Vitro İnsan Mezenkimal Kök hücre farklılaşma fonksiyonel Cardiomyocyte benzeri hücre içine

* These authors contributed equally
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Burada, fonksiyonel, sözleşme, cardiomyocyte benzeri hücreler üretmek için kardiyak farklılaşma potansiyeli insan Mezenkimal kök hücrelerin genç kaynaklarının verimli koşum için bir yöntem mevcut tüp bebek.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Szaraz, P., Gratch, Y. S., Iqbal, F., Librach, C. L. In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells. J. Vis. Exp. (126), e55757, doi:10.3791/55757 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Miyokard İnfarktüsü ve sonraki iskemik art arda sıralı cardiomyocytes, konjestif kalp yetmezliği, ölüm dünya çapında önde gelen nedenidir önde gelen geniş kaybına neden. Mezenkimal Kök hücre (MSCs) geçerli, invaziv teknikler değiştirmek hücre tabanlı terapiler için umut verici bir seçenek vardır. MSCs kardiyak hücre tipleri, dahil olmak üzere Mezenkimal soy ayırabilirsiniz ama fonksiyonel hücrelere tam farklılaşma değil henüz elde. Önceki yöntemler farklılaşma farmakolojik ajanlar veya büyüme faktörleri dayalı. Ancak, daha fizyolojik ilgili stratejileri cardiomyogenic dönüşüme MSCs etkinleştirmesini de isteyebilirsiniz. Burada, cardiomyocyte gibi sözleşme hücreleri üretmek için cardiomyocyte besleyici katmanlar üzerinde MSC toplamları kullanarak bir farklılaşma yöntem mevcut.

İnsan göbek kordonu Perivasküler hücreleri (HUCPVCs) daha ayrıştırması daha potansiyel için gösterilmiştir kemik iliği MSCs (BMSCs) gibi MSC türleri yaygın olarak araştırıldı. Ontogenetically genç bir kaynağı olarak, biz büyük kaynaklarına göre birinci üç aylık dönem (FTM) HUCPVCs cardiomyogenic potansiyelini araştırdık. FTM HUCPVCs çoğu zaman kültürlü rahim içinde immunoprivileged özellikleri korumak MSCs roman, zengin bir kaynağıdır vitro. Bu farklılaşma protokolü, FTM ve terim kullanarak HUCPVCs BMSCs için karşılaştırıldığında önemli ölçüde artış cardiomyogenic farklılaşma cardiomyocyte işaretleri (Yani, myocyte artırıcı bir faktör 2 C, kardiyak troponin T, ağır zincir kardiyak myosin, sinyal düzenleyici protein α ve connexin 43) artan ifade tarafından belirtildiği şekilde elde. Onlar da kendi alt HLA-A ifade ve daha yüksek HLA-G ifade tarafından gösterdiği olarak anlamlı derecede düşük immünojenisite muhafaza. Farklılaşma toplamak tabanlı uygulama, FTM HUCPVCs potansiyel ve oluşturulan ortak kültür kardiyak besleyici katmanlar üzerinde 1 hafta içinde hücre kümeleri müteahhitlik, bunu yapmak için ilk MSC türü haline artan toplama oluşumu gösterdi.

Bu farklılaşma stratejisi etkili FTM HUCPVCs gibi genç MSCs cardiomyogenic potansiyelini koşum ve o vitro öncesi farklılaşma onların rejeneratif etkinliği içinde vivoartırmak için potansiyel bir strateji olabilir öneriyor bizim sonuçlar gösterilmektedir.

Introduction

Konjestif kalp yetmezliği (CHF) morbidite ve mortalite dünya çapında önde gelen bir nedeni olarak devam ederse. En düşük CHF kez cardiomyocytes büyük kaybı ve akut miyokard infarktüsü (mı)1patolojik sonucu olarak skar dokusu boş hücre gelişimi takip oluşur. Kalp kısmen kendi kendini yenileyerek bir organ olmakla birlikte, bereket ve fonksiyon kez yaralanma sonra en iyi kurtarma için yetersiz hale yaşlı hastalarda ikamet kök ve progenitör hücre havuz önemli ölçüde doku rejenerasyonu yürütmek için sorumlu azalır. Böylece, sağlıklı donör hücre nakli hasarlı Miyokardiyum içine dahil deneysel tedaviler geliştirmede büyük bir ilgi vardır. Donör hücreleri doku yapısı geri kalmayıp aynı zamanda etkilenen Miyokardiyum fonksiyonel iyileşme elde etmek olduğunu zorunludur.

Yerel kalp kalp doku yerleşik istihdam ve endojen kemik iliği kökenli kök hücre sonrası yaralanma için2,3,4onarmak. Rejeneratif hücreleri-host ve donör-kaynaklı hem-must uygun fenotip ve yetenek verimli ve güvenli bir şekilde kayıp hücreleri değiştirmek için birlikte remodeling Miyokardiyum microenvironment işlevinde elde etmek için kapasite var. Vitro farklılaştırma yöntemleri yaygın yüksek verimli, kök hücre tabanlı cardiomyocyte üretim5,6elde etmek için kullanılmaktadır. Kardiyak lineage işaretleri ifade profili kardiyak lineage7karşı kök hücre farklılaşma süreci tanımlamak için kullanılır. Erken ayırt etme belirteçleri, NKX2.5, myocyte enhancer factor 2 C gibi (Mef2c) ve GATA48,9, cardiomyogenic sürecinin başlangıç belirtisi olabilir. Olgun cardiomyocyte işaretleri farklılaşma etkinliğini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan sinyal düzenleyici protein α (SIRPA)10, kardiyak troponin T (cTnT)11, ağır zincir kardiyak myosin (MYH6)8,12,13ve connexin 43 (Cx43)14,15,16' dır. Embriyonik kök hücreler (ESCs) ve pluripotent kök hücreler (PSC) kullanarak yöntemler iyice en iyi duruma getirilmiş ve endüktif faktörler, oksijen ve besin gradyan ayrıntılarını ve eylem5,6,7,17,18tam zamanlaması ile ilgili ele. Yine de, ESC ve PSC temel teknolojileri hala birden çok etik ve güvenlik endişeleri, suboptimal Elektrofizyolojik ve immünolojik özellikleri19,20birlikte mevcut. Bu hücreler ile sık sık nakledilen ev sahipliği yapan immunorejection deneyim ve kalıcı immünosupresyon gerektirir. Bu esas olarak MHC kompleksi (MHC) molekülleri ana bilgisayar ve donör ve elde edilen T hücreli yanıt21eşleşmeyebilir nedeniyle. Bireysel MHC sınıf ı eşleştirme olası bir çözüm, daha erişilebilir bir klinik pratikte immunoprivileged ret endişe üstesinden gelmek için evrensel bir hücre kaynağı gerektirir.

Klinik uygulamalar, MSCs ve özellikle, BMSCs, kullanmak için bir alternatif hücre kaynağı olarak kullanılmak üzere doku rejenerasyonu 199522onların ilk açıklama beri araştırdı. MSCs hemen hemen her bozukluklarına doku23' bulunabilir yerleşik rejeneratif hücreleri olduğuna inanılmaktadır. Yalıtım istenilen kaynaktan üzerine MSCs kültüründe kolayca genişletilebilir, geniş parakrin kapasitesine sahip ve genellikle immunoprivileged ya da immunomodulatory özellikleri24,25sahip. Onların güvenliği ve etkinliği zaten birkaç önceden klinik çalışmalarda, özellikle kalp yenilenme3,26için gösterilmiştir.

Birçok MSC farklılaşma stratejileri farmakolojik ajanlar, 5-azacytidine22 ve DMSO27ve büyüme veya BMP5,7,28,29 veya Anjiyotensin-II gibi30, morphogenic faktörler gibi değişken verimlilik ile kullanmaktadır. Bu stratejiler, saf rejeneratif hücre posta veya yaralanma siteye teslim sonra karşılaşmak muhtemeldir engelleri Ancak, temel alan değil içinde vivo. Daha fizyolojik ilgili stratejileri, süre daha zor için tanımlamak ve işlemek, MSC farklılaşma doku microenvironment gelen sinyalleri aracılığıyla bağlı olmak öncül dayalı. Önceki çalışmalarda bu maruz kalma kardiyak hücre lysates31 veya Ventriküler Miyokardiyum32,33göstermiştir veya doğrudan birincil cardiomyocytes vitro15,34, kişiyle MSCs kardiyak işaretlerinin ifade artırabilir. Kısmen, BMSCs ve cardiomyocytes39,40 füzyon doğmakta olan Miyokardiyum oluşturulan, ancak diğerleri ile MSCs35,36,37,38, kardiyak yaralanmaları tedavi sonra spontan cardiomyogenesis göstermiştir. Bilgimizi, fonksiyonel, kendiliğinden sözleşme cardiomyocytes insan MSCs (hMSCs) herhangi bir doku kaynağı üzerinden henüz bildirilmiştir değil.

Geçerli fikir birliği tüm MSCs Perivasküler hücreleri23ortaya olduğunu. Genç MSCs pericyte özelliklere sahip insan göbek kordonu doku41,42,43Perivasküler bölgesinden ayrılmış olabilir. BMSCs ile karşılaştırıldığında, HUCPVCs sahip artan farklılaşma potansiyeli ve birçok Rejeneratif avantajı, her iki vitro41,44 ve in vivo45,46,47. Özellikle, maternal-fetal arabirim olan kaynak, önemli ölçüde daha düşük immünojenisite MSCs yetişkin kaynaklarına göre HUCPVCs var. Bizim araştırma karakterizasyonu ve FTM HUCPVCs, araştırdık, MSCs en genç kaynak önceden klinik uygulamaları hangi biz daha önce proliferatif ve daha yüksek multilineage arttı göstermiştir odaklanır ayırt etme kapasiteleri, cardiomyogenic soy41yılında da dahil olmak üzere.

Burada, endüktif Kuvvetleri MSCs. toplamları tam cardiomyogenic farklılaşma ulaşmak için daha iyi koşullar içinde vivo 2D yapisan kültürlere göre modeller 3D bir çevre sağlamak olarak toplama oluşumu ve birincil kalp hücresi besleyici katmanlar birleştirir bir iletişim kuralı mevcut. Kardiyak besleyici katmanlar kullanarak son nakli site için MSCs temsilcisidir bir ortam sağlar. Biz öncesi ya da doğum sonrası göbek bağları izole MSCs genç kaynakları formu toplamları ve yetişkin BMSCs için hala onların bağışıklık ayrıcalık koruyarak karşılaştırıldığında kalp fenotip ulaşmak için daha yüksek bir kapasiteye sahip göstermek. Kardiyak lineage marker genler ve hücre içi indüklenen ifade dik yükselmesine dışında (Yani, cTnT ve MYH6) ve hücre yüzey proteinleri (Yani, SIRPA ve Cx43) belirli cardiomyocytes için biz göstermek FTM HUCPVCs farklılaşma potansiyeli bu yöntemle harnessed olabilir ve onlar kendiliğinden cardiomyocyte benzeri hücreler sözleşme için artış verebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kök hücre kardiyak farklılaşma geliştirme için 2 yılda altında MSC kaynaklardan cardiomyocyte benzeri hücreleri oluşturmak için kullanılan birkaç farklı stratejileri ile olmuştur. Bu stratejiler, birçoğu ancak, verimsiz, ve kullanılan koşulları genellikle çevre nakledilen hücreler karşılaşma içinde vivotemsilcisi değildir.

Mevcut yöntemler aksine burada sunulan Protokolü birincil kardiyak besleyici katmanlar ve MSC toplama oluşumu bir arada kullanır. Birincil kardiyak besleyici Katmanlar hangi hMSCs transplantasyonu açık olduğu benzer bir farklılaşma ortamı sağlar. Agrega lineage taahhüt başlatılıyor üzerinde endüktif bir etkisi olabilir oksijen ve besin degradeler bir ortam oluşturur. PSC ve ESC bağlı kardiyak farklılaşma stratejileri hipoksik Önkoşullanma kullanarak ve toplama oluşumu kök hücre5,52,53endüktif bu etkisi oluşturdu. Buna ek olarak, 3D bir yapı daha iyi içinde vivohücre hücre bağlantıları sağlanan benzer. Bu yöntemi kullanarak, biz başarıyla zaman uyumlu olarak sözleşme hMSC toplayan ilk kez bir hMSC türü bilgimizi bunu başarmak başardı üretti. Önemlisi, uygulanan, yalnızca en genç hMSC hücre kaynağını FTM HUCPVCs, bu yetenek sergiledi.

