Reinigung von biotinylierten Zelloberflächenproteinen aus

Published 7/23/2017
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Biochemistry

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Summary

Eine modifizierte Dichte-Zentrifugations-Gradienten-basierte Methodik wurde verwendet, um Epithelzellen aus Rhipicephalus microplus- Darmgewebe zu isolieren. Oberflächengebundene Proteine ​​wurden biotinyliert und durch Streptavidin-Magnetperlen zur Verwendung in nachgeschalteten Anwendungen gereinigt.

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Karbanowicz, T. P., Lew-Tabor, A., Rodriguez Valle, M. Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells. J. Vis. Exp. (125), e55747, doi:10.3791/55747 (2017).

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Abstract

Rhipicephalus microplus - die Rindertick - ist der bedeutendste Ektoparasit in Bezug auf die ökonomischen Auswirkungen auf Viehbestand als Vektor von mehreren Krankheitserregern. Bemühungen wurden der Vieh-Tick-Kontrolle gewidmet, um ihre schädlichen Wirkungen zu verringern, wobei der Fokus auf die Entdeckung von Impfstoffkandidaten wie BM86, die sich auf der Oberfläche der Tick-Darm-Epithelzellen befinden, Die aktuelle Forschung konzentriert sich auf die Nutzung von cDNA und genomischen Bibliotheken, um für andere Impfstoffkandidaten zu screenen. Die Isolierung von Tick-Darmzellen stellt einen wichtigen Vorteil bei der Untersuchung der Zusammensetzung von Oberflächenproteinen auf der Tick-Darm-Zellmembran dar. Dieses Papier stellt eine neuartige und machbare Methode für die Isolierung von Epithelzellen dar, von den Tick-Darm-Inhalten von halb engorgestem R. microplus . Dieses Protokoll nutzt TCEP und EDTA, um die Epithelzellen aus dem subepithelialen Stützgewebe und einem diskontinuierlichen Dichtezentrifugationsgradie freizusetzenNt, um Epithelzellen aus anderen Zelltypen zu trennen. Zelloberflächenproteine ​​wurden biotinyliert und aus den Tick-Darm-Epithelzellen isoliert, wobei Streptavidin-verknüpfte magnetische Perlen verwendet wurden, die nachgeschaltete Anwendungen in FACS- oder LC-MS / MS-Analyse erlaubten.

Introduction

Rhipicephalus microplus , die Viehzuttel, ist der bedeutendste Ektoparasit in Bezug auf die ökonomische Auswirkung auf die Viehwirtschaft der tropischen und subtropischen Regionen, da sie Rinder-Tick-Fieber (Babesiose), Anaplasmose und pferdeartige Piroplasmose 1 , 2 , 3 , 4 . Es wurden Anstrengungen zur Rindertickkontrolle unternommen, um die schädliche Wirkung zu verringern, aber herkömmliche Verfahren wie die Verwendung von chemischen Akariziden haben implizite Nachteile, wie das Vorhandensein von chemischen Rückständen in Milch und Fleisch und die Zunahme der Prävalenz von chemisch resistenten Zecken 5 , 6 , 7 Folglich wurde die Entwicklung alternativer Methoden der Zeckenkontrolle untersucht, wie die Verwendung von natürlichen Resistenzvieh, biologische Kontrolle (Biopestizide) und VaccInes 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 .

Bei der Verfolgung von Proteinen, die als Impfstoffkandidaten verwendet werden können, konzentriert sich die aktuelle Forschung auf den Tick Darm. Die Mittelgutwand ist aus einer einzigen Schicht von Epithelzellen aufgebaut, die auf einer dünnen Basallamelle ruht, wobei die Außenseite der Basallamina ein Netz von Muskeln bildet. Licht- und Elektronenmikroskop Beobachtungen zeigen, dass die Midgut besteht aus drei Arten von Zellen: Reserve (undifferenziert), sekretorischen und Verdauung. Die Anzahl der Zelltypen variiert in Abhängigkeit von der physiologischen Phase erheblich. Sekretorische und Verdauungszellen stammen beide aus Reservezellen 18 , 19 , 20 .

