극저온에서 수성 유리의 밀도 측정

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Summary

극저온에서 수성 혼합물의 마이크로 - 피코 리터 크기의 액 적의 유리 상 밀도를 결정하기위한 프로토콜이 기술되어있다.

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Shen, C., Julius, E. F., Tyree, T. J., Dan, R., Moreau, D. W., Thorne, R. Measuring the Densities of Aqueous Glasses at Cryogenic Temperatures. J. Vis. Exp. (124), e55761, doi:10.3791/55761 (2017).

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Abstract

우리는 원하는 극저온 단계를 준비하기 위해 수성 혼합물 및 빠른 냉각이 필요한 다른 샘플의 유리 상 극저온 밀도를 결정하는 방법을 시연합니다. 마이크로 리터 대 피코 리터 크기의 드롭은 액체 질소 - 아르곤 (N2-Ar) 혼합물 내로 투영함으로써 냉각된다. 방울의 극저온 단계는 X 선 회절 측정과 관련이있는 시각적 분석을 사용하여 평가됩니다. 액체 N 2 -Ar 혼합물의 밀도는 방울이 중성 부력이 될 때까지 N 2 또는 Ar을 첨가하여 조정한다. 이 혼합물의 밀도 및 따라서 낙하의 밀도는 시험 매스 (test mass) 및 아르키메데스 (Archimedes) 원리를 사용하여 결정된다. 방울 준비, 액체 냉각제 혼합물 위의 가스 관리로 빙결을 최소화하고 저온 혼합물을 규칙적으로 혼합하여 밀도 층화 및 상분리를 방지하고 밀도가 50pL만큼 작은 방울의 <0.5 %까지 정확합니다쉽게 결정될 수있다. 수성 동결 방지제 혼합물에 대한 측정은 동결 방지제 작용에 대한 통찰력을 제공하고, 생물학적 동결 보존에서의 열 수축 정합을 용이하게하는 정량적 데이터를 제공한다.

Introduction

다양한 단계에서 물과 수성 혼합물의 물리적 성질은 근본적인 관심사이며 생체 내생체 시스템의 생체 시스템 이해에 중요합니다. 현재의 저온 생물학 및 생물학적 저온 보존에서, 수성 저온 보호제 혼합물의 유리질 또는 비결 정성 단계는 특히 중요하다. 핵 결정의 핵 형성과 성장은 세포와 조직을 파괴하고 단백질의 변성과 응집을 촉진시켜 용제를 투명하게하는 저온 보존 프로토콜이 점점 대중화되고 있습니다. 생체 분자 결정학에서 생체 분자 사이의 채널에서 용매의 결정화는 결정 격자를 파괴하고 회절 특성을 저하시킵니다. 유리질 제거 (Vitrification)는 급냉, 탈수 및 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 동결 방지용 용질의 첨가를 통해 달성됩니다.알콜 및 염.

유리화는 얼음 결정화 및 성장을 제한하지만 모든 냉각 관련 샘플 손상을 제거하지는 않습니다. 예를 들어, 단백질 결정이 유리화 상태로 냉각 될 때 결정 모세관 현상 (결정 평면 방향 분포의 척도)은 일반적으로 10 내지 100 배 증가하고, 유리화 된 정자 세포 및 난 모세포의 해동 후 생존율은 광범위하게 변한다 .

하나의 손상 메커니즘은 냉각 과정에서 용매 및 주변 물질의 수축 차이 3 , 4 , 5 입니다. 결정, 세포 또는 조직 내의 평형 용매 및 용질 농도는 온도에 의존하고, 용제 + 용질 및 주변 물질은 상이한 양만큼 수축 될 수있다. 급속 냉각은 유리화 및 용융 계약 이전에 용매 및 용질 재분배를 방지 할 수 있습니다. 시료가 손상 될 수있는 크고 불균일 한 비 평형 응력을 유발할 수 있습니다.

따라서 냉각에 의한 손상을 줄이기위한 합리적 접근법은 액체 및 유리질을 함유 한 수성 혼합물의 온도 의존 밀도에 대한 지식으로부터 이익을 얻을 수있다. 용질의 중량 대비 50 % 이상의 용질 농도 (w / w)에서 대부분의 수성 동결 방지제 혼합물은 10 K / s 이하의 적당한 냉각 속도로 유리화되어 큰 유리질 시료를 사용하여 밀도 측정 및 생산이 가능합니다. 밀도는 질소와 같은 액체 한제에 현탁 될 때 시료의 겉보기 무게를 측정하여 아르키메데스의 원리를 사용하여 결정할 수 있습니다. 그러나 용질 농도가 감소함에 따라 유리화에 필요한 냉각 속도가 빠르게 증가합니다. 수용성 글리세롤 혼합물의 냉각 속도는 g의 용질 50 % 중량에서 10K / s에서 mL (w / v)의 용적에서 1,000 25 % w / v의 K / sass = "xref"> 7. 열전달은 경계층이 제한되어보다 큰 냉각 속도를 달성하기 위해서는 더 작고 작은 샘플이 필요합니다.

순수 유리질 물 및 얼음의 밀도 측정은 거시적 인 (그램 덩어리) 샘플을 형성하기 위해 극저온 냉각 된 표면 상에 마이크로 미터 직경 (펨토 리터 부피)의 드롭을 진공으로 증착시킴으로써 달성되었다. 이 샘플의 밀도는 액체 질소 - 아르곤 혼합물에서 극저온 액체의 밀도가 샘플이 중성으로 부양 될 때까지 조정 된 극저온 냉각 (cryoflotation)에 의해 결정되었다. 그러나 이전의 유리질 밀도 측정에서 중요한 오류 원인 인 공극 체적을 최소화하는 방식으로 많은 수의 작은 방울에서 큰 샘플을 생성하는 것은 그리 중요하지 않습니다. 수성 혼합물의 경우 에어로졸 화 및 진공 증착시 용액 성분의 차등 증발은침착 된 농도의 실질적인 불확실성.

우리는 cryoflotation에 기초한 방법을 개발하여 개별 방울 50 pL 10을 사용하는 수성 혼합물의 정확한 밀도 결정을 가능하게했습니다. 이 방울은 원래 농도를 유지하면서 빠르게 냉각 될 수 있으며, 극저온 상태 (유리화 또는 결정질)는 X- 선 회절 측정과 상관 관계가있는 간단한 시각적 분석을 사용하여 평가할 수 있습니다. 이 방법은 수성 및 비 수성 혼합물에 광범위하게 적용 할 수 있으며 세포 ( 예 : 줄기와 난), 조직 표본 및 단백질 밀도가 0.8 ~ 1.4 g / mL이다.

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Protocol

주의 : 사용하기 전에 모든 관련 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 적절한 보정 가스 처리 조절기 및 밸브, 승인 된 가스 튜빙을 포함한 압축 가스를 사용할 때는 모든 적절한 안전 관행을 사용하십시오. 액체 한제와 접촉하면 심한 동상과 괴사를 일으킬 수 있습니다. 적절한 개인 보호 장비 (얼굴 가리개, 장갑, 실험용 코트, 긴 바지, 닫힌 발가락 신발)를 사용하십시오.이 모든 것은 액체 질소를 불 투과성으로해야합니다. 서있는 상태를 유지하고 액체 한제를 사용할 때 장치에서 방해받지 않는 출구 경로를 확보하십시오. 압축 가스 및 액체 한제를 사용할 때 질식 위험을인지하고 적절한 보충 공기 (흄 후드 또는 높은 공기 회전율 실)로 통풍이 잘되는 곳에서 작업하십시오.

1. 밀도 측정을위한 수용액의 제조

참고 : 무게는 vol보다 높은 정확도로보다 쉽게 ​​측정되기 때문에용액의 농도는 w / w 단위로 측정됩니다. 모든 밀도와 용융 또는 끓는 온도는 ~ 100kPa의 대기압을 가정합니다. 다음 단계는 35 % w / w 글리세롤 용액의 제조를 설명합니다. 같은 과정을 다른 농도와 용질에 사용할 수 있습니다.

  1. 관심있는 각각의 용질 유형과 농도에 대해 총 용액 용량에 대해 원하는 최종 농도 ( 예 : 25 % w / w와 100 % w / w)를 얻기 위해 필요한 용질 질량을 대략적으로 추정하면, V tot = . 예를 들어, 35 % w / w 글리세롤 용액 ( ρ s = 1.26 g / mL)의 경우, 용질 질량 m s 는 다음과 같습니다.
    방정식
    여기서 x 는 용질 질량 분율 (0.35)이고 ρw = 1 g / mL는 물의 밀도입니다.
  2. 냄비에 15 mL 원심 분리 튜브 (또는 기타 용량 보정 수 불투수 용기)를 놓습니다분석 용 저울 튜브에 원하는 양의 용질 / 동결 방지제 ( 예 : 35 % w / w 용액의 경우 글리세롤 3.77g)를 분배하고 실제 용질 질량을 기록하십시오.
  3. 고순도 (> 18 MΩ)의 탈 이온수를 추가하여 총 질량을 10.0 g
  4. 용액이 광학적으로 균질 할 때까지 용기를 30 초 (액체 용질 용) 또는 5 분 (고체 용질 용) 동안 볼 텍싱한다.
  5. 솔루션의 최종 질량을 측정하고 기록하십시오. 기밀 캡으로 용기를 밀봉하고 일정 온도 (293-298 K)에서 보관하십시오.