Saf ya da önceden farklılaştırılmış MSCs ESCs veya PSC üzerinden kardiyak rejenerasyon için kullanmanın önemli bir avantaj onların immunomodulatory veya immunoprivileged özelliklerinde yatıyor. Ancak, hatta MSCs söz konusu olduğunda, onların yaş ve kaynak54ile immunomodulatory özellikleri değişir. BMSCs sık sık onların reddedilmesi üzerine implantasyon55yol açar onların immünojenik özellikleri sonrası farklılaşma değiştirmek gösterilmiştir. Daha önce açıklandığı gibi göbek kordonu üzerinden MSCs kökenli sahip özel bağışıklık ayrıcalık56 rahim içinde kökenlerine nedeniyle. İletişim kuralı kullanılarak bile cardiomyocyte gibi hücrelere, terim ve FTM HUCPVCs farklılaşma HLA-G (yani aktif olarak doğuştan gelen bağışıklık yanıtı azaltarak) yüksek düzeyde sergilenen sonra yukarıda açıklanan ve HLA-A (belirleyen sitotoksisite T-Hücre aracılı) düşük seviyelerde saklanır.

Bu farklılaşma Protokolü elverişli bir konuma sahip birden çok düzeyde analiz için izin vermenin avantajına sahiptir. İlk olarak, toplamları müteahhitlik canlı görüntüleme, fonksiyonel, tek hücre ayrım bir besleyici katmana entegre daha daha uygun olduğunu. Karışık-tür ortak kültürler protokol kullanır gibi FACS hem de ICC fenotip-özellikle, hızlı kimlik sağlarken insan özgü astar qPCR analiz için uygulanır kardiyak marker ifade (Şekil 2). Protokol açıklandığı gibi kullanarak, SIRPA, cTnT, MYH6, aSarc, Mef2c ve Cx43 yüksek seviyede tespit edildi. HuNu ile birlikte, Mef2c ve aSarc içinde farklılaşmış hMSCs ifadesi tanımlamak için ve fare cardiomyocyte elde edilen besleyici katmanlar veya yuvarlak hücre ayırt etmek mümkündür. Besleyici katmandaki sözleşme toplamları tanımlaması nispeten kolay olmakla birlikte, toplama veya onları toplamaktan bir sınırlama oluşturabilir. Bir micromanipulator ile donatılmış mikroskoplar bu meydan okuma işlemek için istihdam edilebilir. Alternatif olarak, insan hücreleri insan özel anti-TRA-1-85 antikorları kullanarak ortak kültürler verimli bir şekilde sıralanabilir. Ortak kültürler da potansiyel hücre füzyon meydan mevcut iken, bu çok nükleer ve hücre yüzeyine insan marker tarayıcıları (ek şekil 1) bir birleşimini kullanarak üstesinden gelinebilir.

Toplamları oluşumunu ayarlamak için ayırt etme yöntemimiz olası bir değişiklik olduğunu. Bizim sonuçları toplam boyutu için en uygun farklılaşma kritik bir parametre olabilir öneririz. Toplama daha yapışkan hücreler için seçici olduğunu varsayarak, CD49f pozitif hMSCs için bir ön seçim adım olarak hareket edebilir. Gelişmiş MSC küre oluşumu CD49f ifade49artış için bağlı ve SOX2 ve OCT449için doğrudan bağladığı CD49f da daha yüksek stemness ile ilişkilidir. Biz düşük numaraların büyük kaynakları azalan toplam boyutu gözlenen açıklayabilir FTM HUCPVCs için karşılaştırıldığında hMSCs CD49f pozitif hücrelerinin gözlenen. Bu seçim için hMSCs başına daha yüksek toplam boyutu elde etmek için toplam sayısını artırarak telafi ki böylece muhtemelen artan verimliliği toplama kaynaklı farklılaşma farzet.

Gelecekteki uygulamalar protokolü de değişiklikler gerektirebilir. Bu klinik uygulamaları önceden farklılaşmış hMSCs yer alan koşulları xeno-Alerjik zorunludur. Bu iletişim kuralı kullanılarak üretilen sözleşme toplamları mühendislik kalp kas doku oluşturmak için de kullanılabilir. Klinik olarak ilgili bir ürünü üretmek için cGMP uyumlu bir iş akışı gereklidir. Xeno-Alerjik kültür orta hMSCs için kullanılabilir olmakla birlikte, bir besleyici hayvan ücretsiz katmanı sağlamak zor. Ancak, iPSCs gibi diğer kök hücre kaynaklar önceden farklılaştırılmış besleyici katmanları uygulayarak olası bir çözümdür.