Der Aufbau von cDNA-BibliothekenUm die Zusammensetzung des Zeckendarms zu untersuchen, hat zur Identifizierung von antigenen Proteinen wie Bm86 als potentielle Impfstoffkandidaten 2 , 3 , 4 geführt . Das Glykoprotein Bm86 ist an der Oberfläche der Tick-Darmzellen lokalisiert und induziert eine schützende Immunantwort gegen die Rindertick ( R. microplus ) bei geimpften Rindern. Anti-Bm86-IgGs, die durch den immunisierten Wirt produziert werden, werden von der Zecke eingenommen, erkennen dieses Antigen auf der Oberfläche von Tick-Darmzellen und stören anschließend die Tick-Darm-Gewebefunktion und die Integrität. Impfstoffe basieren auf Bm86 Antigene wirksame Kontrolle von R. micro und Rhipicephalus annulatus, in einem reduzierten Larvenbefall durch die Verringerung der Zahl, Gewicht und Fortpflanzungsfähigkeit von Verschlingen Weibchen, was 4 in nachfolgenden Generationen tick gezeigt. Allerdings sind Bm86-basierte Impfstoffe nicht wirksam gegen alle Tick-Stufen und habenZeigte eine unbefriedigende Wirksamkeit gegen einige geographische Stämme von R. microplus , folglich haben die Rindfleisch- und Milchindustrie diese Impfstoffe schlecht angenommen 2 , 4 .

Die Fähigkeit, Epithelzellen aus dem Tick-Darm zu isolieren, ist eine signifikante Innovation, die es ermöglicht, die Projektion der Forschung zu bestimmen, um die Proteinmembranzusammensetzung einschließlich Morphologie und Physiologie unter verschiedenen Umgebungsbedingungen zu bestimmen. Das hier beschriebene Verfahren verwendet den Chelatbildner Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und das Reduktionsmittel Tris (2-carboxyethyl) phosphin (TCEP), um das Epithel aus seinen subepithelialen Trägergeweben 10 freizusetzen. Das Epithel wird nach mechanischer Zerstörung der Gewebe durch Schütteln gewonnen, gefolgt von einer diskontinuierlichen Gradientenzentrifugation in Percoll. Dieses Papier beschreibt eine machbare und neuartige Technik für die Isolierung von Tick Darm epiThelialen Zellen Biotinylierte Zelloberflächenproteine, die von der Oberfläche dieser Epithelzellen isoliert wurden, können anschließend in nachgeschalteten Anwendungen wie FACS und / oder LC-MS / MS-Analyse analysiert werden.

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Protocol

1. Dissektion des Darm-Epithels aus R. microplus

  1. Sammeln Sie am Tag des Experiments halb engagierte Zecken aus Rindern. Dissect-Ticks innerhalb von 24 Stunden nach dem Entfernen vom Wirt.
  2. Kleben Sie einen Streifen Klebeband auf den Boden der 92 mm x 16 mm Petrischale. Füge dem Tape einen Tropfen Superleim hinzu. Legen Sie die Zecke, ventral Seite nach unten auf den Super-Leim, lassen Sie für 2 min trocknen.
  3. 100 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in die Petrischale geben oder bis die Zecke vollständig eingetaucht ist.
  4. Unter Verwendung einer Skala der Größe 11, schneiden Sie von der Oberseite der Augen zu den unteren Girlanden, auf beiden Seiten der Zecke.
  5. Mit sterilen Pinzetten, entfernen Sie vollständig das Scutum und alloscutum , um die inneren Organe freizulegen.
  6. Entfernen Sie die feinen weißen fadenähnlichen Organe (Trachea) und andere Membranen, um eine Kontamination zu vermeiden.
  7. Den Darm mit einer Pinzette entfernen, indem man den oberen Bereich einklemmt und aus demKarkasse. Entfernen Sie alle verbleibenden Darmgewebe, um sicherzustellen, dass keine anderen Gewebe seziert wurden.
  8. Dose in eiskalter Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) ohne Calciumchlorid und Magnesiumsulfat mit Proteinase-Inhibitor Cocktail (PIC) aufbewahren. Schnappen Sie den Eingeweide in Trockeneis ein und lag bei -20 ° C auf.
    Anmerkung: Zur Unterstützung der Darmdissektion und Details der tick inneren Organe siehe Kapitel 3.1 von D. Sonenshine, "Biologie der Zecken" 19 .

