Oprensning af biotinylerede celleoverfladeproteiner fra

Published 7/23/2017
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

En centrifugeringsgradientbaseret metode med modificeret densitet blev anvendt til at isolere epithelceller fra Rhipicephalus microplus gutvæv . Overfladebundne proteiner blev biotinyleret og oprenset gennem streptavidinmagnetiske perler til anvendelse i nedstrøms applikationer.

Cite this Article

Copy Citation

Karbanowicz, T. P., Lew-Tabor, A., Rodriguez Valle, M. Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells. J. Vis. Exp. (125), e55747, doi:10.3791/55747 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Rhipicephalus microplus - kvæget - er den mest betydningsfulde ektoparasit med hensyn til økonomisk indvirkning på husdyr som vektor af flere patogener. Der er sat en indsats på kvægkontrollen for at mindske dens skadelige virkninger, med fokus på opdagelsen af ​​vaccinekandidater, såsom BM86, der er placeret på overfladen af ​​tarmkirtleepitelcellerne. Nuværende forskning fokuserer på udnyttelsen af ​​cDNA og genomiske biblioteker til screening for andre vaccinkandidater. Isoleringen af ​​tarmkanalceller udgør en vigtig fordel ved undersøgelse af sammensætningen af ​​overfladeproteiner på tarmkirtlemembranen. Dette papir udgør en ny og gennemførlig metode til isolering af epithelceller, fra tærskelarmindholdet af semi-engorged R. microplus. Denne protokol anvender TCEP og EDTA for at frigive epithelcellerne fra subepitelialstøttevævene og en diskontinuerlig densitetscentrifugeringsgradieNt til at adskille epithelceller fra andre celletyper. Celleoverfladeproteiner blev biotinyleret og isoleret fra tick-gut-epithelcellerne ved anvendelse af streptavidin-bundet magnetiske perler, der muliggør nedstrømsapplikationer i FACS- eller LC-MS / MS-analyse.

Introduction

Rhipicephalus microplus , kvæget, er den mest betydningsfulde ektoparasit med hensyn til økonomisk indvirkning på kvægindustrien i tropiske og subtropiske regioner, da det er vektorer af kvægfiskfeber (babesiosis), anaplasmosis og equine piroplasmosis 1 , 2 , 3 , 4 . Der er gjort en indsats for kvægetekskontrol for at mindske den skadelige effekt, men konventionelle metoder som brugen af ​​kemiske acaricider har implicitte ulemper, såsom tilstedeværelsen af ​​kemiske rester i mælk og kød, og stigningen i forekomsten af ​​kemisk resistente flåter 5 , 6 , 7 . Derfor er udviklingen af ​​alternative metoder til tærskekontrol blevet undersøgt, såsom brugen af ​​naturligt resistent kvæg, biologisk kontrol (biopesticider) og vaccineInes 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 .

I udøvelsen af ​​proteiner, der kan anvendes som vaccinkandidater, er den aktuelle forskning fokuseret på tarmkanalen. Midgutvæggen er bygget af et enkelt lag epithelceller hvilende på en tynd basal lamina, hvor ydersiden af ​​basal lamina udgør et netværk af muskler. Lys- og elektronmikroskopobservation viser, at midgut består af tre typer af celler: reserve (udifferentieret), sekretorisk og fordøjelseskrævende. Antallet af celletyper varierer betydeligt afhængigt af den fysiologiske fase. Sekretoriske og fordøjelsesceller stammer begge fra reserveceller 18 , 19 , 20 .

Konstruktionen af ​​cDNA-bibliotekerAt undersøge sammensætningen af ​​tarmkanalen har ført til identifikationen af ​​antigeniske proteiner, såsom Bm86, som potentielle vaccinkandidater 2 , 3 , 4 . Glycoproteinet Bm86 er lokaliseret på overfladen af ​​tarmkanalceller og fremkalder et beskyttende immunrespons mod kvægtæppet ( R. microplus ) hos vaccineret kvæg. Anti-Bm86 IgG'er produceret af den immuniserede vært indtages af tæsken, genkender dette antigen på overfladen af ​​tarmkanalceller og forstyrrer efterfølgende tarmvævets funktion og integritet. Vacciner baseret på Bm86 antigener har vist effektiv kontrol af R. microplus og Rhipicephalus annulatus ved at reducere antallet, vægt og reproduktionskapacitet hos hunner, der resulterer i reduceret larveinfektion i efterfølgende trikgenerationer 4 . Bm86-baserede vacciner er dog ikke effektive mod alle fikseringstrin og harViste utilfredsstillende effekt over for nogle geografiske stammer af R. microplus , og derfor har oksekøds- og mejeribranchen dårligt vedtaget disse vacciner 2 , 4 .

Evnen til at isolere epithelceller fra tarmkanalen er en betydelig innovation, der vil muliggøre forskydning af forskning til bestemmelse af proteinmembran-sammensætning, herunder morfologi og fysiologi under forskellige miljømæssige forhold. Fremgangsmåden beskrevet her anvender chelateringsmidlet ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) og reduktionsmidlet tris (2-carboxyethyl) phosphin (TCEP) for at frigive epithelet fra dets subepitheliale bærevæv 10 . Epitelet genvindes efter mekanisk afbrydelse af vævene ved omrystning efterfulgt af diskontinuerlig gradientcentrifugering i Percoll. I dette papir beskrives en gennemførlig og ny teknik til isolering af tarmkirtepiThelleceller. Biotinylerede celleoverfladeproteiner, isoleret fra overfladen af ​​disse epithelceller, kan efterfølgende analyseres i downstream-applikationer, såsom FACS og / eller LC-MS / MS-analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Dissektion af Gut Epithelium fra R. microplus

  1. Saml semi-engorged flåter fra kvæg på forsøgsdagen. Dissekter fliser inden for 24 timer efter fjernelse fra værten.
  2. Anbring en strimmel af duct tape til bunden af ​​92 mm x 16 mm petriskålen. Tilføj en dråbe superlim til båndet. Sæt krydset, ventralsiden ned på superlimmen, lad det tørre i 2 minutter.
  3. Hæld 100 ml phosphatpufret saltvand (PBS) i petriskålen, eller indtil krydset er helt nedsænket.
  4. Udnyt en størrelse 11 skalpel, skåret fra toppen af ​​øjnene til bunden på begge sider af tæsken.
  5. Anvendelse af steril pincet, helt fjerne scutum og alloscutum, for at blotlægge de indre organer.
  6. Fjern de fine, hvide trådlignende organer (luftrøret) og andre membraner for at forhindre forurening.
  7. Fjern tarmen med tang, ved at klemme den øvre region og trække fraslagtekrop. Fjern eventuelle resterende tarmvæv, og sørg for, at intet andet væv er blevet dissekeret.
  8. Opbevares tarm i iskold Hank Balanced Salt Solution (HBSS) uden calciumchlorid og magnesiumsulfat med proteinaseinhibitor cocktail (PIC). Snap fryser tarmene i tøris og opbevar ved -20 ° C.
    Bemærk: For at hjælpe med darmdissektion og detaljer i de indre indre organer henvises til kapitel 3.1 af D. Sonenshine, "Biology of Ticks" 19 .

2. Epitelcelledissociation

  1. Hæld den dissekerede tarm på en 70 μm cellefil i et 50 ml rør.
  2. Skyl tarmvævet med 50 ml iskold HBSS med PIC, indtil opløsningen løber tør, og tarmene får et hvidt / klart udseende.
  3. Genopløs gutten i 30 ml iskold HBSS med PIC, bland forsigtigt og centrifuger ved 500 xg ved 4 ° C i 10 minutter for at pille tarmene. Fjern supernatanten og gentag vaskeprocessen tre gange.
  4. Filtrer suspensionen gennem en 250 μm cellefil, vortex gennemstrømningen og filtrer gennem en 70 μm cellefil, der samler den resterende gennemstrømning.
  5. Centrifug suspensionen ved 500 xg ved 4 ° C i 20 minutter for at pille de enkelte celler.