Sonuç olarak, açıklanan ayırt etme yöntemi fonksiyonel cardiomyocyte benzeri hücreler hMSCs genç kaynaklardan uygun ve tekrarlanabilir bir şekilde üretmek için uygulanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dr. Clifford L. Librach olduğunu ortak patent sahibinin: Kanada ve Avustralya'verilen yöntemleri yalıtım ve ilk üç aylık göbek kordonu dokusundan elde edilen hücre kullanımı,.

Acknowledgments

Yazarlar aşağıdaki personel üye teşekkür ve araştırma katkılarından dolayı personel: Matthew Librach, Leila Maghen, Tanya A. Baretto, Shlomit Kenigsberg ve Andrée Gauthier-Fisher. Bu eser Ontario araştırma fonu tarafından - araştırmada mükemmellik (ORF-RE, yuvarlak #7) ve Program A.ş. oluşturmak destek verdi

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin/EDTA Gibco 25200056 For cell dissociation
Alpha-MEM Gibco 12571071 For HUCPVC and BMSC culture media.
PE-conjugated anti-human/mouse CD49f antibody Biolegend 313612 Integrin marker for FC
APC-conjugated human Cx43/GJA1 antibody R&D Systems FAB7737A Connexin 43 marker for FC
FITC-conjugated HLA-A2 antibody Genway Biotech Inc. GWB-66FBD2 Immunogenicity marker for FC
FITC-conjugated anti-HLA-G [MEM-G/9] antibody Abcam ab7904 Immunogenicity marker for FC
FITC-conjugated mouse anti-human SIRPA/CD172a antibody AbD Serotec/Bio-Rad MCA2518F Cardiac marker for FC
APC-conjugated human TRA-1-85/CD147 antibody R&D Systems FAB3195A Human cell marker for FC and FACS
FITC-conjugated human TRA-1-85/CD147 antibody R&D Systems FAB3195F Human cell marker for FC and FACS
Anti-connexin 43/GJA1 antibody Abcam ab11370 Cx43. For ICC
Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 Life Technologies A-21428 For ICC
Anti-sarcomeric alpha actinin [EA-53] antibody Abcam ab9465 aSARC. For ICC
Goat anti-mouse IgM heavy chain cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 Life Technologies A-21426 For ICC
Mef2C (D80C1) XP rabbit antibody New England BioLabs Ltd. 5030S For ICC
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 Life Technologies A-21206 For ICC
Anti-nuclei (HuNu) (clone 235-1) antibody EMD Millipore MAB1281 For ICC
MZ9.5 Stereomicroscope Leica For imaging aggregates.
1.5 ml centrifuge microtubes Axygen MCT-150-C For staining MSCs with fluorescent dye.
ImageJ Open source image processing software.
Aria II  BD UHN SickKids FC Facility. For cell sorting.
Bone marrow mesechymal stromal cells Lonza PT-2501 BMSCs
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7030-100G BSA. To prepare solutions for ICC
BrdU EMD Millipore MAB3424 Caution: BrdU is a strong teratogen and suspected mutagen. Please ensure proper training and refer to the SDS before use.
Canto II BD UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry.
cDNA EcoDry Premix Clontech/Takara 639570 For preparation of cDNA for qPCR
CellTracker Green CMFDA Dye Life Technologies C7025 Fluorescent imaging of cell cytoplasm
Countess automated cell counter Invitrogen Inc. C10227 For cell counting
DMEM-F12 Sigma-Aldrich D6421 For rat primary cardiomyocyte culture medium.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco 10010023 D-PBS, without Ca2+, Mg2+
EVOS Life Technologies In-house fluorescent microscope
FACSCalibur BD In-house. For flow cytometry.
Fetal bovine serum (Hyclone) GE Healthcare SH3039603 FBS. Component of cell culture medium.
IDT Prime Time qPCR probes Integrated Data Technologies FAM fluorophore http://www.idtdna.com/pages/products/gene-expression/primetime-qpcr-assays-and-primers
Lab Vision PermaFluor Aqueous Mounting Medium ThermoScientific TA-030-FM For storage of cells to undergo ICC
LSR II  BD UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry.
MoFlo Astrios Beckman Coulter UHN SickKids FC Facility. For cell sorting.
Normal goat serum Cell Signaling Technology 5425S NGS. Used in blocking solution for ICC
Nunc Lab-Tek II Chamber Coverglass, 8-wells Thermo Scientific Nunc 155409 To prepare samples for ICC
OmniPur Triton X-100 Surfactant EMD Millipore 9410-OP As a component of permeabilizing solution when preparing cells for ICC
Paraformaldehyde, 16% Solution, EM Grade Electron Microscopy Sciences 15710 For fixing cells for ICC.
Penicillin/streptomycin Gibco 15140122 Component of cell culture medium.
Primers Sigma Custom Standard DNA Oligos, Desalted, 0.2 μmol CTnT_F: GGC AGC GGA AGA GGA TGC TGA A; CTnT_R: GAG GCA CCA AGT TGG GCA TGA ACG A; MYH6 F: GCA AAG TAC TGG ATG ACA CGC T; MYH6 R: GTC ATT GCT GAA ACC GAG AAT G
Quorum Spinning Disk Confocal Zeiss SickKids Imaging Facility
ReproCardio hiPS cell derived cardiomyocytes ReproCell RCD001N Positive control for qPCR
RNeasy mini kit Qiagen 74106 To isolate RNA for qPCR
Rotor-Gene SYBR Green PCR Kit Qiagen 204074 For qPCR with master mix
RPMI 1640 Gibco A1049101 For MSC, monocyte coculture medium.
TaqMan qPCR primer assays Thermo Fisher Scientific 4444556 For qPCR
Trypan Blue Life Technologies T10282 Staining of cells for viability and counting
Trypsin Gibco 272500108 For cell dissociation
Volocity Perkin-Elmer Volocity 6.3 Imaging software
0.2 μm pore filter Thermo Fisher Scientific 566-0020 For sterilizing tissue culture media
HERAcell 150i CO2 Incubator Thermo Fisher Scientific 51026410 For incubating cells
Dulbecco's phosphate buffered saline Sigma-Aldrich D8537 PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride
Forceps Almedic 7727-A10-704 For handing rat heart. Can use any similar forceps.
Scissors Fine Science Tools 14059-11 For mincing rat heart. Curved scissors recommended.
50 mL tube BD Falcon 352070 For collection during cardiomyocyte collection and general tissue culture procedures
15 mL tube BD Falcon 352096 For general tissue culture procedures
6-well plates Thermo Scientific Nunc CA73520-906 For tissue culture
10 cm tissue culture dishes Corning 25382-428 For aggregate formation
Axiovert 40C Microscope Zeiss For bright-field imaging through out tissue culture and the rest of the protocol
70 μm cell strainer Fisherbrand 22363548 To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting
Triton X-100 EMD Millipore 9410-1L Used in permeabilization solution for ICC
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H1399 Stain used during visualization of Cx43 localization