2. 샘플 냉각 실의 준비

  1. 아래에 설명 된 실험 장치를 엔클로저에 넣고 건조한 공기 (> 5 % 상대 습도 (rh))를 엔클로저에 유입시킵니다.
    참고 : 인클로저는 상단과 3면이 투명한 플라스틱 시트로 밀봉되고 유연한 플라스틱 시트로 덮힌 네 번째면을 통해 실험 액세스가 가능한 단순한 금속 프레임 일 수 있습니다. 입고 있다얼굴 방패 및 전신 커버링으로 실험자가 수분을 최소화합니다. 수분 응결과 얼음 형성은 여러 가지 방법으로 극저온 밀도 측정을 방해 할 수 있으므로 최소화해야합니다.
  2. 듀어 플라스크를 손상시키지 않도록 네오프렌 고무 디스크를 4.5L 유리 듀어 플라스크 바닥에 놓습니다.
  3. 조심스럽게 높은 열전 도성 구리 챔버 (밀폐 된 바닥이있는 중공 실린더)를 고무 디스크에 닿을 때까지 플라스크에 넣으십시오. 챔버가 Dewar 벽으로 바깥쪽으로 돌출 된 스트럿을 조정하여 챔버가 중앙에 위치하고 흔들리는 경향이 없어야합니다.
    참고 : 듀어 플라스크는 액체 질소를 보유하고 훨씬 더 작은 부피의 구리 챔버는 액체 N 2 -Ar 혼합물을 보유합니다. 액체 질소는 구리 챔버 및 그 내용물을 77K의 일정 온도로 유지시키고 챔버에서의 비등 및 증발 손실을 감소시키는 열욕을 제공한다. 챔버 및 #39의 작은 지름은 부력 측정을 방해 할 수있는 표면파를 억제하고 장치 내의 다른 곳에서 형성된 서리 및 얼음으로부터 챔버 내의 액체를 격리하는 데 도움을줍니다.
  4. ~ 2 L / min으로 흐르는 건조 N 2 가스가있는 가스 튜브의 출구를 구리 챔버의 바닥에 삽입하고 습기 찬 챔버를 퍼지하십시오.
  5. 구리 챔버 외부의 Dewar 플라스크에 천천히 액체 질소를 붓고 질소가 끓을 때까지 기다립니다.
    참고 : 최종 채우기 수준은 끓기가 중단 된 후 구리 챔버 상단에서 약 4cm 이내 여야합니다.
  6. 듀어 플라스크의 바깥 쪽 부분을 고리 모양의 폼 절연 덮개로 덮으십시오. 구리 챔버에서 건조 된 N2 가스 퍼지 관을 제거하고 뚜껑의 일치하는 입구에 삽입하십시오.
    참고 : 듀어 플라스크의 끓인 물과 퍼지 흐름의 N 2 가스 조합은 습기 찬 공기를 배출하여 응축 및 결정화를 방지합니다.n 차가운 표면.
  7. 천천히 구리 챔버로 액체 질소를 부어. 끓음이 끝난 후 최종 충전 레벨은 구리 챔버의 상단에서 약 4cm 이내 여야합니다.
  8. 광학적으로 투명한 얇은 플라스틱 시트를 뚜껑의 통풍구 또는 환기구 위에 놓고 N 2 가스 유속을 ~ 0.2 L / 분으로 줄이고 극저온 액체 위의 가스 공간 내에 N 2 가스를 약간 과도한 압력으로 남겨 둡니다.
    참고 : 극저온 액체가 Dewar와 챔버에 존재하는 한,이 과압을 유지하고 Dewar에 유입되어 습기가 얼음을 형성하지 못하도록 필요한만큼 N 2 가스 흐름을 계속 조정하십시오.

3. T = 298 K 및 T = 77 K에서 시험 질량의 부피 및 밀도 결정

  1. 냄비에 T = 298 K의 공기 중 ~ 1 g, ~ 0.4 mL PTFE 시험 물질 ( 표본 물질 )의 겉보기 질량을 결정하십시오캘리브레이션 된 분석 용 마이크로 저울
  2. 가스 비중계를 사용하여 T = 298 K에서 시험 질량의 부피 V (298 K)를 결정하거나 캘리퍼스를 사용하여 치수를 측정합니다. 치수 측정을 사용하는 경우, 시험 매스는 단순하고 정확한 모양 (테이퍼 또는 둥근 모서리가 없어야 함)을 가져야하며 관통 구멍의 부피가 결정되어야합니다.
  3. 다음에 따라 공기에 의해 부력이 가해지는 부력에 대한 측정 된 겉보기 질량을 보정하여 시험 질량의 질량 m 을 계산합니다.
    방정식
    ρ 공기 = 1.23 g / L (~ 0.1 % 보정).
  4. Dewar flask 위에서 약 10cm의 안정된 플랫폼에 microbalance를 놓고 교정을 확인하십시오. 마이크로 저울의 밑면에있는 훅에서 매달아 놓은 2mil (50um) 모노 필라멘트 라인 (질량 측정을 위해 설계됨)과 throu테스트 질량에 구멍을 줘. 대기 중의 겉보기 질량을 결정하고 단계 3.3의 측정과 비교하여 필요에 따라 선의 질량을 보정하십시오.
  5. 순수한 액체 질소에서의 겉보기 질량을 측정하여 T = 77K에서 시험 질량의 부피 V (77K)를 결정한다. 그것이 완전히 잠길 때까지 구리 챔버 내의 액체 질소로 시험 질량을 낮추십시오. 끓는 것이 중지되면 겉보기 질량을 측정하십시오.
    참고 : 구리 챔버의 액체 질소가 대기 상태이고 미세 기상과 액체 표면 사이의 공기 흐름이 최소 인 경우이 질량은 ± 0.0002g 정확도 이상으로 측정 할 수 있습니다.
  6. 선의 잠긴 부분에 대한 부력을 예측하고 측정 오류와 비교하여 작 은지 확인합니다.
  7. 알려진 질량 m 과 77 K에서 LN2의 측정 된 겉보기 질량을 사용하여 77 K에서 시험 질량의 부피와 밀도를 계산한다. m app in LN2, 다음에 따라 :
    방정식
    여기서 ρLN2 ( (77 K) = 0.807 g / mL).

4. 초기 액체 N 2 -Ar 혼합물의 제조

  1. 코일 형 튜브를 통해 ~ 2 L / min의 유속으로 Ar 가스를 배출구로 흘려 보내십시오. 구리 챔버의 위치를 ​​안정화시키는 상부 스트러트 상단에 코일 튜브를 놓고, 액체 질소 레벨 바로 위 및 Dewar의 상단 표면 아래에 놓습니다. 차가운 N 2 및 Ar 가스가 극저온 액체 위에 쌓이게되고 열전도, 대류 및 복사가 튜빙과 Ar 가스를 냉각시킵니다.
  2. 감긴 튜브를 5 분 동안 냉각시킨 후 액체 질소 표면 아래 최소 10cm의 구리 챔버에 튜브의 배출구를 놓으십시오. 그런 다음 고리 모양의 덮개와 투명 시트로 Dewar를 덮으십시오.
  3. Ar 기포가 상승 할 때까지 Ar 유량을 조정하십시오.튜브 배출구에서 액체 질소의 상부 표면까지. 그런 다음 거품이 출구에서 형성 될 때까지 유속을 줄이면서 액체 질소 표면을 깨기 직전에 용해 또는 액화하십시오.
    참고 : 구리 챔버의 Ar 농도가 증가함에 따라 기포 형성을 유지하기 위해 필요에 따라 Ar 유량을 주기적으로 조정하십시오. Ar 유량이 너무 낮 으면 Ar이 튜브 내부에서 동결되어 유량을 차단할 수 있습니다.
  4. 필요에 따라 액체 질소를 추가하여 주위의 Dewar에서 레벨을 유지합니다. 찬 표면에 얼음이 쌓일 때 얼음을 제거하십시오.
  5. 얇은 절연로드에 부착 된 얇은 ( 예 : 35 미크론) 원형 호일 시트를 구리 챔버에 넣고 피스톤처럼 천천히 위아래로 움직여 액체를 주기적으로 혼합하십시오. 이것은 용액의 농도 구배와 Ar이 결정화되는 경향을 감소시킵니다.

5. 초기 N 2 -Ar 혼합의 밀도 측정 및 조정사실

  1. 측정하고자하는 시료의 T = 77 K 밀도를 측정하여 N 2 -Ar 혼합물의 목표 밀도를 계산하십시오 ( 예 : 시료의 비 수성 성분 농도가 높을 때의 측정).
  2. 모노 필라멘트 라인을 사용하여 시험 물질을 마이크로 밸런스 측정 팬의 밑면에있는 후크에 부착하고 공기 중 겉보기 질량을 측정 한 다음 3.1 단계의 측정과 일치하는지 확인하십시오.
  3. 단계 4.5에서와 같이 농도와 농도 기울기를 제거하기 위해 N 2 -Ar 용액을 섞는다.
  4. 시험실을 구리 챔버 외부의 액체 질소로 낮춰 T = 77K로 예열한다. 시험 물질을 액체 질소 위의 차가운 질소 가스 층으로 올리고, 잔여 액체 질소가 시험 물질에서 증발 할 때까지 기다린 다음 차갑고 건조한 시험 물질을 N 2 -Ar 혼합물에 완전히 담글 때까지 내린다. 액체 표면의 2cm 이내.
  5. m 및 T = 77 K 용적 V (77K)를 사용하여 용액 밀도를 계산하십시오.
    방정식
  6. 원하는 초기 농도가 얻어 질 때까지 추가로 Ar을 흐르게하여 용액 밀도를 증가 시키십시오. 싱크대가 떨어지는 샘플 방울은 쉽게 손실 될 수 있으므로 초기 밀도는 예상 샘플 밀도보다 몇 % 이상 높아야합니다. 시료는 부유되어 쉽게 추적 할 수 있으며, N 2 -Ar 혼합물 밀도는 액체 N 2 를 첨가하여 아래로 조정될 필요가 있습니다.
  7. Ar 사전 냉각 코일 튜브를 제거하고 다음에 사용하기 전에 따뜻하게하고 말립니다.

6. 시료 용액 냉각 방울

  1. 방울을 떨어 뜨리고 냉각하기 직전에 1.5에서 mix 질소 / 아르곤 극저온 액체. 거품이 들지 않도록주의하십시오.
  2. 샘플 튜브의 밀폐 캡을 제거하십시오. 깨끗한 1mL 주사기를 사용하여 최대 1mL의 용액을 추출하고 캡을 교체하십시오. 27 ~ 33 G 바늘을 주사기에 부착 한 다음 주사 바늘을 통해 소량의 시료를 밀어 공기 및 이전 디스펜스의 잔여 물을 뺍니다.
  3. 두 가지 방법을 사용하여 N 2 -Ar 혼합물에 시료 방울을 투사 할 수 있습니다.
    1. 적당한 냉각 속도로 유리화 될 수있는 비 수성 성분 농도가 큰 (> 45 % w / w) 샘플의 경우 주사기를 살짝 눌러 작은 직경 (250 μm ~ 1 mm)을 ~ 10 nL ~ 1 μL로 옮깁니다 표면 장력에 의해 바늘 끝에서 매달린다. 부드럽게 바늘을 탭하여 액체 N 2 -Ar 혼합물쪽으로 방울을 분리하여 투사하십시오.
    2. 유리화를 위해 더 빨리 냉각해야하는 시료의 경우 진공관에 연결된 가스 튜브의 출구를 배치하십시오또는 (실험실의 압축 공기에 의해 공급되는) 액체 N 2 -Ar 혼합물 위의 가스 공간에서 제거하고, 형성되는 저온 가스 층을 부드럽게 흡입합니다. 이것은 작은 샘플 11의 냉각 속도를 증가시킵니다.
      1. 조심스럽게 바늘 끝을 25-75 μm 두께의 투명 폴리머 스트립에 대고 작은 체적 (<10 nL, 샘플의 드롭 직경 <200 μm에 해당)을 분배합니다.
        참고 : 가장 작고 거의 구형이며 가장 쉽게 제거 된 방울을 얻기 위해 10 분 동안 소수성 코팅 용액에 스트립을 담그고 시료를 분배하기 전에 건조시킵니다.
      2. 첨부 된 플라스틱이나 나무 막대를 사용하여 스트립을 잡고 수동으로로드와 스트립을 액체 N 2 -Ar 혼합물에 넣습니다.
      3. 방울이 고형화되고 끓는 물이 멈추었 으면 핀셋을 사용하여 막대 반대쪽의 스트립 가장자리를 잡습니다. 스트립을 휘게하여 액체 N 2 -Ar에 담그고 시료가 튀어 나올 때까지 서핑을하십시오.에이스.

7. 샘플 상태의 평가

  1. 장시간 작동 거리 (5-10 cm)의 쌍안 현미경과 LED 또는 광섬유 조명 장치의 밝고 시원한 조명을 사용하여 액체 N 2 -Ar에 잠긴 채로 조심스럽게 조사하십시오. 유리화 된 방울은 깨끗하게 보입니다 12 , 13 . 흐려 지거나 흐려지는 (한 단계 이상을 포함 할 가능성이있는) 방울 및 / 또는 균열 (평균 밀도를 변화시키는 공극과 관련 될 수 있음)을 포함한 광학적 불완전 성을 나타내는 방울을 거부하십시오.
    참고 : 검정색 배경을 제공하기 위해 구리 챔버의 내부 표면을 페인팅하면 시료 불완전 성을 식별 할 수 있습니다.

8. 시료의 밀도 결정

  1. 분배 된 방울은 N 2 -Ar 혼합물에서 중립적으로 떠 다니거나 떠오를 것입니다 (드물게).떠 다니는 물방울은 때때로 표면 장력, 작은 기포 또는 부착 된 얼음 입자에 의해 억제 될 수 있습니다. 현미경으로 전체 낙하면을 검사하십시오. 작은 (직경 2 ~ 3 mm, 길이 10 cm) 사전 냉각 된 플라스틱 또는 목재 막대를 사용하여 액체 표면에서 방울을 아래쪽으로 바꾸고 반응을 관찰합니다.
  2. 방울이 가라 앉으면 물방울이 중성 부력이되거나 부유 할 때까지 4 단계의 절차를 사용하여 액체 N 2 -Ar의 밀도를 증가시킵니다.
  3. 방울이 뜨면 1.8 mL의 냉동고를 사용하여 액체 질소를 가하여 N 2 -Ar 액체의 밀도를 줄이십시오. 초기 혼합 밀도가 크면 (1.2-1.3g / mL), N 2 를 1mL 씩 증가 시키면 밀도가 상당히 달라 지지만, 밀도가 낮은 경우 (0.8-0.9g / mL) 5mL로 증가시켜야합니다. 부드럽게 구리 챔버에서 위아래로 얇은 천공 된 구리 호일 시트를 사용하여 N 2 -Ar (시료 방울을 잃지 않도록)을 섞으십시오.
  4. 각 N 2 추가 후, 작은 미리 냉각 된 막대를 사용하여 부드럽게 물방울을 액체 속으로 아래로 옮기고 표면으로 돌아 오는 속도를 관찰하십시오.
  5. 용액 농도가 중성 부력으로 나타나거나 매우 천천히 상승하도록 (50 μm / s 미만에서는 50 pL 이하의 물방울에 대해 ~ 0.1 % 또는 더 높은 밀도 정확도를 보장합니다), N 2 - Ar 혼합물 밀도를 측정한다. 그런 다음 방울이 처음 천천히 가라 앉기 시작할 때까지 액체 N 2를 추가하고 N 2 -Ar 혼합물 밀도를 다시 측정한다. 이 두 측정 값은 드롭 밀도에 대한 경계를 제공합니다.

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Representative Results

수성 글리세롤 및 에틸렌 글리콜 대비 동결 방지제 농도에 대한 T = 77 K에서의 밀도 측정은 각각 그림 1A그림 1B에 표시되어 있으며 T = 298 K에서 77 K 사이의 해당 부피 변화가 이전에 결정된 T = 298 K 밀도는 그림 2에 나와있다 . 높은 동결 방지제 농도에서 용액은 유리화 상태로 냉각되면서 수축되고 순수한 물은 팽창합니다. 두 가지 동결 방지제의 20-25 % w / w 용액 근처에는 순 팽창 또는 수축이 나타나지 않는 것으로 예측됩니다. 부피 변화 농도의 기울기는 물의 4 면체 저온 구조에 대한 추가적인 동결 방지제의 효과가 가장 두드러지는 40 % w / w 미만의 가장 큰 크기를 갖는다.

그림 1
그림 1 : 유리 상 T = 77 K 밀도 Cryoprotectant 농도 . T = 77 K 밀도 대 ( A ) 글리세롤 및 ( B ) 에틸렌 글리콜을 함유하는 유리화 된 수성 액적에 대한 농도. 데이터는 3 개의 개별 방울의 평균 ± SEM으로 나타내었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : 298 K에서 액체에서 77 K에서 유리상 으로 냉각시의 비 체적 변화. 298 K에서 77 K 로의 수성 용매 냉각시 부피 변화글리세롤과 에틸렌 글리콜이 포함되어 있습니다. T = 298 K 용액 밀도는 이전의 측정 값 14 , 15 로부터 얻어진다. 데이터는 3 개의 개별 방울의 평균 ± SEM으로 나타내었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

그럼에도 불구하고 장비 제작 도구 및 기계류에 대한 접근이 제한적인 학부생에 의해 주로 개발 된 본 장치 및 방법은 50pL만큼 작은 개별 액체 방울에 대해 매우 정확한 밀도 측정을 제공합니다. 유리화 된 시료를 얻기에 작은 냉각 속도가 충분한 50 % w / w 이상의 농도 범위에서 벌크 시료에 대한 이전의 측정에서 얻은 밀도와 일치합니다. 현재 밀도가 0 % 농도 - 순수한 것으로 외삽 된 것은 또한 77K에서 저밀도 비정질 얼음의 허용 밀도와 상당히 잘 일치한다.

주어진 혼합물을 중성으로 부양 시키는데 필요한 최종 N - Ar 밀도에 따라, Ar 흐름의 30 분 내지 5 시간 사이에 필요한 N2 - Ar 혼합물을 생성시켰다. 이 시간은 디퓨저 또는 다중 가스 튜브를 사용하여 Ar mixin의 표면적을 증가시킴으로써 줄일 수 있습니다g을 극저온 액체에 넣었다. 중성 부력으로 낙하가 확인 될 때까지 N 2 -Ar 밀도를 조정하는 것은 또한 시간이 오래 걸릴 수 있으며, 특히 작은 반경 ( r )의 낙하가 작은 단자 속도 ( 방정식 r 2 )보다주의 깊은 관찰이 필요하다. N 2 -Ar 혼합물은 수직 밀도 / 조성 구배를 나타내는 경향이 있으므로 규칙적으로 혼합되어야한다. 결과적으로, 주어진 용질 유형 및 농도에 대해 단일 유리상 밀도 점을 결정하고, 적어도 3-5 방울의 측정을 요구하는 데는 수 시간이 걸릴 수 있습니다.

각 농도에서 2 ~ 3 방울의 밀도가 일반적으로 측정됩니다. 각 방울의 "밀도"는 방울 싱크를 만든 가장 큰 측정 된 N 2 -Ar 밀도와 플로트로 만든 최소 밀도로 주어진 밀도에 대해 측정 된 상한 및 하한 경계의 평균으로 계산됩니다. 단단한 상한과 단단한 하한 (단단함이 상승 속도 또는 낙하의 강하에 의해 평가되는 경우)이 주어진 낙하의 측정에서 항상 얻어지는 것은 아니므로 ( 예 : 혼합 중에 낙하가 손실 될 수 있음), 측정 동일한 농도와 크기의 방울은 때때로 단일 밀도 추정치로 합쳐졌습니다.

실험 시간을 줄이기 위해 고밀도 N 2 -Ar 혼합물을 준비하고 1-3 일 후에 사용하기 위해 극저온 저장 용기에 저장하려고 시도했다. 모든 경우에 Ar은 용액에서 결정화되었고 액체 밀도는 저장 시간에 따라 감소했다. 액체 N 2 -Ar가 규칙적으로 혼합되지 않으면 Ar 밀도와 액체 밀도가 감소한다.

이러한 측정의 주요 과제는 설탕 제거 및 얼음 형성을 최소화하는 것입니다. 수증기 응축, 얼음 형성 및 얼음 축적다른 차가운 표면에있는 샘플 냉각 챔버, N 2 -Ar 혼합물 위의 차가운 가스 및 N 2 -Ar 혼합물 자체에서 밀도 측정에 사용 된 샘플을 오염시키고, 내부에서 얼음 핵 생성을 촉진하며, 겉보기 밀도를 변경할 수 있습니다. 시료 위에 얼음을 띄우고 액체 N 2 -Ar 혼합물 위에 떠 다니면 샘플의 저온 상태 (유리질 또는 다결정)를 평가하기가 어려울 수 있습니다. 얼음 형성을 최소화하려면 정기적으로 차가운 모든 표면을 얼음으로 검사하십시오. 조심스럽게 기계적으로 얼음을 제거하거나 따뜻한 N 2 가스를 사용하십시오. 구리 챔버에 얼음이 쌓인 경우 미세 메시 스크린을 사용하여 얼음을 제거하거나 그렇지 않으면 챔버를 제거하고, 비어서 건조시키고 다시 채우십시오.

유리화 된 시료를 얻는 데 필요한 최소 (임계) 냉각 속도는 용질 농도가 감소함에 따라 증가하며 순수한 물에 대해 10 6 K / s에 이릅니다. 샘플 냉각 속도는 방울 모양 및 크기에 따라 다릅니다 (액체 냉각제에 투사되는 속도, 액체 냉각제 위의 냉각 가스의 존재 (냉각 속도를 감소시키는), 액체 한제의 특성에 따라 달라질 수 있습니다. 일반적으로 1,000 K / s보다 큰 냉각 속도는 ~ 1 nL (~ 100 μm)보다 작은 부피 (직경)의 방울을 필요로합니다.

유리질 밀도를 측정 할 수있는 가장 낮은 용질 또는 동결 방지제 농도는 최대 낙하 냉각 속도와 유리화를위한 시각적 분석을 신뢰할 수있게 사용할 수있는 최소 크기의 낙하로 설정됩니다. 액체 프로판 또는 액체 프로판 - 에탄 혼합물에서 샘플을 냉각하여 냉각 속도를 ~ 5 배까지 증가시킬 수 있습니다. 액체 N 2 와는 달리,이 극저온 액체는 끓는점과 용융 온도 사이에서 큰 분리를 가지므로 열 전달 제한 표면 비등없이 훨씬 많은 열을 흡수 할 수 있습니다. 냉각 된 방울은 N 2 -Ar로 전달 될 수있다.밀도 측정을위한 혼합물. 맑은 물방울에서 흐릿한 물방울 또는 흐린 물방울로의 전환은 용질 농도 (약 2 % w / w) 및 냉각 속도의 좁은 범위에서 급격하게 발생하며 X- 선 회절 패턴 16 , 17 . 그러나 드롭 볼륨이 10 pL로 감소함에 따라 정확한 시각적 명확성 평가가 더 어려워집니다.

N 2 -Ar 혼합물을 사용하는 시료 밀도의 접근 가능한 범위는 순수한 액체의 밀도에 의해 각각 0.81 g / mL 및 1.40 g / mL로 설정됩니다. 액체 Ar-Kr 혼합물은 Kr 결정화에 민감하지만, 액체가 일정하게 혼합되어 있으면이 밀도 범위를 확장하는 데 사용될 수 있습니다.

여기에 설명 된 방법은 수용성 혼합물, 세포, 세포 응집체, 기타 생물학적 물질 및 기타 시료의 밀도를 결정하는 데 광범위하게 적용 할 수 있습니다.원하는 저온 단계를 달성하기 위해 큰 냉각 속도가 요구된다. 이러한 밀도는 저온 보존에서의 시료 손상을 이해하고 최소화하고, 수용액 및 밀폐 된 환경에서 물의 거동을 이해하는데 유용 할 것이다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

이 작품은 MCB-1330685 상을 수상한 NSF의 지원을 받았다. DWM은 Cornell University의 분자 생물 물리학 훈련 보조금 (NIH T32GM0082567)의 부분 지원을 인정합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
centrifuge tube Falcon 6029236 15 mL conical centrifuge tube
glycerol, >99.5% Sigma  G9012-100 mL
ethylene glycol, >99.8% Sigma 324558-100 mL
analytical microbalance Mettler AE240 Analytical balance, 0.01 mg resolution, has hook on bottom for weighing below the balance 
vortexer Scientific Industries SI-0236 Vortex-Genie 2
Apparatus enclosure framing Unistrut  1-5/8" metal framing 48" wide x 24" deep x 40" tall 
Apparatus enclosure air barrier any clear plastic sheeting
neoprene rubber disk 4" diameter, 1/8" thick
dewar flask Scilogix Dilvac SS333 4.5 liter dewar flask with steel case and clamp lid
copper chamber This fabricated part is comprised of a 1.43" diameter, 0.017" wall thickness copper tube with a solid cylindrical copper base soldered to seal one end.  The copper base is 0.87" tall and the overall chamber height is 7".
nitrogen gas Airgas NI HP300 99.998% pure N2 gas
argon gas Airgas AR HP300 99.998% pure Ar gas
rotameter Omega FL3692ST 2.52 L/min max flow rate
foam insulating lid This part is fabricated from 4 lb/ft3 crosslinked polyethylene foam (supplied by Technifab, 1355 Chester Industrial Parkway, Avon, OH), and has an OD of 2.42", and ID of 1.52", and a thickness of 0.79".    
PTFE test mass This fabricated part is a 0.246" diameter, 0.580" tall cylinder with a 0.060" diameter hole running perpendicular to and intersecting the cylinder axis ~0.10" from one end. 
microbalance platform Unistrut 1-5/8" metal framing 11" wide x 24" long x 24" high rectangular frame with an top aluminum sheet containing a hole for the monofilament and hanging test mass
2 mil (50 um) monofilament line Berkley NF1502-CM Nanofil fishing line
Argon precooling coil tubing VWR 60985-512 1/8" ID x 1/4" OD PVC tubing
perforated copper foil mixer 1.4" diameter,  35 micron thick copper disk, cut from 1 ounce/ft2 copper sheet and perforated with holes using an awl or other sharp pointed tool.  Insert 1-2 mm diameter rigid thermally insulating (plastic or wood) rod into the center and fix using epoxy as needed.
syringe BD 309628 1 mL Luer-Lok tip syringe
vacuum generator Gast VG-015-00-00 compressed air venturi single stage vacuum generator
hydrophobic coating spray RainX 620036 plastic water repellent
long focal length stereo microscope Bausch and Lomb Stereozoom 6 0.67-4 x zoom pod with 20X eyepieces, 10 cm working distance 
LED ring illuminator Amscope LED144S
LED spot illuminator Newhouse Lighting NHCLP-LED 3W LED gooseneck clamp lamp
1.8 ml cryo vial Nunc V7634-500EA Any 1.8 or 2 mL cryovial is adequate

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References

  1. Fahy, G. M., Wowk, B. Principles of Cryopreservation by Vitrification. Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols. 21-82 (2015).
  2. Nagy, Z. P., Nel-Themaat, L., Chang, C. -C., Shapiro, D. B., Berna, D. P. Cryopreservation of eggs. Human Fertility: Methods and Protocols. 439-454 (2014).
  3. Kriminski, S., Caylor, C. L., Nonato, M. C., Finkelstein, K. D., Thorne, R. E. Flash cooling and annealing of protein crystals. Acta Cryst Sect D. 58, (3), 459-471 (2002).
  4. Juers, D. H., Matthews, B. W. Reversible lattice repacking illustrates the temperature dependence of macromolecular interactions. J Mol Biol. 311, (4), 851-862 (2001).
  5. Juers, D. H., Matthews, B. W. Cryo-cooling in macromolecular crystallography: advantages, disadvantages and optimization. Q Rev Biophys. 37, (2), 105-119 (2004).
  6. Alcorn, T., Juers, D. H. Progress in rational methods of cryoprotection in macromolecular crystallography. Acta Cryst Sect D. 66, (4), 366-373 (2010).
  7. Warkentin, M., Sethna, J., Thorne, R. Critical Droplet Theory Explains the Glass Formability of Aqueous Solutions. Phys Rev Lett. 110, (1), 15703 (2013).
  8. Kriminski, S., Kazmierczak, M., Thorne, R. E. Heat transfer from protein crystals: implications for flash-cooling and X-ray beam heating. Acta Cryst Sect D. 59, (4), 697-708 (2003).
  9. Loerting, T., Bauer, M., Kohl, I., Watschinger, K., Winkel, K., Mayer, E. Cryoflotation: Densities of amorphous and crystalline ices. J Phys Chem B. 115, (48), 14167-14175 (2011).
  10. Shen, C., Julius, E. F., Tyree, T. J., Moreau, D. W., Thorne, R. E. Thermal contraction of aqueous glycerol and ethylene glycol solutions for optimized protein-crystal cryoprotection Thermal contraction of aqueous glycerol and ethylene glycol solutions for optimized protein-crystal cryoprotection. Acta Cryst Sect D. 72, (6), 742-752 (2016).
  11. Warkentin, M., Berejnov, V., Husseini, N. S., Thorne, R. E. Hyperquenching for protein cryocrystallography. J Appl Cryst. 39, (6), 805-811 (2006).
  12. McFerrin, M. B., Snell, E. H. The development and application of a method to quantify the quality of cryoprotectant solutions using standard area-detector X-ray images. J Appl Cryst. 35, (5), 538-545 (2002).
  13. Chinte, U., Shah, B., DeWitt, K., Kirschbaum, K., Pinkerton, A. A., Schall, C. Sample size: An important parameter in flash-cooling macromolecular crystallization solutions. J. Appl. Cryst. 38, (3), 412-419 (2005).
  14. Bosart, L. W., Snoddy, A. O. Specific gravity of glycerol. Ind Eng Chem. 20, (12), 1377-1379 (1928).
  15. Rodrigues, M., Francesconi, A. Z. Experimental study of the excess molar volumes of binary and ternary mixtures containing water + (1,2-ethanediol, or 1,2-propanediol, or 1,3-propanediol, or 1,2-butanediol) + (1-n-butyl-3-methylimidazolium bromide) at 298.15 K and atmospheric pressure. J Solution Chem. 40, (11), 1863-1873 (2011).
  16. Berejnov, V., Husseini, N. S., Alsaied, O. A., Thorne, R. E. Effects of cryoprotectant concentration and cooling rate on vitrification of aqueous solutions. J Appl Cryst. 39, (2), 244-251 (2006).
  17. Meisburger, S. P., Warkentin, M., et al. Breaking the Radiation Damage Limit with Cryo-SAXS. Biophys J. 104, (1), 227-236 (2013).

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