3. Isolering af enkelt epithelceller ved anvendelse af en densitetscentrifugeringsgradient

  1. Forbered tæthedscentrifugeringsgradienten ( f.eks . Percoll) ved at filtrere gennem et AP15-forfilterpapir. Forbered 40% og 20% ​​Percoll i mqH 20 (v / v) og afkølet ved 4 ° C i 1 time før lakering af gradienten.
  2. Brug af peristaltikPumpe sat til den laveste hastighed, lag 3 ml 40% densitetscentrifugeringsgradient i et 16 ml ultracentrifugerør, hvilket gør det muligt at sætte sig på is i 15 minutter. Pumpens hastighed skal føre til en <1 ml pr. Min strømningshastighed.
  3. Tiltning af røret i en 45 ° vinkel, brug den peristaltiske pumpe til at lagre 20% densitetscentrifugeringsgradienten oven på 40% lag. Pumpens hastighed skal føre til <1 ml pr. Min strømningshastighed. Lad lagene sætte sig på is i 15 minutter.
  4. Brug peristaltisk pumpe ved <1 ml pr. Min strømningshastighed til lag 3 ml DMEM-medium indeholdende tarmkanalceller over 20-40% densitetscentrifugeringsgradienten.
  5. Program centrifugen for maksimal acceleration og minimum deceleration. Centrifuge ved 600 xg i 10 minutter. Saml interfaser mellem DMEM: 20% densitetscentrifugeringsgradient og 20%: 40% densitetscentrifugeringsgradienter for at isolere epitelceller. Opbevar indsamlede interfaser ved 4 ° C til efterfølgende analyser.

4. Vurdering af celleisolering

  1. hæmacytometer
    1. Rengør hæmacytometerskinnen med alkohol.
    2. .Re-suspendere cellerne ved forsigtigt at pipettere cellerne op og ned. Pipetter 100 μl af cellesuspensionen og anbring i et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
    3. Tilsæt 400 μl 0,4% Trypan Blue. Bland forsigtigt ved at flippe røret.
    4. Pipetter 100 μL af den Trypan Blue-behandlede celle suspension til langsomt at fylde begge kamre af hæmocytometeret.
    5. Placer hæmocytometeret under et lysmikroskop med fokus på gridlinierne i hæmocytometeret med et 10X objektiv.
    6. Tæl de levende ufarvede celler i et sæt på 16 kvadrater ved hjælp af en håndholdt taltæller. Tæl de blå døde celler inden for samme firkant. Fortsæt med at tælle, indtil fire sæt med 16 kvadrater tælles.
    7. Beregn de totale celler pr. Ml ved anvendelse af formlen:
      47eq1.jpg "/>
    8. Beregn procentdelens levedygtighed ved at bruge formlen:
      Ligning 2
  2. Cellisolere visualisering
    1. Fortynd 1 μl af de isolerede celler i 9 μl HBSS i et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Smør mikrocentrifugerøret forsigtigt for at blande.
    2. Pipetter 5 μl isolerede celler i HBSS ind i midten af ​​en glasskinne. Påfør tre dråber monteringsmedium med 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI).
    3. Inkuber glideren ved stuetemperatur i 5 minutter. Anbring forsigtigt et dækslip over præparatet, undgå luftbobler.
    4. Visualisere celler farvet med DAPI ved excitation 360 nm og emission ved 460 nm under et fluorescerende mikroskop.

5. Cell Surface Protein Biotinylation

  1. Biotinylat 100 μl enkeltcellede epithelceller under anvendelse af Biotin (Type A) -konjugeringKit, ved et molforhold på 1: 1 overfladeprotein til konjugat, ifølge producentens anvisninger
  2. Til cellelyse tilsættes 100 μl PBS, 1% Triton X-100, 10% glycerol, 100 μM oxideret glutathion og PIC til de biotinylerede celler. Inkubér på is i 1 time med forsigtig blanding hver 10 min.
  3. Centrifug de biotinylerede celler ved 20.000 xg ved 4 ° C i 20 min til pellet uopløseligt materiale. Saml supernatanten indeholdende cytoplasmatiske og biotinylerede membranproteiner.
  4. Bestem proteinkoncentrationen ved brug af Bradford-analysen.

6. Isolering af biotinylerede overfladeproteiner

  1. Tilsæt 50 μL streptavidinmagnetiske perler i et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
  2. Placer røret i et magnetisk stativ, og saml perlerne mod røret. Fjern og kassér supernatanten.
  3. Tilsæt 1000 μL TBS, 0,1% Tween-20 til røret. Bland forsigtigt og saml perlerne med magnetisk stand. Fjern og kassér supernatanten.
  4. Kombiner 40 μg biotinylerede celleoverfladeproteiner, fortyndet til 300 μl i 1x PBS med vaskede magnetiske perler. Inkubér i 2 timer ved stuetemperatur under omrøring.
  5. Saml perlerne med en magnetisk stativ, fjern og kassér supernatanten.
  6. Tilsæt 300 μl TBS, 0,1% Tween-20 til røret, bland forsigtigt for at suspendere perlerne igen. Saml perler, fjern og kassér supernatanten. Gentag dette vaske trin to gange.
  7. Tilsæt 100 μL af 0,1 M glycin pH 2,0 til de magnetiske perler og inkuber ved stuetemperatur i 5 minutter. Saml perler og fjern supernatant indeholdende eluerede biotinylerede overfladeproteiner.
  8. Visualiser isolerede overfladeproteiner på en 4-20% Tris-MOPS SDS-PAGE gel.

7. Vurdering af biotinyleret overfladeprotein

  1. Dot Blot
    1. Skær en 7 cm x 3 cm strimmel nitrocellulosemembran.
    2. Påfør 10 μg total tick guT indhold (fra 1,8 ovenfor) og 10 μg biotinyleret overfladeprotein til membranen. Tillad tørring i 15 minutter ved stuetemperatur.
    3. Overfør til en beholder og nedsænk i 100 ml blokeringsbuffer. Inkuber ved stuetemperatur under omrøring i en time. Kassér blokeringsbuffer.
    4. Vask nitrocellulosemembran i 100 μl PBS, 0,05% Tween-20 i 5 minutter med omrøring. Kassér vaskebuffer og gentag vaskene tre gange.
    5. Inkuber i 1/5000 Streptavidin-peberrodsperoxidase (HRP) i 100 μl PBS, 0,05% Tween-20 i 2 timer med omrøring ved stuetemperatur og kassér eventuel resterende opløsning.
    6. Vask nitrocellulosemembran i 100 μl PBS, 0,05% Tween-20 i 5 minutter med omrøring. Kassér vaskebuffer og gentag vasken tre gange.
    7. Til påvisning opløses 1 tablet 4-chlor-1-naphthol i 10 ml iskold methanol. Tilsæt 4 ml methanolbestand til 20 ml TBS. Tilsæt 10 μL frisk 30% hydrogenperoxid og immediaGælder for nitrocellulosemembranen.
    8. Inkuber med omrøring ved stuetemperatur, indtil substrat producerer et uopløseligt blåt slutprodukt. Dette kan tage mellem 2-15 minutter.
    9. Kassér påvisning opløsning og vaskes membranen tre gange i 100 pi MQH 2 O.
  2. ELISA-analyse
    1. Fortynd 200 ng af hver prøve med 400 μl 100 mM carbonatbelægningsbuffer og coat 2 baner i den første række (A #) af ELISA-pladen (fladbundede brønde)
    2. Tilsæt 100 μl 100 mM carbonatbelægningsbuffer til alle andre tilsvarende brønde i rækker (BH).
    3. Forbered serielle fortyndinger af hver prøve ved at pipettere 100 μl fra hver brønd i række A og overføre til række B. Bland forsigtigt ved pipettering og undgå at producere bobler. Gentag fortyndingerne ned i hver række, og kassér den endelige 100 μL fra hver brønd i række H.
    4. Dæk pladen med parafilm og inkuber ved 4 ° C natten over.
    5. Vask pladenE med 200 μl PBS, 0,05% Tween-20 pr. Brønd tre gange.
    6. Tilsæt 200 μL blokeringsbuffer til de coatede brønde, dække med Parafilm og inkuber ved 4 ° C natten over.
    7. Fortynd 1 / 15.000 Streptavidin-HRP i blokeringsbuffer og tilsæt 100 μL til hver brønd på pladen. Dæk med parafilm og inkuber ved 4 ° C natten over.
    8. Vask pladen i 200 μl PBS, 0,05% Tween-20 pr. Brønd fem gange.
    9. For at detektere tilsættes 100 μL TMB-reagens pr. Brønd. Efter tilstrækkelig farveudvikling, sædvanligvis mellem 10-15 minutter, tilsættes 100 μL 1 M phosphorsyre for at stoppe reaktionen.
    10. Læs absorbansen af ​​hver brønd ved A = 450 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Epitelceller blev isoleret fra tarmvævene af R. microplus ifølge det skematiske fremlagt i figur 1 . Repræsentativ fluorescensmikroskopi billeddannelse af tarmkirtepitelceller fremstillet ved anvendelse af denne protokol er vist i figur 2A Og 2B. Da celleisoleringen udføres på semi-engorged R. microplus, forekommer celler som enformet, sfærisk, glat overflademorfologi og en ensartet størrelse i hele prøven. Forskelle i størrelsen og typen af ​​tarmcellepopulationer er mere tydelige, når tæppet fortsætter med at blive fuldt engorged voksne.

Fluorescerende farvning af kernen i isolerede epithelceller med DAPI hjælper til at visualisere cellerne. Dårlig isolationer visualiseres for at indeholde ufuldstændig dissociation af epithElialceller med varierende cellepopulationer identificeret gennem de forskellige cellestørrelser og morfologier ( figur 2C og 2D )

Ved anvendelse af denne protokol isolerede ca. 1,2 x 10 7 celle pr. Ml fra 50 tarmdisektioner med 75-80% levedygtighed succesfuldt fra R. microplus tick tarm. Krydsforurening fra værtsproteiner ( figur 3A ) kan minimeres ved tilstrækkelig skylning af tærskegods, indtil de har et hvidt udseende, der resulterer i en hvid / klar Percoll-gradient ( Figur 3B ).

Overfladebundne proteiner blev isoleret gennem biotinylering af overfladebundne proteiner, destruktion af cellulære membraner og oprensning af biotinylerede overfladeproteiner med magnetiske streptavidinperler. I alt 20-24 μg renset biotinLedede overfladeproteiner kan isoleres til downstream-applikationer fra en initial dissektion af 50x tærskegods under anvendelse af denne protokol. Sammenligning af proteiner med SDS-PAGE ( figur 4A ), sølvfarvning ( figur 4B ), dot blot ( figur 5 ) og ELISA ( figur 6 ) indikerer, at den beskrevne metode effektivt renset biotinylerede overfladeproteiner fra epithelceller isoleret fra R. microplus tick tarm.

figur 1
Figur 1 : Skematisk repræsentation til isolering af biotinylerede proteiner, der er til stede i overfladen af R. microplus midgutceller. Venligst clIck her for at se en større version af denne figur.

Figur 2
Figur 2 : Fluorescensmikroskop visualisering (100x) af R. microplus midgut epitelceller farvet med DAPI. Softwaren blev brugt til at udføre fluorescensoverlejringen. A & B) Repræsentere epithelceller med succes isoleret fra R. microplus midgut. C / D) Epitelceller isoleret fra R. microplus gut forurenet med større tykvæv.

Figur 3
Figur 3 : Percollgradient indeholdende DMEM: 20% Percoll: 40% Percoll. Epithelcellelagene blev dannet mellem DMEM: 20% PErcoll og 20: 40% Percoll. ( A ) Tjek gut dissektion uden passende vask trin. ( B ) Afkryds gutdissektion med tilstrækkeligt vaskestrin. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4
Figur 4 : Elektroforetiske separationer af biotinylerede overfladeproteiner kører på 4-20% Tris-MOPS-gel ved 140 V i 55 minutter med 10 μg prøve udnyttet. (L) PageRuler Præfarvede protein stige (1) Ikke-mærket R. microplus hele gut prøve (2) Biotinylerede proteiner ekstraheret fra R. microplus hele tarmen ifølge trin 6. (3) Proteiner fra epitelceller ekstraheret fra umærket R. microplus gut (4 ) Biotinylerede proteiner ekstraheret fra R. microplusEpithelceller som i trin 6. ( A ) SDS-PAGE farvet med Comassie blue ( B ) Silver stain.

Figur 5
Figur 5 : Dot blot analyse. Streptavidin-HRP konjugeret fortyndet 1/5000. ( A ) I alt 10 μg rå krydsegentproteinekstrakt ( B ) Biotinylerede overfladeproteiner ekstraheret fra rensede epithelceller (10 μg).

Figur 6
Figur 6 : Vurdering af biotinyleret overfladeprotein-levedygtighed ved anvendelse af ELISA. ELISA af overfladeproteiner blev udviklet af Strep-HRP konjugeret antistof fortyndet 1 / 15.000 mod forskellige koncentrationer af biotinyleret ticK-gutproteiner (fra 0,7 ng til 100 ng). Ikke-mærkede krydsegentproteiner og bovint serumalbumin (BSA) blev anvendt som negativ kontrol af ELISA. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kvægbekæmpelse udgør et stort problem for kvægindustrien i tropiske og subtropiske regioner i verden med den mest almindelige kontrolmetode afhængig af anvendelsen af ​​acaricider 1 , 4 . Bm86 blev tidligere identificeret inden for epiteloverfladen af ​​tarmkirtlen som et beskyttende antigen mod R. microplus infestation 10 med begrænset succes som en vaccinestrategi på grund af Bm86 geografisk sekvensvariation og kravet om regelmæssig boosting 4 .

Tidligere publikationer med fokus på epithelialisoleringsmetoder var primært fokuseret på hvirveldyr eller insekter, species 9 , 11 , 12 , 13 , 14 . For eksempel forsøger tidlig fraktionering at isolere midgutVed anvendelse af pattedyrsteknikker fandt man, at den samme metode ikke kunne anvendes på insekter på grund af den forskellige cellestruktur og organisationer 12 . Endvidere afhænger pattedyrsteknikker på anvendelsen af ​​enten dipase eller collagenase til enzymatisk at fordøje cellecelleforbindelsesproteinerne 9 , 13 . Dipase og collagenase påvirker signifikant celleoverfladebundne proteiner, og derfor er teknikker, der er afhængige af deres anvendelse, ikke egnede til celleoverfladeproteinstudier 15 . Insekt midgutcelleisolationer fokuserer for øjeblikket på to teknikker. Den første bruger mekanisk forstyrrelse af midgut gennem ultralyd efterfulgt af separation over en kontinuert lineær sucrose gradient 8 , 11 , 12 , 14 . Denne mekaniske teknik frembringer en prøve, der næsten er fri for forurenende stofferVer producerer et lavt udbytte af mikrovillarmembraner 14 . Den anden teknik er afhængig af Tris-afbrydelse af membraner for at frigive mikrovillar membraner 8 .

Teknikken beskrevet i dette papir muliggør isolering af epithelceller, biotinylering af overfladeproteiner og deres isolering 16 , hvilket muliggør yderligere undersøgelser gennem nedstrøms applikationer såsom massespektrometri eller FACS. Fremgangsmåden beskrevet her anvender chelateringsmiddelet EDTA og reduktionsmiddelet TCEP. EDTA funktioner til at sekvestrere calciumioner, inhibere cadheriner, bryde cadherin-medierede celle-celleforbindelser, medens TCEP reducerer disulfidbindingerne, som giver viskositet af den glykanrige mucuslignende peritrofe matrix, som adskiller tarmens lumen fra epitelet. Epitelet genvindes efter mekanisk afbrydelse af vævene ved omrystning efterfulgt af diskontinuerlig gradientcentrifugering i densittenY centrifugeringsgradient. Epitelceller isoleres mellem DMEM: 20% densitetscentrifugeringsgradienten og 20%: centrifugeringsgradientlag med 40% densitet.

Anvendelse af en højere temperatur under epithelcelledissociation vil forårsage, at store væv adskilles fra tarmen, hvilket fører til manglende isolation af epithelceller. Sikring af, at epitelcelledissociation udføres straks efter krydsdissektion; Udnyttelsen af ​​iskalde buffere og undgåelse af høje centrifugeringshastigheder er afgørende for at holde levende levedygtige celler tilbage. På trods af dette kan fjernelsen af ​​større celler fra basal lamina give en vis forurening. Endvidere ændrer tarmens midgutepitel sig dramatisk afhængigt af tiden fra det sidste blodmel 18 , 19 , 20 .

Som sådan er denne protokol designet og fået adgang til R. microplus Figur 1 ) ensartede.

Som konklusion anvendte metoderne i denne undersøgelse succesfuldt isolerede epithelceller fra hele tarmene af R. microplus . Proteiner fra overfladen af R. microplus epitelceller blev opnået til yderligere analyse og undersøgelser. Endelig har den udviklede protokol vist det potentielle udbytte af epitelceller fra tarmkanalen og effektiviteten af ​​biotinylerede overfladeproteiner i cellen. Den udviklede protokol kan anvendes i enhver krydsart af økonomisk betydning i et forsøg på at undersøge kryds: værtsinteraktioner ved at studere membranprotein comTarmens placering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgements

Forfatterne ønsker at takke Biosecurity Tick Colony (Queensland Department of Agriculture & Fisheries, Australien) til levering af Rhipicephalus microplus ticks anvendt til dette studie, og Lucas Karbanowicz til hjælp med videooptagelse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4% Trypan Blue ThermoFisher Scientific 15250061
1.5 mL microcentrifuge tube Eppendorf 3322
100mM Carbonate Buffer 3.03 g Na2CO3, 6.0 g NaHCO3 1000 ml distilled water pH 9.6
16 mL centrifuge tubes with sealing cap Thermo Scientific 3138-0016 Cool in ice prior to gradient
250 µM cell strainer Thermo Fisher 87791
3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA Sigma T0440 Stored at 4C
30% Hydrogen Peroxide Labscene BSPA5.500
4-20% Tris-MOPS Gel Gen Script M42015
4-Chloro-1-naphthol tablet Sigma-Aldrich C6788
50 mL Falcon Tube Corning Blue 30 x 115mm style. Polyproplyene conical tube.
70 µM cell strainer BD Falcon 352350
AP15 filter paper Millipore AO1504200
Biotin (Type A) Conjugation Kit Abcam Ab102865
Dissection microscope Olympus SZX7
DP Manager  Olympus 2.2.1.195 Cell imagery software
Duct Tape Home Handyman 48mm x 25mm Duct Tape
Dulbecco’s Modified Eagle Medium Gibco 11995-065 DMEM - ice cold for protocol
EDTA Amresco 0105-500G
F96 Maxisorp Immuno Plate Nunc 439454
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich 12003C FCS
Fluorescence microscope   Olympus  BX51
Fluoroshield with DAPI Sigma-Aldrich F6057-20ML DAPI
Forceps Dumont #9 Dumont - Switerzland
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 Glycerol for molecular biology >99%
Glycine Sigma-Aldrich 410225
Hand-Held Counter Officeworks JA0376230
Hank’s Balanced Salt Solution Sigma Life Sciences H9394 HBSS – ice cold for protocol
Hemacytometer Optik Lakor - -
L-Glutathione oxidized Sigma-Aldrich G4376
Magnetic Separation Stand Novagen - 4-Tube Magnetic Separation Rack
Methanol Sigma-Aldrich 179337
Milli-Q Water Millipore ZRXQ003WW Integral Water Purification System for Ultrapure Water
Nitrocellulose Membrane Life Sciences 66485 30cm x 3M pure nitrocellulose membrane
PageRuler Prestained protein Ladder Thermo-Fisher SM0671
PBS 1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4.0 g NaCl (500 ml distilled water) pH 7.4
Percoll Sigma-Aldrich P1644-500ML
Peristaltic Pump Masterflex 7518-10
Phosphoric Acid Sigma-Aldrich P6560
Pierce Protein-Free T20 PBS Blocking Buffer Thermo-Scientific 37573 Stored at 4C. Blocking Buffer
Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich P8215-5ML PIC – stored at -20 °C
Quick Start Bradford Dye Reagent 1x Biorad 500-0205 For Bradford Assay
Quick Start BSA Standards Biorad 500-0207 BSA standards for Bradford Assay
Scalpel Lab. Co Size 11 Scalpel
SilverQuest TM Staining Kit Invitrogen LC6070
Simply Blue TM Safe Stain  Invitrogen LC6060
Sorvall C6+ Ultracentrifuge Thermo Scientific 46910
Streptavidin (HRP) Abcam AB7403
Streptavidin Magnetic Beads New England Biolabs S1420S
Super Glue - Ultra Fast Mini UHU UHU Super Glue 1mg. Ultra Fast mini
Table-top Centrifuge Eppendorf 22331
TCEP Thermo Fisher 20490
Triton X-100 Biorad 161-0407
Tween-20 Sigma P2287-500ML
Vortex Mixer Ratek VM1
Water Bath Grant GD100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rodriguez-Valle, M., et al. Efficacy of Rhipicephalus (Boophilus) microplus Bm86 against Hyalomma dromedarii and Amblyomma cajennense tick infestations in camels and cattle. Vaccine. 30, 3453-3458 (2012).
  2. De Rose, R., et al. Bm86 antigen induces a protective immune-response against Boophilus microplus following DNA and protein vaccination in sheep. Vet. Immunol. Immunopathol. 71, 151-160 (1999).
  3. García-García, J. C., et al. Sequence variations in the Boophilus microplus Bm86 locus and implications for immunoprotection in cattle vaccinated with this antigen. Exp. Appl. Acarol. 23, 883-895 (1999).
  4. Abbas, R. Z., Zaman, M. A., Colwell, D. D., Gilleard, J., Iqbal, Z. Acaricide resistance in cattle ticks and approaches to its management: The state of play. Vet. Parasitol. 203, 6-20 (2014).
  5. Kearney, S. Acaricide (chemical) resistance in cattle ticks. AgNote No. K58. (2013).
  6. Foil, L. D., et al. Factors that influence the prevalence of acaricide resistance and tick-borne diseases. Vet. Parasitol. 125, 163-181 (2004).
  7. Rodriguez, M., et al. High level expression of the B. microplus Bm86 antigen in the yeast Pichia pastoris forming highly immunogenic particles for cattle. J Biotechnol. 33, 135-146 (1994).
  8. Rodriguez, M., et al. Effect of vaccination with a recombinant Bm86 antigen preparation on natural infestations of Boophilus microplus in grazing dairy and beef pure and cross-bred cattle in Brazil. Vaccine. 13, (18), 1804-1808 (1995).
  9. Lew-Tabor, A. E., Rodriguez Valle, M. A review of reverse vaccinology approaches for the development of vaccines against ticks and tick borne diseases. Ticks Tick Borne Dis. 7, 573-585 (2016).
  10. Capella, A. N., Terra, W. R., Ribeiro, A. F., Ferreira, C. Cytoskeleton removal and characterization of the microvillar membranes isolated from two midgut regions of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera). Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 793-801 (1997).
  11. Cioffi, M., Wolfersberger, M. G. Isolation of separate apical, lateral and basal plasma membrane from cells of an insect epithelium. A procedure based on tissue organization and ultrastructure. Tissue Cell. 15, 781-803 (1983).
  12. Koefoed, B. M. A simple mechanical method to isolate the basal lamina of insect midgut epithelial cells. Tissue Cell. 17, 763-768 (1985).
  13. Roche, J. K. Isolation of a purified epithelial cell population from human colon. Methods Mol. Med. 50, 15-20 (2001).
  14. Terra, W. R., Costa, R. H., Ferreira, C. Plasma membranes from insect midgut cells. An. Acad. Bras. Ciênc. 78, 255-269 (2006).
  15. Vargas, A. E., Markoski, M. M., Cañedo, A. D., Helena, F., Nardi, N. B. Identification, isolation and culture of intestinal epithelial stem cells from murine intestine. Stem Cells. 879, 479-490 (2012).
  16. Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).
  17. Karhemo, P. R., et al. An optimized isolation of biotinylated cell surface proteins reveals novel players in cancer metastasis. J. Proteomics. 77, 87-100 (2012).
  18. Obenchain, F. R., Galun, R. Physiology of Ticks. Current Themes in Tropical Science Volume 1. Pergamon Press. 201-205 (1982).
  19. Sonenshine, D., Roe, R. Chapter 3.1. "Biology of Ticks". 1, Two, Oxford University Press. (2014).
  20. Raikhel, A. S., Balashov, Y. S. "An Atlas of Ixodid Tick Ultrastructure" (English Translation). Entomology Society of America Entomological Society of America. (1983).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats