 LC-MS / MS 분석과 같은 다운 스트림 응용 프로그램에서이어서 분석 할 수 있습니다.

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Protocol

1. R. microplus 의 Gut Epithelium 해부

  1. 실험 당일에 가축에서 반 엔 다당류 진드기를 수집합니다. 호스트에서 제거한 후 24 시간 이내에 진드기를 해부합니다.
  2. 92mm x 16mm 페트리 접시 바닥에 덕트 테이프를 붙입니다. 슈퍼 접착제 한 방울을 테이프에 추가하십시오. 진드기, 복부면을 슈퍼 접착제 위에 놓고 2 분 동안 건조시킵니다.
  3. 페트리 접시에 인산염 완충 식염수 (PBS) 100 ML을 부어, 또는 진드기가 완전히 잠길 때까지.
  4. 크기 11의 메스를 사용하여 눈의 꼭대기에서 진드기의 양쪽에있는 하단 꽃줄로 잘라냅니다.
  5. 살균 포셉을 사용하여 scutumalloscutum을 완전히 제거하여 내부 장기를 노출시킵니다.
  6. 오염을 방지하기 위해 미세한 흰색 실 모양의 기관 (기관) 및 기타 막을 제거하십시오.
  7. 포셉을 사용하여 위 부분을 집어 넣고시체. 다른 조직이 해부되지 않도록 나머지 조직을 제거하십시오.
  8. 염화칼슘과 단백 분해 효소 칵테일 (PIC)이 포함 된 마그네슘 설페이트가없는 얼음처럼 차가운 Hank 's Balanced Salt Solution (HBSS)에 보관하십시오. 드라이 아이스로 용기를 고정시키고 -20 ° C에서 보관하십시오.
    참고 : 장 절제술 및 진드기 내부 장기의 세부 사항을 지원하기는 D 소넨샤인, 19 "진드기의 생물학 '의 3.1 장을 참조하십시오.

2. 상피 세포 해리

  1. 50 ML 튜브 내부 70 μm의 셀 스트레이너에 해부 직감을 부어.
  2. 용액이 깨끗해질 때까지 PIC가있는 50 mL의 차가운 HBSS로 창자 조직을 씻어 낸다. 그러면 내장은 흰색 / 깨끗한 모양을 취한다.
  3. PIC와 30 ML 얼음 추위 HBSS의 용기를 다시 일시 중지하고 부드럽게 혼합하고 4 X에서 500 XG 10 분 원심 분리 용기를 펠렛. 뜨는 물을 제거하고 세 번 반복 세척 과정.
  4. 250 μm 셀 스트레이너를 통해 현탁액을 여과하고, 흐름을 통과시키고 70 μm 셀 스트레이너를 통해 여과하여 남아있는 흐름을 수집합니다.
  5. 단일 세포를 펠렛으로 20 분 동안 4 ° C에서 500 XG에서 현탁액을 원심 분리하십시오.

밀도 원심 분리 구배를 이용한 단일 상피 세포의 분리

  1. AP15 사전 여과지를 통해 여과하여 밀도 원심 분리 구배 ( 예 : Percoll)를 준비하십시오. mqH 2 0 (v / v)에 40 % 및 20 % Percoll을 준비하고 그라디언트를 쌓기 전에 4 ° C에서 1 시간 동안 냉각하십시오.
  2. 연동 운동 사용펌프를 최저 속도로 놓고, 16 mL 초 원심 분리 관에 40 % 밀도 원심 분리 그라디언트 3 mL를 놓고 얼음에 15 분 동안 침전되도록합니다. 펌프의 속도는 분당 1mL 미만의 유속으로 이어집니다.
  3. 45 ° 각도로 튜브를 기울이면 연동 펌프를 사용하여 40 % 층 상단에 20 % 밀도 원심 분리 그라데이션을 겹쳐 놓습니다. 펌프의 속도는 분당 1 mL 이하로 유지되어야합니다. 레이어가 얼음에 15 분 동안 정착 수 있습니다.
  4. 연동 펌프를 분당 1mL 미만의 유속으로 사용하여 20-40 % 밀도 원심 분리 그라데이션에 진드기 직감 세포가 들어있는 DMEM 배지 3 mL를 섞으십시오.
  5. 최대 가속과 최소 감속을 위해 원심 분리기를 프로그래밍하십시오. 10 분 동안 600 XG에서 원심 분리하십시오. DMEM : 20 % 밀도 원심 분리 그라데이션과 20 % : 40 % 밀도 원심 분리 그라데이션 사이의 중간 단계를 수집하여 상피 단일 세포를 분리합니다. 이후의 분석을 위해 수집 된 interphases를 4 ° C에 보관하십시오.

