इन विट्रो में कार्यात्मक Cardiomyocyte की तरह कोशिकाओं में मानव Mesenchymal स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव

* These authors contributed equally
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

यहाँ, हम कुशलतापूर्वक कार्यात्मक, करार, cardiomyocyte की तरह कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए हृदय भेदभाव की क्षमता मानव mesenchymal स्टेम कोशिकाओं के युवा स्रोतों का दोहन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत इन विट्रो.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Szaraz, P., Gratch, Y. S., Iqbal, F., Librach, C. L. In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells. J. Vis. Exp. (126), e55757, doi:10.3791/55757 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Myocardial रोधगलन और बाद ischemic झरना cardiomyocytes, दिल विफलता के लिए, दुनिया भर में मृत्यु का प्रमुख कारण प्रमुख के व्यापक नुकसान में परिणाम। Mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) वर्तमान, इनवेसिव तकनीकों को प्रतिस्थापित करने के लिए कोशिका आधारित चिकित्सा के लिए एक आशाजनक विकल्प हैं। MSCs कार्डिएक सेल प्रकार, सहित mesenchymal प्रजातियों में अंतर कर सकते हैं, लेकिन कार्यात्मक कक्षों में पूरी भेदभाव अभी तक हासिल नहीं किया गया है। भेदभाव के पिछले विधियों औषधीय एजेंट या विकास कारकों पर आधारित थे। हालांकि, अधिक physiologically प्रासंगिक रणनीतियों भी MSCs cardiomyogenic परिवर्तन से गुजरना करने के लिए सक्षम कर सकते हैं। यहाँ, हम एक भेदभाव एमएससी समुच्चय cardiomyocyte फीडर की परतों पर cardiomyocyte की तरह करार कोशिकाओं का उत्पादन करने के लिए का उपयोग कर पद्धति मौजूद है।

मानव गर्भनाल perivascular कोशिकाओं (HUCPVCs) करने के लिए एक अधिक से अधिक भेदभाव से संभावित दिखाया गया है आमतौर पर अस्थि मज्जा MSCs (BMSCs) जैसे, एमएससी प्रकार की जांच की। एक ontogenetically छोटे स्रोत के रूप में, हम करने के लिए पुराने स्रोतों की तुलना में पहली तिमाही (FTM) HUCPVCs की cardiomyogenic क्षमता की जांच की। FTM HUCPVCs MSCs कि उनकी इसमें में immunoprivileged गुण जब सभ्य बनाए रखने का एक उपन्यास, अमीर स्रोत हैं इन विट्रो में। इस भेदभाव प्रोटोकॉल, FTM और शब्द का उपयोग HUCPVCs BMSCs करने के लिए, की तुलना में काफी वृद्धि हुई cardiomyogenic भेदभाव cardiomyocyte मार्कर (यानी, myocyte बढ़ाने के कारक 2 C, हृदय troponin T, भारी चेन हृदय myosin, सिग्नल विनियामक प्रोटीन α और connexin 43) की वृद्धि हुई अभिव्यक्ति के द्वारा दर्शाई के रूप में प्राप्त किया। वे भी काफी कम इम्यूनोजेनेसिटी, उनके कम एचएलए-ए अभिव्यक्ति और उच्च एचएलए-जी अभिव्यक्ति द्वारा प्रदर्शन के रूप में बनाए रखा। कुल-आधारित भेदभाव लागू करने, FTM HUCPVCs वृद्धि समग्र गठन संभावित और कार्डिएक फीडर परतों पर सह संस्कृति के 1 सप्ताह के भीतर कक्षों क्लस्टर्स करार, ऐसा करने के लिए पहले एमएससी प्रकार बनने उत्पन्न दिखाया।

हमारे परिणाम प्रदर्शित करता है कि इस भेदभाव की रणनीति कारगर ढंग से युवा MSCs, FTM HUCPVCs, जैसे की cardiomyogenic क्षमता का दोहन कर सकते हैं और पता चलता है कि इन विट्रो में पूर्व भेदभाव में vivoअपने पुनर्योजी प्रभावकारिता को बढ़ाने के लिए एक संभावित रणनीति हो सकता है।

Introduction

दिल विफलता (CHF) रुग्णता और मृत्यु दर दुनिया भर में एक प्रमुख कारण के रूप में बनी रहती है। CHF अक्सर cardiomyocytes के बड़े पैमाने पर नुकसान और रोग के परिणाम एक myocardial रोधगलन (MI)1के रूप में सेल मुक्त निशान ऊतक के विकास के बाद उत्पन्न होती है। जबकि एक आंशिक रूप से स्व-नवीकरण अंग दिल है, निवासी स्टेम और जनक कोशिका पूल ऊतक पुनर्जनन काफी निष्पादित करने के लिए जिम्मेदार बहुतायत और अक्सर चोट के बाद इष्टतम वसूली के लिए अपर्याप्त होता जा रहा वृद्ध रोगियों में समारोह में घटता है। इस प्रकार, वहाँ प्रयोगात्मक उपचार है कि स्वस्थ दाता कोशिकाओं का प्रत्यारोपण क्षतिग्रस्त myocardium में शामिल विकसित करने में बहुत रुचि है। यह दाता कोशिकाओं कि न केवल ऊतक की संरचना को पुनर्स्थापित करें, लेकिन भी प्रभावित myocardium के कार्यात्मक वसूली को प्राप्त करने जरूरी है।

देशी दिल दिल ऊतक-निवासी कार्यरत हैं और2,3,4अंतर्जात अस्थि मज्जा-उत्पत्ति स्टेम सेल पश्चात चोट के लिए मरम्मत। पुनर्योजी कोशिकाओं-होस्ट और दाता-व्युत्पन्न एक जैसे-चाहिए और उपयुक्त phenotype remodeling myocardium, कुशलता से और सुरक्षित रूप से खो कोशिकाओं को प्रतिस्थापित करने की क्षमता के साथ की microenvironment में समारोह को प्राप्त करने की क्षमता है। इन विट्रो में भिन्नता के तरीके बड़े पैमाने पर उच्च दक्षता, स्टेम सेल आधारित cardiomyocyte उत्पादन5,6को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। कार्डियक वंश मार्करों की अभिव्यक्ति प्रोफाइल स्टेम सेल हृदय वंश7के प्रति भेदभाव की प्रक्रिया निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है। जल्दी भेदभाव मार्करों, NKX2.5, myocyte बढ़ाने के कारक 2 C जैसे (Mef2c), और GATA48,9, cardiomyogenic प्रक्रिया की दीक्षा का एक संकेत हो सकता है। परिपक्व cardiomyocyte मार्करों भेदभाव प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया संकेत विनियामक प्रोटीन α (SIRPA)10, हृदय troponin T (cTnT)11, भारी चेन हृदय myosin (MYH6)8,12,13, और connexin 43 (Cx43)14,15,16हैं। भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ESCs) और pluripotent स्टेम कोशिकाओं (पीएससी) का उपयोग कर तरीकों अच्छी तरह से अनुकूलित किया गया है और प्रेरक कारक, ऑक्सीजन और पोषक तत्व ग्रेडिएंट का विवरण, और क्रिया5,6,7,17,18के सही समय के बारे में चर्चा की। फिर भी, ESC और पीएससी-आधारित तकनीकों अभी भी सबऑप्टिमल electrophysiological और प्रतिरक्षाविज्ञानी सुविधाओं19,20के साथ एक से अधिक नैतिक और सुरक्षा चिंताओं, प्रस्तुत करते हैं। इन कोशिकाओं के साथ अक्सर प्रतिरोपित मेजबान immunorejection अनुभव और स्थायी प्रतिरक्षादमन की आवश्यकता होती है। यह मुख्य रूप से प्रमुख histocompatibility परिसर (MHC) अणुओं में होस्ट और दाता और परिणामस्वरूप टी-सेल प्रतिक्रिया21mismatching के कारण है। जबकि अलग-अलग MHC वर्ग मैं एक संभव समाधान है मिलान, एक और अधिक सुलभ नैदानिक अभ्यास सर्वत्र immunoprivileged अस्वीकृति की चिंता पर काबू पाने के लिए है एक सेल स्रोत की आवश्यकता होगी।

एक वैकल्पिक कक्ष उपयोग नैदानिक अनुप्रयोगों, MSCs में और विशेष रूप से, BMSCs, के लिए स्रोत के रूप में ऊतक पुनर्जनन 199522में अपने प्रारंभिक विवरण बाद में उपयोग के लिए जांच की गई है। MSCs निवासी पुनर्योजी कोशिकाओं है कि पाया जा सकता है लगभग किसी भी vascularized ऊतक23में किया जा करने के लिए माना जाता है। इच्छित स्रोत से अलगाव, पर MSCs संस्कृति में आसानी से विस्तार किया जा सकता, व्यापक paracrine की क्षमता है, और अक्सर immunoprivileged या प्रतिरक्षण निश्चायक गुण24,25अधिकारी। उनकी सुरक्षा और प्रभावकारिता पहले से ही कई पूर्व नैदानिक अध्ययन में, विशेष रूप से हृदय पुनर्जनन3,26के लिए दिखाया गया है।

कई एमएससी भेदभाव रणनीतियों औषधीय एजेंट, जैसे 5-azacytidine22 और DMSO27, और विकास या morphogenic कारकों, जैसे BMPs5,7,28,29 या एन्जियोटेन्सिन २30, साथ चर दक्षता का उपयोग करें। इन रणनीतियों, तथापि, बाधाएं है कि एक अनुभवहीन पुनर्योजी सेल होमिंग या चोट की साइट के लिए वितरित किया जा रहा के बाद मुठभेड़ की संभावना है के आधार पर कर रहे हैं नहीं vivo में. Physiologically अधिक प्रासंगिक रणनीतियों, जबकि करने के लिए और अधिक कठिन को परिभाषित और हेरफेर, आधार है कि एमएससी भेदभाव ऊतक microenvironment से संकेतों के माध्यम से प्रेरित किया जा कर सकते हैं पर आधारित कर रहे हैं। पिछले अध्ययनों कि कार्डिएक सेल lysates31 या वेंट्रिकुलर myocardium32,33को जोखिम से पता चला है, या प्रत्यक्ष संपर्क प्राथमिक cardiomyocytes इन विट्रो में15,34, साथ MSCs में कार्डियक मार्करों की अभिव्यक्ति को बढ़ा सकते हैं। भाग में, BMSCs और cardiomyocytes39,40 का विलय नवजात myocardium उत्पन्न, हालांकि दूसरों MSCs35,36,37,38, साथ हृदय चोटों के इलाज के बाद सहज cardiomyogenesis दिखा दिया है। हमारे ज्ञान करने के लिए, कार्यात्मक, अनायास करार cardiomyocytes मानव MSCs (hMSCs) के किसी भी ऊतक स्रोत से अभी तक रिपोर्ट किया गया है नहीं।

वर्तमान आम सहमति कि सभी MSCs perivascular कक्ष23से उत्पन्न होती है। Pericyte गुण के साथ युवा MSCs मानव गर्भनाल ऊतक41,42,43के perivascular क्षेत्र से अलग हो सकता है। की तुलना में BMSCs, HUCPVCs अधिकारी, संभावित वृद्धि भेदभाव और अन्य कई पुनर्योजी फायदे, दोनों इन विट्रो में41,44 और vivo में45,46,47। विशेष रूप से, स्रोत, मातृ-भ्रूण इंटरफ़ेस किया जा रहा HUCPVCs MSCs के वयस्क स्रोतों की तुलना में काफी कम इम्यूनोजेनेसिटी है। जो हम पहले proliferative और उच्च multilineage में वृद्धि हुई है दिखाया है हमारे अनुसंधान के लक्षण वर्णन और FTM HUCPVCs, सबसे कम उम्र के स्रोत की जांच की, MSCs के की पूर्व-नैदानिक अनुप्रयोगों पर केंद्रित भेदभाव क्षमताओं में cardiomyogenic वंश41सहित,।

यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल है कि समग्र गठन और प्राथमिक कार्डिएक सेल फीडर परतों को जोड़ती है आगमनात्मक बलों MSCs. समुच्चय की पूरी cardiomyogenic भिन्नता प्राप्त करने के लिए एक 3 डी वातावरण, जो बेहतर करने के लिए 2D के अनुयायी संस्कृतियों की तुलना में परिस्थितियों में vivo मॉडल उपलब्ध कराने के रूप में मौजूद है। कार्डियक फीडर परतों का उपयोग MSCs के लिए परम ट्रांसप्लांटेशन साइट का प्रतिनिधि है एक वातावरण प्रदान करता है। हम प्रदर्शित करता है कि पूर्व या प्रसवोत्तर गर्भनाल से अलग MSCs के छोटे स्रोत प्रपत्र समुच्चय और कार्डिएक phenotype करने के लिए वयस्क BMSCs, की तुलना में अभी भी उनके प्रतिरक्षा-विशेषाधिकार को बनाए रखते हुए तक पहुँचने के लिए एक उच्च क्षमता है। कार्डियक वंश मार्कर जीन और intracellular की प्रेरित अभिव्यक्ति की खड़ी ऊंचाई के अलावा (यानी, cTnT और MYH6) और कोशिका-सतह प्रोटीन (यानी, SIRPA और Cx43) विशिष्ट cardiomyocytes के लिए, हम कि भेदभाव की क्षमता FTM HUCPVCs की इस विधि के साथ इस्तेमाल किया जा सकता कि वे अनायास cardiomyocyte की तरह कोशिकाओं करार को जन्म दे सकते हैं दिखाने के और।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

स्टेम कोशिकाओं के कार्डियक भेदभाव 2 दशकों से अधिक के लिए विकास cardiomyocyte की तरह कोशिकाओं एमएससी स्रोतों से उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया जा रहा कई अलग अलग रणनीतियों के साथ किया गया है। इन रणनीतियों में से कई बहरहाल, अक्षम हैं, और इस्तेमाल किया शर्तों के पर्यावरण प्रतिरोपित कोशिकाओं मुठभेड़ में vivoके प्रतिनिधि अक्सर नहीं कर रहे हैं।

मौजूदा विधियों के विपरीत, यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल प्राथमिक हृदय फीडर परतों और एमएससी समग्र संरचना का एक संयोजन का इस्तेमाल करता है। प्राथमिक हृदय फीडर परतें एक भेदभाव जो hMSCs पर प्रत्यारोपण करने के लिए उजागर कर रहे हैं कि करने के लिए समान वातावरण प्रदान करते हैं। समुच्चय ऑक्सीजन और पोषक तत्व gradients, जो वंश प्रतिबद्धता की शुरुआत पर एक प्रेरक प्रभाव हो सकता है के साथ एक वातावरण उत्पन्न करते हैं। पीएससी और ESC-आधारित हृदय भेदभाव रणनीतियों हाइपोक्सिक preconditioning का उपयोग और समग्र गठन स्टेम सेल5,52,53पर इस प्रेरक प्रभाव की स्थापना की है। साथ ही, एक 3D संरचना बेहतर सेल करने के लिए कनेक्शन प्रदान किए गए में vivoजैसा दिखता है। इस पद्धति का उपयोग करके, हम सफलतापूर्वक एक hMSC प्रकार यह हमारे ज्ञान को प्राप्त करने में सक्षम था असिंक्रोनस रूप करार hMSC समुच्चय-पहली बार उत्पादन किया। महत्वपूर्ण बात, लागू है, केवल सबसे कम उम्र hMSC सेल स्रोत FTM HUCPVCs, इस की क्षमता का प्रदर्शन किया।

या तो अनुभवहीन या पूर्व विभेदित MSCs ESCs या पीएससी पर कार्डियक पुनर्जनन के लिए का उपयोग कर के एक महत्वपूर्ण लाभ उनके प्रतिरक्षण निश्चायक या immunoprivileged गुण में निहित है। हालांकि, MSCs के मामले में भी, प्रतिरक्षण निश्चायक गुणों के साथ उनकी उम्र और स्रोत54अलग-अलग। BMSCs उनके immunogenic गुण पश्चात भेदभाव, जो अक्सर आरोपण55पर उनकी अस्वीकृति के लिए जाता है परिवर्तित करने के लिए दिखाया गया है। पहले के रूप में वर्णित, गर्भनाल से MSCs मूल के अधिकारी अपने में इसमें मूल कारण विशेष प्रतिरक्षा विशेषाधिकार56 । प्रोटोकॉल का उपयोग करके भी cardiomyocyte की तरह कोशिकाओं, शब्द और FTM HUCPVCs में भेदभाव एचएलए-जी (है कि सक्रिय रूप से सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया attenuates) का उच्च स्तर प्रदर्शित करने के बाद, ऊपर वर्णित और एचएलए-ए (T-सेल मध्यस्थता cytotoxicity निर्धारित करता है कि) निम्न स्तर बनाए रखा।

इस भेदभाव प्रोटोकॉल सुविधा विश्लेषण के अनेक स्तरों के लिए अनुमति देने के लाभ है। पहले, लाइव इमेजिंग समुच्चय करार के कार्यात्मक, एकल कक्षों भेद एक फीडर परत में एकीकृत से अधिक व्यावहारिक है। मिश्रित प्रजातियों सह संस्कृतियों प्रोटोकॉल का उपयोग करता है के रूप में, मानव-विशिष्ट प्राइमरों qPCR विश्लेषण करने के लिए लागू कर रहे हैं FACS और आईसीसी phenotype-विशेष रूप से, यह तेजी से पहचान प्रदान करते हैं, जबकि हृदय मार्कर अभिव्यक्ति (चित्रा 2)। प्रोटोकॉल का उपयोग कर के रूप में वर्णित, SIRPA, cTnT, MYH6, aSarc, Mef2c, और Cx43 का ऊंचा स्तर पाए गए। HuNu के साथ संयोजन के रूप में, यह Mef2c और विभेदित hMSCs में aSarc की अभिव्यक्ति की पहचान करने के लिए और चूहा फीडर cardiomyocyte निकाली गई परतों या आपस में जुड़े कोशिकाओं से अंतर करने के लिए संभव है। जबकि फीडर परत पर करार समुच्चय की पहचान अपेक्षाकृत आसान है, एकत्रित करना या उन्हें कटाई कमी पैदा कर सकते हैं। सूक्ष्मदर्शी के साथ एक micromanipulator से लैस इस चुनौती को हैंडल करने के लिए नियोजित किया जा सकता। वैकल्पिक रूप से, मानव कोशिकाओं कुशलता से सह संस्कृतियों से मानव-विशिष्ट एंटी-TRA-1-85 एंटीबॉडी का उपयोग कर हल किया जा कर सकते हैं। जबकि सह संस्कृतियों भी संभावित सेल फ्यूजन की चुनौती मौजूद है, यह भी परमाणु और कोशिका-सतह मानव मार्कर tracers (अनुपूरक चित्र 1) का एक संयोजन का उपयोग करके दूर किया जा सकता।

हमारे भेदभाव विधि के एक संभव संशोधन समुच्चय के गठन को समायोजित करने के लिए है। कुल आकार इष्टतम भेदभाव के लिए एक महत्वपूर्ण पैरामीटर हो सकता है कि हमारे परिणाम सुझाव है। यह मानते हुए कि एकत्रीकरण के लिए अधिक चिपकने वाला कक्ष चयनित है, यह एक पूर्व चयन चरण CD49f सकारात्मक hMSCs के लिए के रूप में कार्य कर सकते हैं। एन्हांस्ड एमएससी क्षेत्र गठन CD49f अभिव्यक्ति49में वृद्धि करने के लिए जोड़ा गया है, और CD49f भी उच्च stemness के साथ जुड़ा हुआ है क्योंकि यह सीधे कनेक्टेड है के लिए SOX2 और OCT449। हम CD49f-सकारात्मक FTM HUCPVCs, जो कम समग्र आकार स्वीकार्य समझा सकता है करने के लिए की तुलना में hMSCs के पुराने सूत्रों में कक्षों की कम संख्या मनाया। हम इस चयन के लिए एक उच्च कुल आकार को प्राप्त करने के लिए कुल प्रति hMSCs की संख्या में वृद्धि से भरपाई हो सकती है कि इस प्रकार संभवतः एकत्रीकरण-प्रेरित भेदभाव की दक्षता बढ़ाने कि सिद्धांत है।

भविष्य अनुप्रयोगों के रूप में अच्छी तरह से प्रोटोकॉल में संशोधन पड़ सकता है। यह पूर्व विभेदित hMSCs के नैदानिक अनुप्रयोगों xeno-मुक्त स्थिति में जगह ले आवश्यक है। करार समुच्चय इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर उत्पादन इंजीनियर दिल मांसपेशियों के ऊतकों के निर्माण के लिए भी किया जा सकता। एक चिकित्सकीय लागू उत्पाद का उत्पादन करने के लिए, एक cGMP-समर्थक वर्कफ़्लो आवश्यक है। Xeno-नि: शुल्क संस्कृति मध्यम hMSCs के लिए उपलब्ध है, जबकि एक फीडर पशु-नि: शुल्क परत प्रदान चुनौतीपूर्ण हो सकता है। हालांकि, अन्य स्टेम सेल स्रोतों, iPSCs, जैसे की पूर्व विभेदित फीडर परतों लागू एक संभव समाधान है।

अंत में, वर्णित भिन्नता विधि एक सुविधाजनक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य ढंग से hMSCs के युवा स्रोतों से कार्यात्मक cardiomyocyte की तरह कोशिकाओं का उत्पादन करने के लिए लागू किया जा सकता।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dr. क्लिफर्ड एल Librach पेटेंट के संयुक्त धारक है: कनाडा और ऑस्ट्रेलिया में दी अलगाव और पहली तिमाही गर्भनाल ऊतक से व्युत्पन्न कोशिकाओं के उपयोग के तरीके

Acknowledgments

लेखक निम्नलिखित स्टाफ के सदस्यों को धन्यवाद और अनुसंधान कर्मियों उनके योगदान के लिए: मैथ्यू Librach, लीला Maghen, तान्या a. Baretto, Shlomit Kenigsberg, और Andrée Gauthier-फिशर। यह काम ओंटारियो अनुसंधान कोष द्वारा - (ORF-फिर, दौर #7) अनुसंधान उत्कृष्टता और कार्यक्रम इंक बनाने समर्थित किया गया था

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin/EDTA Gibco 25200056 For cell dissociation
Alpha-MEM Gibco 12571071 For HUCPVC and BMSC culture media.
PE-conjugated anti-human/mouse CD49f antibody Biolegend 313612 Integrin marker for FC
APC-conjugated human Cx43/GJA1 antibody R&D Systems FAB7737A Connexin 43 marker for FC
FITC-conjugated HLA-A2 antibody Genway Biotech Inc. GWB-66FBD2 Immunogenicity marker for FC
FITC-conjugated anti-HLA-G [MEM-G/9] antibody Abcam ab7904 Immunogenicity marker for FC
FITC-conjugated mouse anti-human SIRPA/CD172a antibody AbD Serotec/Bio-Rad MCA2518F Cardiac marker for FC
APC-conjugated human TRA-1-85/CD147 antibody R&D Systems FAB3195A Human cell marker for FC and FACS
FITC-conjugated human TRA-1-85/CD147 antibody R&D Systems FAB3195F Human cell marker for FC and FACS
Anti-connexin 43/GJA1 antibody Abcam ab11370 Cx43. For ICC
Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 Life Technologies A-21428 For ICC
Anti-sarcomeric alpha actinin [EA-53] antibody Abcam ab9465 aSARC. For ICC
Goat anti-mouse IgM heavy chain cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 Life Technologies A-21426 For ICC
Mef2C (D80C1) XP rabbit antibody New England BioLabs Ltd. 5030S For ICC
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 Life Technologies A-21206 For ICC
Anti-nuclei (HuNu) (clone 235-1) antibody EMD Millipore MAB1281 For ICC
MZ9.5 Stereomicroscope Leica For imaging aggregates.
1.5 ml centrifuge microtubes Axygen MCT-150-C For staining MSCs with fluorescent dye.
ImageJ Open source image processing software.
Aria II  BD UHN SickKids FC Facility. For cell sorting.
Bone marrow mesechymal stromal cells Lonza PT-2501 BMSCs
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7030-100G BSA. To prepare solutions for ICC
BrdU EMD Millipore MAB3424 Caution: BrdU is a strong teratogen and suspected mutagen. Please ensure proper training and refer to the SDS before use.
Canto II BD UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry.
cDNA EcoDry Premix Clontech/Takara 639570 For preparation of cDNA for qPCR
CellTracker Green CMFDA Dye Life Technologies C7025 Fluorescent imaging of cell cytoplasm
Countess automated cell counter Invitrogen Inc. C10227 For cell counting
DMEM-F12 Sigma-Aldrich D6421 For rat primary cardiomyocyte culture medium.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco 10010023 D-PBS, without Ca2+, Mg2+
EVOS Life Technologies In-house fluorescent microscope
FACSCalibur BD In-house. For flow cytometry.
Fetal bovine serum (Hyclone) GE Healthcare SH3039603 FBS. Component of cell culture medium.
IDT Prime Time qPCR probes Integrated Data Technologies FAM fluorophore http://www.idtdna.com/pages/products/gene-expression/primetime-qpcr-assays-and-primers
Lab Vision PermaFluor Aqueous Mounting Medium ThermoScientific TA-030-FM For storage of cells to undergo ICC
LSR II  BD UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry.
MoFlo Astrios Beckman Coulter UHN SickKids FC Facility. For cell sorting.
Normal goat serum Cell Signaling Technology 5425S NGS. Used in blocking solution for ICC
Nunc Lab-Tek II Chamber Coverglass, 8-wells Thermo Scientific Nunc 155409 To prepare samples for ICC
OmniPur Triton X-100 Surfactant EMD Millipore 9410-OP As a component of permeabilizing solution when preparing cells for ICC
Paraformaldehyde, 16% Solution, EM Grade Electron Microscopy Sciences 15710 For fixing cells for ICC.
Penicillin/streptomycin Gibco 15140122 Component of cell culture medium.
Primers Sigma Custom Standard DNA Oligos, Desalted, 0.2 μmol CTnT_F: GGC AGC GGA AGA GGA TGC TGA A; CTnT_R: GAG GCA CCA AGT TGG GCA TGA ACG A; MYH6 F: GCA AAG TAC TGG ATG ACA CGC T; MYH6 R: GTC ATT GCT GAA ACC GAG AAT G
Quorum Spinning Disk Confocal Zeiss SickKids Imaging Facility
ReproCardio hiPS cell derived cardiomyocytes ReproCell RCD001N Positive control for qPCR
RNeasy mini kit Qiagen 74106 To isolate RNA for qPCR
Rotor-Gene SYBR Green PCR Kit Qiagen 204074 For qPCR with master mix
RPMI 1640 Gibco A1049101 For MSC, monocyte coculture medium.
TaqMan qPCR primer assays Thermo Fisher Scientific 4444556 For qPCR
Trypan Blue Life Technologies T10282 Staining of cells for viability and counting
Trypsin Gibco 272500108 For cell dissociation
Volocity Perkin-Elmer Volocity 6.3 Imaging software
0.2 μm pore filter Thermo Fisher Scientific 566-0020 For sterilizing tissue culture media
HERAcell 150i CO2 Incubator Thermo Fisher Scientific 51026410 For incubating cells
Dulbecco's phosphate buffered saline Sigma-Aldrich D8537 PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride
Forceps Almedic 7727-A10-704 For handing rat heart. Can use any similar forceps.
Scissors Fine Science Tools 14059-11 For mincing rat heart. Curved scissors recommended.
50 mL tube BD Falcon 352070 For collection during cardiomyocyte collection and general tissue culture procedures
15 mL tube BD Falcon 352096 For general tissue culture procedures
6-well plates Thermo Scientific Nunc CA73520-906 For tissue culture
10 cm tissue culture dishes Corning 25382-428 For aggregate formation
Axiovert 40C Microscope Zeiss For bright-field imaging through out tissue culture and the rest of the protocol
70 μm cell strainer Fisherbrand 22363548 To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting
Triton X-100 EMD Millipore 9410-1L Used in permeabilization solution for ICC
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H1399 Stain used during visualization of Cx43 localization

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Badano, L. P., et al. Prevalence, clinical characteristics, quality of life, and prognosis of patients with congestive heart failure and isolated left ventricular diastolic dysfunction. J Am Soc Echocardiogr. 17, (3), 253-261 (2004).
  2. Leri, A., Kajstura, J., Anversa, P. Cardiac stem cells and mechanisms of myocardial regeneration. Physiol Rev. 85, (4), 1373-1416 (2005).
  3. Orlic, D., et al. Mobilized bone marrow cells repair the infarcted heart, improving function and survival. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, (18), 10344-10349 (2001).
  4. Schuster, M. D., et al. Myocardial neovascularization by bone marrow angioblasts results in cardiomyocyte regeneration. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287, (2), 525-532 (2004).
  5. Zandstra, P. W., et al. Scalable production of embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Tissue Eng. 9, (4), 767-778 (2003).
  6. Boheler, K. R., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into cardiomyocytes. Circ Res. 91, (3), 189-201 (2002).
  7. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8, (2), 228-240 (2011).
  8. Dixon, J. E., Dick, E., Rajamohan, D., Shakesheff, K. M., Denning, C. Directed differentiation of human embryonic stem cells to interrogate the cardiac gene regulatory network. Mol Ther. 19, (9), 1695-1703 (2011).
  9. Stennard, F. A., et al. Cardiac T-box factor Tbx20 directly interacts with Nkx2-5, GATA4, and GATA5 in regulation of gene expression in the developing heart. Dev Biol. 262, (2), 206-224 (2003).
  10. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29, (11), 1011-1018 (2011).
  11. Panteghini, M. Present issues in the determination of troponins and other markers of cardiac damage. Clin Biochem. 33, (3), 161-166 (2000).
  12. Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25, (4), 929-938 (2007).
  13. Ovchinnikov, D. A., et al. Isolation of contractile cardiomyocytes from human pluripotent stem-cell-derived cardiomyogenic cultures using a human NCX1-EGFP reporter. Stem Cells Dev. 24, (1), 11-20 (2015).
  14. Moscoso, I., et al. Differentiation "in vitro" of primary and immortalized porcine mesenchymal stem cells into cardiomyocytes for cell transplantation. Transplant Proc. 37, (1), 481-482 (2005).
  15. Ramkisoensing, A. A., et al. Gap junctional coupling with cardiomyocytes is necessary but not sufficient for cardiomyogenic differentiation of cocultured human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30, (6), 1236-1245 (2012).
  16. van Kempen, M., et al. Expression of the electrophysiological system during murine embryonic stem cell cardiac differentiation. Cell Physiol Biochem. 13, (5), 263-270 (2003).
  17. Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ Res. 111, (3), 344-358 (2012).
  18. Puceat, M. Protocols for cardiac differentiation of embryonic stem cells. Methods. 45, (2), 168-171 (2008).
  19. Naito, H., et al. Optimizing engineered heart tissue for therapeutic applications as surrogate heart muscle. Circulation. 114, 1 Suppl 72-78 (2006).
  20. Zimmermann, W. H., et al. Heart muscle engineering: an update on cardiac muscle replacement therapy. Cardiovasc Res. 71, (3), 419-429 (2006).
  21. Hulot, J. S., et al. Considerations for pre-clinical models and clinical trials of pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Res Ther. 5, (1), 1 (2014).
  22. Wakitani, S., Saito, T., Caplan, A. I. Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve. 18, (12), 1417-1426 (1995).
  23. Caplan, A. I. Adult Mesenchymal Stem Cells: When, Where, and How. Stem Cells Int. 2015, 628767 (2015).
  24. Burchfield, J. S., Dimmeler, S. Role of paracrine factors in stem and progenitor cell mediated cardiac repair and tissue fibrosis. Fibrogenesis Tissue Repair. 1, (1), 4 (2008).
  25. Hsiao, S. T., et al. Comparative analysis of paracrine factor expression in human adult mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose, and dermal tissue. Stem Cells Dev. 21, (12), 2189-2203 (2012).
  26. Tomita, S., et al. Autologous transplantation of bone marrow cells improves damaged heart function. Circulation. 100, 19 Suppl 247-256 (1999).
  27. Skerjanc, I. S. Cardiac and skeletal muscle development in P19 embryonal carcinoma cells. Trends Cardiovasc Med. 9, (5), 139-143 (1999).
  28. Hou, J., et al. Combination of BMP-2 and 5-AZA is advantageous in rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells differentiation into cardiomyocytes. Cell Biol Int. 37, (12), 1291-1299 (2013).
  29. Yoon, J., et al. Differentiation, engraftment and functional effects of pre-treated mesenchymal stem cells in a rat myocardial infarct model. Acta Cardiol. 60, (3), 277-284 (2005).
  30. Xing, Y., Lv, A., Wang, L., Yan, X. The combination of angiotensin II and 5-azacytidine promotes cardiomyocyte differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells. Mol Cell Biochem. 360, (1-2), 279-287 (2012).
  31. Yuan, Y., et al. Differentiation of mesenchymal stem cells into cardio myogenic cells under the induction of myocardial cell lysate. Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi. 33, (2), 170-173 (2005).
  32. Toma, C., Pittenger, M. F., Cahill, K. S., Byrne, B. J., Kessler, P. D. Human mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotype in the adult murine heart. Circulation. 105, (1), 93-98 (2002).
  33. Yannarelli, G., et al. Donor mesenchymal stromal cells (MSCs) undergo variable cardiac reprogramming in vivo and predominantly co-express cardiac and stromal determinants after experimental acute myocardial infarction. Stem Cell Rev. 10, (2), 304-315 (2014).
  34. Rangappa, S., Entwistle, J. W., Wechsler, A. S., Kresh, J. Y. Cardiomyocyte-mediated contact programs human mesenchymal stem cells to express cardiogenic phenotype. J Thorac Cardiovasc Surg. 126, (1), 124-132 (2003).
  35. Bakogiannis, C., et al. Circulating endothelial progenitor cells as biomarkers for prediction of cardiovascular outcomes. Curr Med Chem. 19, (16), 2597-2604 (2012).
  36. Deb, A., et al. Bone marrow-derived cardiomyocytes are present in adult human heart: A study of gender-mismatched bone marrow transplantation patients. Circulation. 107, (9), 1247-1249 (2003).
  37. Laflamme, M. A., Myerson, D., Saffitz, J. E., Murry, C. E. Evidence for cardiomyocyte repopulation by extracardiac progenitors in transplanted human hearts. Circ Res. 90, (6), 634-640 (2002).
  38. Quaini, F., et al. Chimerism of the transplanted heart. N Engl J Med. 346, (1), 5-15 (2002).
  39. Alvarez-Dolado, M., et al. Fusion of bone-marrow-derived cells with Purkinje neurons, cardiomyocytes and hepatocytes. Nature. 425, (6961), 968-973 (2003).
  40. Nygren, J. M., et al. Bone marrow-derived hematopoietic cells generate cardiomyocytes at a low frequency through cell fusion, but not transdifferentiation. Nat Med. 10, (5), 494-501 (2004).
  41. Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells Dev. 22, (17), 2425-2439 (2013).
  42. Sarugaser, R., Ennis, J., Stanford, W. L., Davies, J. E. Isolation, propagation, and characterization of human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs). Methods Mol Biol. 482, 269-279 (2009).
  43. Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: a source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23, (2), 220-229 (2005).
  44. Kadivar, M., et al. In vitro cardiomyogenic potential of human umbilical vein-derived mesenchymal stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 340, (2), 639-647 (2006).
  45. Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 25, (6), 1384-1392 (2007).
  46. Wu, K. H., et al. Cardiac potential of stem cells from whole human umbilical cord tissue. J Cell Biochem. 107, (5), 926-932 (2009).
  47. Yannarelli, G., et al. Human umbilical cord perivascular cells exhibit enhanced cardiomyocyte reprogramming and cardiac function after experimental acute myocardial infarction. Cell Transplant. 22, (9), 1651-1666 (2013).
  48. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. J Pharmacol Pharmacother. 1, (2), 94-99 (2010).
  49. Yu, K. R., et al. CD49f enhances multipotency and maintains stemness through the direct regulation of OCT4 and SOX2. Stem Cells. 30, (5), 876-887 (2012).
  50. Lee, R. H., et al. The CD34-like protein PODXL and alpha6-integrin (CD49f) identify early progenitor MSCs with increased clonogenicity and migration to infarcted heart in mice. Blood. 113, (4), 816-826 (2009).
  51. Szaraz, P., et al. In Vitro Differentiation of First Trimester Human Umbilical Cord Perivascular Cells into Contracting Cardiomyocyte-Like Cells. Stem Cells Int. 2016, 7513252 (2016).
  52. Bauwens, C., Yin, T., Dang, S., Peerani, R., Zandstra, P. W. Development of a perfusion fed bioreactor for embryonic stem cell-derived cardiomyocyte generation: oxygen-mediated enhancement of cardiomyocyte output. Biotechnol Bioeng. 90, (4), 452-461 (2005).
  53. Jing, D., Parikh, A., Tzanakakis, E. S. Cardiac cell generation from encapsulated embryonic stem cells in static and scalable culture systems. Cell Transplant. 19, (11), 1397-1412 (2010).
  54. Hare, J. M., et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial. JAMA. 308, (22), 2369-2379 (2012).
  55. Huang, X. P., et al. Differentiation of allogeneic mesenchymal stem cells induces immunogenicity and limits their long-term benefits for myocardial repair. Circulation. 122, (23), 2419-2429 (2010).
  56. Hare, J. M., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (prochymal) after acute myocardial infarction. J Am Coll Cardiol. 54, (24), 2277-2286 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics