인간 승모판에서 단백질 추출을위한 최적화 된 프로토콜

Biochemistry

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Summary

인간 승모판의 단백질 조성은 여전히 ​​부분적으로 알려지지 않았는데, 그 이유는 세포질이 낮아 단백질 생합성이 낮기 때문에 분석이 복잡하기 때문입니다. 이 연구는 승모판 프로테옴의 분석을 위해 단백질을 효율적으로 추출하기위한 프로토콜을 제공합니다.

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Banfi, C., Guarino, A., Brioschi, M., Ghilardi, S., Mastrullo, V., Tremoli, E., Polvani, G. Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve. J. Vis. Exp. (124), e55762, doi:10.3791/55762 (2017).

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Abstract

세포 성 프로테옴의 분석은 복잡한 생물학적 시스템에 존재하는 단백질의 대규모 동정 및 정량화를 가능하게하는 기술의 개발로 인한 질병의 근원적 인 분자 기작을 밝히는데 도움이 될 수 있습니다. 단백질 학적 접근으로부터 얻은 지식은 잠재적으로 질병의 기초가되는 병원성 메커니즘에 대한 더 나은 이해, 새로운 진단 및 예후 질환 표지자의 확인 및 치료 목표의 희망을 가능하게한다. 그러나, 심장 승모판 막은 proteoglycan과 collagen-enriched extracellular matrix의 세포질이 낮기 때문에 proteomic analysis에서 매우 어려운 표본이됩니다. 이것은 전 지구적인 단백질 분석을 위해 단백질을 추출하는 것을 어렵게 만든다. 이 작품은 양적 proteomics 및 immunoblotting과 같은 후속 단백질 분석과 호환 프로토콜입니다. 이것은 데이터의 상관 관계를 허용 할 수있다.g 단백질 발현을 정량적 mRNA 발현 및 비 정량 면역 조직 화학적 분석에 대한 데이터로 비교 하였다. 사실, 이러한 접근법은 함께 수행 될 때 mRNA에서 번역 후 단백질 변형에 이르기까지 질병을 근본으로하는 분자 메커니즘에 대한보다 포괄적 인 이해로 이어질 것입니다. 따라서이 방법은 심장 판막 생리 병리학의 연구에 관심이있는 연구자들에게 적합 할 수있다.

Introduction

최근의 증거는 mRNA 합성 후 발생하는 많은 조절 기작의 역할에 대한 이해를 변화시켰다. 사실, 번역, post-transcriptional 및 proteolytic 프로세스는 단백질의 풍부와 기능을 조절할 수 있습니다. transcript level이 protein abundance의 주된 결정 인자라고 가정 할 때, mRNA 농도가 상응하는 단백질의 그것들에 대한 proxies라고 말하는 dogma는 부분적으로 수정되었다. transcript level은 단지 단백질의 양을 부분적으로 예측할 뿐이며, post-transcriptional events 세포 1 , 2 내의 단백질을 조절합니다.

또한, 단백질은 궁극적으로 세포의 기능을 지시하고 따라서 autocrine, paracrine 및 내분비 요인에 대한 응답으로 역동적 인 변화를 겪을 수있는 표현형을 지시합니다. 혈액 매개 매개체; 온도; 약물 치료; 질병이 생기다.ment. 따라서, 단백질 수준에 초점을 맞춘 표현 분석은 proteome을 특성화하고 질병 병인의 일부로 발생하는 중대한 변화를 밝혀내는 데 유용합니다 3 .

따라서 기존의 기술적 어려움에도 불구하고 건강과 질병 상태를 명확히하기 위해 프로테오믹스가 제시하는 기회는 엄청납니다. proteomics가 기여할 수있는 연구 분야 중 특히 유망한 분야 : 모든 수준 ( 즉, 전체 세포 또는 조직, 세포 내 구획 및 생물학적 유체)에서 단백질 발현의 변화 여부 확인; 질병의 진단 및 예후에 유용한 새로운 바이오 마커의 확인, 확인 및 확인; 약물 효과 및 독성 평가뿐만 아니라 치료 목적으로 사용될 수있는 새로운 단백질 표적의 확인 4 .

복잡성 포착프로테옴은 기술적 도전을 나타냅니다. 현재의 프로테오믹스 도구는 변경된 단백질 수준의 확인, 정량화 및 검증을 위해 대규모의 높은 처리량 분석을 수행 할 수있는 기회를 제공합니다. 또한, 가장 풍부한 단백질로 인한 간섭을 피하기위한 분획 화 및 농축 기술의 도입은 가장 풍부한 단백질을 포함시킴으로써 단백질 확인을 향상 시켰습니다. 마지막으로 proteomics는 단백질 기능의 중요한 조절 자로서 점차적으로 출현하는 번역 후 변형의 분석에 의해 보완되었다.

그러나 분석중인 생물 표본의 시료 준비 및 단백질 회수는 여전히 proteomic 워크 플로우의 제한 단계로 남아 있으며 가능한 함정 가능성을 높입니다. 사실, 최적화되어야하는 대부분의 분자 생물학 기술에서 첫 번째 단계는 조직 균질화이온 및 세포 용해, 특히 증폭 방법이 존재하지 않는 저농도 단백질의 분석에 유용합니다. 또한, 단백질의 화학적 특성은 자체 복구에 영향을 줄 수 있습니다. 예를 들어, 고도로 소수성 인 단백질의 분석은 isoelectric focusing 동안 쉽게 침전되기 때문에 매우 어렵습니다. 반면에 trans-membrane 단백질은 거의 용해되지 않습니다 (참고 문헌 5에서 검토). 또한, 조직 조성의 가변성은 보편적 인 추출 방법을 개발하는데 중요한 장벽이된다. 마지막으로, 거의 모든 임상 표본의 수량이 제한되어 있기 때문에 최소 샘플 양에서 최대 회수 및 재현성으로 단백질 준비를 할 수 있어야합니다.

이 작품은 proteomic 분석을위한 매우 도전 샘플을 나타내는 정상적인 인간의 심장 승모판에서 단백질 추출을위한 최적화 된 프로토콜을 설명합니다. 정상적인 승모판은좌심방과 심장 좌심실 사이에있는 렉스 구조 ( 그림 1 ). 심방에서 심실까지의 혈류를 조절하고 역류를 방지하며 전신에 적절한 수준의 산소 공급을 보장하여 적절한 심 박출량을 유지하는 데 중요한 역할을합니다. 그러나, 세포질이 적고 구성 요소가 거의없는 "비활성"조직으로 주로 간주됩니다 (주로 세포 외 기질에 있음). 이는 정상 상태에서 상주 판막 간질 세포 (VIC)가 낮은 단백질 생합성 률로 정지 상태를 나타 내기 때문입니다.

그러나 병리학 적 상태에서는 해면질 내의 VIC 수가 증가하고 단백질 합성이 다른 기능적 및 표현형 변화와 함께 활성화된다는 것이 입증되었습니다. 따라서, 최소한의 데이터를 사용할 수 있다는 것은 놀라운 일이 아닙니다.문헌은 병리학 승모판의 분석에 초점을 맞추고 있는데, 증가 된 수의 활성화 된 VIC가 확인 된 단백질의 상대적으로 많은 수를 설명 할 수있다.

결론적으로, 본 프로토콜은 승모판 막 단백질 성분의 연구를 통해 승모판 막 질환의 원인이되는 병원성 기전을 이해하는 데 도움이 될 수있다. 실제로, 근본적인 병리학 적 과정에 대한 더 깊은 이해는 혈류 역학적 인 고려 사항에 대한 현재의 적응증이있는 판막 질환의 임상 관리를 개선하는 데 도움이 될 수있다.