4. 세포 분리의 평가

  1. 혈색소
    1. 알코올로 혈구 미터 슬라이드를 청소하십시오.
    2. 세포를 위아래로 부드럽게 pipetting하여 세포를 다시 정지시킵니다. 1.5 ML microcentrifuge 튜브에 세포 현탁액과 장소의 피펫 100 μL.
    3. 0.4 % Trypan Blue 400 μL를 첨가하십시오. 부드럽게 튜브를 flicking하여 섞는다.
    4. 천천히 hemocytometer의 두 챔버를 채우기 위해 Trypan 블루 - 처리 세포 현탁액 100 μL를 피펫.
    5. hemocytometer를 10X 객관적으로 hemocytometer의 그리드 라인에 초점을 맞추고 가벼운 현미경 아래에 놓습니다.
    6. 휴대용 집계 카운터를 사용하여 16 개의 사각형 집합 내의 살아 있지 않은 셀을 계산합니다. 같은 광장 안에서 파란색 죽은 세포를 세어보세요. 16 세트의 4 세트가 계산 될 때까지 계속 계산하십시오.
    7. 다음 공식을 사용하여 mL 당 총 세포를 계산하십시오 :
      47eq1.jpg "/>
    8. 다음 공식을 사용하여 세포 생존률 백분율을 계산하십시오.
      등식 2
  2. 세포 격리 시각화
    1. 1.5 ML microcentrifuge 튜브에 HBSS 9 μL에 고립 된 세포의 1 μL를 희석. 미세 원심 분리 관을 천천히 섞어서 섞으십시오.
    2. 유리 슬라이드의 중간에 HBSS에 고립 된 세포 5 μL 피펫. 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)와 함께 3 방울의 마운팅 매질을 적용하십시오.
    3. 5 분 동안 실온에서 슬라이드를 품어. 조심스럽게 공기 방울을 피하면서 준비 위에 커버 슬립을 놓습니다.
    4. DAPI로 염색 된 세포를 형광 현미경 하에서 360 nm 여기시키고 460 nm에서 방출하는 것으로 시각화하십시오.

5. 세포 표면 단백질 Biotinylation

  1. Biotin (유형 A) 접합을 사용하여 단일 세포 상피 세포 100 μL를 Biotinylate키트를 제조사의 지시에 따라 1 : 1 표면 단백질 대 접합체의 몰비
  2. 세포 용해를 위해 PBS, 1 % 트리톤 X - 100, 10 % 글리세롤, 100 μm의 산화 glutathione 및 PIC의 100 μL를 biotinylated 세포에 추가합니다. 10 분마다 부드럽게 혼합하면서 얼음에 1 시간 동안 품어 낸다.
  3. 불용성 물질을 펠렛에 20 분 동안 4 ° C에서 20,000 XG에서 biotinylated 세포를 원심 분리기. 세포질 및 biotinylated 막 단백질을 포함하는 뜨는을 수집합니다.
  4. Bradford 분석법을 사용하여 단백질 농도를 결정하십시오.

6. Biotinylated 표면 단백질의 분리

  1. 1.5 ML microcentrifuge 튜브에 Streptavidin 자기 구슬 50 μL를 추가합니다.
  2. 튜브를 마그네틱 스탠드에 넣고 튜브 측면에 비드를 수집합니다. 뜨는 부분을 버리고 버린다.
  3. 1000 μL의 TBS, 0.1 % Tween-20을 튜브에 첨가하십시오. 부드럽게 혼합하고 자석 스탠드로 비즈를 수집하십시오.디. 뜨는 부분을 버리고 버린다.
  4. 씻은 자기 구슬과 1x PBS에서 300 μL로 희석 biotinylated 세포 표면 단백질 40 μg을 결합하십시오. 교반과 함께 상온에서 2 시간 동안 품어 낸다.
  5. 자성 스탠드로 구슬을 수집하고, 뜨는을 제거하고 버립니다.
  6. 튜브에 TBS, 0.1 % Tween-20 300 μL를 가하고 가볍게 혼합하여 구슬을 다시 정지시킵니다. 구슬을 모으고 상징액을 버리고 버린다. 이 세척 단계를 두 번 반복하십시오.
  7. 자성 구슬에 0.1 M 글리신 산도 2.0의 100 μL를 추가하고 실온에서 5 분 품어. 구슬을 수집하고 elotated biotinylated 표면 단백질을 포함하는 뜨는을 제거하십시오.
  8. 4 ~ 20 % Tris-MOPS SDS-PAGE 젤에서 분리 된 표면 단백질을 시각화합니다.

