Måling af tætheder af vandige briller ved kryogene temperaturer

* These authors contributed equally
Engineering

Your institution must subscribe to JoVE's Engineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

En protokol til bestemmelse af glasagtige fasedensiteter af mikro- til pico-liters størrelse dråber vandige blandinger ved kryogene temperaturer er beskrevet.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Shen, C., Julius, E. F., Tyree, T. J., Dan, R., Moreau, D. W., Thorne, R. Measuring the Densities of Aqueous Glasses at Cryogenic Temperatures. J. Vis. Exp. (124), e55761, doi:10.3791/55761 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Vi demonstrerer en fremgangsmåde til bestemmelse af de glasagtige fase-kryogeniske temperaturdensiteter af vandige blandinger og andre prøver, som kræver hurtig afkøling, for at fremstille den ønskede kryogentemperaturfase. Microliter til picoliterstørrelsesdråber afkøles ved fremspring i en flydende nitrogen-argon (N2-Ar) -blanding. Dråbens kryogene temperaturfase evalueres ved anvendelse af et visuelt assay, der korrelerer med røntgendiffraktionsmålinger. Tætheden af ​​den flydende N2-Ar-blanding justeres ved tilsætning af N2 eller Ar, indtil dråben bliver neutralt flydende. Tætheden af ​​denne blanding og dermed af dråben bestemmes ved anvendelse af en testmasse og Archimedes-princip. Med passende omhu i dråbeforberedelse, styring af gas over den flydende kryogenblanding for at minimere isning og regelmæssig blanding af den kryogene blanding for at forhindre densitetstratifikation og faseseparation, tætheder, der er nøjagtige til <0,5% dråber så små som 50 pL kanLet bestemmes. Målinger på vandige kryobeskyttelsesblandinger giver indsigt i kryobeskyttende virkning og tilvejebringer kvantitative data for at lette termisk sammentrykningsmatchning i biologisk kryopreservering.

Introduction

De fysiske egenskaber af vand og vandige blandinger i deres forskellige faser er af grundlæggende interesse og er vigtige for in vivo og in vitro forståelse af biologiske systemer. I nutidig kryobiologi og biologisk kryopreservering er de glasagtige eller amorfe faser af vandige kryobeskyttelsesblandinger af særlig interesse 1 , 2 . Kernering og vækst af iskrystaller kan forstyrre celler og væv og fremme protein denaturering og aggregering, så kryopreserveringsprotokoller, der fortynder opløsningsmidlet, er blevet mere og mere populære. Ved biomolekylær krystallografi forstyrrer krystalliseringen af ​​opløsningsmiddel i kanalerne mellem biomolekyler krystalgitter og nedbryder diffraktionsegenskaber. Vitrifikation opnås ved en kombination af hurtig afkøling, dehydrering og tilsætning af kryobeskyttende opløste stoffer såsom glycerol, ethylenglycol, polyethylenglycoler (PEG'er),Alkoholer og salte.

Vitrifikation begrænser iskrystallisation og vækst, men eliminerer ikke al kølemæssig prøveskade. For eksempel øges krystalmosaiciteten (et mål for fordelingen af ​​krystalplanretninger) rutinemæssigt med en faktor fra 10 til 100, når proteinkrystaller afkøles til en forglasset tilstand 3 , og efter-optødeligheden af ​​forglassede spermaceller og oocytter varierer meget .

En skadesmekanisme er differentiel sammentrækning af opløsningsmiddel og omgivende materiale under afkøling 3 , 4 , 5 . Ligevægtsopløsningsmidlet og opløst koncentration i en krystal, celle eller væv er temperaturafhængige, og opløsningsmidlet plus opløste og omgivende materiale kan indgå i forskellige mængder. Hurtig afkøling kan forhindre opløsning af opløsningsmiddel og opløsning inden forglasning og differentialkontrakt På kan føre til store, inhomogene, ikke-ligevægtspændinger, som forårsager prøveskade.

Rationelle fremgangsmåder til reduktion af køleinduceret skade kunne således drage fordel af kendskabet til temperaturafhængige tætheder af flydende og forglassede vandige blandinger. Ved opløst koncentrationer over 50 vægtprocent opløst stof til vægten af ​​opløsning (vægt / vægt) kan de mest vandige kryobeskyttelsesblandinger forglasses med beskedne afkølingshastigheder på 10 K / s eller mindre, hvilket tillader produktion af og densitetsmålinger ved anvendelse af store glasagtige prøver 6 . Densiteten kan derefter bestemmes ved anvendelse af Archimedes 'princip ved at måle den tilsyneladende vægt af prøven, når den suspenderes i et flydende kryogen som nitrogen. Da opløsningsmiddelkoncentrationen falder, øges kølingshastighederne for vitrifikation hurtigt: Køleværdier for vandige glycerolblandinger stiger fra <10 K / s ved 50 vægtprocent opløsning i g til volumen opløsning i mL (vægt / volumen) til> 1000 K / s ved 25% vægt / volumenAss = "xref"> 7. Varmeoverførsel begrænses grænselag, således at opnå større kølehastigheder kræver mindre og mindre prøver 8 .