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Protocol

이 프로토콜에서는 정상적인 심 초음파 검사의 매개 변수에도 불구하고 기술적 또는 기능적 이유로 기관 이식에서 제외 된 다기관 기증자로부터의 다기관 외과 (4 ~ 12 시간의 냉증 허혈 시간, 평균 6 ± 2 시간) 동안 인간의 심장을 수집합니다. 그들은 대동맥 및 폐동맥 판막의 은행 업무를 위해 Monzino Cardiologic Centre (Milan, Italy) 밀라노 심장 혈관 조직 은행으로 보내집니다. 승모판 후엽은 임상 목적으로 사용되지 않으므로 기증자의 친척으로부터 정보에 입각 한 동의를 얻은 후 대동맥 및 폐동맥 판막 분리시 수집됩니다. 이식 및 연구를위한 조직은 부모의 동의가 있어야 수집됩니다. 동의서에서 그들은 윤리적위원회의 지침에 따라 인간의 임상 적 사용 ( 즉, 미생물 학적, 기능적 및 혈청 학적 문제)에 적합하지 않은 경우에만 연구를위한 심장 조직의 사용을 허가합니다 (또는 사용하지 않음).몬 지노 심장 센터.

1. 승모판 준비

  1. 장기 explantation (4 ~ 12 시간의 냉증 허혈 시간) 후 최대한 빨리 인간 승모판을 수확.
  2. 클린 룸에서 차가운 (4 ° C) 용액 ( 즉, 염분 용액 또는 균형 잡힌 Eurocollins 또는 위스콘신)이 담긴 운반 백에서 심장을 제거합니다. 버킷에 넣고 밸브 준비를 위해 바이오 안전성 캐비닛 (biohazard vertical air flow, 클래스 A, GMP (Good Manufacturing Practices) 분류)에 넣으십시오.
  3. 캐비닛에 멸균 일회용 드레이프에 심장을 놓습니다. 멸균 일회용 메스를 사용하여 정점에서 약 4cm 떨어진 좌우 심실의 레벨에서 심장을 주축에 수직으로 완전히 자릅니다.
  4. 왼쪽 가슴 지붕을 표시하는 오름차순 대동맥과 폐동맥을 이동하십시오.
  5. 멸균 된 오토 클레이브 가능한 포셉과 피크를 사용하여좌측 심방 루프는 승모판이 보이도록 만들고 위대한 승모 전단 (전방)과 작은 승모 전단 (후방)을 식별 할 수 있도록합니다.
    참고 : 전 측방 및 후방 측방 판막은 전방 판막과 후방 경계의 경계를 정의합니다.
  6. 무균 autoclavable 가위와 비 외상성 집게를 사용하여, 전체 승모판 주위의 좌심방과 심실 벽 두께를 해부 .
  7. mitro-aortic valve continuity를 확인하십시오.
    참고 : 좌심실에는 전체 승모판과 코드가 포함되어 있습니다.
  8. 후부 승모판 판 전단에서 앞쪽 승모판 전단지를 분리하고, 심실 (삽입)과 함께 삽입을 따라 후부 전단지를 절단.
  9. 생리 식염수에서 후방 전단지를 씻으십시오. 전단지를 작은 조각 (<1cm 2 )으로 자른 다음 개별적으로 알루미늄 호일로 포장하십시오. 액화 질소로 그들을 고정하십시오.
    주의 : 액체 질소를 사용할 때는 조직의 안전 절차를 따르십시오.
    1. 절차가 끝나면 70 % 이소 프로필 알콜 용액과 6 % 과산화수소 용액으로 캐비닛 테이블을 살균하십시오.

2. 단백질 추출

  1. 집게를 사용하여 액체 질소에 저장된 시료를 채취하고 즉시 알루미늄 호일에 싸서 드라이 아이스에 놓습니다. 시료를 옮길 때 시료를 녹이지 마십시오.
  2. 분쇄하기 전에 분쇄기 시스템 ( 예 : CryoGrinder)의 도자기 / 지르코늄 모르타르와 유봉을 액체 질소가 들어있는 듀어 플라스크 (~ 500 mL)에 넣음으로써 시료와 함께 냉장하십시오.
    주의 : 액체 질소를 사용할 때는 조직의 안전 절차를 따르십시오.
  3. 박격포와 유봉을 드라이 아이스가 들어있는 폴리스티렌 상자에 넣으십시오. 알루미늄 호일에서 샘플을 꺼내어 박격포에 넣으십시오.
  4. 갈아 입히기그는 유봉을 회전시키기 위해 스크루 드라이버를 사용하여 박격포에 대 한 큰 유봉을 샘플링한다. 연삭 과정 중에 샘플을 사전 냉각 된 주걱 끝과 섞는다.
    1. 작은 유봉으로 반복하십시오.
  5. 튜브를 뒤집어서 모르타르 위에 올려 놓고 시료를 튜브로 옮기려면 함께 뒤집어서 이전에 계량 한 튜브 ( 예 : 15 mL 원심 튜브)에 지상 샘플을 옮기십시오. 박격포에서 모든 재료를 회수하려면 사전 냉각 된 주걱을 사용하십시오.
    1. 샘플을 옮길 때 샘플이 녹지 않도록 샘플을 드라이 아이스에 보관하십시오.
  6. 샘플 순 중량을 계산하십시오.
  7. 각 시료 다음에 박격포와 유봉을 깨끗이하고 고압 증기 멸균 또는 200 ° C에서 2 시간 가열하여 오염 제거하십시오.
  8. 원심 분리기 튜브에서 분쇄 한 시료를 균질 기의 유리 튜브로 옮긴다.
  9. 여과 된 요소 쇄석 추가유리 조직에 분말 조직 10mg 당 200uL의 우레아 완충액 (8M 우레아, 2M 티오 우레아, 4 % w / v CHAPS, 20mM 트리스 및 55mM 디티 오 트레이 톨)을 넣었다.
    참고 : 원심 분리 관에 남아있는 잔유 가루 시료는 계산 된 부피의 우레아 완충액의 일부를 사용하여 회수 할 수 있습니다.
  10. 붕규산 유리 몰탈과 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 유봉이 장착 된 교반기를 사용하여 시료를 균질화하십시오. 비틀린 동작 (1,500 rpm)으로 샘플을 천천히 10 번 누르십시오.
  11. 상층 액을 회수하고 깨끗한 1.7 mL 원심 분리 튜브로 옮긴다. 다시 신선한 우레아 완충액으로 나머지 시료를 추출하고 첫 번째 추출 중에 사용 된 부피의 절반을 더하십시오.
  12. 2.10 단계를 반복하십시오.
  13. 상등액을 회수하고 2.11 단계의 상등액과 합칩니다. 30 분 동안 튜브 rotator에 결합 된 뜨는을 놓으십시오.
  14. 튜브를 13,000 xg 및 4 ° C에서 30 분간 원심 분리하십시오.
  15. 상청액을제조자의 지시에 따라 Bradford 단백질 분석을 사용하여 단백질 농도를 측정한다. 샘플을 사용할 때까지 -80 ° C에 보관하십시오.

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Representative Results

요소 버퍼에서 단백질의 추출 및 용해는 등전두 초점 (2 차원 전기 영동 (2-DE) ) 및 액상 등전점 (IEF) 12 에 기반한 proteomic 방법과 직접 호환되며 Laemmli 버퍼 13 에서 희석 한 후 면역 블로 팅 프로 테아 제 억제제 칵테일을 함유하고있다.

겔이없는 질량 분석기 기반의 방법 ( 즉, 데이터 독립 질량 분광법 분석 (LC / MS E ) 및 2 차원 LC / MS E (2D-LC / MS E )에 결합 된 액체 크로마토 그래피 15 ) 기술 된 우레아 완충액에서, 우레아 및 티오 우레아를 제거하기 위해 추가로 처리 할 필요가 있으며, 이는 이후의 단백질 분해 및 액체 크로마토 그래피 분리를 방해 할 수있다. 티s 탈염 단계는 상업적 단백질 침전 키트를 사용하여, 단백질을 침전시키는 제조자의 지시에 따라 달성 될 수있다. 시료는 단백질 소화를 위해 0.1 % 절단 가능한 세제가 함유 된 25 mM NH 4 HCO 3에 용해 될 수 있습니다 16 . 단백질의 침전은 완충 성분을 제거하여 단백질 함량에 최소한 영향을 미치므로 (단백질 회수율 :> 85 %), 모든 종류의 분석에 적합한 시료로 만들 수 있습니다.