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Badano, L. P., et al. Prevalence, clinical characteristics, quality of life, and prognosis of patients with congestive heart failure and isolated left ventricular diastolic dysfunction. J Am Soc Echocardiogr. 17, (3), 253-261 (2004).
  2. Leri, A., Kajstura, J., Anversa, P. Cardiac stem cells and mechanisms of myocardial regeneration. Physiol Rev. 85, (4), 1373-1416 (2005).
  3. Orlic, D., et al. Mobilized bone marrow cells repair the infarcted heart, improving function and survival. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, (18), 10344-10349 (2001).
  4. Schuster, M. D., et al. Myocardial neovascularization by bone marrow angioblasts results in cardiomyocyte regeneration. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287, (2), 525-532 (2004).
  5. Zandstra, P. W., et al. Scalable production of embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Tissue Eng. 9, (4), 767-778 (2003).
  6. Boheler, K. R., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into cardiomyocytes. Circ Res. 91, (3), 189-201 (2002).
  7. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8, (2), 228-240 (2011).
  8. Dixon, J. E., Dick, E., Rajamohan, D., Shakesheff, K. M., Denning, C. Directed differentiation of human embryonic stem cells to interrogate the cardiac gene regulatory network. Mol Ther. 19, (9), 1695-1703 (2011).
  9. Stennard, F. A., et al. Cardiac T-box factor Tbx20 directly interacts with Nkx2-5, GATA4, and GATA5 in regulation of gene expression in the developing heart. Dev Biol. 262, (2), 206-224 (2003).
  10. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29, (11), 1011-1018 (2011).
  11. Panteghini, M. Present issues in the determination of troponins and other markers of cardiac damage. Clin Biochem. 33, (3), 161-166 (2000).
  12. Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25, (4), 929-938 (2007).
  13. Ovchinnikov, D. A., et al. Isolation of contractile cardiomyocytes from human pluripotent stem-cell-derived cardiomyogenic cultures using a human NCX1-EGFP reporter. Stem Cells Dev. 24, (1), 11-20 (2015).
  14. Moscoso, I., et al. Differentiation "in vitro" of primary and immortalized porcine mesenchymal stem cells into cardiomyocytes for cell transplantation. Transplant Proc. 37, (1), 481-482 (2005).
  15. Ramkisoensing, A. A., et al. Gap junctional coupling with cardiomyocytes is necessary but not sufficient for cardiomyogenic differentiation of cocultured human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30, (6), 1236-1245 (2012).
  16. van Kempen, M., et al. Expression of the electrophysiological system during murine embryonic stem cell cardiac differentiation. Cell Physiol Biochem. 13, (5), 263-270 (2003).
  17. Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ Res. 111, (3), 344-358 (2012).
  18. Puceat, M. Protocols for cardiac differentiation of embryonic stem cells. Methods. 45, (2), 168-171 (2008).
  19. Naito, H., et al. Optimizing engineered heart tissue for therapeutic applications as surrogate heart muscle. Circulation. 114, 1 Suppl 72-78 (2006).
  20. Zimmermann, W. H., et al. Heart muscle engineering: an update on cardiac muscle replacement therapy. Cardiovasc Res. 71, (3), 419-429 (2006).
  21. Hulot, J. S., et al. Considerations for pre-clinical models and clinical trials of pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Res Ther. 5, (1), 1 (2014).
  22. Wakitani, S., Saito, T., Caplan, A. I. Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve. 18, (12), 1417-1426 (1995).
  23. Caplan, A. I. Adult Mesenchymal Stem Cells: When, Where, and How. Stem Cells Int. 2015, 628767 (2015).
  24. Burchfield, J. S., Dimmeler, S. Role of paracrine factors in stem and progenitor cell mediated cardiac repair and tissue fibrosis. Fibrogenesis Tissue Repair. 1, (1), 4 (2008).
  25. Hsiao, S. T., et al. Comparative analysis of paracrine factor expression in human adult mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose, and dermal tissue. Stem Cells Dev. 21, (12), 2189-2203 (2012).
  26. Tomita, S., et al. Autologous transplantation of bone marrow cells improves damaged heart function. Circulation. 100, 19 Suppl 247-256 (1999).
  27. Skerjanc, I. S. Cardiac and skeletal muscle development in P19 embryonal carcinoma cells. Trends Cardiovasc Med. 9, (5), 139-143 (1999).
  28. Hou, J., et al. Combination of BMP-2 and 5-AZA is advantageous in rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells differentiation into cardiomyocytes. Cell Biol Int. 37, (12), 1291-1299 (2013).
  29. Yoon, J., et al. Differentiation, engraftment and functional effects of pre-treated mesenchymal stem cells in a rat myocardial infarct model. Acta Cardiol. 60, (3), 277-284 (2005).
  30. Xing, Y., Lv, A., Wang, L., Yan, X. The combination of angiotensin II and 5-azacytidine promotes cardiomyocyte differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells. Mol Cell Biochem. 360, (1-2), 279-287 (2012).
  31. Yuan, Y., et al. Differentiation of mesenchymal stem cells into cardio myogenic cells under the induction of myocardial cell lysate. Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi. 33, (2), 170-173 (2005).
  32. Toma, C., Pittenger, M. F., Cahill, K. S., Byrne, B. J., Kessler, P. D. Human mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotype in the adult murine heart. Circulation. 105, (1), 93-98 (2002).
  33. Yannarelli, G., et al. Donor mesenchymal stromal cells (MSCs) undergo variable cardiac reprogramming in vivo and predominantly co-express cardiac and stromal determinants after experimental acute myocardial infarction. Stem Cell Rev. 10, (2), 304-315 (2014).
  34. Rangappa, S., Entwistle, J. W., Wechsler, A. S., Kresh, J. Y. Cardiomyocyte-mediated contact programs human mesenchymal stem cells to express cardiogenic phenotype. J Thorac Cardiovasc Surg. 126, (1), 124-132 (2003).
  35. Bakogiannis, C., et al. Circulating endothelial progenitor cells as biomarkers for prediction of cardiovascular outcomes. Curr Med Chem. 19, (16), 2597-2604 (2012).
  36. Deb, A., et al. Bone marrow-derived cardiomyocytes are present in adult human heart: A study of gender-mismatched bone marrow transplantation patients. Circulation. 107, (9), 1247-1249 (2003).
  37. Laflamme, M. A., Myerson, D., Saffitz, J. E., Murry, C. E. Evidence for cardiomyocyte repopulation by extracardiac progenitors in transplanted human hearts. Circ Res. 90, (6), 634-640 (2002).
  38. Quaini, F., et al. Chimerism of the transplanted heart. N Engl J Med. 346, (1), 5-15 (2002).
  39. Alvarez-Dolado, M., et al. Fusion of bone-marrow-derived cells with Purkinje neurons, cardiomyocytes and hepatocytes. Nature. 425, (6961), 968-973 (2003).
  40. Nygren, J. M., et al. Bone marrow-derived hematopoietic cells generate cardiomyocytes at a low frequency through cell fusion, but not transdifferentiation. Nat Med. 10, (5), 494-501 (2004).
  41. Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells Dev. 22, (17), 2425-2439 (2013).
  42. Sarugaser, R., Ennis, J., Stanford, W. L., Davies, J. E. Isolation, propagation, and characterization of human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs). Methods Mol Biol. 482, 269-279 (2009).
  43. Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: a source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23, (2), 220-229 (2005).
  44. Kadivar, M., et al. In vitro cardiomyogenic potential of human umbilical vein-derived mesenchymal stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 340, (2), 639-647 (2006).
  45. Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 25, (6), 1384-1392 (2007).
  46. Wu, K. H., et al. Cardiac potential of stem cells from whole human umbilical cord tissue. J Cell Biochem. 107, (5), 926-932 (2009).
  47. Yannarelli, G., et al. Human umbilical cord perivascular cells exhibit enhanced cardiomyocyte reprogramming and cardiac function after experimental acute myocardial infarction. Cell Transplant. 22, (9), 1651-1666 (2013).
  48. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. J Pharmacol Pharmacother. 1, (2), 94-99 (2010).
  49. Yu, K. R., et al. CD49f enhances multipotency and maintains stemness through the direct regulation of OCT4 and SOX2. Stem Cells. 30, (5), 876-887 (2012).
  50. Lee, R. H., et al. The CD34-like protein PODXL and alpha6-integrin (CD49f) identify early progenitor MSCs with increased clonogenicity and migration to infarcted heart in mice. Blood. 113, (4), 816-826 (2009).
  51. Szaraz, P., et al. In Vitro Differentiation of First Trimester Human Umbilical Cord Perivascular Cells into Contracting Cardiomyocyte-Like Cells. Stem Cells Int. 2016, 7513252 (2016).
  52. Bauwens, C., Yin, T., Dang, S., Peerani, R., Zandstra, P. W. Development of a perfusion fed bioreactor for embryonic stem cell-derived cardiomyocyte generation: oxygen-mediated enhancement of cardiomyocyte output. Biotechnol Bioeng. 90, (4), 452-461 (2005).
  53. Jing, D., Parikh, A., Tzanakakis, E. S. Cardiac cell generation from encapsulated embryonic stem cells in static and scalable culture systems. Cell Transplant. 19, (11), 1397-1412 (2010).
  54. Hare, J. M., et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial. JAMA. 308, (22), 2369-2379 (2012).
  55. Huang, X. P., et al. Differentiation of allogeneic mesenchymal stem cells induces immunogenicity and limits their long-term benefits for myocardial repair. Circulation. 122, (23), 2419-2429 (2010).
  56. Hare, J. M., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (prochymal) after acute myocardial infarction. J Am Coll Cardiol. 54, (24), 2277-2286 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics