लंबे समय तक की लाइव इमेजिंग

Developmental Biology
 

Summary

यह प्रोटोकॉल लंबी अवधि के पूर्व vivo संस्कृति और एक ड्रोसोफिला imaginal डिस्क के लाइव इमेजिंग के लिए एक विस्तृत विधि का वर्णन है। यह फोटोरिसेप्टर भेदभाव और ommatidial रोटेशन आंख डिस्क की लाइव इमेजिंग के 10 घंटे की अवधि के भीतर दर्शाता है। प्रोटोकॉल सरल है और महंगा सेटअप की आवश्यकता नहीं है।

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Tsao, C. K., Ku, H. Y., Sun, Y. H. Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc. J. Vis. Exp. (123), e55748, doi:10.3791/55748 (2017).

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Abstract

लाइव इमेजिंग लगातार वास्तविक समय में गतिशील सेलुलर और विकासात्मक प्रक्रियाओं ट्रैक करने की क्षमता प्रदान करता है। ड्रोसोफिला लार्वा imaginal डिस्क जैसे सेल प्रसार, भेदभाव, विकास, प्रवास, apoptosis, प्रतियोगिता, सेल कोशिका संकेतन, और पूरक सीमा गठन के रूप में कई जैविक प्रक्रियाओं, अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, लंबी अवधि के पूर्व vivo संस्कृति और imaginal डिस्क की लाइव इमेजिंग के लिए तरीके संतोषजनक नहीं किया गया है, कई प्रयासों के बावजूद। हाल ही में, हम लंबे समय तक पूर्व vivo संस्कृति और अप करने के लिए 18 घंटे के लिए imaginal डिस्क की लाइव इमेजिंग के लिए एक विधि विकसित की। संस्कृति माध्यम में एक उच्च इंसुलिन एकाग्रता का उपयोग कर के अलावा, एक कम पिघलने agarose भी यह इमेजिंग अवधि के दौरान बहने से रोकने के लिए डिस्क एम्बेड करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इस रिपोर्ट में एक उदाहरण के रूप आंख antennal डिस्क का उपयोग करता है। फोटोरिसेप्टर R3 / 4-विशिष्ट mδ0.5-Ga4 अभिव्यक्ति है कि फोटोरिसेप्टर एडवेंचर्स प्रदर्शित करने के लिए पीछा किया गया थाtiation और ommatidial रोटेशन एक 10 घंटे लाइव इमेजिंग अवधि के दौरान देखा जा सकता है। यह एक विस्तृत इस सरल विधि का वर्णन प्रोटोकॉल है।

Introduction

ड्रोसोफिला लार्वाल कॉम्प्लेन्टल डिस्क जैविक तंत्र की एक विस्तृत विविधता के अध्ययन के लिए एक पसंदीदा प्रायोगिक प्रणाली रही है। ये डिस्क भ्रूणिक उपकला से निकलते हैं और दो उपकला परतों, पेरीपोडियल एपीथेलियम (पीई) और डिस्क प्रोपर (डीपी) 1 , 2 द्वारा निर्मित सैक-जैसे संरचना बनती हैं। लार्वा और पिल्चर चरण के दौरान कल्पनाशील डिस्क कोशिकाएं पैदा होती हैं और धीरे-धीरे अंतर करती हैं और अंततः वयस्क शरीर संरचनाओं में विकसित होती हैं। इम्प्लिंक डिस्क्स के फ्लैट और सरल दो-स्तरीय संरचना के कारण, लार्वा से विच्छेदित किए जाने पर वे आसानी से देख सकते हैं। हालांकि, कई समूहों के कई प्रयासों के बावजूद, कल्पनात्मक डिस्क की दीर्घकालिक संस्कृति के लिए मौजूदा तरीकों संतोषजनक नहीं हैं। हमने हाल ही में एक संस्कृति पद्धति विकसित की है जो 18 घंटे तक कई कल्पित डिस्क के सामान्य विकास को बनाए रख सकती है और वह लाइव इमेजिंग की अनुमति देता है 3 3 की उच्च सांद्रता है। विधि सरल है, और कोई विशेष वातन या मध्यम परिसंचरण की आवश्यकता है।