인간 승모판에서 단백질 추출을위한이 프로토콜의 응용 프로그램은 이전에 자세히 11 , 15 에서 설명한 4 가지 proteomics 접근법을 결합하여 총 422 개의 단백질을 식별 할 수있었습니다. 구체적으로, 2-DE에 의해 169 개의 ​​단백질, IEF에 의해 330 개의 단백질, LC / MS E 에 의해 96 개의 단백질, 148 개의 단백질2D-LC / MS E (표 1).

subcellular localization의 관점에서 422 개의 확인 된 단백질을 분류하기 위해 소프트웨어가 gene ontology (GO) 분석 ( 예 : Cytoscape)에 사용되었습니다. 소프트웨어와 해당 플러그인으로 생성 된 네트워크는 세포 외 영역에 국한된 예상 단백질 ( 그림 2 의 오른쪽 상단 참조) 외에도 proteomic 접근법으로 확인 된 대부분의 단백질이 세포 내 영역 ( 즉, 세포질, 세포 소기관, 소포 및 세포 뼈대). 세포 표면 단백질도 동정되었다 ( 그림 2 ).

결과는 3 개의 독립적 인 승모판 샘플에서 더 확인되었다. Immunoblotting은 4 개의 단백질 군 ( 즉, septin-11, 4 개 및 half LIM 영역 단백질 1 (FHL-1), dermatopontin 및 alpha-crystallin B (CryAB))를 포함하고 있습니다 ( 그림 3 ).

그림 1
그림 1 : 승모판 구조. 폐쇄 ( A ) 또는 개방 ( B ) 인간 승모판을 보여주는 인간의 마음의 상위 뷰. 인간 심장 ( C )의 왼쪽 심실의 전면보기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
도표 2 : 세포질 분포의 기간에있는 확인 된 승모판 단백질의 분석. Cytoscape와 플러그인 BiNGO가 obtai에 사용되었습니다.n 세포 구성 요소 범주에서 유전자 온톨로지 (GO)의 분포. 원의 크기는 선택된 GO 항과 연관된 단백질 성분의 수에 비례하며, 초과 표현의 p- 값에 대한 컬러 스케일이보고됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : 세 개의 인간 정상 승모판 엽총에서 추출한 septin-11, FHL-1, dermatopontin 및 CryAB의 Immunoblotting 분석 Immunoblotting은 CryAB에 대한 마우스 단일 클론 항체와 septin-11, FHL-1 및 dermatopontin 항체에 대한 토끼 다 클론 항체를 사용하여 수행되었다. 부디이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