7. Biotinylated 표면 단백질의 평가

  1. 점 얼룩
    1. 니트로 셀룰로스 멤브레인의 7cm x 3cm 스트립을 자릅니다.
    2. 10 μg 총 진드기 적용t 내용물 (위의 1.8에서)과 10 μg의 biotinylated 표면 단백질을 막으로 옮긴다. 실온에서 15 분간 건조시킨다.
    3. 용기에 옮기고 100 mL의 블로킹 완충액에 담근다. 1 시간 동안 교반하면서 실온에서 배양하십시오. 블로킹 버퍼를 버립니다.
    4. 교반과 함께 5 분 동안 100 μL PBS, 0.05 % 트윈 -20에 nitrocellulose 막을 씻으십시오. 세척 완충액을 버리고 세 번 세척을 반복하십시오.
    5. 실온에서 교반하면서 2 시간 동안 100μL PBS, 0.05 % Tween-20에서 1/5000 Streptavidin-horseradish 과산화 효소 (HRP)를 배양하고 남아있는 용액을 버린다.
    6. 교반하에 5 분 동안 PBS, 0.05 % Tween-20 100 μL에서 니트로 셀룰로스 멤브레인을 씻으십시오. 세척 완충액을 버리고 세 번 반복합니다.
    7. 검출을 위해 4- 클로로 -1- 나프톨 1 정을 얼음 냉 메탄올 10 mL에 녹인다. TBS 20 mL에 메탄올 스톡 4 mL를 넣는다. 신선한 30 % 과산화수소 및 immedia 10 μL를 추가하십시오니트로 셀룰로스 멤브레인에 적 용하십시오.
    8. 기질이 불용성 청색 최종 생성물을 생성 할 때까지 실온에서 교반하면서 인큐베이션한다. 이것은 2-15 분 사이에 걸릴 수 있습니다.
    9. 검출 용액을 버리고 100 μL mqH 2 O에서 멤브레인을 3 번 씻으십시오.
  2. ELISA 분석법
    1. 100 mM 탄산염 코팅 완충액 400 μL로 각 시료 200 ng을 희석하고 ELISA 플레이트 (평평한 바닥 판)의 첫 번째 행 (A #)의 2 차선을 코팅하십시오.
    2. 행 (BH)에있는 모든 다른 해당 우물에 100 MM 탄산염 코팅 버퍼의 100 μL를 추가합니다.
    3. 행 A의 각 우물에서 100 μL를 pipetting하여 행 B로 전송하여 각 샘플의 연속 dilutions을 준비 pipetting하여 부드럽게 혼합하고 거품을 피하십시오. 행 H에있는 각 우물에서 최종 100 μL를 버리고, 각 행 아래로 희석액을 반복합니다.
    4. parafilm와 접시를 덮고 4 ° C에서 밤새 품어.
    5. 외판을 닦으십시오.PBS 200 μL, 0.05 % Tween-20 / 웰 당 3 회.
    6. 코팅 된 우물에 차단 버퍼 200 μL를 추가하고, Parafilm으로 덮고 4 ° C에서 밤새 품을 수 있습니다.
    7. 1 / 15,000 Streptavidin-HRP를 블로킹 완충액으로 희석하고 플레이트의 각 웰에 100 μL를 첨가한다. parafilm으로 덮고 4 ° C 밤새 인큐베이션하십시오.
    8. 플레이트를 200 μL PBS, 0.05 % Tween-20에서 5 번 씻으십시오.
    9. 감지하려면 우물 당 TMB 시약 100 μL를 추가하십시오. 충분한 색 발색 후, 보통 10-15 분 사이에 반응을 멈추기 위해 1 M 인산 100 μL를 첨가한다.
    10. λ = 450nm에서 각 웰의 흡광도를 읽으십시오.

