In Vitro Diferenciação de células-tronco mesenquimais humanas em células casos funcionais

* These authors contributed equally
Developmental Biology

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Summary

Aqui, apresentamos um método para eficientemente aproveitar o potencial de diferenciação cardíaca da jovens fontes de células-tronco mesenquimais humanas a fim de gerar células funcionais, contratantes, casos, como in vitro.

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Szaraz, P., Gratch, Y. S., Iqbal, F., Librach, C. L. In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells. J. Vis. Exp. (126), e55757, doi:10.3791/55757 (2017).

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Abstract

Infarto do miocárdio e a subsequente cascata isquêmica resultam na perda extensa de cardiomyocytes, levando à insuficiência cardíaca congestiva, a principal causa de mortalidade em todo o mundo. Células-tronco mesenquimais (MSCs) são uma opção promissora das terapias baseadas em células substituir as técnicas atuais, invasivas. MSCs podem diferenciar em linhagens mesenquimais, incluindo tipos de células cardíacas, mas completa diferenciação em células funcionais ainda não foi alcançada. Métodos anteriores de diferenciação foram baseados em agentes farmacológicos ou fatores de crescimento. No entanto, estratégias mais fisiologicamente relevantes também podem habilitar o MSCs submeter-se a transformação do cardiomyogenic. Aqui, apresentamos um método de diferenciação usando MSC agregados em camadas de alimentador de casos para produzir células contratantes casos.

Cordão humano perivasculares células (HUCPVCs) foram mostradas para ter uma maior diferenciação potencial do que comumente investigados tipos MSC, tais como a medula óssea MSCs (BMSCs). Como uma fonte de ontogenetically mais jovem, nós investigamos o potencial de cardiomyogenic de HUCPVCs de (FTM) do primeiro trimestre em comparação com as fontes mais antigas. FTM HUCPVCs são uma fonte rica, romance de MSCs que retêm suas no utero immunoprivileged Propriedades quando cultivadas em vitro. Usando este protocolo de diferenciação, FTM e termo HUCPVCs alcançado cardiomyogenic significativamente maior diferenciação em relação ao BMSCs, conforme indicado pelo aumento da expressão de marcadores de casos (ou seja, miócito factor potenciador 2C, troponina cardíaca T, cardíaco miosina de cadeia pesada, α proteína reguladora de sinal e connexin 43). Eles também mantiveram significativamente mais baixa imunogenicidade, como demonstrado pela sua menor expressão de HLA-A e HLA-G maior. Aplicação de diferenciação baseada no agregado, FTM HUCPVCs mostrou maior formação de agregados potenciais e gerado contratação aglomerados de células dentro de 1 semana de co-cultura sobre camadas cardíacas alimentador, tornando-se o primeiro tipo MSC a fazê-lo.

Nossos resultados demonstram que esta estratégia de diferenciação pode efetivamente aproveitar o potencial de cardiomyogenic da jovens MSCs, tais como FTM HUCPVCs e sugere que em vitro pre-diferenciação poderia ser uma estratégia potencial para aumentar sua eficácia regenerativa em vivo.

Introduction

Insuficiência cardíaca congestiva (ICC) persiste como das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. CHF ocorre frequentemente após a perda maciça de cardiomyocytes e o desenvolvimento do tecido de cicatriz sem célula como resultado patológico de um infarto do miocárdio (MI)1. Enquanto o coração é um órgão parcialmente auto renovadora, a residente tronco progenitoras célula piscina e responsável pela execução de regeneração tecidual significativamente diminui em abundância e função em pacientes idosos, muitas vezes tornando-se insuficiente para a recuperação ideal após a lesão. Assim, há grande interesse no desenvolvimento de tratamentos experimentais que envolvem o transplante de células de doadores saudáveis para o miocárdio danificado. É imperativo que as células do doador não só restaurar a estrutura do tecido, mas também alcançar a recuperação funcional do miocárdio afetado.

O coração nativo emprega coração tecido-residente e endógenas células-tronco da medula óssea-originou para pós-lesão reparar2,3,4. Regenerativa células-host e doador derivada de iguais, deve ter a capacidade de obter o fenótipo apropriado e a função do microambiente do miocárdio remodelação, juntamente com a capacidade de forma eficiente e segura a substituir as células perdidas. Métodos de diferenciação in vitro têm sido amplamente utilizados para alcançar alta eficiência, com base em células estaminais casos produção5,6. O perfil de expressão de marcadores de linhagem cardíaca é usado para definir o processo de diferenciação de células-tronco para a linhagem cardíaca7. Início diferenciação marcadores, tais como NKX2.5, factor potenciador de miócito 2C (Mef2c) e GATA48,9, podem ser uma indicação do início do processo de cardiomyogenic. Marcadores de casos maduro, comumente usados para avaliar a eficácia de diferenciação são sinal proteína reguladora α (SIRPA)10, troponina cardíaca T (miocardite)11, cadeia pesada miosina cardíaca (MYH6)8,12,13e connexin 43 (Cx43)14,15,16. Os métodos usando células-tronco embrionárias (CES) e as células-tronco pluripotentes (EPS) foram cuidadosamente otimizados e discutidos sobre os detalhes de fatores indutivos, oxigênio e nutrientes gradientes e o momento exato da ação5,6,7,17,18. No entanto, ESC e PSC-com base em tecnologias ainda apresentam várias preocupações éticas e de segurança, juntamente com características eletrofisiológicas e imunológicos suboptimal19,20. Hosts transplantados com estas células frequentemente experimentam immunorejection e requerem imunossupressão permanente. Isto é principalmente devido ao descasamento de histocompatibilidade (MHC) as moléculas complexas no host e o doador e o resultante de resposta de células T21. Enquanto indivíduo MHC classe I de correspondência é uma solução possível, uma prática clínica mais acessível exigiria uma fonte de celular que é universalmente immunoprivileged superar a preocupação de rejeição.

Como uma fonte alternativa de células para uso em aplicações clínicas, MSCs e em particular, BMSCs, têm sido investigados para uso na regeneração de tecidos desde sua descrição inicial em 199522. MSCs são acreditados para ser residentes células regenerativas que podem ser encontradas em quase qualquer tecido vascularizado23. Após o isolamento da fonte desejada, MSCs podem facilmente ser expandidos na cultura, têm capacidade extensa parácrina e frequentemente possuem immunoprivileged ou imunomoduladores propriedades24,25. Sua segurança e eficácia já foram mostrados em diversos estudos pré-clínicos, em particular para regeneração cardíaca3,26.

Muitas estratégias de diferenciação de MSC utilizam agentes farmacológicos, tais como azacytidine 522 e DMSO27e crescimento ou fatores morphogenic, BMPs5,7,28,29 ou da angiotensina-II30, com eficiência variável. Estas estratégias, no entanto, não se baseiam os obstáculos que um celular regenerativa ingênuo é provável encontrar depois de hospedagens ou sendo entregue para o local da lesão in vivo. Estratégias mais fisiologicamente relevantes, embora mais difícil de definir e manipular, baseiam-se na premissa de que a diferenciação de MSC pode ser induzida através de sinais do microambiente do tecido em si. Estudos anteriores mostraram que a exposição à célula cardíaca lysates31 ou32,de miocárdio ventricular33, ou direto contato com cardiomyocytes primária em vitro15,34, pode aumentar a expressão dos marcadores cardíacos no MSCs. Outros demonstraram cardiomyogenesis espontânea após o tratamento de lesões cardíacas com MSCs35,36,37,38, embora em parte, a fusão de BMSCs e cardiomyocytes39,40 gerado o miocárdio nascente. A nosso conhecimento, funcionais, espontaneamente contratantes cardiomyocytes do MSCs humanas (hMSCs) de qualquer fonte de tecidos ainda não foram relatados.

O consenso atual é que todos os MSCs surgem a partir de células perivasculares23. Young MSCs com Pericito propriedades podem ser isolados da região perivascular de4342,41,do tecido humano do cordão umbilical. Em comparação com BMSCs, HUCPVCs possuem potencial maior diferenciação e várias outras vantagens regenerativas, ambos em vitro41,44 e na vivo45,46,47. Notavelmente, a fonte, sendo a interface materno-fetal, HUCPVCs têm significativamente mais baixa imunogenicidade em comparação com adultas fontes do MSCs. Nossa pesquisa centra-se na caracterização e aplicações pré-clínicas de FTM HUCPVCs, a mais nova fonte de MSCs investigados, que mostramos anteriormente ter aumentado multilineage proliferativa e maior capacidade de diferenciação, incluindo a linhagem de cardiomyogenic41.

Aqui, apresentamos um protocolo que combina a formação de agregados e camadas de alimentador primário de células cardíacas como indutivas forças para alcançar a diferenciação de cardiomyogenic completa de MSCs. agregados fornecem um ambiente 3D, que modela melhor condições em vivo em comparação com as culturas aderentes 2D. Utilizar camadas cardíacas alimentador fornece um ambiente que é representante do site do transplante final para os MSCs. Demonstramos que fontes mais jovens de MSCs isoladas de cordões umbilicais de pré ou pós-natal têm uma maior capacidade para agregados de forma e atingir o fenótipo cardíaco em comparação com BMSCs adultos, mantendo ainda o seu privilégio imunológico. Além da elevação íngreme de genes marcadores de linhagem cardíaca e a expressão induzida de intracelular (i.e., miocardite e MYH6) e as proteínas da pilha-superfície (i.e., SIRPA e Cx43) específicos para cardiomyocytes, mostramos que o potencial de diferenciação da FTM HUCPVCs pode ser aproveitado com esse método e que eles podem dar origem a contratantes espontaneamente células casos.

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Discussion

A diferenciação cardíaca de células-tronco tem sido sob desenvolvimento por mais de 2 décadas, com várias estratégias diferentes, sendo usadas para gerar células casos de fontes MSC. Muitas destas estratégias, no entanto, são ineficientes, e as condições usadas frequentemente não são representativas do ambiente transplantada células encontro na vivo.

Em contraste com os métodos existentes, o protocolo aqui apresentado utiliza uma combinação de camadas de alimentador cardíaca primária e formação de agregados de MSC. As camadas de primário alimentador cardíaca fornecem um ambiente de diferenciação semelhante a isto que os hMSCs estão expostos a após transplante. Os agregados geram um ambiente com gradientes de oxigénio e nutrientes, que podem ter um efeito indutivo sobre iniciando compromisso linhagem. PSC e ESC-com base em estratégias de diferenciação cardíaca usando pré-condicionamento hipóxica e formação de agregados estabeleceram esse efeito indutivo sobre células-tronco5,52,53. Além disso, uma estrutura 3D melhor assemelha-se a ligações de celular para celular fornecidas em vivo. Usando esse método, produzimos com êxito sincronicamente contratantes hMSC agregados, a primeira vez que um tipo de hMSC foi capaz de alcançar este objectivo, a nosso conhecimento. Importante, só o caçula hMSC célula fonte aplicado, FTM HUCPVCs, exibiu essa capacidade.

Uma vantagem significativa de uso ingênuo ou MSCs pre-diferenciadas sobre CES ou EPS para regeneração cardíaca encontra-se em suas propriedades immunomodulatory ou immunoprivileged. No entanto, mesmo no caso de MSCs, imunomodulador Propriedades variam de acordo com sua idade e origem54. BMSCs foram mostrados para alterar sua pós-diferenciação Propriedades imunogênicas, que muitas vezes leva à sua rejeição mediante implantação de55. Como descrito anteriormente, MSCs do cordão umbilical origem possuem privilégio especial imune56 devido a sua origem no útero . Usando o protocolo descrito acima, mesmo depois de diferenciação em células de casos semelhantes, termo e FTM HUCPVCs expostos a altos níveis de HLA-G (que ativamente atenua a resposta imune inata) e mantido a níveis baixos de HLA-A (que determina a células T mediada por citotoxicidade).

Este protocolo de diferenciação tem a vantagem de permitir convenientemente para vários níveis de análise. Primeiro, a imagem ao vivo de funcional, contratação de agregados é mais viável do que distinguir células únicas integrados em uma camada de alimentador. Como o protocolo utiliza co culturas misturadas-espécie, primers específicos humanos são aplicados à análise de qPCR, enquanto FACS e ICC fornecem a identificação rápida de fenótipo-especificamente, expressão marcador cardíaco (Figura 2). Usando o protocolo conforme descrito, foram detectados níveis elevados de SIRPA, miocardite, MYH6, aSarc, Mef2c e Cx43. Em conjunto com HuNu, é possível identificar a expressão de Mef2c e aSarc em hMSCs diferenciadas e para distinguir as camadas de alimentador de casos-derivado de rato ou células fundidas. Enquanto a identificação dos contratantes agregados na camada do alimentador é relativamente fácil, coleta ou colheita-los pode representar uma limitação. Microscópios, equipados com um micromanipulador podem ser empregados para lidar com este desafio. Como alternativa, células humanas podem ser classificadas com eficiência de culturas co usando anticorpos anti-TRA-1-85 de humanos específicos. Enquanto as culturas co também apresentam o desafio de potencial fusão celular, isso também pode ser superado usando uma combinação de marcadores marcador humana nuclear e da pilha-superfície (complementar a Figura 1).

Uma eventual modificação do nosso método de diferenciação é ajustar a formação de agregados. Nossos resultados sugerem que o tamanho agregado pode ser um parâmetro crítico de diferenciação ideal. Supondo que a agregação é seletiva para células mais adesivas, ele pode atuar como uma etapa de pré-seleção para hMSCs de CD49f-positivo. Maior formação de esfera MSC tem sido associada a aumento de expressão CD49f49, e CD49f também está associada com maior stemness, porque ele está diretamente ligado a SOX2 e OCT449. Observamos os números mais baixos de células CD49f-positivo em fontes mais antigas de hMSCs comparado com HUCPVCs FTM, o que poderia explicar o tamanho agregado diminuição observado. Podemos teorizar que esta selecção pode ser compensada pelo aumento do número de hMSCs por agregado para atingir um tamanho maior de agregação, possivelmente aumentando assim a eficiência da agregação induzida por diferenciação.

Futuras aplicações podem exigir modificações para o protocolo também. É imperativo que aplicações clínicas de hMSCs pre-diferenciada realizar-se em condições de xeno-livre. Os contratantes agregados produzidos usando este protocolo também podem ser usados para a criação de tecidos do músculo de coração engenharia. Para produzir um produto clinicamente aplicável, um fluxo de trabalho compatíveis com o cGMP é necessário. Enquanto meio de cultura de xeno-livre está disponível para hMSCs, fornecer uma camada de alimentação animal-free pode ser um desafio. No entanto, aplicar camadas pré-diferenciadas alimentador de outras fontes de células-tronco, tais como iPSCs, é uma solução possível.

Em conclusão, o método de diferenciação descrito pode ser aplicado para produzir funcionais células casos de jovens fontes de hMSCs de forma conveniente e reprodutível.

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Disclosures

Dr. Clifford L. Librach é co-titular da patente: métodos de isolamento e o uso de células derivadas de tecido de cordão umbilical do primeiro trimestre, concedido no Canadá e Austrália.

Acknowledgments

Os autores agradecer os seguintes membros de pessoal e investigação pessoal para suas contribuições: Matthew Librach, Leila Maghen, Tanya A. Baretto, Shlomit Kenigsberg e Andrée Gauthier-Fisher. Este trabalho foi financiado pelo fundo de pesquisa The Ontário - excelência em pesquisa (ORF-RE, rodada #7) e criar programa Inc..