<td> x <td> <td> Proteasome subunit 베타 타입 4 전구체 <td> </ tr> <td> 트랜스 그린 2 <td> <tr> <td>
가입 기술 2-DE 2D-LC LC-MS E 액상 IEF
A6NMZ7 콜라겐 알파 VI 엑스
O00151 PDZ 및 LIM 도메인 단백질 1 엑스
O00299 염화물 세포 내 채널 단백질 1 엑스
O00764 피리독스 키나아제 엑스
O14558 열 쇼크 단백질 베타 6 엑스
O43399 종양 단백질 D54 엑스
O43488 Aflatoxin B1 알데히드 환원 효소 원 2 엑스
O43707 알파 액 티닌 4 엑스 엑스
O43866 전구체와 같은 CD5 항원 엑스
O60493 Nexin 3 정렬하기 엑스
O60701 UDP 포도당 6 탈수소 효소 엑스
O75223 특징없는 단백질 엑스
O75368 글루탐산이 풍부한 SH3 도메인 결합 단백질 엑스
O75390 시트르산 합성 효소 미토콘드리아 전구체 엑스
O75489 NADH 탈수소 효소 유비 퀴논 철 황 단백질 3 미토콘드리아 전구체 엑스 엑스
O75608 아실 단백질 티오 에스 테라 제 1 엑스
O75828 카르 보닐 환원 효소 NADPH 3 엑스
O75874 아이소 시트르산 탈수소 효소 NADP 세포질 엑스
O75955 Flotillin 엑스
O94760 NG NG 디메틸 아르기닌 디메틸 아미노 히드로 라제 1 엑스
O94788 망막 탈수소 효소 2 엑스
O95865 NG NG dimethylarginine dimethylaminohydrolase 2 엑스 엑스
P00325 알콜 탈수소 효소 1B 엑스 엑스
P00338 L 젖산 탈수소 효소 A 사슬 엑스
P00352 망막 탈수소 효소 1 엑스
P00441 Superoxide dismutase Cu Zn 엑스 엑스
P00450 세룰로 플라스 민 전구체 엑스 엑스
P00488 응고 인자 XIII A 사슬 전구체 엑스
P00491 푸린 뉴 클레오 사이드 포스 포 릴라 제 엑스
P00492 Hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase 엑스
P00558 포스 포 글리세 레이트 키나아제 1 엑스 엑스
P00568 아데 닐 레이트 키나아제 이소 효소 1 엑스
P00734 프로트롬빈 엑스 엑스
P00738 합 토글 로빈 엑스 엑스 엑스 엑스
P00739 합 토글 로빈 관련 단백질 전구체 엑스
P00751 보완 인자 B 엑스 엑스 엑스
P00915 탄산 탈수 효소 1 엑스
P00918 탄산 탈수 효소 2 엑스
P01008 안티 트롬빈 Ⅲ 전구체 엑스 엑스 엑스
P01009 알파 1 항 트립신 엑스 엑스 엑스 엑스
P01011 알파 1 안티 키모 트립신 엑스 엑스 엑스 엑스
P01019 안지오텐신 원 전구체 엑스 엑스
P01023 알파 2 마크로 글로불린 엑스 엑스
P01024 C3 보완 엑스 엑스 엑스 엑스
P01033 메탈 로프 로테이나 제 억제제 1 전구체 엑스
P01042 키니노겐 1 전구체 엑스
P01593 Ig 카파 사슬 VI 지역 AG 엑스
P01598 Ig 카파 사슬 VI 지역 EU 엑스
P01600 Ig 카파 쇄 VI 영역 하우 엑스 엑스
P01611 Ig 카파 사슬 VI 영역 웨스 엑스
P01620 Ig 카파 쇄 V Ⅲ 영역 SIE 엑스
P01625 Ig 카파 체인 V IV 지역 Len 엑스
P01766 Ig 중쇄 Ⅲ 영역 BRO 엑스 엑스
P01781 Ig 중쇄 Ⅲ 영역 GAL 엑스
P01834 Ig 카파 사슬 C 영역 엑스 엑스 엑스 엑스
P01842 Ig λ 쇄 C 영역 엑스 엑스 엑스
P01857 Ig 감마 1 쇄 C 영역 엑스 엑스 엑스 엑스
P01859 Ig 감마 2 쇄 C 영역 엑스 엑스 엑스 엑스
P01860 Ig 감마 3 쇄 C 영역 엑스 엑스 엑스
P01861 Ig 감마 4 쇄 C 영역 엑스 엑스 엑스
P01871 Ig 뮤 체인 C 영역 엑스 엑스 엑스
P01876 Ig 알파 1 쇄 C 영역 엑스 엑스 엑스 엑스
P01877 Ig 알파 2 쇄 C 영역 엑스
P02144 미오글로빈 엑스 엑스
P02452 콜라겐 알파 1 사슬 엑스 엑스 엑스 엑스
P02511 알파 크리스틴 B 사슬 엑스
P02545 라민 AC 70 kDa 라미네이트 엑스 엑스 엑스 엑스
P02647 아포지 단백질 AI 엑스 엑스 엑스 엑스
P02649 아포지 단백질 E 엑스 엑스 엑스 엑스
P02671 피브리노겐 알파 사슬 엑스 엑스 엑스 엑스
P02675 피브리노겐 베타 사슬 엑스 엑스 엑스 엑스
P02679 피브리노겐 감마쇄 엑스 엑스 엑스 엑스
P02689 Myelin P2 단백질 엑스
P02735 혈청 아밀로이드 A 단백질 전구체 엑스
P02741 C 반응성 단백질 전구체 엑스
P02743 혈청 아밀로이드 P 성분 엑스 엑스 엑스 엑스
P02746 C1q 하위 구성 요소 하위 단위 B를 보완합니다. 엑스 엑스
P02747 C1q 하위 구성 요소 하위 단위 C 전구체 보완 엑스
P02748 컴포넌트 C9 보완 엑스 엑스 엑스
P02749 베타 2 당 단백질 1 엑스 엑스 엑스 엑스
P02750 류신 풍부 알파 2 당 단백질 전구체 엑스
P02751 피브로넥틴 엑스 엑스
P02760 AMBP 단백질 전구체 엑스 엑스 엑스 엑스
P02763 알파 1 산 당 단백질 1 엑스 엑스 엑스
P02765 알파 2 HS 당 단백질 전구체 엑스
P02766 트란스 타이 레틴 전구체 엑스 엑스 엑스
P02768 혈청 알부민 엑스 엑스 엑스 엑스
P02774 비타민 D 결합 단백질 전구체 엑스
P02787 세로토닌 엑스 엑스 엑스 엑스
P02788 락트 트랜스페린 전구체 엑스
P02790 헤모페신 엑스 엑스 엑스 엑스
P02792 Ferritin 경쇄 엑스
P04004 비트로 네틴 엑스 엑스 엑스 엑스
P04075 프룩 토스 비스 포스페이트 알 돌라 제 A 엑스
P04083 아 넥신 A1 엑스 엑스 엑스 엑스
P04179 Superoxide dismutase Mn 미토콘드리아 전구체 엑스
P04196 히스티딘이 풍부한 당 단백질 전구체 엑스
P04217 알파 1B 당 단백질 전구체 엑스 엑스
P04350 튜 불린 베타 4 사슬 엑스
P04406 글리세 알데히드 3 인산 탈수소 효소 엑스 엑스 엑스 엑스
P04792 열 충격 단백질 베타 1 엑스 엑스 엑스 엑스
P05091 알데히드 탈수소 효소 미토콘드리아 전구체 엑스 엑스
혈장 프로테아제 C1 억제제 전구체 엑스
P05156 I 인자 전구체 보완 엑스
P05413 지방산 결합 단백질 심장 엑스
P05452 테트라 네 넥틴 전구체 TN 엑스 엑스
P05787 Keratin II 형 세포 골격 8 엑스
P06396 겔솔린 엑스 엑스 엑스 엑스
P06576 ATP 합성 효소 서브 유닛 베타 미토콘드리아 전구체 엑스 엑스
P06732 크레아틴 키나아제 M 형 엑스 엑스
P06733 알파에 노라 제 엑스 엑스 엑스 엑스
P06753 트로포 미오신 알파 3 사슬 엑스 엑스
P07108 아실 CoA 결합 단백질 엑스
P07195 L 젖산 탈수소 효소 B 사슬 엑스 엑스 엑스
P07196 신경 섬유 폴리펩티드 엑스
P07197 Neurofilament medium polypeptide 엑스 엑스
P07237 단백질 다이 설파이드 이성화 효소 전구체 엑스 엑스
P07339 카테친 D 전구체 엑스 엑스
P07355 아 넥신 A2 엑스 엑스 엑스 엑스
P07360 Complement component C8 gamma chain precursor 엑스
P07437 튜 불린 베타 사슬 엑스 엑스 엑스 엑스
P07585 장식 엑스 엑스 엑스 엑스
P07737 프로필 링 1 엑스
P07858 카테친 B 전구체 엑스
P07900 열 충격 단백질 HSP 90 알파 엑스 엑스
P07951 트로피 미오신 베타 사슬 엑스
P07954 푸마 레이트 히드라 타제 미토콘드리아 전구체 엑스
P07996 트롬 보스 폰틴 1 엑스 엑스 엑스
P08107 열충격 70 kDa 단백질 1A 1B 엑스 엑스 엑스 엑스
P08123 콜라겐 알파 2 I 사슬 엑스 엑스 엑스 엑스
P08133 아 넥신 A6 엑스 엑스
P08238 열 충격 단백질 HSP 90 베타 엑스 엑스
P08253 72 kDa 타입 IV 콜라게나 제 전구체 엑스
P08294 세포 외 슈퍼 옥사이드 디스 뮤타 아제 Cu Zn prec저 엑스 엑스 엑스
P08590 미오신 경질 폴리 펩타이드 3 엑스 엑스
P08603 보체 인자 H 엑스 엑스 엑스 엑스
P08670 비 멘틴 엑스 엑스 엑스 엑스
P08729 Keratin II 형 세포 골격 7 엑스
P08758 아 넥신 A5 엑스 엑스 엑스 엑스
P09211 글루타티온 S 전이 효소 P 엑스 엑스 엑스
P09382 갈 락틴 1 엑스 엑스 엑스
P09417 디 하이드로프테리딘 환원 효소 엑스
P09493 트로피 미오신 1 알파 사슬 엑스 엑스
P09525 아 넥신 A4 엑스 엑스
P09651 이질적 핵 리보 뉴클레오타이드 A1 엑스
P09871 C1s 하위 구성 요소 전구체 보완 엑스
P09936 유비퀴틴 카르 복실 말단 가수 분해 효소 L1 엑스
P09972 프룩 토스 비스 포스페이트 알 돌라 제 C 엑스
P0C0L4 보체 C4 전구체 엑스
P0CG05 Igλ2 쇄 C 영역 엑스
P0CG38 POTE ankyrin 도메인 가족 구성원 I 엑스
P10515 pyruvate dehydrogenase complex의 dihydrolipoyllysine residue acetyltransferase 구성 요소 엑스
P10768 S 포르 밀 글루타티온 가수 분해 효소 엑스
P10809 60 kDa 열충격 단백질 미토콘드리아 전구체 엑스
P10909 Clusterin 엑스 엑스 엑스 엑스
P10915 Hyaluronan과 proteoglycan은 단백질 1 전구체를 연결합니다. 엑스 엑스
P11021 78 kDa g루시스 조절 단백질 엑스 엑스 엑스
P11047 라미닌 서브 유닛 감마 1 전구체 엑스
p11142 열 충격 동족체 71 kDa 단백질 엑스 엑스 엑스 엑스
P11177 Pyruvate 탈수소 효소 E1 성분 subunit 베타 mitochondrial 선구자 엑스
P11217 글리코겐 포스 포 릴라 제 근육 형태 엑스
P11310 중간 사슬 특이 적 아실 CoA 탈수소 효소 미토콘드리아 전구체 엑스
P11413 포도당 6 인산염 1 탈수소 효소 엑스
P11766 알콜 탈수소 효소 클래스 3 카이 사슬 엑스
P12036 신경 필라멘트 중 폴리펩티드 엑스
P12109 Collagen alpha 1 VI 사슬 엑스 엑스 엑스 엑스
P12110 콜라겐 알파 2 사슬 엑스 엑스 엑스 엑스
P12111 콜라겐 알파 3 사슬 엑스 엑스 엑스
P12277 크레아틴 키나제 B 형 엑스
P12429 아 넥신 A3 엑스 엑스
P12814 알파 액티 닌 1 엑스 엑스
P12829 미오신 경질 폴리 펩타이드 4 엑스
P12882 미오신 1 엑스
P12883 미오신 7 엑스 엑스
P12955 Xaa Pro 디펩 티딜 엑스
P13489 리보 뉴 클레아 억제제 엑스
P13533 미오신 6 엑스 엑스
P13611 Versican 핵심 단백질 전구체 엑스 엑스
P13639 신장률 2 엑스
P13716 델타 아미노 레 불린 산 탈수 효소 엑스
P13796 플라스틴 2 엑스
P13804 전자 전달 flavoprotein subunit 알파 미토콘드리아 전구체 엑스
P13929 Beta enolase 엑스 엑스
P14136 신경 교세포 성 산성 단백질 성상 교세포 엑스
P14314 글루코시다 아제 2 서브 유닛 베타 전구체 엑스
P14550 알코올 탈수소 효소 NADP 엑스
P14618 피루브테이트 키나아제 아이소 자임 M1 M2 엑스 엑스 엑스
P14625 </ td> 엔도 플라스 민 전구체 엑스 엑스
P15121 알 도스 환원 효소 엑스
P15259 Phosphoglycerate mutase 2 엑스
P16152 카르 보닐 환원 효소 NADPH 1 엑스
P17066 열충격 70 kDa 단백질 6 엑스 엑스 엑스
P17174 세포질 아스파 테이트 아미노 트랜스퍼 라제 엑스
P17540 크레아틴 키나아제 원핵 세포 미토콘드리아 전구체 엑스
P17661 데스 민 엑스 엑스 엑스 엑스
P17980 26S 프로 테아 제 조절 서브 유닛 6A 엑스
P17987 T 복합 단백질 1 서브 유닛 알파 엑스
P18206 빈린 엑스 엑스
P18428 리포 폴리 사카 라이드 결합 단백질 전구체 엑스
P18669 Phosphoglycerate mutase 1 엑스
P19105 미오신 규제 가벼운 사슬 2 엑스 엑스
P19623 스 페르미 딘 합성 효소 엑스
P19652 알파 1 산 당 단백질 2 전구체 엑스 엑스
P19823 인터 알파 트립신 억제제 중쇄 H2 엑스
P19827 인터 알파 트립신 억제제 중쇄 H1 엑스 엑스
P20073 아 넥신 A7 엑스
P20618 Proteasome subunit 베타 타입 1 전구체 엑스
P20774 Mimecan 엑스 엑스 엑스 엑스
P21266 글루타티온 S 전이 효소 Mu 3 엑스
P21333 필라 민 엑스 엑스
P21796 전압 의존성 음이온 선택성 채널 단백질1 엑스
P21810 빅 글리 칸 엑스 엑스 엑스 엑스
P21980 단백질 글루타민 감마 글루 타밀 전이 효소 2 엑스 엑스
P22105 테 나신 X 엑스 엑스
P22314 Ubiquitin 활성화 효소 E1 엑스
P22352 글루타티온 퍼 옥시다아제 3 전구체 엑스 엑스
P22626 이질적 핵 리보 뉴클레오타틴 A2 B1 엑스
P22695 유비 퀴놀 시토크롬 c 환원 효소 복합체 핵심 단백질 2 미토콘드리아 전구체 엑스
P23141 간 카복시 에스 테라 제 1 전구체 엑스
P23142 파이 빈 1 엑스 엑스 엑스 엑스
P23284 펩티 딜 프로 릴 시스 트랜스 이성화 효소 B 전구체 엑스
P23381 Tryptophanyl tRNA synthetase 세포질 엑스
P23526 아데노 실 (Adenosylhomocysteinase) 엑스 엑스
P23528 코필 린 1 엑스
P24752 아세틸 CoA 아세틸 트랜스퍼 라제 미토콘드리아 전구체 엑스
P25311 아연 알파 2 당 단백질전구체 엑스
P25705 알파 미토콘드리아 ATP 합성 효소 서브 유닛 엑스
P25788 Proteasome subunit 알파 타입 3 엑스 엑스
P25789 Proteasome subunit 알파 타입 4 엑스
P26447 단백질 S100 A4 엑스
P27348 14 3 3 단백질 쎄타 엑스 엑스
P27797 칼레 티 쿠린 전구체 엑스
P28066 Proteasome subunit 알파 타입 5 엑스
P28070 엑스 엑스
P28072 Proteasome subunit 베타 타입 6 전구체 엑스
P28074 Proteasome subunit 베타 타입 5 전구체 엑스
P28331 NADH 유비 퀴논 산화 환원 효소 75 kDa 아 단위 미토콘드리아 전구체 엑스
P28838 Cytosol aminopeptidase 엑스
P29218 이노시톨 모노 포스파타제 엑스
P29401 트랜스 케 토라 제 엑스
P29692 신장 인자 1 델타 엑스
P29966 미리 스토 닐화 된 알라닌이 풍부한 C 키나아제 기질 엑스
P30040 소포체 단백질 ERp29 전구체 엑스
P30041 과록 소 독신 6 엑스 엑스
P30043 플라 빈 환원 효소 엑스
P30044 Peroxiredoxin 5 미토콘드리아 전구체 엑스
P30085 UMP CMP 키나아제 엑스
P30086 포스파티딜 에탄올 아민 결합 단백질 1 엑스
P30101 Protein 디설파이드 이소 머라 아제 A3 전구체 엑스 엑스 엑스
P30613 피루 베이트 키나아제 동질 효소 RL 엑스
P30740 백혈구 엘라 스타 제 억제제 엑스
P31025 리포 칼린 1 전구체 엑스
P31937 3 히드 록시 이소 부티레이트 탈수소 효소 미토콘드리아 전구체 엑스
P31942 이질적 핵 리보 핵산 단백질 H3 엑스
P31943 이질적 핵 리보 핵산 단백질 H 엑스
P31946 14 3 3 단백질 베타 알파 엑스 엑스
P31948 스트레스에 의한 인산화 단백질 1 엑스
P31949 단백질 S100 A11 엑스
P32119 페록시 레 독신 2 엑스 엑스
P34931 열 충격 70 kDa 단백질 1 like 엑스 엑스
P34932 열충격 70 kDa 단백질 4 엑스
P35232 금지 엑스
P35237 서핀 B6 엑스
P35443 트롬 보스 폰틴 4 엑스
P35555 섬유소 1 엑스 엑스
P35579 미오신 9 엑스 엑스 엑스
P35580 미오신 10 엑스 엑스
P35609 알파 액티 닌 2 엑스
P35625 메탈로 프로 티아 제 억제제 3 엑스 엑스
P35998 26S 프로 테아 제 조절 서브 유닛 7 엑스
P36871 포스 포 글루코 스타 제 1 엑스 엑스
P36955 안료 상피 유도 인자 엑스 엑스
P37802 엑스 엑스
P37837 트랜스 탈라 레아 엑스
P38117 전자 이동 flavoprotein subunit 베타 엑스
P38646 스트레스 70 단백질 미토콘드리아 전구체 엑스 엑스
P39687 산성 류신 풍부한 핵산 단백질 32 가족 구성원 A 엑스
P40121 대 식세포 캡핑 단백질 엑스
P40925 말산염 탈수소 효소 세포질 엑스
P40926 말 산염 탈수소 효소 미토콘드리아 전구체 엑스
P41219 과 페린 엑스
P42330 알도 케토 환원 효소 계열 1 형 C3 엑스