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Representative Results

상피 세포는 R. microplus 의 장 조직으로부터 그림 1에 제시된 도식에 따라 분리되었다. 이 프로토콜을 사용하여 준비된 진드기 배 상피 세포의 대표적인 형광 현미경 이미지를 도 2A에 나타내었다 2B. 세포 격리가 semi-engorged R. microplus에서 수행됨에 따라 세포는 표본 전체에 단수 롭고 구형이며 매끄러운 표면 형태와 일정한 크기로 나타납니다. 소화관 세포 집단의 크기와 유형의 차이는 진드기가 완전히 충혈 된 성인으로 진행되면 더욱 분명해진다.

DAPI로 분리 된 상피 세포의 핵을 형광으로 염색하면 세포를 시각화 할 수 있습니다. 불량한 분리가 epith의 불완전한 해리를 포함하도록 시각화됩니다.변화하는 세포 크기 및 형태 ( 도 2C2D )를 통해 확인 된 다양한 세포 집단을 갖는 상피 세포

75-80% 생존이 프로토콜, 50 틱 장 해부에서 당 약 1.2 × 10 7 세포 / mL로, 활용하는 것은 성공적 R. microplus 틱 장에서 분리 하였다. 숙주 단백질 ( 그림 3A )의 교차 오염은 흰색 / 투명 Percoll 그라디언트를 초래하는 백색 외관을 가질 때까지 진드기 배를 적절히 씻어 냄으로써 최소화 할 수 있습니다 ( 도 3B ).

표면 결합 단백질은 표면 결합 단백질의 바이오틴 화, 세포막의 파괴 및 자성 스트렙 타비 딘 비드를 이용한 비오틴 화 표면 단백질의 정제를 통해 분리되었다. 총 20-24 μg의 정제 된 생물 독소lated 표면 단백질은이 프로토콜을 사용하는 50x 째트 창자의 초기 절개로부터 다운 스트림 응용을 위해 분리 될 수 있습니다. SDS-PAGE ( 그림 4A ), Silver 얼룩 ( 그림 4B ), Dot blot ( 그림 5 ) 및 ELISA ( 그림 6 )에 의한 단백질의 비교는 기술 된 방법이 R. microplus tick으로부터 분리 된 상피 세포로부터 바이오틴 일 표면 단백질을 성공적으로 정제 함을 나타냅니다 거트.

그림 1
그림 1 : R. microplus midgut 세포 의 표면에 존재하는 비 오티 닐화 단백질을 분리하는 개략도 . 제발이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : DAPI로 염색 된 R. microplus midgut 상피 세포 의 형광 현미경 시각화 (100 배) . 소프트웨어는 형광 오버레이를 수행하는 데 사용되었습니다. A & B) R. microplus midgut으로부터 성공적으로 분리 된 상피 세포를 나타낸다. C / D) 큰 진드기 조직으로 오염 된 R. microplus 장으로부터 분리 된 상피 세포.

그림 3
그림 3 : Percoll 그라디언트 DMEM 포함 : 20 % Percoll : 40 % Percoll. 상피 세포 층은 DMEM : 20 % Percoll 및 20 : 40 % Percoll. ( A ) 적절한 세척 단계없이 창자 해부를 체크하십시오. ( B ) 적당한 세척 단계로 창자 절개를 진드기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 : biotinylated 표면 단백질의 전기 영동 분리는 샘플 10 μg를 사용하여 55 분 동안 140 V에서 4-20 % Tris-MOPS 겔에서 작동됩니다. (L) PageRuler Prestained protein ladder (1) 비 표지 된 R. microplus whole gut sample (2) R. microplus whole gut에서 추출한 Biotinylated protein (6). (3) 표지되지 않은 R. microplus gut에서 추출한 상피 세포의 단백질 ) R. microplus 에서 추출한 Biotinylated 단백질( A ) Comassie blue ( B ) Silver stain에 의해 염색 된 SDS-PAGE.

그림 5
그림 5 : 점 얼룩 분석. Streptavidin-HRP conjugated 1 / 5,000 희석. ( A ) 원료 틱 굿트 단백질 추출물 ( B )의 총 10 μg 정제 된 상피 세포 (10 μg)에서 추출한 Biotinylated 표면 단백질.

그림 6
도표 6 : ELISA를 사용하여 Biotinylated 표면 단백질 생존 능력의 평가. 표면 단백질의 ELISA는 Strep-HRP 접합 항체에 의해 1 / 15,000으로 희석 된 biotinylated tick 장 단백질 (0.7 ng 내지 100 ng). 비 표지 틱 거트 단백질과 소 혈청 알부민 (BSA)을 ELISA의 음성 대조군으로 사용 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

가축 진드기 침입은 살 처분제 1 , 4 의 사용에 의존하는 가장 보편적 인 관리 방법과 함께 전 세계의 열대 및 아열대 지역의 소 산업에서 주요한 문제를 구성합니다. Bm86은 이전에 Bm86 지리적 인 순서 변화와 규칙적인 부스팅 4에 대한 요구 사항으로 인해 백신 전략으로서의 제한된 성공으로 R. microplus의 감염 10 에 대한 방어 항원으로 진드기 장 상피 세포 내에서 확인되었다.

상피 분리 방법론에 초점을 맞춘 이전의 간행물은 주로 척추 동물 또는 곤충류 9 , 11 , 12 , 13 , 14에 집중되어있었습니다. 예를 들어, midgut을 분리하기위한 조기 분획 시도포유류의 기술을 이용하여, 동일한 방법으로 인해 다른 셀 구조 및기구 (12)에 곤충에 적용 할 수 없다는 것을 알았다. 또한, 포유류 기술은 dipase 또는 collagenase를 사용하여 효소 적으로 세포 - 세포 접합 단백질 9 , 13을 소화시킵니다. Dipase와 콜라게나 아제는 세포 표면 결합 단백질에 상당한 영향을 미치므로 사용에 의존하는 기술은 세포 표면 단백질 연구에 적합하지 않습니다 15 . Insect midgut 세포 분리는 현재 두 가지 기술에 초점을 맞추고 있습니다. 첫 번째 방법은 초음파를 통한 중추의 기계적 파괴를 이용하여 연속 선형 설탕 구배 8 , 11 , 12 , 14를 분리하는 것 입니다. 이 기계적 기술은 오염 물질이 거의없는 샘플을 생산합니다. 하우ver는 microvillarmembranes 14 의 낮은 수율을 생성합니다. 두 번째 기법은 멤브레인의 트리스 (Tris) 파열에 따라 마이크로 비늘 막을 방출합니다 8 .

이 백서에 기술 된 기술은 상피 세포의 분리, 표면 단백질의 바이오틴 화 및 이들의 분리 16 을 허용하여 질량 분석법 또는 FACS와 같은 다운 스트림 어플리케이션을 통해 추가 연구를 허용합니다. 여기에 기술 된 방법은 킬레이트 제 EDTA 및 환원제 TCEP를 이용한다. EDTA는 칼슘 이온을 차단하여 cadherin을 억제하고 cadherin 매개 세포 - 세포 접합을 파괴하는 반면 TCEP는 상피로부터 내장 내강을 분리하는 glycan이 풍부한 점액과 같은 복막 세포 매트릭스의 점도를 부여하는 이황화 결합을 감소시킵니다. 상피는 흔들어서 조직을 기계적으로 파괴 한 다음에 밀도가 불연속적인 그라디언트 원심 분리를 한 후 회수됩니다y 원심 분리기 구배. 상피 세포는 DMEM : 20 % 밀도 원심 분리 구배 및 20 % : 40 % 밀도 원심 분리 구배 층 사이에서 단리된다.

상피 세포 해리 중에 고온을 사용하면 커다란 조직이 장에서 해리되어 상피 세포를 분리하지 못하게된다. 상피 세포 해리가 즉시 수행되는지 확인하십시오. 얼음처럼 차가운 완충액을 사용하고 높은 원심 분리 속도를 피하는 것은 생존 가능한 세포를 유지하는 데 중요합니다. 그럼에도 불구하고, 기저 층에서 더 큰 세포가 탈락하면 약간의 오염이 생길 수 있습니다. 또한 진드기의 중추 상피는 마지막 혈액 식사 18 , 19 , 20 로부터의 시간에 크게 의존합니다.

이와 같이,이 프로토콜은 R. microplus 에서 설계 및 액세스되었습니다 . 그림 1 )는 균일 한 특성을 지닙니다.