2. Epithelzelldissoziation

  1. Gießen Sie den sezierten Darm auf einen 70 μm Zellsieb in einem 50 mL Röhrchen.
  2. Spülen Sie das Darmgewebe mit 50 mL eiskaltem HBSS mit PIC, bis die Lösung klar läuft und die Eingeweide ein weißes / klares Aussehen annehmen.
  3. Den Magen in 30 mL eiskaltem HBSS mit PIC suspendieren, vorsichtig mischen und bei 500 ° C bei 4 ° C für 10 min zentrifugieren, um den Darm zu pellet Entfernen Sie den Überstand und wiederholen Sie den Waschvorgang dreimal.
  4. Filtriere die Suspension durch einen 250 μm-Zellsieb, verwirre den Durchfluss und filtriere durch einen 70 μm-Zellsieb, der den verbleibenden Durchfluss sammelt.
  5. Die Suspension bei 500 xg bei 4 ° C für 20 min zentrifugieren, um die einzelnen Zellen zu pelletieren.

3. Isolierung einzelner Epithelzellen unter Verwendung eines Dichte-Zentrifugationsgradienten

  1. Den Dichte-Zentrifugationsgradienten ( zB Percoll) durch Filtrieren durch ein AP15-Vorfilterpapier vorbereiten. 40% und 20% Percoll in mqH 2 0 (v / v) vorbereiten und bei 4 ° C für 1 h abkühlen, bevor der Gradient geschichtet wird.
  2. Mit einem peristaltischenPumpe auf die niedrigste Geschwindigkeit eingestellt, Schicht 3 ml von 40% Dichte Zentrifugation Gradient in ein 16 mL Ultrazentrifugenröhrchen, so dass es auf Eis für 15 min absetzen. Die Geschwindigkeit der Pumpe sollte zu einer <1 mL pro Minute Durchflussmenge führen.
  3. Kippen des Rohres in einen 45 ° -Winkel, verwenden Sie die peristaltische Pumpe, um den 20% Dichte-Zentrifugationsgradienten auf der 40% -Schicht zu schichten. Die Geschwindigkeit der Pumpe sollte zu <1 mL pro min Durchfluss führen. Lassen Sie die Schichten 15 Minuten lang auf Eis absetzen.
  4. Verwenden Sie die peristaltische Pumpe bei <1 mL pro Minute Durchflussmenge auf Schicht 3 ml DMEM-Medium, das Tick-Darmzellen über dem 20-40% Dichte-Zentrifugationsgradienten enthält.
  5. Programmieren Sie die Zentrifuge für maximale Beschleunigung und minimale Verzögerung. Zentrifuge bei 600 xg für 10 min. Sammeln Sie Interphasen zwischen dem DMEM: 20% Dichte-Zentrifugationsgradient und den 20%: 40% Dichte-Zentrifugationsgradienten, um epitheliale Einzelzellen zu isolieren. Lagern Sie gesammelte Zwischenphasen bei 4 ° C für nachfolgende Analysen.

4. Bewertung der Zellisolation

  1. Hemacytometer
    1. Reinigen Sie den Hämacytometer mit Alkohol.
    2. .Entfernen Sie die Zellen durch sanftes Pipettieren der Zellen nach oben und unten. 100 μl der Zellsuspension pipettieren und in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen geben.
    3. Fügen Sie 400 μl 0,4% Trypan Blue hinzu. Vorsicht mischen, indem man die Röhre schlägt.
    4. 100 μl der mit Trypan Blue behandelten Zellsuspension pipettieren, um langsam beide Kammern des Hämocytometers zu füllen.
    5. Legen Sie das Hämocytometer unter ein Lichtmikroskop und fokussieren auf die Gitterlinien des Hämocytometers mit einem 10fachen Objektiv.
    6. Mit einem Hand-Tally-Zähler zählen die lebenden ungefärbten Zellen innerhalb eines Satzes von 16 Quadraten. Innerhalb des gleichen Platzes zählen die blauen toten Zellen. Weiterzählen, bis vier Sätze von 16 Quadraten gezählt werden.
    7. Berechnen Sie die Gesamtzellen pro ml mit der Formel:
      47eq1.jpg "/>
    8. Berechnen Sie die prozentuale Zelllebensfähigkeit anhand der Formel:
      Gleichung 2
  2. Zelle isolieren Visualisierung
    1. 1 μl der isolierten Zellen in 9 μl HBSS in einem 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen verdünnen. Das Mikrozentrifugenröhrchen vorsichtig mischen.
    2. 5 μl isolierte Zellen in HBSS in die Mitte einer Glasrutsche pipettieren. Tragen Sie drei Tropfen Montagemedium mit 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) auf.
    3. Inkubieren Sie den Objektträger bei Raumtemperatur für 5 min. Setzen Sie sorgfältig einen Deckel über die Vorbereitung, Vermeidung von Luftblasen.
    4. Visualisierung der mit DAPI gefärbten Zellen bei Anregung 360 nm und Emission bei 460 nm unter einem Fluoreszenzmikroskop.

5. Zelloberflächenprotein-Biotinylierung

  1. Biotinylierung von 100 & mgr; l Einzelzell-Epithelzellen unter Verwendung von Biotin (Typ A) KonjugationKit, bei einem Molverhältnis von 1: 1 Oberflächenprotein zu konjugieren, wie nach Herstellerangaben
  2. Für die Zelllyse werden 100 μl PBS, 1% Triton X-100, 10% Glycerin, 100 μM oxidiertes Glutathion und PIC zu den biotinylierten Zellen gegeben. Inkubieren auf Eis für 1 h mit sanften Mischen alle 10 min.
  3. Die biotinylierten Zellen bei 20.000 xg bei 4 ° C für 20 min zentrifugieren, um unlösliches Material zu pelletieren. Sammeln Sie den Überstand, der zytoplasmatische und biotinylierte Membranproteine ​​enthält.
  4. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit dem Bradford-Assay.

6. Isolierung von biotinylierten Oberflächenproteinen

  1. 50 μl Streptavidin-Magnetperlen in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen geben.
  2. Legen Sie den Schlauch in einen Magnetständer und sammeln die Perlen gegen die Seite des Rohres. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand.
  3. Füge 1000 μl TBS, 0,1% Tween-20 zum Röhrchen hinzu. Mischen Sie sanft und sammeln Sie die Perlen mit dem magnetischen StanD. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand.
  4. Kombinieren Sie 40 μg biotinylierte Zelloberflächenproteine, verdünnt auf 300 μl in 1x PBS mit gewaschenen magnetischen Kügelchen. Inkubieren für 2 h bei Raumtemperatur unter Rühren.
  5. Die Perlen mit einem Magnetständer sammeln, den Überstand entfernen und entsorgen.
  6. Zugabe von 300 μl TBS, 0,1% Tween-20 zum Röhrchen, sanftes Mischen zur erneuten Suspendierung der Perlen. Perlen sammeln, den Überstand entfernen und entsorgen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt zweimal.
  7. 100 & mgr; l des 0,1 M Glycin pH 2,0 zu den magnetischen Kügelchen geben und bei Raumtemperatur für 5 min inkubieren. Sammeln Sie Perlen und entfernen Sie den Überstand, der eluierte biotinylierte Oberflächenproteine ​​enthält.
  8. Visualisiere isolierte Oberflächenproteine ​​auf einem 4-20% Tris-MOPS SDS-PAGE-Gel.

7. Bewertung von biotinyliertem Oberflächenprotein

  1. Dot Blot
    1. Schneiden Sie einen 7 cm x 3 cm Streifen Nitrozellulosemembran.
    2. Tragen Sie 10 μg total Tick GuT-Gehalt (ab 1.8) und 10 μg biotinyliertes Oberflächenprotein an die Membran. Trocknen 15 Minuten bei Raumtemperatur trocknen lassen.
    3. Übertragen Sie in einen Container und tauchen Sie in 100 ml Blockierpuffer ein. Inkubieren bei Raumtemperatur unter Rühren für eine Stunde. Blockierpuffer verwerfen
    4. Nitrozellulosemembran in 100 μl PBS, 0,05% Tween-20 für 5 min unter Rühren waschen. Verwerfen Sie Waschpuffer und wiederholen Sie die Waschungen für dreimal.
    5. Inkubieren in 1/5000 Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase (HRP) in 100 μl PBS, 0,05% Tween-20 für 2 h unter Rühren bei Raumtemperatur und entsorgen jede verbleibende Lösung.
    6. Nitrozellulosemembran in 100 μl PBS, 0,05% Tween-20 für 5 min unter Rühren abwaschen. Waschpuffer verwerfen und dreimal wiederholen.
    7. Zum Nachweis 1 Tablette 4-Chlor-1-napthol in 10 ml eiskaltem Methanol auflösen. Füge 4 ml Methanol-Stamm zu 20 ml TBS hinzu. Füge 10 μl frisches 30% iges Wasserstoffperoxid und sofort hinzuGelten für Nitrozellulosemembran.
    8. Inkubieren unter Rühren bei Raumtemperatur, bis Substrat ein unlösliches blaues Endprodukt erzeugt. Dies kann zwischen 2-15 min dauern.
    9. Die Erkennungslösung entsorgen und die Membran dreimal in 100 μl mqH 2 O waschen.
  2. ELISA-Assay
    1. Verdünnen Sie 200 ng jeder Probe mit 400 μl 100 mM Carbonat-Beschichtungspuffer und beschichten Sie 2 Bahnen der ersten Reihe (A #) der ELISA-Platte (flache Bodenwannen)
    2. Füge 100 μl 100 mM Carbonat-Beschichtungspuffer zu allen anderen entsprechenden Vertiefungen in Reihen (BH) hinzu.
    3. Vorbereiten der seriellen Verdünnungen jeder Probe durch Pipettieren von 100 & mgr; l von jeder Vertiefung in Reihe A und Übertragen in Reihe B. Mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren und vermeiden Sie die Herstellung von Blasen. Wiederholen Sie die Verdünnungen in jeder Zeile, wobei die letzten 100 & mgr; l aus jeder Vertiefung in der Reihe H entsorgt werden.
    4. Die Platte mit Parafilm bedecken und bei 4 ° C über Nacht inkubieren.
    5. Waschen Sie die PlatE mit 200 μl PBS, 0,05% Tween-20 pro Well dreimal.
    6. 200 μl Blockierungspuffer zu den beschichteten Vertiefungen geben, mit Parafilm abdecken und bei 4 ° C über Nacht inkubieren.
    7. 1 / 15.000 Streptavidin-HRP in Blockierungspuffer verdünnen und 100 μl zu jeder Vertiefung der Platte hinzufügen. Mit Parafilm abdecken und bei 4 ° C über Nacht inkubieren.
    8. Waschen Sie die Platte in 200 μl PBS, 0,05% Tween-20 pro Brunnen fünfmal.
    9. Um zu detektieren, fügen Sie 100 & mgr; l TMB-Reagenz pro Vertiefung hinzu. Nach einer ausreichenden Farbentwicklung, üblicherweise zwischen 10-15 min, werden 100 μl 1 M Phosphorsäure zugegeben, um die Reaktion zu stoppen.
    10. Lesen Sie die Extinktion jeder Vertiefung bei λ = 450nm.

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Representative Results

Epithelzellen wurden aus dem Darmgewebe von R. microplus gemäß dem in Fig. 1 dargestellten Schema isoliert. Repräsentative Fluoreszenzmikroskopie-Bilder von Tick-Darm-Epithelzellen, die unter Verwendung dieses Protokolls hergestellt wurden, sind in Fig. 2A gezeigt Und 2B. Da die Zellisolation auf halb engorgestem R. microplus durchgeführt wird , erscheinen Zellen als singuläre, sphärische, glatte Oberflächenmorphologie und eine gleichbleibende Grße während der Probe. Unterschiede in der Größe und Art der Darm-Zellpopulationen, sind deutlicher, sobald die Tick fortfährt, voll-engorged Erwachsene zu werden.

Die Fluoreszenzfärbung des Kerns der isolierten Epithelzellen mit DAPI hilft, die Zellen zu visualisieren. Schlechte Isolationen werden visualisiert, um eine unvollständige Dissoziation von Epith zu enthaltenEliale Zellen mit variierenden Zellpopulationen, die durch die variierenden Zellgrößen und Morphologien identifiziert wurden ( Abbildung 2C und 2D )

Unter Verwendung dieses Protokolls, etwa 1,2 × 10 7 Zellen pro / ml von 50 Zecke gut Dissektionen, mit 75-80% Lebensfähigkeit wurden von R. micro Zecke gut erfolgreich isoliert. Die Kreuzkontamination von Wirtsproteinen ( Abbildung 3A ) kann durch eine ausreichende Spülung der Tick-Einschnitte minimiert werden, bis sie ein weißes Aussehen haben, was zu einem weißen / klaren Percoll-Gradienten führt ( Fig. 3B ).

Oberflächengebundene Proteine ​​wurden durch Biotinylierung von oberflächengebundenen Proteinen, Zerstörung von Zellmembranen und die Reinigung von biotinylierten Oberflächenproteinen mit magnetischen Streptavidinperlen isoliert. Insgesamt 20-24 μg gereinigte BiotineLate Oberflächenproteine ​​können für Downstream-Anwendungen aus einer anfänglichen Sezierung von 50x Tick Eingeweide unter Verwendung dieses Protokolls isoliert werden. Vergleich von Proteinen durch SDS-PAGE ( Abbildung 4A ), Silberfärbung ( Abbildung 4B ), Dot-Blot ( Abbildung 5 ) und ELISA ( Abbildung 6 ) zeigt an, dass die beschriebene Methode erfolgreich biotinylierte Oberflächenproteine ​​aus Epithelzellen, die aus R. microplus- Tick ​​isoliert wurden, Darm.

Abbildung 1
Abbildung 1 : Schematische Darstellung zur Isolierung biotinylierter Proteine, die in der Oberfläche der R. microplus midgut Zellen vorhanden sind. Bitte clIck hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2 : Fluoreszenzmikroskop-Visualisierung (100x) der R.-Mikroplus- Midgut-Epithelzellen, die mit DAPI gefärbt wurden. Die Software wurde verwendet, um die Fluoreszenz-Overlay zu führen. A & B) Repräsentieren Epithelzellen erfolgreich isoliert aus dem R. microplus midgut. C / D) Epithelzellen, isoliert aus dem R. Mikroplus- Darm, verunreinigt mit größeren Tickgeweben.

Abbildung 3
Abbildung 3 : Percoll-Gradient mit DMEM: 20% Percoll: 40% Percoll. Die Epithelzellschichten wurden zwischen dem DMEM: 20% P gebildetErcoll und die 20: 40% Percoll. ( A ) Tick Darmdissektion ohne ausreichenden Waschschritt. ( B ) Tick Darmdissektion mit ausreichender Waschstufe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4 : Elektrophoretische Trennungen von biotinylierten Oberflächenproteinen laufen auf 4-20% Tris-MOPS-Gel bei 140 V für 55 min mit 10 μg Proben. (1) Unbeschriftete R. microplus ganze Darmprobe (2) Biotinylierte Proteine, extrahiert aus R. microplus ganzen Darm nach Schritt 6. (3) Proteine ​​aus Epithelzellen, die aus unmarkiertem R. microplus Darm extrahiert wurden (4 ) Biotinylierte Proteine, extrahiert aus R. microplusEpithelzellen nach Schritt 6. ( A ) SDS-PAGE gefärbt von Comassie blau ( B ) Silberfärbung.

Abbildung 5
Abbildung 5 : Dot-Blot-Analyse Streptavidin-HRP konjugiertes verdünntes 1 / 5.000. ( A ) Insgesamt 10 μg rohes Tick-Darm-Proteinextrakt ( B ) Biotinylierte Oberflächenproteine, die aus gereinigten Epithelzellen (10 μg) extrahiert wurden.

Abbildung 6
Abbildung 6 : Bewertung der biotinylierten Oberflächenproteine ​​Lebensfähigkeit unter Verwendung von ELISA. ELISA von Oberflächenproteinen wurde durch Strep-HRP-konjugierter Antikörper entwickelt, der 1 / 15.000 gegen verschiedene Konzentrationen von biotinyliertem Tic verdünnt warK-Darm-Proteine ​​(von 0,7 ng bis 100 ng). Unmarkierte Tick-Darm-Proteine ​​und Rinderserumalbumin (BSA) wurden als Negativkontrolle des ELISA verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Vieh-Tick-Befall stellt ein großes Problem für die Viehwirtschaft in tropischen und subtropischen Regionen der Welt dar, wobei die gängigste Methode der Kontrolle von der Verwendung von Akariziden 1 , 4 abhängig ist. Bm86 wurde zuvor innerhalb der Tick-Darm-Epitheloberfläche als Schutz-Antigen gegen R. microplus- Befall 10 identifiziert, mit begrenztem Erfolg als Impfstrategie aufgrund der Bm86-geographischen Sequenzvariation und der Forderung nach einer regulären Verstärkung 4 .

Frühere Publikationen, die sich auf epitheliale Isolationsmethoden konzentrierten, konzentrierten sich hauptsächlich auf Wirbeltiere oder Insektenarten 9 , 11 , 12 , 13 , 14 . Zum Beispiel versucht die frühe Fraktionierung, Midgut zu isolierenUnter Verwendung von Säugetiertechniken, festgestellt, dass die gleiche Methodik nicht auf Insekten aufgrund der verschiedenen Zellstruktur und Organisationen angewendet werden konnte 12 . Weiterhin beruhen die Techniken der Säugetiere auf der Verwendung von entweder Dipase oder Collagenase, um die Zell-Zell-Junction-Proteine 9 , 13 enzymatisch zu verdauen. Dipase und Kollagenase beeinflussen die Zelloberflächen-gebundenen Proteine ​​erheblich, und daher sind Techniken, die von ihrer Verwendung abhängig sind, für Zelloberflächen-Protein-Studien nicht geeignet 15 . Insekten-Midgut-Zell-Isolationen konzentrieren sich derzeit auf zwei Techniken. Die erste nutzt mechanische Störung des Mittelguts durch Ultraschall, gefolgt von einer Trennung über einen kontinuierlichen linearen Saccharosegradienten 8 , 11 , 12 , 14 . Diese mechanische Technik produziert eine Probe fast frei von Verunreinigungen, HoweVer produziert eine geringe Ausbeute an Mikrovillarmembranen 14 . Die zweite Technik beruht auf der Tris-Störung der Membranen zur Freisetzung von Mikrovillarmembranen 8 .

Die in diesem Papier skizzierte Technik ermöglicht die Isolierung von Epithelzellen, die Biotinylierung von Oberflächenproteinen und deren Isolation 16 , was weitere Untersuchungen durch nachgeschaltete Anwendungen wie Massenspektrometrie oder FACS ermöglicht. Das hier beschriebene Verfahren verwendet den Chelatbildner EDTA und das Reduktionsmittel TCEP. EDTA-Funktionen zur Sequenzierung von Calcium-Ionen, zur Hemmung von Cadherinen, zum Brechen von Cadherin-vermittelten Zell-Zell-Übergängen, während TCEP die Disulfid-Bindungen reduziert, die die Viskosität der Glykan-reichen Schleim-artigen peritrophischen Matrix verleihen, die das Darmlumen vom Epithel trennt. Das Epithel wird nach mechanischer Zerstörung der Gewebe durch Schütteln gewonnen, gefolgt von einer diskontinuierlichen Gradientenzentrifugation im DensitY Zentrifugationsgradient Epithelzellen werden zwischen dem DMEM: 20% Dichte-Zentrifugationsgradienten und 20%: 40% Dichte-Zentrifugationsgradientenschichten isoliert.

Die Verwendung einer höheren Temperatur während der Epithelzelldissoziation führt dazu, dass große Gewebe aus dem Darm dissoziieren, was zu einem Versagen führt, Epithelzellen zu isolieren. Sicherstellung, dass die Epithelzelldissoziation sofort nach der Zeckensektion durchgeführt wird; Die Ausnutzung von eiskalten Puffern und die Vermeidung von hohen Zentrifugationsgeschwindigkeiten ist entscheidend für die Beibehaltung lebender lebensfähiger Zellen. Trotzdem kann die Verschiebung von größeren Zellen aus der Basallamina eine gewisse Kontamination liefern. Darüber hinaus ändert sich das Midgut-Epithel der Zecke dramatisch von der Zeit aus dem letzten Blutmehl 18 , 19 , 20 .

Als solches wurde dieses Protokoll entworfen und auf R. microplus zugegriffen Abbildung 1 ) einheitlicher Natur.

Abschließend haben die in dieser Studie verwendeten Methoden erfolgreich Epithelzellen aus dem ganzen Darm von R. microplus isoliert. Proteine ​​aus der Oberfläche von R. microplus Epithelzellen wurden für weitere Analysen und Studien erhalten. Schließlich hat das entwickelte Protokoll die potentielle Ausbeute an Epithelzellen aus dem Tick-Darm und die Effizienz von biotinylierten Oberflächenproteinen der Zelle gezeigt. Das entwickelte Protokoll kann in jeder Tickart von ökonomischer Bedeutung verwendet werden, um Tick zu untersuchen: Wirtsinteraktionen durch das Studium des Membranproteins comPosition des Darms

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgements

Die Autoren möchten den Biosicherheit Tick Colony (Queensland Department of Agriculture & Fischerei, Australien) für die Bereitstellung von Rhipicephalus Zecken micro für diese Studie verwendet, und Lucas Karbanowicz für die Unterstützung bei der Videoaufnahme danken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4% Trypan Blue ThermoFisher Scientific 15250061
1.5 mL microcentrifuge tube Eppendorf 3322
100mM Carbonate Buffer 3.03 g Na2CO3, 6.0 g NaHCO3 1000 ml distilled water pH 9.6
16 mL centrifuge tubes with sealing cap Thermo Scientific 3138-0016 Cool in ice prior to gradient
250 µM cell strainer Thermo Fisher 87791
3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA Sigma T0440 Stored at 4C
30% Hydrogen Peroxide Labscene BSPA5.500
4-20% Tris-MOPS Gel Gen Script M42015
4-Chloro-1-naphthol tablet Sigma-Aldrich C6788
50 mL Falcon Tube Corning Blue 30 x 115mm style. Polyproplyene conical tube.
70 µM cell strainer BD Falcon 352350
AP15 filter paper Millipore AO1504200
Biotin (Type A) Conjugation Kit Abcam Ab102865
Dissection microscope Olympus SZX7
DP Manager  Olympus 2.2.1.195 Cell imagery software
Duct Tape Home Handyman 48mm x 25mm Duct Tape
Dulbecco’s Modified Eagle Medium Gibco 11995-065 DMEM - ice cold for protocol
EDTA Amresco 0105-500G
F96 Maxisorp Immuno Plate Nunc 439454
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich 12003C FCS
Fluorescence microscope   Olympus  BX51
Fluoroshield with DAPI Sigma-Aldrich F6057-20ML DAPI
Forceps Dumont #9 Dumont - Switerzland
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 Glycerol for molecular biology >99%
Glycine Sigma-Aldrich 410225
Hand-Held Counter Officeworks JA0376230
Hank’s Balanced Salt Solution Sigma Life Sciences H9394 HBSS – ice cold for protocol
Hemacytometer Optik Lakor - -
L-Glutathione oxidized Sigma-Aldrich G4376
Magnetic Separation Stand Novagen - 4-Tube Magnetic Separation Rack
Methanol Sigma-Aldrich 179337
Milli-Q Water Millipore ZRXQ003WW Integral Water Purification System for Ultrapure Water
Nitrocellulose Membrane Life Sciences 66485 30cm x 3M pure nitrocellulose membrane
PageRuler Prestained protein Ladder Thermo-Fisher SM0671
PBS 1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4.0 g NaCl (500 ml distilled water) pH 7.4
Percoll Sigma-Aldrich P1644-500ML
Peristaltic Pump Masterflex 7518-10
Phosphoric Acid Sigma-Aldrich P6560
Pierce Protein-Free T20 PBS Blocking Buffer Thermo-Scientific 37573 Stored at 4C. Blocking Buffer
Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich P8215-5ML PIC – stored at -20 °C
Quick Start Bradford Dye Reagent 1x Biorad 500-0205 For Bradford Assay
Quick Start BSA Standards Biorad 500-0207 BSA standards for Bradford Assay
Scalpel Lab. Co Size 11 Scalpel
SilverQuest TM Staining Kit Invitrogen LC6070
Simply Blue TM Safe Stain  Invitrogen LC6060
Sorvall C6+ Ultracentrifuge Thermo Scientific 46910
Streptavidin (HRP) Abcam AB7403
Streptavidin Magnetic Beads New England Biolabs S1420S
Super Glue - Ultra Fast Mini UHU UHU Super Glue 1mg. Ultra Fast mini
Table-top Centrifuge Eppendorf 22331
TCEP Thermo Fisher 20490
Triton X-100 Biorad 161-0407
Tween-20 Sigma P2287-500ML
Vortex Mixer Ratek VM1
Water Bath Grant GD100

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References

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