P45880 전압 의존성 음이온 선택성 채널 단백질 2 엑스
P47755 F 액틴 캡핑 단백질 서브 유닛 α2 엑스 엑스
P47756 F 액틴 캡핑 단백질 서브 유닛 베타 엑스 엑스
P47985 유비 퀴놀 시토크롬 c 환원 효소 철 유황 하위 단위 미토콘드리아 전구체 엑스
P48047 ATP 합성 효소 O 소단위 미토콘드리아 전구체 엑스
P48637 글루타티온 신테 타제 엑스
P48741 열충격 70 kDa 단백질 7 엑스 엑스
P49189 4 트리메틸 아미노 부 티르 알데히드 탈수소 효소 엑스
P49368 T 복합 단백질 1 서브 유닛 감마 엑스
P49747 연골 올리고머 매트릭스 단백질 엑스 엑스 엑스 엑스
P49748 매우 긴 사슬 특이 적 아실 CoA 탈수소 효소 미토콘드리아 전구체 엑스
P50395 Rab GDP 해리 억제제 베타 엑스 x </ td>
P50454 Serpin H1 전구체 엑스
P50995 아 넥신 A11 엑스
P51452 이중 특이성 단백질 인산 가수 분해 효소 3 엑스
P51884 루미 칸 엑스 엑스 엑스 엑스
P51888 프롤 알진 전구체 엑스 엑스 엑스 엑스
P52565 Rho GDP 해리 억제제 1 엑스
P52566 Rho GDP 해리 억제제 2 엑스
P54652 열 충격과 관련된 70 kDa 단백질 2 엑스 엑스 엑스 엑스
P55072 전이성 소포체 ATPase 엑스
P55083 Microfibril 관련 당 단백질 4 전구체 엑스 엑스
P57053 히스톤 H2B 형 F 엑스
P60174 트리 오스 포스페이트 이소 메라 아제 엑스 엑스 엑스
P60660 미오신 경질 폴리 펩타이드 6 엑스 엑스
P60709 액틴 세포질 1 엑스 엑스 엑스 엑스
P60981 데스 린 엑스
P61086 유비퀴틴 접합 효소 E2 25 kDa 엑스
P61088 유비퀴틴 접합 효소 E2 엑스
P61224 Ras 관련 단백질 Rap 1b 전구체 엑스
P61978 이질적 핵 리보 핵산 단백질 K 엑스 엑스
P61981 14 3 3 단백질 감마 엑스 엑스 엑스
P62258 14 3 3 단백질 엡실론 14 3 3E 엑스
P62491 Ras 관련 단백질 엑스
P62714 세린 트레오닌 단백질 포스 파타 아제 2A 촉매 서브 유닛 베타 이소 형 엑스
P62736 액틴 대동맥 평활근 엑스 엑스 엑스
P62805 히스톤 H4 엑스
P62826 GTP 결합 핵 단백질 란 엑스
P62873 구아닌 뉴클레오타이드 결합 단백질 GIGSGT 서브 유닛 베타 1 엑스
P62879 구아닌 뉴클레오타이드 결합 단백질 GIGSGT 서브 유닛 베타 2 엑스
P62937 펩티 딜 프로 릴 시스 트랜스 이성화 효소 A 엑스 엑스
P62987 유비퀴틴 60S 리보솜 단백질 L40 엑스
P63104 14 3 3 프로테인 제타 델타 엑스 엑스 엑스 엑스
P63241 진핵 세포 번역 개시 인자 5A 1 엑스
P63244 구아닌 뉴클레오타이드 결합 단백질 서브 유닛 베타 2 엑스
P63267 액틴 감마 장 평활근 엑스 엑스
P67936 트로포 미오신 알파 4 사슬 엑스
P68032 액틴 알파 심장 근육 1 엑스
P68104 신장 인자 1 알파 1 엑스 엑스 엑스
P68133 액틴 알파 골격근
P68363 튜 불린 알파 1B 사슬 엑스 엑스 엑스
P68371 튜 불린 베타 2C 사슬 엑스 엑스 엑스
P68402 혈소판 활성화 인자 아세틸 하이드로 라 아제 IB 서브 유닛 베타 엑스
P68871 헤모글로빈 서브 유닛 베타 엑스 엑스 엑스
P69905 헤모글로빈 소단위 알파 엑스 엑스
P78371 T 복합 단백질 1 서브 유닛 베타 엑스
P78417 글루타티온 전이 효소 오메가 1 엑스 엑스
P80748 Ig 람다 체인 VIII 지역 LOI 엑스
P98095 파이 빈 2 엑스 엑스
Q01082 스펙 트린 베타 체인 1 엑스
Q01449 미오신 조절 경쇄 2 심방 이소 형 엑스
Q01518 Adenylyl cyclase 관련 단백질 1 엑스
Q01995 Transgelin 평활근 단백질 22 알파 엑스
Q03252 라민 B2 엑스 엑스
Q03591 보체 인자 H 관련 단백질 1 전구체 엑스
Q04917 14 3 3 단백질 η 엑스 엑스
Q06323 Proteasome activator 복합 subunit 1 엑스
Q06828 피브로 모듈린 엑스 엑스 엑스 엑스
Q06830 과록소 독소 1 엑스 엑스
Q07507 더 마토 폰틴 엑스 엑스 엑스 엑스
Q07960 Rho GTPase 활성화 단백질 1 엑스
Q08257 퀴논 산화 환원 효소 엑스
Q08431 락 타도 린 엑스 엑스
12,765 에스에이서 니어 1 엑스
Q13011 델타 3 5 델타 -2 4 디에 노일 CoA 이소 머라 제 미토콘드리아 전구체 엑스 엑스
Q13228 셀레늄 결합 단백질 1 엑스 엑스
Q13404 유비퀴틴 접합 효소 E2 변이체 1 엑스
Q13409 세포질 dynein 1 중급 사슬 2 엑스
Q13509 튜 불린 베타 3 사슬 엑스 엑스 엑스
Q13642 4 개 반 LIM 도메인 단백질 1 엑스
Q13765 초기 폴리 펩타이드 복합체 α 엑스
Q13885 N Tubulin 베타 2A 사슬 엑스 엑스
Q14194 디 히드로 피리 미디 나제 관련 단백질 1 엑스
Q14195 Dihydropyrimidinase 관련 단백질 3 엑스 엑스 엑스 엑스
Q14624 인터 알파 트립신 억제제 중쇄 H4 전구체 엑스
Q14697 중성 알파 글루코시다 아제 AB 전구체 엑스
Q14764 주요 금고 단백질 엑스
Q14767 잠재 변환 단백질 성장 인자 β 결합 단백질 2 엑스 엑스
Q14894 뮤 crystallin homolog NADP 조절 갑상선 호르몬 결합 단백질 엑스
Q15063 페리오 스틴 전구체 엑스 엑스 엑스 엑스
Q15084 단백질 디설파이드 이소 머라 제 A6 전구체 엑스
Q15113 프로 콜라겐 C 엔도 펩티다아제 인핸서 1 전구체 엑스
Q15181 무기 pyrophosphatase 엑스
Q15365 폴리 rC 결합 단백질 1 엑스
Q15366 폴리 rC 결합 단백질 2 엑스
Q15582 형질 전환 성장 인자 베타 유도 단백질 엑스 엑스 엑스
Q15819 유비퀴틴 접합 효소 E2 변이체 2 엑스
16352 알파 internexin 엑스
Q16473 추정 테 네스틴 XA 엑스
16555 디 히드로 피리 미디 나제 관련 단백질 2 엑스 엑스 엑스
169698 2 4 디에 노일 CoA 환원 효소 미토콘드리아 전구체 엑스
168891 미토콘드리아 내막 엑스
Q562R1 단백질 2와 같은 베타 액틴 엑스
Q6S8J3 POTE ankyrin 도메인 가족 구성원 E 엑스
Q6UWY5 Olfactomedin 단백질 1 전구체 엑스 엑스
Q71U36 튜 불린 알파 1A 사슬 엑스 엑스 엑스
Q7Z7G0 Nesh SH3 전구체의 표적 엑스 엑스 엑스
Q8WUM4 프로그램 된 세포 사멸 상호 작용 단백질 6 엑스
Q8WWX9 Selenoprotein M 전구체와 같은 Thioredoxin 엑스
Q92597 단백질 NDRG1 엑스
Q92945 원 상류 요소 결합 단백질 2 엑스
Q96CN7 이소 코리 스 타타 아제 도메인 함유 단백질 1 엑스
Q96CX2 BTB POZ 도메인 함유 단백질 엑스
Q96KK5 히스톤 H2A 유형 1 H 엑스 엑스
Q96KP4 Cytosolic 비 특이성 dipeptidase 엑스
Q99426 튜 불린 특유의 샤페론 B 엑스
Q99497 단백질 DJ 1 엑스 엑스
Q99536 시냅스 소포 막 단백질 엑스 엑스 엑스
Q99714 3 hydroxyacyl CoA dehydrogenase type 2 엑스
Q99715 콜라겐 알파 1 XII 사슬 엑스 엑스
Q99798 Aconitate hydratase 미토콘드리아 전구체 엑스
Q9BQE3 튜 불린 알파 6 쇄 엑스
Q9BUF5 튜 불린 베타 6 사슬 엑스 엑스
Q9BUT1 3 hydroxybutyrate dehydrogenase type 2 엑스
Q9BVA1 튜 불린 베타 2B 사슬 엑스 엑스 엑스
Q9BXN1 아스 포린 엑스 x </ td> 엑스 엑스
Q9H0W9 에스테르 가수 분해 효소 C11orf54 엑스
Q9H4B7 튜 불린 베타 1 사슬 엑스
Q9NRN5 단백질 3 전구체와 같은 Olfactomedin 엑스 엑스
Q9NRV9 Heme 결합 단백질 1 엑스
Q9NSB2 Keratin II 형 큐티클 Hb4 엑스 엑스
Q9NVA2 Septin 11 엑스
Q9UBR2 카테 텔린 Z 전구체 엑스
Q9UBX5 파이 블린 5 엑스 엑스
Q9UK22 F 박스 전용 단백질 2 엑스
Q9Y277 전압 의존성 음이온 선택성 채널 단백질 3 엑스
Q9Y281 코필 린 2 엑스
Q9Y490 탈린 1 엑스
Q9Y696 염화물 세포 내 채널 단백질 4 엑스
Q9Y6C2 에밀린 1 엑스 엑스

표 1 : 4 가지 proteomic 접근법을 적용했을 때 승모판 막 추출물에서 확인 된 단백질의 목록 : 2 차원 전기 영동 (2-DE), 2 차원 LC-MS E (2D-LC / MS E ), LC / MS E 및 액상 IEF가있다. 각 단백질을 확인하는 방법이보고되었습니다.

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Discussion

이 프로토콜의 한 가지 중요한 단계는 액체 질소를 사용하여 시료를 동결시키고 그라인더 시스템을 냉각시키는 것입니다. 액체 질소를 사용하면 생물학적 분해를 방지하고 분말 파우더를 효율적으로 사용할 수 있지만 안전한 취급을위한 특수 교육이 필요합니다.

이 프로토콜에는 작은 시료를 표준 박격포와 유봉에서 복구하기가 어렵 기 때문에 시료 분쇄를위한 분쇄기 시스템이 있습니다. 이 경우 작은 샘플이 모르타르 표면에 미세한 분말로 퍼지기 때문에 수집이 어려워집니다. 또 다른 장점은 분쇄기가 모터 구동되어 재현성있는 방식으로 더 많은 샘플을 처리 할 수 ​​있고 피로를 추가하지 않아도된다는 것입니다. 분쇄기의 사용에 대한 하나의 한계는 박격포가 박격포에 효과적으로 눌려 지도록 작아야하는 시료 크기 (100mg 이하)입니다. 또한, 분쇄기 구성 요소는 세척을위한 사용 사이에서 실온으로 가온되어야합니다 지. 결과적으로, 절차는 시간 소모적이며 많은 샘플이 매일 처리되는 경우 많은 세트가 필요합니다.

추가적인 중요한 단계는 추출 버퍼의 준비입니다. 특히 우레아 (8M)와 티오 우레아 (2M)의 염 농도는 상당히 높습니다. 따라서 소금의 양은 용액의 총 부피의 거의 절반이다. 또한, 37 ° C 이상에서 우레아가 단백질 / 펩티드의 N 말단 및 라이신 및 아르기닌 잔기의 측쇄 아미노기에서 단백질 카바 닐화를 유도 할 수 있기 때문에 열을 피해야한다는 것을 고려하면 용출은 쉽지 않다. . 일단 용해되면 요소 버퍼는 0.22 μm 필터로 여과해야하며 추출 효능에 영향을 미치지 않으면 서 -80 ° C에서 4 주 동안 보관할 수 있지만 완전히 용해되도록 사용하기 전에 15 ° C 이상으로 가열해야합니다 .

수정 및 문제 해결

이 프로토콜에서, 단백질 추출은 등전점 초점과의 호환성 및 용 장성 용해성 단백질의 가용화 효율로 인해 proteomic 연구에 가장 일반적으로 사용되는 단백질 추출 용액 중 하나이기 때문에 설명 된 요소 버퍼를 사용하여 수행됩니다. 이 완충액은 내장 막 단백질 19 , 또는 응집 경향이 매우 큰 단백질, 예를 들어 튜 불린 18 을 매우 효율적으로 가용화 할 수 있다는 것을 입증했다. 또한,이 완충액은 단백질 농도를 결정하기 위해 Bradford 분석과 완벽하게 호환되며, 그것은 2-DE 및 액상 IEF 분석에 직접 사용될 수 있습니다.

그러나이 완충액은 시료에 존재하는 모든 단백질의 가용화에는 이상적이지 않습니다. 상이한 추출 버퍼가이 프로토콜에 의해 검출되지 않는 단백질을 나타낼 수있는 가능성이있다. 예를 들어, 그것은 잘 알고있다.리보솜 및 핵 단백질은 산 추출 또는 트리클로로 아세트산 / 아세톤 침전 20 으로 잘 추출 될 수 있지만 알칼리성 pH 수준은 막 단백질 21 , 22 에 더 적합합니다. 따라서, 대체 완충액의 사용은 2-DE 또는 액상 IEF를 방해하는 염을 제거하기 위해 단백질 침전을위한 추가 단계가 필요할 수있다.

기술의 한계

이 프로토콜에 의해 규명 된 단백질의 수는 상대적으로 낮지 만 최근 몇 년 동안 질량 정확도와 시퀀싱 속도가 급격히 증가한보다 현대적인 도구를 사용하면 단백질 확인의 수와 단백질 분석의 범위를 더 늘릴 수 있습니다 23. 액체 채널을위한 긴 구배를 사용함으로써, 예비 분별 단계없이, 프로테옴의 많은 부분을 덮는 것이 가능합니다로메 토 그래피 분리와 빠른 시퀀싱 속도를 가진 고해상도 MS 기기 24가 결합 되었습니다.

기존 / 대체 방법에 대한 기술의 중요성

승모판과 같은 인간 심장 판막의 단백질을 확인하고 정량화하는 능력은 밸브 질환에서 생리 학적 / 병리학 적 과정의 메커니즘을 밝히는 데 도움이되는 중요하고 도전적인 과제입니다. 승모판 프로테옴의 변화를 정의하면 조직의 질병 상태와 관련된 생물학적 과정의 본질에 대한 이해가 크게 높아질 것입니다.

승모판의 생리 병리학에 대한 현재의 지식은 제한적이며 일반적으로 세포 외 기질 개장, 지혈, 염증 또는 산화 스트레스와 같은 특정 과정에 관여하는 개별 단백질의 분석을 통해 얻어진다.

포괄적 인 proteomic 연구의 부족은 extracellular 매트릭스 단백질 ( 즉, proteoglycans, 콜라겐 및 엘라스틴)에 매우 풍부한이 낮은 세포 조직의 복잡성으로 볼 수 있습니다. 이들 단백질은 총량의 약 80 %를 구성하며, 저농도 단백질의 분석을 방해합니다 26 .

따라서,이 조직의 프로테옴을 기술하기 위해 단백질 가용화를 최대화하기위한 효율적인 추출 프로토콜을 확립하는 것이 필요했다. 이 프로토콜은 조직 1mg에서 ~ 50μg의 단백질 추출을 허용했습니다. 이것은 "연질"조직과 비교할 때 상대적으로 낮은 수율입니다.간 (1 mg 조직에서 ~ 135 μg)으로 투여 할 수 있지만 개별 시료에 대한 단백질 분석을 수행하는 것으로 충분합니다. 이는 특히 현상의 개체 내 변동성을 정의 할 때 적절합니다.

또한이 방법은 많은 분석 응용 프로그램과 호환 될 수 있다는 장점이 있습니다. 제안 된 추출 버퍼에 용해 된 승모판 단백질은 2 차원 전기 영동 및 액상 등전점 법에 기초한 면역 블로 팅 및 프로테옴 분석에 직접 사용될 수 있고 , 11 , 12 또는 완충 성분 간섭을 제거하기위한 단백질 침전 후, 겔이없는 질량 분석 15 .

이 추출 프로토콜의 응용과 함께, 정상적인 승모판 조직의 단백질 성분에 대한보다 철저한 특성 규명은 많은 세포 내 동정라틴 단백질. 이러한 단백질은 세포질 기질뿐만 아니라 세포질 또는 세포 소기관에 국한되어 있으며 분자 및 생물학적 기능이 다릅니다. 다른 흥미로운 단백질 ( 즉, CryAB, septin-11, FHL-1 및 dermatopontin)도 확인되었습니다. 이 단백질들은 승모판에서 잘 알려져 있지 않지만, 그들의 생물학적 특성은 밸브 질환에서의 역할을 암시한다.

이 기술을 습득 한 이후의 응용 프로그램 또는 지시 사항

이 프로토콜을 사용하면 정량적 mRNA 발현 및 비 정량 면역 조직 화학 분석에 대한 데이터와 단백질 발현 관련 데이터를 연관시킬 수 있습니다. 사실, 이들 접근법을 함께 사용하면 mRNA에서 번역 후 단백질 변형에 이르기까지 질병을 근본적으로 다루는 분자 메커니즘을보다 포괄적으로 이해하게됩니다. 따라서,이 방법은 심장 판막 생리 병리학에 초점을 맞춘 연구자들에게 흥미가있을 수있다. 지느러미또한이 프로토콜은 인간의 밸브 27 과 매우 흡사하며 밸브 기능 평가를위한 실험 모델로 사용되는 돼지 승모판에도 적용 할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

이탈리아 보건부는이 연구를 지원했습니다 (RC 2013-BIO 15). 그녀는 훌륭한 기술 지원을 해주신 Barbara Micheli에게 감사드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Saline solution 0.9 % NaCl
Eurocollins A SALF 30874046 Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins
Eurocollins B SALF 30874022 Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins
Wisconsin Bridge life RM/N 4081 Balanced organ's transport medium
Biohazard vertical flow air Burdinola Class A GMP classification
Dewar Flask Thermo Scientific Nalgene 4150-1000
Cryogrinder system OPS diagnostics CG 08-01 Grinder system containing mortars, pestles and screwdriver
Stainless steel forceps
Stainless steel spatula
Disposable sterile scalpel Medisafe MS-10
Stainless steel scissors Autoclavable
Stainless steel picks Autoclavable
Disposable sterile drap Mon&Tex 3.307.08
Sterilizing solution with isopropyl alcohol 70% isopropyl alcohol
Sterilizing solution with hydrogen peroxide 6% hydrogen peroxide
Micropipette, 1 mL, with tips
15 mL centrifuge tubes VWR international 9278
1.7 mL centrifuge tubes VWR international PIER90410
Urea buffer 8 M urea, 2 M thiourea, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol
Urea Sigma aldrich U6504-1KG To be used for Urea buffer
Thiourea Sigma aldrich T8656 To be used for Urea buffer
CHAPS Sigma aldrich C3023-5GR To be used for Urea buffer
Dithiotreitol Sigma aldrich D0632-5G To be used for Urea buffer
Syringe 50 mL PIC To be used to filter Urea buffer
0.22 µm filter Millipore SLGP033RB To be used to filter Urea buffer
PFTE Pestle, 2 mL Kartell 6302 Part of Potter-Elvehjem homogenizer
Borosilicate glass mortar Kartell 6102 Part of Potter-Elvehjem homogenizer
Stirrer VELP scientifica Stirrer DLH To be used for homogenization by Potter-Elvehjem
Bradford Protein assay Bio-Rad laboratories 5000006
Tube rotator Pbi International F205
Liquid nitrogen
Aluminum foil
Ice
Polystyrene box
Dry ice
Centrifuge For centrifugation of 1.7 mL centrifuge tubes at 13,000 x g
Freezer -80°C
Precision balance
Autoclave For sterilization
Cryogenic gloves for liquid nitrogen
Gloves
Professional forced ventilation and natural air convection oven For sterilization
Protease inhibitor cocktail Sigma aldrich P8340-5ML 100X solution
ProteoExtract Protein Precipitation Kit Calbiochem 539180
RapiGest Waters 186001861
Cytoscape www.cytoscape.org version 2.7 Software platform for Gene Ontology analysis
BiNGO http://apps.cytoscape.org/apps/bingo version 3.0.3 Plugin for Gene ontology analysis
AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody Novus Biologicals NBP1-97494 Mouse monoclonal antibody against CryAB
Septin-11 Antibody Novus Biologicals NBP1-83824 Rabbit polyclonal antibody against septin-11
FHL1 Antibody Novus Biologicals NBP-188745 Rabbit polyclonal antibody against FHL-1
Dermatopontin Antibody Novus Biologicals NB110-68135 Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin
Goat Anti mouse IgG HRP Sigma aldrich A4416-0.5ML Secondary antibody for immunoblotting
Goat Anti rabbit IgG HRP Bio-Rad laboratories 170-5046 Secondary antibody for immunoblotting

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References

  1. Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13, (4), 227-232 (2012).
  2. de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expression levels. Mol Biosyst. 5, (12), 1512-1526 (2009).
  3. Hanash, S. Disease proteomics. Nature. 422, (6928), 226-232 (2003).
  4. Ahram, M., Petricoin, E. F. Proteomics Discovery of Disease Biomarkers. Biomark Insights. 3, 325-333 (2008).
  5. Chandramouli, K., Qian, P. Y. Proteomics: challenges, techniques and possibilities to overcome biological sample complexity. Hum Genomics Proteomics. 2009, (2009).
  6. Singleton, C. Recent advances in bioanalytical sample preparation for LC-MS analysis. Bioanalysis. 4, (9), 1123-1140 (2012).
  7. Williams, T. H., Jew, J. Y. Is the mitral valve passive flap theory overstated? An active valve is hypothesized. Med Hypotheses. 62, (4), 605-611 (2004).
  8. Rabkin, E., et al. Activated interstitial myofibroblasts express catabolic enzymes and mediate matrix remodeling in myxomatous heart valves. Circulation. 104, (21), 2525-2532 (2001).
  9. Martins Cde, O., et al. Distinct mitral valve proteomic profiles in rheumatic heart disease and myxomatous degeneration. Clin Med Insights Cardiol. 8, 79-86 (2014).
  10. Tan, H. T., et al. Unravelling the proteome of degenerative human mitral valves. Proteomics. 15, (17), 2934-2944 (2015).
  11. Banfi, C., et al. Proteome of platelets in patients with coronary artery disease. Exp Hematol. 38, (5), 341-350 (2010).
  12. Banfi, C., et al. Proteomic analysis of human low-density lipoprotein reveals the presence of prenylcysteine lyase, a hydrogen peroxide-generating enzyme. Proteomics. 9, (5), 1344-1352 (2009).
  13. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193, (1), 265-275 (1951).
  14. Banfi, C., et al. Very low density lipoprotein-mediated signal transduction and plasminogen activator inhibitor type 1 in cultured HepG2 cells. Circ Res. 85, (2), 208-217 (1999).
  15. Brioschi, M., et al. Normal human mitral valve proteome: A preliminary investigation by gel-based and gel-free proteomic approaches. Electrophoresis. 37, (20), 2633-2643 (2016).
  16. Brioschi, M., Lento, S., Tremoli, E., Banfi, C. Proteomic analysis of endothelial cell secretome: a means of studying the pleiotropic effects of Hmg-CoA reductase inhibitors. J Proteomics. 78, 346-361 (2013).
  17. Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers. Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).
  18. Rabilloud, T., Adessi, C., Giraudel, A., Lunardi, J. Improvement of the solubilization of proteins in two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis. 18, (3-4), 307-316 (1997).
  19. Santoni, V., Molloy, M., Rabilloud, T. Membrane proteins and proteomics: un amour impossible? Electrophoresis. 21, (6), 1054-1070 (2000).
  20. Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. Extraction, purification and analysis of histones. Nat Protoc. 2, (6), 1445-1457 (2007).
  21. Fujiki, Y., Hubbard, A. L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: application to endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 93, (1), 97-102 (1982).
  22. Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4, (12), 3665-3685 (2004).
  23. Mann, M., Kelleher, N. L. Precision proteomics: the case for high resolution and high mass accuracy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (47), 18132-18138 (2008).
  24. Thakur, S. S., et al. Deep and highly sensitive proteome coverage by LC-MS/MS without prefractionation. Mol Cell Proteomics. 10, (8), M110.003699 (2011).
  25. Loardi, C., et al. Biology of mitral valve prolapse: the harvest is big, but the workers are few. Int J Cardiol. 151, (2), 129-135 (2011).
  26. Schoen, F. J. Evolving concepts of cardiac valve dynamics: the continuum of development, functional structure, pathobiology, and tissue engineering. Circulation. 118, (18), 1864-1880 (2008).
  27. Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart. J Am Assoc Lab Anim Sci. 53, (5), 432-438 (2014).

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