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin/EDTA Gibco 25200056 For cell dissociation
Alpha-MEM Gibco 12571071 For HUCPVC and BMSC culture media.
PE-conjugated anti-human/mouse CD49f antibody Biolegend 313612 Integrin marker for FC
APC-conjugated human Cx43/GJA1 antibody R&D Systems FAB7737A Connexin 43 marker for FC
FITC-conjugated HLA-A2 antibody Genway Biotech Inc. GWB-66FBD2 Immunogenicity marker for FC
FITC-conjugated anti-HLA-G [MEM-G/9] antibody Abcam ab7904 Immunogenicity marker for FC
FITC-conjugated mouse anti-human SIRPA/CD172a antibody AbD Serotec/Bio-Rad MCA2518F Cardiac marker for FC
APC-conjugated human TRA-1-85/CD147 antibody R&D Systems FAB3195A Human cell marker for FC and FACS
FITC-conjugated human TRA-1-85/CD147 antibody R&D Systems FAB3195F Human cell marker for FC and FACS
Anti-connexin 43/GJA1 antibody Abcam ab11370 Cx43. For ICC
Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 Life Technologies A-21428 For ICC
Anti-sarcomeric alpha actinin [EA-53] antibody Abcam ab9465 aSARC. For ICC
Goat anti-mouse IgM heavy chain cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 Life Technologies A-21426 For ICC
Mef2C (D80C1) XP rabbit antibody New England BioLabs Ltd. 5030S For ICC
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 Life Technologies A-21206 For ICC
Anti-nuclei (HuNu) (clone 235-1) antibody EMD Millipore MAB1281 For ICC
MZ9.5 Stereomicroscope Leica For imaging aggregates.
1.5 ml centrifuge microtubes Axygen MCT-150-C For staining MSCs with fluorescent dye.
ImageJ Open source image processing software.
Aria II  BD UHN SickKids FC Facility. For cell sorting.
Bone marrow mesechymal stromal cells Lonza PT-2501 BMSCs
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7030-100G BSA. To prepare solutions for ICC
BrdU EMD Millipore MAB3424 Caution: BrdU is a strong teratogen and suspected mutagen. Please ensure proper training and refer to the SDS before use.
Canto II BD UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry.
cDNA EcoDry Premix Clontech/Takara 639570 For preparation of cDNA for qPCR
CellTracker Green CMFDA Dye Life Technologies C7025 Fluorescent imaging of cell cytoplasm
Countess automated cell counter Invitrogen Inc. C10227 For cell counting
DMEM-F12 Sigma-Aldrich D6421 For rat primary cardiomyocyte culture medium.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco 10010023 D-PBS, without Ca2+, Mg2+
EVOS Life Technologies In-house fluorescent microscope
FACSCalibur BD In-house. For flow cytometry.
Fetal bovine serum (Hyclone) GE Healthcare SH3039603 FBS. Component of cell culture medium.
IDT Prime Time qPCR probes Integrated Data Technologies FAM fluorophore http://www.idtdna.com/pages/products/gene-expression/primetime-qpcr-assays-and-primers
Lab Vision PermaFluor Aqueous Mounting Medium ThermoScientific TA-030-FM For storage of cells to undergo ICC
LSR II  BD UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry.
MoFlo Astrios Beckman Coulter UHN SickKids FC Facility. For cell sorting.
Normal goat serum Cell Signaling Technology 5425S NGS. Used in blocking solution for ICC
Nunc Lab-Tek II Chamber Coverglass, 8-wells Thermo Scientific Nunc 155409 To prepare samples for ICC
OmniPur Triton X-100 Surfactant EMD Millipore 9410-OP As a component of permeabilizing solution when preparing cells for ICC
Paraformaldehyde, 16% Solution, EM Grade Electron Microscopy Sciences 15710 For fixing cells for ICC.
Penicillin/streptomycin Gibco 15140122 Component of cell culture medium.
Primers Sigma Custom Standard DNA Oligos, Desalted, 0.2 μmol CTnT_F: GGC AGC GGA AGA GGA TGC TGA A; CTnT_R: GAG GCA CCA AGT TGG GCA TGA ACG A; MYH6 F: GCA AAG TAC TGG ATG ACA CGC T; MYH6 R: GTC ATT GCT GAA ACC GAG AAT G
Quorum Spinning Disk Confocal Zeiss SickKids Imaging Facility
ReproCardio hiPS cell derived cardiomyocytes ReproCell RCD001N Positive control for qPCR
RNeasy mini kit Qiagen 74106 To isolate RNA for qPCR
Rotor-Gene SYBR Green PCR Kit Qiagen 204074 For qPCR with master mix
RPMI 1640 Gibco A1049101 For MSC, monocyte coculture medium.
TaqMan qPCR primer assays Thermo Fisher Scientific 4444556 For qPCR
Trypan Blue Life Technologies T10282 Staining of cells for viability and counting
Trypsin Gibco 272500108 For cell dissociation
Volocity Perkin-Elmer Volocity 6.3 Imaging software
0.2 μm pore filter Thermo Fisher Scientific 566-0020 For sterilizing tissue culture media
HERAcell 150i CO2 Incubator Thermo Fisher Scientific 51026410 For incubating cells
Dulbecco's phosphate buffered saline Sigma-Aldrich D8537 PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride
Forceps Almedic 7727-A10-704 For handing rat heart. Can use any similar forceps.
Scissors Fine Science Tools 14059-11 For mincing rat heart. Curved scissors recommended.
50 mL tube BD Falcon 352070 For collection during cardiomyocyte collection and general tissue culture procedures
15 mL tube BD Falcon 352096 For general tissue culture procedures
6-well plates Thermo Scientific Nunc CA73520-906 For tissue culture
10 cm tissue culture dishes Corning 25382-428 For aggregate formation
Axiovert 40C Microscope Zeiss For bright-field imaging through out tissue culture and the rest of the protocol
70 μm cell strainer Fisherbrand 22363548 To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting
Triton X-100 EMD Millipore 9410-1L Used in permeabilization solution for ICC
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H1399 Stain used during visualization of Cx43 localization

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References

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