सबसे अच्छा अध्ययन किया imaginal डिस्क में से एक आंख antennal डिस्क है। ड्रोसोफिला आंख के लगभग 800 ommatidia बनाया गया है। प्रत्येक ommatidium आठ फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं (आर 1-R8) से मिलकर बना है। लार्वा आंख डिस्क में, फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं Morphogenetic कुंड (एमएफ) है, जो पीछे से आंख डिस्क भर में स्वीप के पारित होने के 4, 5 पूर्वकाल के लिए निम्नलिखित को अलग करें। एक ommatidium में फोटोरिसेप्टर अनुक्रम में अंतर, R8, आर 2 / आर 5, R3 / R4, आर 1 / R6, और R7 6 द्वारा पीछा के साथ शुरुआत। पृष्ठीय में ommatidia और veआंख डिस्क की ntral हिस्सों विपरीत दिशाओं में एक 90 डिग्री रोटेशन से गुजरना, विपरीत दाहिनी 7, 8 में जिसके परिणामस्वरूप। रोटेशन प्रक्रिया दो चरणों में होता है: पहला, एक 45 ° रोटेशन पर शुरू होता है और एमएफ पीछे छठे ommatidia पंक्ति में पूरा हो गया है; दूसरा 45 ° रोटेशन पंक्ति 16 9, 10 के बारे में पूरा हो गया है। R3 / 4-विशिष्ट mδ0.5-Ga4 11 द्वारा चिह्नित ommatidial रोटेशन का इस्तेमाल किया इस अध्ययन, सामान्य सेलुलर भेदभाव और गतिशीलता है कि संस्कृति के लिए इस विधि के माध्यम से देखा जा सकता है का प्रदर्शन और जीने की छवि आंख डिस्क को।

Protocol

1. पूर्व प्रयोगात्मक सेटअप

  1. 5 दिनों के लिए एक मक्खी अंडे कि mδ0.5-Gal4 के तहत परमाणु हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) को व्यक्त करता है और 25 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति इकट्ठा।
  2. माइक्रोवेव 1x फॉस्फेट बफर खारा के 10 एमएल (पीबीएस) जब तक agarose पूरी तरह भंग है में agarose कम पिघलने के 0.7 जी। प्रयोग से पहले तक एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 0.7% कम पिघलने जेल रखें।
  3. 12 से अधिक घंटे के लिए संदंश, कैंची, 42 मिमी x 0.17 मिमी coverslips, एक 9 अच्छी तरह से कांच स्थान थाली, और एक चुंबकीय संस्कृति कक्ष सहित सभी उपकरण, 70% इथेनॉल के साथ, नसबंदी।
  4. श्नाइडर की ड्रोसोफिला मध्यम 2% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 0.5% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 1.25 मिलीग्राम / एमएल इंसुलिन के साथ पूरक: संवर्धन माध्यम 3 तैयार करें। संदूषण से बचने के लिए एक सेल संस्कृति हुड में मध्यम तैयार करते हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर तैयार संस्कृति मध्यम स्टोर और एक महीने के भीतर इस्तेमाल किया।
  5. विच्छेदन मंच और प्रयोगकर्ता 'साफरों 70% इथेनॉल के साथ हाथ विच्छेदन शुरू करने से पहले।

2. डिस्क विच्छेदन

  1. एयर 70% इथेनॉल से सभी उपकरणों सूखी।
  2. एक मक्खी शीशी से एक तीसरे इनस्टार लार्वा का चयन करें। मक्खी शीशी से संक्रमण से बचने के लिए, कचरे को हटाने के लिए 1x पीबीएस 3x में लार्वा धोएं।
  3. एक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे कल्चर माध्यम (आरटी पर) 9-अच्छी तरह से कांच स्थान थाली में से 1 एमएल में साफ लार्वा काटना।
  4. पीछे छोर से रास्ते से लगभग एक तिहाई और मुँह हुक पर एक और संदंश में संदंश की एक जोड़ी के साथ लार्वा समझ। विपरीत दिशाओं में दो संदंश खींचो आंतरिक ऊतकों को रिहा करने का।
    1. आंख मस्तिष्क मुंह हुक से जुड़ी जटिल से लार ग्रंथियों, वसा शरीर, और छल्ली निकालें। उदर तंत्रिका कॉर्ड अभी भी जुड़ा हुआ है, तो यह दूर कटौती कैंची के साथ।
  5. मुंह हुक और संदंश की एक जोड़ी समझ संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें कि सह ऊतक का एक टुकड़ा दूर करने के लिएदिमाग और पृष्ठीय भाग में आंख डिस्क nnects।
    नोट: इस ऊतक नहीं हटाया जाता है, तो दो आंख antennal डिस्क एक दूसरे को और मस्तिष्क के करीब हो जाएगा। आंख डिस्क तो coverslip पर फ्लैट झूठ नहीं करेगा क्योंकि इस ऊतक, मस्तिष्क, और आंख को antennal डिस्क एक त्रिकोण बनेगी।
  6. एक उदर-ऊपर की ओर स्थिति के लिए पूरा परिसर घुमाएँ। रेशा हुक या मस्तिष्क के लिए डिस्क से जोड़ता है निकालें।
    ध्यान दें: जब मुंह हुक निकाल दिया जाता है रेशा नहीं हटाया जाता है, तो आंख antennal डिस्क दो टुकड़ा में बंट जाएगा।
    1. मुंह हुक निकालें। ध्यान की प्रक्रिया के दौरान आंख डिस्क को नुकसान न हो।
      नोट: आंख डिस्क अब माध्यम में नि: शुल्क और केवल ऑप्टिकल डंठल द्वारा मस्तिष्क से जुड़ा है।

3. बढ़ते

  1. एयर सूखी और एक 42 मिमी x 0.17 मिमी coverslip के साथ चैम्बर के घटकों को इकट्ठा। कवर स्लिप वें धारण करने के लिए के केंद्र के लिए ओ-रिंग की दोहरी परत संलग्नई agarose।
  2. coverslip के साथ चैम्बर इकट्ठा। चरण स्वीकर्ता पर 42 मिमी x 0.17 मिमी coverslip रखो। कवर स्लिप पर सिलिकॉन ओ-रिंग रखें। आधार रखें। सीलिंग लॉकर ताला और कवर (चित्रा 1) जगह।
  3. ध्यान से एक 10-200 μL टिप के साथ एक 20 μL micropipette का उपयोग ओ-रिंग के केंद्र के लिए विच्छेदित आंख मस्तिष्क जटिल हस्तांतरण।
  4. मध्यम के सबसे निकालें और नमूना (37 डिग्री सेल्सियस पर) 0.7% कम पिघलने agarose के 12 μL जोड़ें।
    नोट: आंख डिस्क की स्थिति agarose के solidification से पहले संदंश के साथ बदला जा सकता है। agarose 5 मिनट के भीतर जमना होगा।
    1. 1 कल्चर माध्यम से एमएल ओ-रिंग के केंद्र के लिए कमरे के तापमान पर जोड़ें; प्रत्येक ओ-रिंग 4 नमूनों को लोड कर सकते हैं। सुनिश्चित करें कि agarose ओ-रिंग से चिपका है नमूने की बहती से बचने के लिए सुनिश्चित करें।
      ध्यान दें: नहीं वातन या मध्यम के संचलन के लिए आवश्यक है।

4. Confocal माइक्रोस्कोपी

  1. तापमान संतुलित करने के लिए 30 मिनट के लिए एक औंधा confocal खुर्दबीन के मंच पर चैम्बर रखें। यह इमेजिंग के दौरान Z- अक्ष बहाव रोक सकते हैं।
  2. लंबे समय तक जीना इमेजिंग से पहले, जाँच करें कि क्या ऊतक अंतर हस्तक्षेप विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा बरकरार है।
  3. phototoxicity बचने के लिए, 2 मेगावाट के नीचे एक लेजर शक्ति का उपयोग करें। इमेजिंग के लिए एक 40x उद्देश्य का उपयोग करें।
  4. 1 सुक्ष्ममापी की एक ऑप्टिकल अंतराल पर 12 मिनट में 62 सुक्ष्ममापी जेड ढेर चित्र प्राप्त। 10 घंटा की कुल से अधिक स्कैन के 40 चक्र प्राप्त। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक चक्र इमेजिंग के 12 मिनट और आराम के 3 मिनट में शामिल है।

Representative Results

इस उदाहरण में, R3 / R4 फोटोरिसेप्टर फोटोरिसेप्टर भेदभाव नजर रखने के लिए mδ0.5-Ga4 के साथ लेबल रहे थे। mδ0.5-Ga4 R3 11 में R4 में मजबूत अभिव्यक्ति और कमजोर अभिव्यक्ति ड्राइव, यह R3 और R4 के लिए एक उत्कृष्ट मार्कर बनाने, साथ ही ommatidial रोटेशन की प्रक्रिया के लिए। मूवी 1 में, R3 और R4 GFP के साथ लेबल रहे थे। 10 घंटे लाइव इमेजिंग सत्र की शुरुआत में, वहाँ ommatidial समूहों (चित्रा 2A और मूवी 1) और अंत (चित्रा 2 बी) पर ommatidial समूहों के 14 पंक्तियों की 8 पंक्तियाँ नहीं थीं। Ommatidial भेदभाव की दर, प्रति पंक्ति 1.67 ज, जो इन विवो डिस्क 7, 8, 9, 10, 11 में 1.5-2 ज / पंक्ति की दर के करीब है थारों = "xref"> 12, 13, 14। R3 और R4 के सापेक्ष स्थिति के आधार पर, ommatidial रोटेशन को लाइव इमेजिंग (चित्रा 2A ', एक', बी ', और बी' ') के दौरान पूर्व vivo सुसंस्कृत डिस्क में हुई। एक एकल R3 / R4 क्लस्टर मूवी 2 के पहले फ्रेम में एक सफेद क्षेत्र के साथ लेबल किया गया था। शुरुआत में, R3 / R4 अक्ष भूमध्य रेखा (चित्रा 2C और मूवी 2) करने के लिए खड़ा हो गया लगता है। इसके बाद यह 3 (चित्रा 2C '), 6 (चित्रा 2C' ') में 15 °, 30 °, और 45 डिग्री बारी बारी से प्रतीत होता है, और 9 (चित्रा 2C' '') ज क्रमशः। यह आंकड़े बताते हैं कि इस विधि 10 घंटे लाइव इमेजिंग के दौरान फोटोरिसेप्टर भेदभाव बनाए रख सकते हैं।

आकृति 1
figuपुनः 1: चैंबर विधानसभा के योजनाबद्ध आरेख चैंबर असेंबली के योजनाबद्ध आरेख: ( 1 ) स्टेज स्वीकर्ता पर डबल-लेयर ओ-रिंग-अटैटेड कंसलिप रखें। ( 2 ) कवर पर्ची पर सिलिकॉन ओ-रिंग रखें। ( 3 ) आधार रखें ( 4 ) सील लॉकर लॉक करें ( 5 ) ओ-रिंग के केंद्र में नमूना लोड करें और कवर करें। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2: आर 3 / आर 4 भेदभाव और रोटेशन का लाइव इमेजिंग। एमएडी0.5-गिल 4 के साथ लेबलित आर 3 / आर 4 लाइव इमेजिंग के 10 घंटे के दौरान परमाणु-फार्म जीएफपी को व्यक्त करते हैं। सभी आंकड़े मूवी 1 से कब्जा किए गए थे। ( ) शुरुआत में लिया गया चित्र ( > A'-ए ') छवि बाएं (ए') और सही (ए पर बॉक्स्ड क्षेत्र से बढ़े ")। (बी) छवि 10 ज अवधि के अंत में ले लिया। (B 'बी') छवि बाईं (बी ') और सही (बी पर बॉक्स्ड क्षेत्र से बढ़े ")। (सीसी '' ') एक एकल R3 / R4 जोड़ी (ए में एक तीर से चिह्नित') R3 / R4 जोड़ी के रोटेशन को दिखाने के लिए समय के माध्यम से पीछा किया जाता है। स्केल सलाखों = 15 सुक्ष्ममापी, 10 सुक्ष्ममापी, और ए, बी, और सी में 5 सुक्ष्ममापी, क्रमशः। सभी आंकड़े अधिकतम तीव्रता z के अनुमानों हैं। समय के पैमाने ज में दिखाया गया है: मि। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

मूवी 1
मूवी 1:rce.jove.com/files/ftp_upload/55748/Movie_1.avi "target =" _ blank "> इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

मूवी 2
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Discussion

इस अध्ययन में, हम ड्रोसोफिला imaginal डिस्क पर एक लंबे समय तक जीना इमेजिंग प्रयोग की एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। हम सावधान विच्छेदन डिस्क क्षति से बचने के लिए और डिस्क coverslips के पास की कुर्की के लिए अनुमति देने के लिए अभ्यास में बहुत समय बिताया। हम पाली-एल लाइसिन (पीएलएल) और कम पिघलने agarose की कोशिश की ऊतक धारण करने के लिए; अंत में, कम पिघलने agarose ऊतक धारण करने के लिए एक बेहतर क्षमता दिखाई। हालांकि केवल आंख डिस्क इस पत्र में इस्तेमाल किया गया था 10 घंटे लाइव इमेजिंग अवधि के दौरान फोटोरिसेप्टर भेदभाव और ommatidial रोटेशन की सामान्य घटना प्रदर्शित करने के लिए इस पद्धति से कम से कम एक अन्य डिस्क, विंग डिस्क को, के रूप में एक में प्रदर्शन लागू किया जा सकता पिछले अध्ययन 3। इसके अलावा, संवर्धन माध्यम तैयारी और लाइव इमेजिंग सेटअप सरल कर रहे हैं और वातन या मध्यम परिसंचरण की आवश्यकता नहीं है।

सतत लाइव इमेजिंग जैविक पूर्व संध्या का एक स्पष्ट अस्थायी अनुक्रम प्रदान कर सकते हैंएनटीएस। Glia भेदभाव और आंख डिस्क में प्रवास के हमारे पहले रिपोर्ट में, हम प्रत्यक्ष प्रमाण है कि लपेटकर glia आंख डिस्क 3 के पूर्वकाल की ओर पलायन के बाद मौजूदा glia से अलग प्रदान की है। लंबे समय तक पूर्व vivo संस्कृति ऐसी Kaede फ्लोरोसेंट प्रोटीन की तस्वीर-रूपांतरण के रूप में कोशिकाओं, के विशिष्ट लेजर सक्रिय लेबलिंग उनके व्यवहार 3 का पालन करने के लिए अनुमति देता है। यह भी रसायन होते हैं जो सीधे संवर्धन माध्यम में जोड़ा जाता है के परीक्षण के समायोजित कर सकते हैं; इस प्रकार, यह एक दवा स्क्रीनिंग मंच के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता। के बाद से कुछ गतिशील प्रक्रिया मिनट या सेकंड के भीतर हो, उच्च अस्थायी संकल्प की आवश्यकता है। लौकिक संकल्प, प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी 15, 16 या कताई डिस्क माइक्रोस्कोपी 17 बढ़ाने के लिए एक अच्छा विकल्प हो सकता है।

वर्तमान संस्कृति हालत सही नहीं है। यह डिस्क वृद्धि का समर्थन नहीं करता। सेल पीroliferation केवल अप करने के लिए 12 घंटे 3 के लिए समर्थित है। पूर्व vivo संस्कृति में 12 घंटे के बाद, फोटोरिसेप्टर भेदभाव की दर 3 कम करने के लिए शुरू होता है। यह कुछ पोषक तत्वों या हार्मोन की कमी के कारण हो सकता है। चूंकि यह संस्कृति माध्यम में प्रमुख अंतर यह इंसुलिन के उच्च एकाग्रता है, स्तनधारी इंसुलिन आंशिक रूप से अंतर्जात इन्सुलिन जैसे पेप्टाइड्स के समारोह नकल उतार हो सकता है। मक्खी निकालने, कीट रक्त शर्करा trehalose, और molting हार्मोन 20 hydroxyecdysone के विभिन्न एकाग्रता के अलावा, लाभकारी 3 नहीं थे। हालांकि, 12-18 ज संस्कृति अवधि कई विकास प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए पर्याप्त है। लार्वा imaginal डिस्क संवर्धन के लिए वैकल्पिक तरीकों संवर्धन 3 तुलना की गई है, और हमारे संवर्धन और इमेजिंग हालत लंबे समय खिड़की और लाइव इमेजिंग के लिए सबसे स्पष्टता प्रदान करता है। हालांकि लाइव लार्वा और प्यूपा भीतर डिस्क सीधे imaged किया जा सकता है18, 19, 20, 21, 22, टिप्पणियों के लिए संकल्प और समय खिड़की सीमित हैं। देर लार्वा और पोटा संबंधी डिस्क एक लंबे समय के 23, 24 के लिए संवर्धित किया जा सकता है लेकिन डिस्क महत्वपूर्ण morphogenesis गुज़रना पड़ता है। सपाट, 2D लार्वा डिस्क का लाभ लेने के लिए, हमारे संवर्धन और इमेजिंग विधि अब तक सबसे अच्छा समाधान है।

Disclosures

लेखकों की घोषणा वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है।

Acknowledgments

हम मक्खी खाना बनाने और बनाए रखने मक्खी शेयरों के लिए चुन-लैन सू और यु-ची यांग के लिए आभारी हैं, और सु-पिंग ली और कोंफोकल माइक्रोस्कोपी के साथ उनकी मदद के लिए आईएमबी इमेजिंग कोर करने के लिए। इस अध्ययन YHS (एनएससी के लिए 101-2321-B-001 -004, एनएससी 100-2321-B-001 -012, एनएससी 102-2321-B-001 -002, सबसे 103-2311-B-001 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया -035 -MY3) राष्ट्रीय विज्ञान परिषद और विज्ञान और रिपब्लिक ऑफ चाइना का प्रौद्योगिकी मंत्रालय से।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Low-melting agarose AMRESCO  0815-25G
Phosphate-buffered Saline (PBS) AMRESCO 0780-2PK
42 mm x 0.17 mm cover slips  PST G401-42
Schneider’s Drosophila medium  Thermo 21720-024
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F9665
Penicillin-streptomycin  GIBCO 759
Insulin Sigma I9278
Culture chamber  PECON POC-R2 Cell Cultivation System
40X objective C-Apochromat 40X/1.2W Korr objective 
Fly strain:nls.GFP Bloominggton 4775

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References

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