결론적으로,이 연구에서 이용 된 방법은 성공적으로 R. microplus 의 전체 장에서 상피 세포를 분리 하였다. R. microplus 상피 세포 표면의 단백질을 추가 분석 및 연구를 위해 얻었다. 마지막으로, 개발 된 프로토콜은 진드기 장으로부터의 상피 세포의 잠재적 수율 및 세포의 바이오틴 화 된 표면 단백질의 효율을 입증 하였다. 개발 된 프로토콜은 진드기를 조사하기위한 노력으로 경제적 중요성을 지닌 모든 진드기 종에서 활용 될 수 있습니다. 막 단백질 com을 연구하여 숙주 상호 작용내장의 위치.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

저자들은이 연구에 활용 된 Rhipicephalus microplus ticks와 Lucas Karbanowicz가 비디오 촬영에 도움을 주도록 Biosecurity Tick Colony (Queensland Agriculture & Fisheries, Australia)에 감사 드리고자합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4% Trypan Blue ThermoFisher Scientific 15250061
1.5 mL microcentrifuge tube Eppendorf 3322
100mM Carbonate Buffer 3.03 g Na2CO3, 6.0 g NaHCO3 1000 ml distilled water pH 9.6
16 mL centrifuge tubes with sealing cap Thermo Scientific 3138-0016 Cool in ice prior to gradient
250 µM cell strainer Thermo Fisher 87791
3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA Sigma T0440 Stored at 4C
30% Hydrogen Peroxide Labscene BSPA5.500
4-20% Tris-MOPS Gel Gen Script M42015
4-Chloro-1-naphthol tablet Sigma-Aldrich C6788
50 mL Falcon Tube Corning Blue 30 x 115mm style. Polyproplyene conical tube.
70 µM cell strainer BD Falcon 352350
AP15 filter paper Millipore AO1504200
Biotin (Type A) Conjugation Kit Abcam Ab102865
Dissection microscope Olympus SZX7
DP Manager  Olympus 2.2.1.195 Cell imagery software
Duct Tape Home Handyman 48mm x 25mm Duct Tape
Dulbecco’s Modified Eagle Medium Gibco 11995-065 DMEM - ice cold for protocol
EDTA Amresco 0105-500G
F96 Maxisorp Immuno Plate Nunc 439454
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich 12003C FCS
Fluorescence microscope   Olympus  BX51
Fluoroshield with DAPI Sigma-Aldrich F6057-20ML DAPI
Forceps Dumont #9 Dumont - Switerzland
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 Glycerol for molecular biology >99%
Glycine Sigma-Aldrich 410225
Hand-Held Counter Officeworks JA0376230
Hank’s Balanced Salt Solution Sigma Life Sciences H9394 HBSS – ice cold for protocol
Hemacytometer Optik Lakor - -
L-Glutathione oxidized Sigma-Aldrich G4376
Magnetic Separation Stand Novagen - 4-Tube Magnetic Separation Rack
Methanol Sigma-Aldrich 179337
Milli-Q Water Millipore ZRXQ003WW Integral Water Purification System for Ultrapure Water
Nitrocellulose Membrane Life Sciences 66485 30cm x 3M pure nitrocellulose membrane
PageRuler Prestained protein Ladder Thermo-Fisher SM0671
PBS 1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4.0 g NaCl (500 ml distilled water) pH 7.4
Percoll Sigma-Aldrich P1644-500ML
Peristaltic Pump Masterflex 7518-10
Phosphoric Acid Sigma-Aldrich P6560
Pierce Protein-Free T20 PBS Blocking Buffer Thermo-Scientific 37573 Stored at 4C. Blocking Buffer
Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich P8215-5ML PIC – stored at -20 °C
Quick Start Bradford Dye Reagent 1x Biorad 500-0205 For Bradford Assay
Quick Start BSA Standards Biorad 500-0207 BSA standards for Bradford Assay
Scalpel Lab. Co Size 11 Scalpel
SilverQuest TM Staining Kit Invitrogen LC6070
Simply Blue TM Safe Stain  Invitrogen LC6060
Sorvall C6+ Ultracentrifuge Thermo Scientific 46910
Streptavidin (HRP) Abcam AB7403
Streptavidin Magnetic Beads New England Biolabs S1420S
Super Glue - Ultra Fast Mini UHU UHU Super Glue 1mg. Ultra Fast mini
Table-top Centrifuge Eppendorf 22331
TCEP Thermo Fisher 20490
Triton X-100 Biorad 161-0407
Tween-20 Sigma P2287-500ML
Vortex Mixer Ratek VM1
Water Bath Grant GD100

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References

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