Målinger af tætheden af ​​rent glasagtigt vand og is er opnået ved at deponere dråber med mikrometer-diameter (femtoliter volumen) i et vakuum på en kryogenisk afkølet overflade for at opbygge en makroskopisk (grammasse) prøve. Tætheden af ​​denne prøve blev bestemt ved cryoflotation i en flydende nitrogen-argonblanding, i hvilken densiteten af ​​den kryogene væske blev justeret, indtil prøven blev neutralt flydende 9 . Imidlertid genererer store prøver fra et stort antal små dråber på en måde, der minimerer tomrumsvolumen - en vigtig fejlkilde i tidligere målinger af glasfasetæthed - ikke-trivielt. For vandige blandinger kan differentiel fordampning af opløsningskomponenter under aerosolisering og afsætning i vakuum føre tilVæsentlige usikkerheder i deponerede koncentrationer.

Vi har udviklet en metode baseret på cryoflotation, der tillader præcis densitet bestemmelse af vandige blandinger under anvendelse af individuelle dråber så små som 50 pL10. Disse dråber kan hurtigt afkøles, mens deres oprindelige koncentrationer bibeholdes, og deres kryogene temperaturtilstand (forglasset eller krystallinsk) kan vurderes ved anvendelse af en simpel visuel analyse, der korrelerer med røntgendiffraktionsmålinger. Denne metode er bredt anvendelig til vandige og ikke-vandige blandinger og kan udvides til en række biologiske prøver, herunder celler ( fx stamme og æg), vævsprøver og proteinkrystaller med lavtemperaturdensiteter mellem 0,8 og 1,4 g / ml.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

FORSIGTIG: Se venligst alle relevante sikkerhedsdatablade (MSDS) inden brug. Brug alle relevante sikkerhedspraksis ved brug af komprimerede gasser, herunder passende kalibrerede gashåndteringsregulatorer og ventiler og godkendt gasrør. Kontakt med flydende kryogener kan forårsage alvorlig frostskader og nekrose. Brug passende personlige værnemidler (ansigtsskærm, handsker, laboratoriefrakke, bukser i fuld længde, lukkede sko), som alle må være uigennemtrængelige for flydende nitrogen. Bliv stående og sikret en uhindret udgangssti fra apparatet, når du bruger flydende kryogener. Vær opmærksom på beskadigelsesfare ved brug af komprimerede gasser og flydende kryogener, og arbejd i et godt ventileret område med tilstrækkelig make-up luft (et dampkåbe eller et højt luftomsætningsrum).

1. Fremstilling af vandige opløsninger til massefylde

BEMÆRK: Fordi vægte lettere måles til en høj nøjagtighed end volOpløsningskoncentrationer måles i vægt / vægt-enheder. Alle tætheder og smeltende eller kogende temperaturer antager et atmosfærisk tryk på ~ 100 kPa. De følgende trin beskriver fremstillingen af ​​en 35% vægt / vægt glycerolopløsning. Den samme procedure kan anvendes til andre koncentrationer og opløste stoffer.

  1. For hver opløst type og koncentration af interesse vurderer du den krævede solut masse til opnåelse af den ønskede slutkoncentration ( f.eks . Mellem 25% vægt / vægt og 100% vægt / vægt) for et totalt opløsningsvolumen, V til = 10 ml opløsningsvolumen . For eksempel er opløsningsmassen, ms , en 35% vægt / vægt glycerolopløsning ( p s = 1,26 g / ml):
    ligning
    Hvor x er opløst massefraktion (0,35) og pw = 1 g / ml er densiteten af ​​vand.
  2. Anbring et 15 ml centrifugerør (eller anden volumenkalibreret vandimpermeabel beholder) på pandenAf en analytisk mikrobalance. Afgiv den ønskede masse af opløst / kryoprotektivt middel ( f.eks . 3,77 g glycerol til en 35% vægt / vægt opløsning) i røret og registrer den faktiske opløste masse.
  3. Tilsæt høj renhed (> 18 MΩ) deioniseret vand for at bringe den samlede masse op til 10,0 g
  4. Vortex beholderen i 30 s (for flydende opløste stoffer) eller 5 min (til faste opløste stoffer), indtil opløsningen er optisk homogen.
  5. Mål og optag den endelige masse af opløsningen. Tæt beholderen med en lufttæt hætte og opbevar ved konstant temperatur (293-298 K).

2. Fremstilling af prøvekølingskammeret

  1. Anbring det eksperimentelle apparat, der er beskrevet nedenfor, i et kabinet og flyd tør luft (> 5% relativ luftfugtighed) i kabinettet.
    BEMÆRK: Kabinettet kan være en simpel metalramme med top og tre sider forseglet med klart plastark og med adgang til eksperiment via en fjerde side dækket af fleksibelt plastark. Have påAnsigtsskærme og fuld kropsbelægning for at minimere fugt indført af eksperimentet. Fugtkondensation og isdannelse kan interferere med målinger af kryogen temperaturdensitet på flere måder, og det skal derfor minimeres.
  2. Anbring en disk af neoprengummi på bunden af ​​en 4,5 L glas Dewar kolbe for at beskytte Dewar kolben mod beskadigelse.
  3. Indsæt forsigtigt et kobberkammer med høj termisk ledningsevne (en hul cylinder med forseglet bund) i kolben, indtil den hviler på gummiskiven. Juster stiver, der rager udad fra kammeret til Dewar-væggene, så kammeret er centreret og har ingen tendens til at rocke.
    BEMÆRK: Dewar-kolben holder flydende nitrogen, og det meget mindre volumen kobberkammer vil holde en flydende N 2 -Ar-blanding. Det flydende nitrogen tilvejebringer et termisk bad, der opretholder kobberkammeret og dets indhold ved en konstant temperatur på 77 K og reducerer kogende og fordampningstab i kammeret. Kammeret & #39; s lille diameter undertrykker overfladebølger, der kan forstyrre opdriftsmålinger og hjælper med at isolere væsken inde i kammeret fra frost og is dannet andetsteds i apparatet.
  4. Indsæt udløbet af et gasrør med tør N 2 gas, der flyder ved ~ 2 l / min ned til bunden af ​​kobberkammeret, og rens kammeret af fugtig luft.
  5. Hæld langsomt flydende nitrogen i Dewar-kolben uden for kobberkammeret, hvilket giver tid til kogning af nitrogen.
    BEMÆRK: Det endelige påfyldningsniveau, efter at kogningen er ophørt, skal være inden for ca. 4 cm af toppen af ​​kobberkammeret.
  6. Dækkolens ydre del dækkes med et ringformet skumisolerende låg. Fjern det tørre N 2 gasudrensningsrør fra kobberkammeret og indsæt i en matchende åbning i låget.
    BEMÆRK: Kombinationen af ​​N 2- gas fra kogning i Dewar-kolben og fra rensevæsken udviser enhver fugtig luft og forhindrer det i at kondensere og krystallisere oN kolde overflader.
  7. Hæld langsomt flydende nitrogen i kobberkammeret. Det endelige påfyldningsniveau, efter at kogningen er ophørt, skal være inden for ca. 4 cm af toppen af ​​kobberkammeret.
  8. Anbring et tyndt optisk transparent plastark over den centrale åbning eller udluftning i låget, og reducer N 2 -gasstrømningshastigheden til ~ 0,2 l / min, hvilket efterlader et let overtryk af N 2 gas inden for gasrummet over de kryogene væsker.
    BEMÆRK: Så længe kryogeniske væsker er til stede i Dewar og kammeret, skal du fortsætte med at justere N 2 -gasstrømmen for at opretholde dette overtryk og forhindre, at fugt kommer ind i Dewar og danner is.

3. Bestemmelse af testmassens volumen og densitet ved T = 298 K og T = 77 K

  1. Bestem den tilsyneladende masse af en ~ 1 g, 0,4 ml PTFE testmasse ( Tabel af materialer ) i luft ved T = 298 K ved at placere den på pandenAf en kalibreret analytisk mikrobalance.
  2. Bestem testmassens volumen V (298 K) ved T = 298 K ved hjælp af et gaspycnometer eller ved dimensionelle målinger ved hjælp af kaliper. Hvis man bruger dimensionelle målinger, skal testmassen have en simpel, præcis form (ingen tapere eller afrundede hjørner), og volumenet af gennemgående hul (for suspensionslinjen) skal bestemmes.
  3. Beregn massens massemasse m ved at korrigere den målte tilsyneladende masse for den flydende kraft, der udøves af luften i henhold til følgende:
    ligning
    Hvor ρ luft = 1,23 g / l (~ 0,1% korrektion).
  4. Placer mikrobalancen på en stabil platform ca. 10 cm over Dewar-kolben og kontroller dens kalibrering. Suspender testmassen ved hjælp af en 2 mil (50 μm) monofilamentlinie, der er stramt fra krogen på undersiden af ​​mikrobalancen (beregnet til hængende massemålinger) og throuGh et hul i testmassen. Bestem den tilsyneladende masse i luften, og sammenlign med måling i trin 3.3, korrigere efter behov for massen af ​​linjen.
  5. Bestem prøvemassens volumen V (77 K) ved T = 77 K ved at måle dens tilsyneladende masse i rent flydende nitrogen, m app i LN2 . Sænk testmassen i det flydende nitrogen i kobberkammeret, indtil det er helt nedsænket. Når kogningen er ophørt måles den tilsyneladende masse.
    BEMÆRK: Hvis flydende kvælstof i kobberkammeret er hvile og luftstrømme mellem mikrobalance og væskeflade er minimale, kan denne masse måles til mere end ± 0,0002 g nøjagtighed.
  6. Anslå den flydende kraft på den neddykkede del af linjen, og kontroller, at den er lille sammenlignet med målefejl.
  7. Beregn testmassens volumen og densitet ved 77 K ved hjælp af dens kendte masse m og den målte tilsyneladende masse i LN2 ved 77 K, m app iN LN2, i overensstemmelse med følgende:
    ligning
    Hvor p LN2 ( (77 K) = 0,807 g / ml.

4. Fremstilling af den oprindelige flydende N2-Ar-blanding

  1. Flow Ar gas ved en strømningshastighed på ~ 2 L / min gennem et spolt rør til dets udløb. Placer det spirede rør oven på de øvre stivere, der stabiliserer kobberkammerets position lige over væskeniveauet og under Dewar's overflade. Kold N 2 og Ar gas vil bygge op over de kryogene væsker, og termisk ledning, konvektion og stråling vil afkøle slangen og Ar gasen indenfor.
  2. Efter at have fået det kølede rør til at afkøle i 5 minutter, skal rørets udløb anbringes i kobberkammeret, mindst 10 cm under overfladen af ​​det flydende nitrogen. Derefter dækker Dewar med det ringformede låg og transparent ark.
  3. Juster Ar flowhastigheden indtil Ar bobler stigerFra rørudløbet til den øverste overflade af det flydende nitrogen. Derefter reduceres strømningshastigheden, indtil boblerne dannes ved udløbet, men opløses eller flyder lige før brydningen af ​​den flydende nitrogenoverflade.
    BEMÆRK: Når Ar-koncentrationen i kobberkammeret øges, justeres periodisk Ar-strømmen, som det er nødvendigt for at opretholde boblingsdannelsen. Hvis Ar-strømningshastigheden er for lav, kan Ar fryser inde i røret og blokere strømmen.
  4. Tilsæt flydende nitrogen efter behov for at opretholde niveauet i den omgivende Dewar. Fjern is, da det ophobes på kolde overflader.
  5. Bland væsken regelmæssigt ved at indsætte et tyndt ( fx 35 mikron) cirkulært ark kobberfolie fastgjort til en tynd isolerende stang i kobberkammeret og langsomt at flytte den op og ned som et stempel. Dette vil reducere koncentrationsgradienterne og tendensen for Ar til at krystallisere ud af opløsningen.

5. Måling og justering af densiteten af ​​den indledende N 2 -Ar-blandingTure

  1. Beregn måltætheden for N 2 -Ar-blandingen ved at estimere T = 77 K-densiteten af ​​prøven, som skal måles, fx målinger ved højere koncentrationer af prøveens ikke-vandige komponent.
  2. Fastgør testmassen ved hjælp af monofilamentlinjen til krogen på undersiden af ​​mikrobalance målepanden, måle dens tilsyneladende masse i luften og bekræft enighed med måling i trin 3.1.
  3. Bland N 2 -Ar-opløsningen for at eliminere koncentrations- og densitetsgradienter som i trin 4.5.
  4. Forkøl prøvemassen til T = 77 K ved at sænke den i det flydende nitrogen uden for kobberkammeret. Hæv testmassen i koldt lag af nitrogengas over det flydende nitrogen, vent til det resterende flydende nitrogen fordamper prøvestansen og sænk derefter den kolde tørmasse i N 2 -Ar-blandingen, indtil den er helt nedsænket og Inden for 2 cm af den flydende overflade.
  5. m og T = 77 K volumen V (77K) fra trin 3.7 i henhold til følgende:
    ligning
  6. Forøg opløsningstætheden ved at flyde yderligere Ar indtil den ønskede initialtæthed er opnået. Prøve dråber, som sinken nemt kan gå tabt, så den indledende tæthed skal være mindst et par procent højere end den forventede prøve densitet. Prøven vil så flyde, hvilket gør det nemmere at holde øje med det, og N 2 -Ar-blandetætheden skal så kun justeres nedad ved at tilsætte væske N 2 .
  7. Fjern Ar-forkølingsrullet rør og lad det varme og tørre inden næste brug.

6. Kølende dråber af prøveopløsning

  1. Umiddelbart inden droppedispensering og afkøling gentages trin 1.5 til miX den nitrogen / argon kryogene væske. Pas på ikke at introducere bobler.
  2. Fjern prøveørets lufttætte hætte. Brug en ren 1 ml sprøjte, ekstraher op til 1 ml opløsning, og udskift hætten. Fastgør en 27 til 33 G nål på sprøjten, og tryk derefter en lille mængde prøve gennem nålen for at udvise luft og rester fra tidligere dispensering.
  3. To metoder kan anvendes til at projicere prøve dråber ind i N 2 -Ar blandingen.
    1. For prøver med store ikke-vandige komponentkoncentrationer (> 45% w / w), der kan forglases med beskedne afkølingshastigheder, tryk let på sprøjten for at forskyde en lille diameter (250 μm til 1 mm), ~ 10 nL til 1 μl dråbe Der hænger fra nålespidsen ved overfladespænding. Tryk forsigtigt på nålen for at løsne og projicere dropen mod den flydende N 2 -Ar-blanding.
    2. Til prøver, der kræver hurtigere afkøling til glasrificering, placeres udløbet af et gasrør forbundet med en vakuumgeneratEller (forsynet af komprimeret luft) i gasrummet over den flydende N 2 -Ar-blanding, og forsigtigt sug det kolde gaslag, der dannes. Dette øger kølehastigheden for små prøver 11 .
      1. Rør forsigtigt nålespidsen til en 25-75 μm tykk klar polymerstrimmel for at dispensere et lille volumen (<10 nL svarende til en dråbe diameter <200 μm) af prøven.
        BEMÆRK: For at opnå de mindste, næsten næsten sfæriske og lettest fjernede dråber, blødgør båndet i en hydrofob belægningsløsning i 10 minutter og lad det tørre før prøveudlevering.
      2. Tag strimlen med en vedhæftet plast- eller træstang, og skub stangen og strimlen manuelt ind i den flydende N 2 -Ar-blanding.
      3. Når dråben har størknet og kogning er ophørt, tag båndkanten modsat stangen med pincet. Flekser strimlen, og hold den nedsænket i væsken N 2 -Ar, indtil prøveløbet falder ud og flyder til surfenes.

7. Vurdering af prøvens tilstand

  1. Ved hjælp af et langt kikkertafstand (5-10 cm) kikkertmikroskop og lys, kølig belysning fra en LED eller fiberoptisk belysning skal du omhyggeligt undersøge dropen, mens du holder den nedsænket i væsken N 2 -Ar. Forglassede dråber skal fremstå klare 12 , 13 . Afvis dråber, der er dovne eller overskyet (sandsynligvis indeholdende mere end en fase) og / eller som viser optiske mangler, herunder revner (som kan være forbundet med hulrum, der ændrer gennemsnitsdensiteten).
    BEMÆRK: Maleri indersiden af ​​kobberkammeret for at give en sort baggrund kan lette identifikationen af ​​stikprøvefejl.

8. Bestemmelse af prøveens massefylde

  1. Den udleverede dråbe vil i første omgang flyde, synke eller (sjældent) være neutralt opdrift i N 2 -Ar-blandingen.Flydende dråber kan nogle gange opbevares ved overfladespænding, små bobler eller klæbende ispartikler. Undersøg hele dråbefladen med mikroskopet. Skub dråben nedad fra væskefladen ved hjælp af en lille (2-3 mm diameter, 10 cm lang) forkølet plast eller træstang og observere dens reaktion.
  2. Hvis dråben synker, øges væskens N2-Ar-densitet ved anvendelse af fremgangsmåden i trin 4, indtil dråben bliver flydende neutral eller flyder.
  3. Hvis dråbet flyder, sænk densiteten af ​​væsken N 2 -Ar ved at tilsætte flydende nitrogen ved hjælp af en 1,8 ml cryovial. Ved store indledende blandingsdensiteter (1,2-1,3 g / ml) giver tilsætning af N2 i trin i 1 ml signifikante densitetsændringer, men dette bør øges til 5 mL ved lave densiteter (0,8-0,9 g / mL). Bland forsigtigt N 2 -Ar (for ikke at miste spor af prøvefaldet) ved hjælp af det tynde perforerede kobberfolieark op og ned i kobberkammeret.
  4. Efter hver N 2 tilsætning, Brug en lille forkølet stang til forsigtigt at forskyde den flydende dråbe nedad i væsken og observere dens hastighed, når den vender tilbage til overfladen.
  5. Når opløsningstætheden er justeret, så dråben ser ud til at være neutralt opdrift eller stiger meget langsomt (<50 μm / s sikrer 0,1% eller bedre tæthedsnøjagtighed for dråber med mængder ned til 50 pL) måles N 2 - Ar blandingsdensitet som beskrevet i trin 5. Derefter tilsættes yderligere væske N2, indtil dråben først begynder at langsomt synke og måle N2 -Ar blandetætheden igen. Disse to målinger vil give grænser for droptætheden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Densitetsmålinger ved T = 77 K for forglassede dråber vandig glycerol og ethylenglycol versus kryobeskyttende koncentration er vist i henholdsvis figur 1 A og figur 1 B og den tilsvarende ændring i specifikt volumen mellem T = 298 K og 77 K beregnet ved anvendelse af tidligere Bestemt T = 298 K densiteter, er vist i figur 2 . Ved høje cryoprotectant koncentrationer kontraktene opløses ved afkøling til forglaset tilstand, mens rent vand udvider. Nær 20-25% vægt / vægtopløsninger af begge kryoprotektive stoffer forudses ikke at udvise nogen netudvidelse eller -kontraktion. Hældningen af ​​volumenændringen i forhold til koncentrationen har den største størrelse under 40% vægt / vægt, hvor virkningerne af yderligere kryobeskyttelsesmiddel på vandets tetrahedrale lavtemperaturstruktur er mest udtalte.

figur 1
Figur 1: Viturgasfase T = 77 K Density Versus Cryoprotectant Concentration . T = 77 K tæthed kontra koncentration for forglassede vandige dråber indeholdende ( A ) glycerol og ( B ) ethylenglycol. Data præsenteres som middel ± SEM af tre individuelle dråber. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2
Figur 2: Ændring i specifikt volumen ved afkøling fra væske ved 298 K til glasfasen ved 77 K. Procent volumenændring ved afkøling fra 298 K til 77 K for vandig opløsningGlycerol og ethylenglycol. T = 298 K opløsningsdensiteter opnås fra tidligere målinger 14 , 15 . Data præsenteres som middel ± SEM af tre individuelle dråber. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det foreliggende apparat og fremgangsmåder, der primært udvikles af undergraduates med begrænset adgang til instrumenteringsværktøjer og maskiner, leverer alligevel meget præcise densitetsmålinger for individuelle væskedråber så små som 50 pL. I koncentrationsområdet nær og over 50% vægt / vægt, hvor små kølehastigheder er tilstrækkelige til opnåelse af forglasede prøver, stemmer tæthederne med dem, der er opnået i tidligere målinger på bulkprøver. Ekstrapoleringer af nutidens tætheder til 0% koncentration - rent vand - er også helt enige med den accepterede tæthed af amorf is med lav densitet ved 77 K 9 .

Generering af de N2-Ar-blandinger, der kræves mellem 30 min og 5 h Ar-strømning, afhængigt af den endelige N 2 -Ar-densitet, der er nødvendig for at gøre en given dråbepræparat neutralt opdrift. Denne gang kan reduceres ved at bruge en diffusor eller flere gasrør for at øge overfladearealet til Ar mixinG i den kryogene væske. Justering af N 2 -Ar-tætheden, indtil en dråbe konstateres at være neutralt opdrift, kan også være tidskrævende, især for små radius ( r ) dråber, der har små terminalhastigheder ( ligning R 2 ) og så kræver mere omhyggelige observationer. N 2 -Ar-blandingen har tendens til at udvikle en vertikal densitet / sammensætningsgradient, og det skal derfor regelmæssigt blandes. Følgelig kan bestemmelse af et enkelt glasagtigt fasedensitetspunkt for en given opløst type og koncentration, der kræver målinger på mindst 3-5 dråber, tage flere h.

Ved hver koncentration måles tykkelserne af to eller tre dråber typisk. Tætheden af ​​hver dråbe anslås som gennemsnittet af de målte øvre og nedre grænser på densiteten, givet af den største målte N 2 -Ar-tæthed, der lavede dråbevis og den mindste densitet, der gjorde det flydende. Da både en tæt øvre grænse og en tæt nedre grænse - hvor stramhed vurderes ved stigningshastighed eller faldfald - ikke altid opnås i målinger på en given dråbe ( fx dråben kan gå tabt under blanding), målinger På dråber med samme koncentration og størrelse blev der nogle gange kombineret til et enkeltdygtighedsoverslag.

For at reducere forsøgstider blev der lavet forsøg på at forberede og opbevare højdensitets N 2 -Ar blandinger i kryogene opbevaringsbeholdere til brug en til tre dage senere. I alle tilfælde krystalliserede Ar ud af opløsningen og den flydende densitet faldt med opbevaringstid. Ar-størkning og nedbrydning af flydende densitet forekom også under dråbevægtsmålinger, hvis væsken N2-Ar ikke blev regelmæssigt blandet.

En stor udfordring i disse målinger minimerer frostdannelse og isdannelse. Vanddampkondensation, isdannelse og isakkumulering påPrøvekølingskammer på andre kolde overflader i den kolde gas over N 2 -Ar-blandingen, og i N 2 -Ar-blandingen kan der selv kontamineres prøver, der anvendes i densitetsmålinger, fremmer iskernering i dem og ændrer deres tilsyneladende tæthed. Is på prøven og flydende på og i den flydende N 2 -Ar-blanding kan gøre det vanskeligt at vurdere prøvenes lave temperatur tilstand (glasagtigt eller polykrystallinsk). For at minimere isdannelsen skal du regelmæssigt kontrollere alle kolde overflader for is. Fjern forsigtigt enhver is mekanisk eller ved brug af varm, tør N 2 gas. Hvis isen akkumuleres i kobberkammeret, skal du fjerne den ved hjælp af en fin maskeringsskærm eller ellers fjerne, tømme, tørre og genopfyld kammeret.

Den mindste (kritiske) afkølingshastighed, der kræves for at opnå en forglaset prøve, stiger med faldende opløst koncentration, nærmer sig 10 6 K / s for rent vand 7 . Prøvekølingshastigheden afhænger af form og størrelse af formularenAsing med faldende diameter), den hastighed hvormed dråben projiceres i væskekryogenet, tilstedeværelsen af ​​kold gas over væskekryogenet (som sædvanligvis mindsker kølehastighederne) og egenskaberne af væskekryogenet. Generelt kræver kølehastigheder større end 1000 K / s dråber med volumen (diametre) mindre end ~ 1 nL (~ 100 μm).

Den laveste koncentration af opløsningsmiddel eller kryoprotektant, for hvilken glasagtige tætheder kan måles, bestemmes ved maksimale faldkølingstal og ved de mindste størrelsesdråber, for hvilke det visuelle assay til glasrifikation kan anvendes pålideligt. Kølehastighederne kan øges med en faktor på ~ 5 ved at afkøle prøver i væskeformig propan eller en væskeformig propanethanblanding. I modsætning til flydende N2 har disse kryogene væsker en stor adskillelse mellem kogende og smeltetemperaturer og kan således absorbere meget mere varme uden varmeoverføringsbegrænsende overfladekogning. Afkølede dråber kunne derefter overføres til N2-ArBlanding for massefylde målinger. Overgangen fra klare dråber til dovne eller overskyede dråber er abrupt, der forekommer over et snævert område af opløst koncentration (ca. 2% vægt / vægt) og afkølingshastighed og er blevet korreleret med udseendet af isringe i røntgendiffraktionsmønstre 16 , 17 . Imidlertid bliver nøjagtig visuel klarhedsvurdering vanskeligere, da faldvolumen falder mod 10 pL.

Det tilgængelige område af prøve densiteter ved anvendelse af N2 -Ar blandinger indstilles ved henholdsvis tæthederne af de rene væsker, henholdsvis 0,81 g / ml og 1,40 g / ml. Flydende Ar-Kr-blandinger er modtagelige for Kr-krystallisation, men kan anvendes til at udvide dette tæthedsområde, forudsat at væskerne blev konstant blandet.

Fremgangsmåderne beskrevet her er bredt anvendelige til bestemmelse af tætheder af vandige blandinger, celler, celleaggregater, andre biologiske materialer og andre systemer, hvor små prøver ogStore kølehastigheder er nødvendige for at opnå den ønskede lavtemperaturfase. Disse tætheder vil være nyttige til forståelse og minimering af prøveskade ved kryopreservering og forståelse af vandets opførsel i vandige opløsninger og i trange og overfyldte omgivelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NSF under prisen MCB-1330685. DWM erkender delvis støtte fra Cornell University's Molecular Biophysics Training Grant (NIH T32GM0082567).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
centrifuge tube Falcon 6029236 15 mL conical centrifuge tube
glycerol, >99.5% Sigma  G9012-100 mL
ethylene glycol, >99.8% Sigma 324558-100 mL
analytical microbalance Mettler AE240 Analytical balance, 0.01 mg resolution, has hook on bottom for weighing below the balance 
vortexer Scientific Industries SI-0236 Vortex-Genie 2
Apparatus enclosure framing Unistrut  1-5/8" metal framing 48" wide x 24" deep x 40" tall 
Apparatus enclosure air barrier any clear plastic sheeting
neoprene rubber disk 4" diameter, 1/8" thick
dewar flask Scilogix Dilvac SS333 4.5 liter dewar flask with steel case and clamp lid
copper chamber This fabricated part is comprised of a 1.43" diameter, 0.017" wall thickness copper tube with a solid cylindrical copper base soldered to seal one end.  The copper base is 0.87" tall and the overall chamber height is 7".
nitrogen gas Airgas NI HP300 99.998% pure N2 gas
argon gas Airgas AR HP300 99.998% pure Ar gas
rotameter Omega FL3692ST 2.52 L/min max flow rate
foam insulating lid This part is fabricated from 4 lb/ft3 crosslinked polyethylene foam (supplied by Technifab, 1355 Chester Industrial Parkway, Avon, OH), and has an OD of 2.42", and ID of 1.52", and a thickness of 0.79".    
PTFE test mass This fabricated part is a 0.246" diameter, 0.580" tall cylinder with a 0.060" diameter hole running perpendicular to and intersecting the cylinder axis ~0.10" from one end. 
microbalance platform Unistrut 1-5/8" metal framing 11" wide x 24" long x 24" high rectangular frame with an top aluminum sheet containing a hole for the monofilament and hanging test mass
2 mil (50 um) monofilament line Berkley NF1502-CM Nanofil fishing line
Argon precooling coil tubing VWR 60985-512 1/8" ID x 1/4" OD PVC tubing
perforated copper foil mixer 1.4" diameter,  35 micron thick copper disk, cut from 1 ounce/ft2 copper sheet and perforated with holes using an awl or other sharp pointed tool.  Insert 1-2 mm diameter rigid thermally insulating (plastic or wood) rod into the center and fix using epoxy as needed.
syringe BD 309628 1 mL Luer-Lok tip syringe
vacuum generator Gast VG-015-00-00 compressed air venturi single stage vacuum generator
hydrophobic coating spray RainX 620036 plastic water repellent
long focal length stereo microscope Bausch and Lomb Stereozoom 6 0.67-4 x zoom pod with 20X eyepieces, 10 cm working distance 
LED ring illuminator Amscope LED144S
LED spot illuminator Newhouse Lighting NHCLP-LED 3W LED gooseneck clamp lamp
1.8 ml cryo vial Nunc V7634-500EA Any 1.8 or 2 mL cryovial is adequate

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fahy, G. M., Wowk, B. Principles of Cryopreservation by Vitrification. Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols. 21-82 (2015).
  2. Nagy, Z. P., Nel-Themaat, L., Chang, C. -C., Shapiro, D. B., Berna, D. P. Cryopreservation of eggs. Human Fertility: Methods and Protocols. 439-454 (2014).
  3. Kriminski, S., Caylor, C. L., Nonato, M. C., Finkelstein, K. D., Thorne, R. E. Flash cooling and annealing of protein crystals. Acta Cryst Sect D. 58, (3), 459-471 (2002).
  4. Juers, D. H., Matthews, B. W. Reversible lattice repacking illustrates the temperature dependence of macromolecular interactions. J Mol Biol. 311, (4), 851-862 (2001).
  5. Juers, D. H., Matthews, B. W. Cryo-cooling in macromolecular crystallography: advantages, disadvantages and optimization. Q Rev Biophys. 37, (2), 105-119 (2004).
  6. Alcorn, T., Juers, D. H. Progress in rational methods of cryoprotection in macromolecular crystallography. Acta Cryst Sect D. 66, (4), 366-373 (2010).
  7. Warkentin, M., Sethna, J., Thorne, R. Critical Droplet Theory Explains the Glass Formability of Aqueous Solutions. Phys Rev Lett. 110, (1), 15703 (2013).
  8. Kriminski, S., Kazmierczak, M., Thorne, R. E. Heat transfer from protein crystals: implications for flash-cooling and X-ray beam heating. Acta Cryst Sect D. 59, (4), 697-708 (2003).
  9. Loerting, T., Bauer, M., Kohl, I., Watschinger, K., Winkel, K., Mayer, E. Cryoflotation: Densities of amorphous and crystalline ices. J Phys Chem B. 115, (48), 14167-14175 (2011).
  10. Shen, C., Julius, E. F., Tyree, T. J., Moreau, D. W., Thorne, R. E. Thermal contraction of aqueous glycerol and ethylene glycol solutions for optimized protein-crystal cryoprotection Thermal contraction of aqueous glycerol and ethylene glycol solutions for optimized protein-crystal cryoprotection. Acta Cryst Sect D. 72, (6), 742-752 (2016).
  11. Warkentin, M., Berejnov, V., Husseini, N. S., Thorne, R. E. Hyperquenching for protein cryocrystallography. J Appl Cryst. 39, (6), 805-811 (2006).
  12. McFerrin, M. B., Snell, E. H. The development and application of a method to quantify the quality of cryoprotectant solutions using standard area-detector X-ray images. J Appl Cryst. 35, (5), 538-545 (2002).
  13. Chinte, U., Shah, B., DeWitt, K., Kirschbaum, K., Pinkerton, A. A., Schall, C. Sample size: An important parameter in flash-cooling macromolecular crystallization solutions. J. Appl. Cryst. 38, (3), 412-419 (2005).
  14. Bosart, L. W., Snoddy, A. O. Specific gravity of glycerol. Ind Eng Chem. 20, (12), 1377-1379 (1928).
  15. Rodrigues, M., Francesconi, A. Z. Experimental study of the excess molar volumes of binary and ternary mixtures containing water + (1,2-ethanediol, or 1,2-propanediol, or 1,3-propanediol, or 1,2-butanediol) + (1-n-butyl-3-methylimidazolium bromide) at 298.15 K and atmospheric pressure. J Solution Chem. 40, (11), 1863-1873 (2011).
  16. Berejnov, V., Husseini, N. S., Alsaied, O. A., Thorne, R. E. Effects of cryoprotectant concentration and cooling rate on vitrification of aqueous solutions. J Appl Cryst. 39, (2), 244-251 (2006).
  17. Meisburger, S. P., Warkentin, M., et al. Breaking the Radiation Damage Limit with Cryo-SAXS. Biophys J. 104, (1), 227-236 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics