Geoptimaliseerd Protocol voor de Extractie van Proteïnen uit de Human Mitral Valve

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

De eiwitsamenstelling van de menselijke mitrale klep is nog steeds gedeeltelijk onbekend, omdat de analyse ervan gecompliceerd is door lage cellulariteit en derhalve door biosynthese met een lage eiwit. Dit werk biedt een protocol om eiwit efficiënt te extraheren voor de analyse van het mitrale klep proteome.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Banfi, C., Guarino, A., Brioschi, M., Ghilardi, S., Mastrullo, V., Tremoli, E., Polvani, G. Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve. J. Vis. Exp. (124), e55762, doi:10.3791/55762 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Analyse van het cellulaire proteome kan bijdragen tot het verhelderen van de moleculaire mechanismen die aanliggende ziekten zijn door de ontwikkeling van technologieën die de grootschalige identificatie en kwantificering van de eiwitten in complexe biologische systemen mogelijk maken. De kennis die wordt verkregen uit een proteomische benadering kan mogelijk leiden tot een Beter inzicht hebben in de pathogene mechanismen die onderliggende ziekten liggen, waardoor de diagnose van nieuwe diagnostische en prognostische ziekte markers mogelijk wordt gemaakt, en hopelijk van therapeutische doelen. Echter, de cardiale mitrale klep vertegenwoordigt een zeer uitdagend monster voor proteomische analyse vanwege de lage cellulariteit in proteoglycan en collageenverrijkte extracellulaire matrix. Dit maakt het uitdagend om eiwitten te extraheren voor een globale proteomische analyse. Dit werk beschrijft een protocol dat compatibel is met latere eiwitanalyse, zoals kwantitatieve proteomics en immunoblotting. Dit kan voor de correlatie van gegevens zorgenG eiwit expressie met gegevens over kwantitatieve mRNA expressie en niet-kwantitatieve immunohistochemische analyse. Inderdaad zullen deze benaderingen leiden tot een uitgebreider begrip van de moleculaire mechanismen die onderliggende ziekten liggen, van mRNA tot post-translatie eiwitmodificatie. Zo kan deze methode relevant zijn voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in de studie van hartklep-fysiopathologie.

Introduction

Recent bewijsmateriaal heeft het begrip van de rollen van de vele regulerende mechanismen die na mRNA synthese optreden veranderd. Inderdaad kunnen translatie-, post-transcriptie- en proteolytische processen het eiwit overvloed en functie regelen. Het dogma - dat zegt dat mRNA concentraties proxies zijn aan die van de bijbehorende eiwitten, in het veronderstellen dat transcriptieniveaus de belangrijkste determinant van eiwit overvloed zijn - is gedeeltelijk herzien. In het begin voorspellen transcriptieniveaus slechts gedeeltelijk eiwit overvloed, wat suggereert dat posttranscriptiegebeurtenissen Voorkomen dat de eiwitten in cellen 1 , 2 gereguleerd worden .

Bovendien dicteert eiwitten uiteindelijk de functie van de cel en dicteert daarom zijn fenotype, dat dynamische veranderingen kan ondergaan in reactie op autocrine, paracriene en endocriene factoren; Bloedgedragen bemiddelaars; temperatuur; behandeling met geneesmiddelen; En ziekte ontwikkelenment. Zo is een expressieanalyse gericht op het eiwitgehalte bruikbaar om het proteome te karakteriseren en de kritische veranderingen die erin voorkomen, te ontrafelen als onderdeel van ziektepatogenese 3 .

Daarom zijn de mogelijkheden die proteomics presenteren om de gezondheids- en ziekteomstandigheden te verduidelijken, ondanks de huidige technologische uitdagingen formidabel. De bijzonder veelbelovende onderzoeksgebieden waaraan proteomics kunnen bijdragen, omvat: het identificeren van gewijzigde eiwituitdrukking op elk niveau ( dwz hele cellen of weefsel, subcellulaire compartimenten en biologische vloeistoffen); De identificatie, verificatie en validatie van nieuwe biomarkers die nuttig zijn voor de diagnose en prognose van de ziekte; En hopelijk de identificatie van nieuwe eiwitdoelstellingen die ter therapeutische doeleinden kunnen worden gebruikt, alsmede voor de beoordeling van de werkzaamheid en toxiciteit van geneesmiddelen 4 .

Het vastleggen van de complexiteit vanHet proteome vertegenwoordigt een technologische uitdaging. De huidige proteomische instrumenten bieden de mogelijkheid om op grote schaal analyses uit te voeren voor de identificatie, kwantificering en validatie van gewijzigde eiwitniveaus. Daarnaast heeft de introductie van fractionerings- en verrijkingstechnieken, die gericht zijn op het vermijden van de interferentie veroorzaakt door de meest overvloedige eiwitten, ook verbeterde eiwitidentificatie door de minste overvloedige eiwitten te omvatten. Tenslotte is proteomics aangevuld met de analyse van post-translational modificaties, die zich als belangrijke modulatoren van eiwitfunctie voordoen.

De monstervoorbereiding en het eiwitherstel in de biologische monsters onder analyse blijven echter de beperkende stappen in de proteomische workflow en vergroten het potentieel voor mogelijke valkuilen 5 . Inderdaad, in de meeste moleculaire biologie technieken die moeten worden geoptimaliseerd, zijn de eerste stappen tissue homogenizatIon- en cellysis, in het bijzonder tijdens de analyse van eiwitten met weinig overvloed waarvoor geen amplificatiemethoden bestaan. Bovendien kan de chemische aard van eiwitten hun eigen herstel beïnvloeden. Bijvoorbeeld, de analyse van zeer hydrofobe eiwitten is zeer uitdagend omdat ze gemakkelijk neerslaan tijdens isoelectrische focus, terwijl transmembraan eiwitten bijna onoplosbaar zijn (in Referentie 5 onderzocht). Bovendien vormt de variatie van de weefselsamenstelling een belangrijke barrière voor het ontwikkelen van een universele extractiemethode. Ten slotte, omdat bijna alle klinische exemplaren van beperkte hoeveelheid zijn, is het essentieel om eiwitbereiding mogelijk te maken met maximaal herstel en reproduceerbaarheid van minimale monsterhoeveelheden 6 .

Dit werk beschrijft een geoptimaliseerd protocol voor extractie van eiwitten uit de normale menselijke hart mitralisklep, die een zeer uitdagend monster voor proteomische analyse vertegenwoordigt. De normale mitrale klep is een compLex structuur tussen het linker atrium en de linker hartslag van het hart ( figuur 1 ). Het speelt een belangrijke rol in de controle van de bloedstroom van het atrium naar de ventrikel, het voorkomen van terugstroom en het verzekeren van de juiste zuurstofvoorziening aan het hele lichaam, waardoor een adequate hartuitgang wordt behouden. Het wordt echter vaak beschouwd als een "inactief" weefsel, met een lage cellulariteit en weinig componenten, voornamelijk in de extracellulaire matrix. Dit komt doordat de inwendige valvulaire interstitiële cellen (VIC's) onder normale omstandigheden een stil fenotype met een biosynthese van lage proteïnen 7 voordoen.

Er is echter aangetoond dat in een pathologische toestand het aantal VICs in de spongiosa toeneemt en hun proteïnesynthese geactiveerd wordt, samen met andere functionele en fenotypische veranderingen 8 . Daarom is het niet verwonderlijk dat de minimale gegevens die beschikbaar zijn inDe literatuur richt zich op de analyse van pathologische mitrale kleppen 9 , 10 , waarin het verhoogde aantal geactiveerde VIC's het relatief hoge aantal geïdentificeerde eiwitten kan verklaren.

Ten slotte kan het onderhavige protocol dienen om het begrip van de pathogene mechanismen die verantwoordelijk zijn voor mitrale klepziekten te ontwikkelen door middel van het bestuderen van mitrale klep eiwit componenten. Inderdaad, een beter begrip van de onderliggende pathologische processen kan bijdragen tot het verbeteren van het klinisch beheer van klepziekten, waarvan de huidige indicaties voor interventie grotendeels op hemodynamische overwegingen zijn gebaseerd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

In dit protocol worden de menselijke harten verzameld tijdens multi-organische explantatie (koude ischemietijd van 4-12 uur, gemiddeld 6 ± 2 uur) van multi-orgaandonoren die om technische of functionele redenen uitgesloten zijn van orgaantransplantatie, ondanks normale echocardiografische parameters. Ze worden gestuurd naar de Cardiovasculaire Weefselbank van Milaan, het Cardiologisch Centrum van Monzino (Milaan, Italië) voor het bankieren van de aorta- en longventielen. De mitrale posterior folders worden niet voor klinische doeleinden gebruikt, dus ze worden verzameld tijdens de aorta- en pulmonale klepisolatie nadat de toestemming van de donors verworven is. Het weefsel voor transplantatie en onderzoek wordt alleen verzameld na toestemming van de ouders; Op het toestemmingsblad machtigen ze (of niet) het gebruik van het hartweefsel voor onderzoek alleen als het niet geschikt is voor menselijk klinisch gebruik ( dwz microbiologische, functionele en serologische problemen), volgens de richtlijnen van de ethische commissie vanMonzino Cardiologic Center.

1. Mitralklepbereiding

  1. Oog de menselijke mitrale klep zo snel mogelijk na organische explantatie (koude ischemietijd van 4-12 uur).
  2. Verwijder in een schone kamer het hart uit de transporttas met een koude (4 ° C) oplossing ( bijv. Zoutoplossing of evenwichtig medium Eurocollins of Wisconsin). Zet het in een emmer en plaats het in een biosafety-kast (biohazard verticale luchtstroom, klasse A, Good Manufacturing Practices (GMP) classificatie) om verder te gaan met de klepbereiding.
  3. Plaats het hart op een steriele wegwerpdoek in de kast. Snijd het hart volledig, loodrecht op de hoofdas, op het niveau van de linker en rechter ventrikels, ongeveer 4 cm van de top, met behulp van een steriele wegwerpschaalpel.
  4. Beweeg de oplopende aorta en longslagader om het linker atriale dak weer te geven.
  5. Met steriele autoclavable tang en picks, snijd de linker auricle op deLinker atriumdak, waardoor de mitralklep zichtbaar is en het mogelijk maakt de grote mitrale leaflet (anterior) en de kleine mitrale leaflet (posterior) te identificeren.
    OPMERKING: Antero-laterale en de achterste mediale commissies definiëren de grens van de voorste folder en het achterste gedeelte.
  6. Ontleed het linkeratrium en de ventrikelwanddikte rond de omtrek van de hele mitrale klep met behulp van steriele autoclaverbare scharen en niet-traumatische tang .
  7. Identificeer de continuïteit van de mitro-aorta klep.
    OPMERKING: De linker ventrikel bevat de hele mitrale klep en akkoorden.
  8. Scheep de anterior mitralklepje uit de posterior mitralklepje, snijd de posterior folder langs de insteek met de ventrikel (commissuur).
  9. Was de posterior folder in de zoutoplossing. Knip de folder in kleine stukken (<1 cm 2 ) en plak ze individueel in aluminiumfolie. Bevroren ze met vloeibare stikstof.
    Let op: Volg de veiligheidswerkzaamheden bij het gebruik van vloeibaar stikstof.
    1. Maak de tafel van de kast schoon met een 70% isopropylalcoholoplossing en 6% waterstofperoxideoplossing aan het einde van de procedure.

2. Proteïne extractie

  1. Gebruik pincet om het monster op te slaan die in vloeibare stikstof is opgeslagen en plaats het op droogijs onmiddellijk terwijl het nog in de aluminiumfolie wordt verpakt. Laat het monster niet ontdooien tijdens overdrachten.
  2. Voor het slijpen, koud de porselein / zirkonium mortel en stamper van een grindersysteem ( bijv. CryoGrinder), samen met het monster, door ze in een Dewar-fles met vloeibare stikstof (~ 500 ml) te plaatsen.
    Let op: Volg de veiligheidswerkzaamheden bij het gebruik van vloeibaar stikstof.
  3. Zet de mortel en de stamper in een polystyreen doos met droogijs. Verwijder het monster uit de aluminiumfolie en steek het in de mortel.
  4. Grind tHij proeft met de grote stamper tegen de mortel 15-20 keer, met behulp van de schroevendraaier om de stamper te draaien. Meng het monster tijdens het slijpproces met de punt van een voorgekoelde spatel.
    1. Herhaal met de kleine stamper.
  5. Breng het grondmonster over op een eerder gewogen buis ( bv. 15 ml centrifugebuis) door de buis om te zetten, plaats het over de mortel en draai ze om elkaar om het monster naar de buis te verplaatsen. Gebruik een voorgekoelde spatel om het materiaal van de mortel te herstellen.
    1. Houd de buis met het monster op droog ijs om te voorkomen dat het ontdooien tijdens de overdracht.
  6. Bereken het netto gewicht van het monster.
  7. Reinig de mortel en de stamper na elk monster en ontreinig ze door autoclaven of verwarm ze bij 200 ° C gedurende 2 uur.
  8. Breng het poedervormige monster uit de centrifugebuis door de inversie naar de glazen buis van een homogenisator.
  9. Voeg gefilterde ureumbuffet toeR (8 M ureum, 2 M thiourea, 4% w / v CHAPS, 20 mM Tris en 55 mM dithiotreitol) aan de glazen buis, 200 μl ureumbuffer voor elke 10 mg poederstof.
    OPMERKING: Residueel poedermonster dat in de centrifugebuis achterblijft, kan worden hersteld met behulp van een deel van het berekende volume ureumbuffer.
  10. Homogeniseer het monster met behulp van een roerder uitgerust met een borosilicaatglasmortel en een polytetrafluorethyleen (PTFE) stamper. Druk langzaam de stamper op het monster met een draaiende beweging (1500 rpm) 10 keer.
  11. Herstel de supernatant en verplaats deze naar een schone 1,7 ml centrifugebuis. Trek het resterende monster opnieuw uit met verse ureumbuffer en voeg de helft toe van het volume dat tijdens de eerste extractie werd gebruikt.
  12. Herhaal stap 2.10.
  13. Herstel de supernatant en combineer deze met de supernatant uit stap 2.11. Plaats de gecombineerde supernatant gedurende 30 minuten op een buisrotator.
  14. Centrifugeer de buis gedurende 30 minuten bij 13.000 xg en 4 ° C.
  15. Herstel de supernatant anD de eiwitconcentratie meten volgens de Bradford-eiwitmeting, volgens de instructies van de fabrikant. Bewaar het monster bij -80 ° C tot aan het gebruik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De extractie en ontbinding van eiwitten in de ureumbuffer is direct verenigbaar met proteomische methoden op basis van isoelectrofocusing (tweedimensionale elektroforese (2-DE) 11 en vloeibare fase isoelektrische focusing (IEF) 12 ) en met immunoblotting na verdunning in Laemmli buffer 13 Bevattende een proteaseremmerscocktail 14 .

Voor gelvrije massaspectrometrie gebaseerde methoden ( dat wil zeggen vloeistofchromatografie gekoppeld aan data-onafhankelijke massaspectrometrie analyse (LC / MS E ) en tweedimensionale LC / MS E (2D-LC / MS E )) 15 , de monsters geëxtraheerd In de beschreven ureumbuffer moet verder worden behandeld om het ureum en thioureum te elimineren, die zou kunnen interfereren met de daaropvolgende eiwitvertering en vloeistofchromatografische scheiding. ThiS ontzilting stap kan worden bereikt met behulp van de commerciële eiwit neerslag kits, volgens de instructies van de fabrikant om de eiwitten te precipiteren. Het monster kan vervolgens worden opgelost in 25 mM NH4HCO3 die 0,1% splijbare detergentia bevat voor eiwitvertering 16 . De neerslag van de eiwitten kan buffercomponenten elimineren, waardoor het eiwitgehalte minimaal wordt beïnvloed (eiwitherstel:> 85%), waardoor het monster geschikt is voor elke soort analyse.

De toepassing van dit protocol voor eiwitxtractie van humane mitralkleppen toegestaan ​​voor de identificatie van in totaal 422 eiwitten, waarbij vier verschillende proteomische benaderingen worden gecombineerd die eerder beschreven in detail 11 , 15 zijn . Specifiek werden 169 eiwitten geïdentificeerd door 2-DE, 330 eiwitten door vloeibare fase IEF, 96 eiwitten door LC / MS E en 148 eiwittenDoor 2D-LC / MS E (tabel 1).

Om de 422 geïdentificeerde eiwitten in termen van subcellulaire lokalisatie te classificeren, werd een software gebruikt voor de gen ontologie (GO) analyse (bijvoorbeeld Cytoscape). Het netwerk dat is gecreëerd met de software en de bijbehorende plug-in bleek dat naast de verwachte eiwitten gelokaliseerd in het extracellulaire gebied (zie het rechterboven gedeelte van figuur 2 ), de meeste eiwitten die werden geïdentificeerd door de proteomische benaderingen, afkomstig waren uit het intracellulaire gebied ( Dwz cytoplasma, organellen, vesicles en cytoskelet). Cell-oppervlakte eiwitten werden ook geïdentificeerd ( Figuur 2 ).

Resultaten werden verder bevestigd in drie onafhankelijke mitrale klepmonsters. Immunoblotting werd gebruikt om een ​​groep van vier eiwitten te analyseren ( dwz septine-11, vier en een half LIM-domeinen eiwit 1 (FHL-1), derMatopontine en alfa-kristalline B (CryAB)) die nog nooit in de normale mitrale klep zijn geïdentificeerd ( figuur 3 ).

Figuur 1
Figuur 1: Mitrale klepstructuur. Bovenaanzicht van het menselijke hart dat de gesloten ( A ) of open ( B ) menselijke mitrale klep toont. Vooraanzicht van de linker ventrikel van een menselijk hart ( C ). Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: Analyse van de geïdentificeerde mitrale klep eiwitten in termen van cellulaire verdeling. Cytoscape en de plugin BiNGO waren gebruikt om obtai te gebruikenN de verdeling van gen ontologie (GO) termen uit de celcomponentcategorieën. De cirkelgrootte is evenredig aan het aantal eiwitcomponenten die verband houden met de geselecteerde GO-termen, en de kleurenschaal voor de p-waarde van de oververtegenwoordiging wordt gerapporteerd. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3: Immunoblottende analyse van septin-11, FHL-1, dermatopontine en CryAB in geheel extract uit drie menselijke normale mitrale klepjes. Immunoblotting werd uitgevoerd met gebruikmaking van monoklonaal monoklonaal antilichaam tegen CryAB en konijn polyclonale antilichamen tegen de septine-11, FHL-1 en dermatopontine antilichamen. alsjeblieftKlik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te zien.

<td> x <td> <Td> Proteasome subunit bèta type 4 precursor <td> </ Tr> <Td> Transgelin 2 <td> <tr> <td>
toetreding Beschrijving 2-DE 2D-LC LC-MS E Vloeibare fase IEF
A6NMZ7 Collageen alfa VI X
O00151 PDZ- en LIM-domeinproteïne 1 X
O00299 Chloride intracellulaire kanaal eiwit 1 X
O00764 Pyridoxale kinase X
O14558 Warmte schok eiwit bèta 6 X
O43399 Tumor eiwit D54 X
O43488 Aflatoxine B1-aldehyde-reductase-lid 2 X
O43707 Alpha actinine 4 X X
O43866 CD5 antigeen zoals precursor X
O60493 Sorteer Nexin 3 X
O60701 UDP glucose 6 dehydrogenase X
O75223 Ongekarakteriseerd eiwit X
O75368 SH3 domein bindend glutaminezuur rijk aan eiwit X
O75390 Citraat synthase mitochondriale precursor X
O75489 NADH dehydrogenase ubiquinon ijzer zwavel eiwit 3 mitochondriale precursor X X
O75608 Acyl eiwit thioesterase 1 X
O75828 Carbonylreductase NADPH 3 X
O75874 Isocitraat dehydrogenase NADP cytoplasmatische X
O75955 Flotillin X
O94760 NG NG dimethylarginine-dimethylaminohydrolase 1 X
O94788 Retinale dehydrogenase 2 X
O95865 NG NG dimethylarginine-dimethylaminohydrolase 2 X X
P00325 Alcoholdehydrogenase 1B X X
P00338 L lactaat dehydrogenase A ketting X
P00352 Retinale dehydrogenase 1 X
P00441 Superoxide dismutase Cu Zn X X
P00450 Ceruloplasmin voorloper X X
P00488 Coagulatiefactor XIII Een ketenvoorloper X
P00491 Purine nucleoside fosforylase X
P00492 Hypoxanthine guanine fosforibosyltransferase X
P00558 Fosfoglyceraatkinase 1 X X
P00568 Adenylaatkinase isoenzym 1 X
P00734 protrombine X X
P00738 haptoglobin X X X X
P00739 Haptoglobine gerelateerde eiwitvoorloper X
P00751 Complement factor B X X X
P00915 Koolzuuranhydrase 1 X
P00918 Koolstofanhydrase 2 X
P01008 Antitrombine III voorloper X X X
P01009 Alpha 1 antitrypsine X X X X
P01011 Alpha 1 antichymotrypsine X X X X
P01019 Angiotensinogene voorloper X X
P01023 Alpha 2 macroglobuline X X
P01024 Complement C3 X X X X
P01033 Metalloproteïnaseremmers 1 voorloper X
P01042 Kininogen 1 voorloper X
P01593 Ig kappa keten VI regio AG X
P01598 Ig kappa keten VI regio EU X
P01600 Ig kappa keten VI gebied Hau X X
P01611 Ig kappa keten VI gebied Wes X
P01620 Ig kappa keten V III regio SIE X
P01625 Ig kappa keten V IV regio Len X
P01766 Ig zware keten V III regio BRO X X
P01781 Ig zware keten V III regio GAL X
P01834 Ig kappa keten C gebied X X X X
P01842 Ig lambda keten C gebieden X X X
P01857 Ig gamma 1-keten C gebied X X X X
P01859 Ig gamma 2-keten C-gebied X X X X
P01860 Ig gamma 3-keten C-gebied X X X
P01861 Ig gamma 4-keten C gebied X X X
P01871 Ig mu-keten C gebied X X X
P01876 Ig alfa 1-keten C-gebied X X X X
P01877 Ig alfa 2-keten C-gebied X
P02144 myoglobin X X
P02452 Collageen alfa 1 I ketting X X X X
P02511 Alpha crystalline B-keten X
P02545 Lamine AC 70 kDa laminaat X X X X
P02647 Apolipoproteïne Al X X X X
P02649 Apolipoproteïne E X X X X
P02671 Fibrinogeen alfa keten X X X X
P02675 Fibrinogeen bèta ketting X X X X
P02679 Fibrinogeen gamma keten X X X X
P02689 Myelin P2 eiwit X
P02735 Serumamyloïde Een eiwitvoorloper X
P02741 C reactieve eiwit precursor X
P02743 Serum amyloïde P component X X X X
P02746 Complement C1q subcomponent subeenheid B X X
P02747 Complement C1q subcomponent subeenheid C precursor X
P02748 Complementcomponent C9 X X X
P02749 Beta 2 glycoproteïne 1 X X X X
P02750 Leucine rijke alfa 2 glycoproteïne precursor X
P02751 fibronectine X X
P02760 AMBP eiwit precursor X X X X
P02763 Alpha 1 zuur glycoproteïne 1 X X X
P02765 Alpha 2 HS glycoproteïne precursor X
P02766 Transthyretin voorloper X X X
P02768 Serumalbumine X X X X
P02774 Vitamine D bindende eiwit precursor X
P02787 serotransferrinevoorloper X X X X
P02788 Lactotransferrine precursor X
P02790 Hemopexine X X X X
P02792 Ferritine lichte ketting X
P04004 vitronectine X X X X
P04075 Fructose bisfosfaat aldolase A X
P04083 Bijlage A1 X X X X
P04179 Superoxide dismutase Mn mitochondriale precursor X
P04196 Histidine rijke glycoproteïne precursor X
P04217 Alpha 1B glycoproteïne precursor X X
P04350 Tubuline Bèta 4-keten X
P04406 Glyceraldehyde 3 fosfaat dehydrogenase X X X X
P04792 Warmte schok eiwit beta 1 X X X X
P05091 Aldehyde dehydrogenase mitochondriale voorloper X X
Plasmaprotease C1 inhibitor precursor X
P05156 Complement factor I precursor X
P05413 Vetzuur bindend eiwit hart X
P05452 Tetranectine precursor TN X X
P05787 Keratine type II cytoskeletaal 8 X
P06396 gelsoline X X X X
P06576 ATP synthase subeenheid beta-mitochondriale voorloper X X
P06732 Creatine kinase M type X X
P06733 Alpha enolase X X X X
P06753 Tropomyosine alfa 3-keten X X
P07108 Acyl CoA bindend eiwit X
P07195 L lactaat dehydrogenase B keten X X X
P07196 Neurofilament licht polypeptide X
P07197 Neurofilament medium polypeptide X X
P07237 Proteïne disulfide isomerase voorloper X X
P07339 Cathepsin D voorloper X X
P07355 Bijlage A2 X X X X
P07360 Complement C8 gamma keten voorloper X
P07437 Tubuline bèta ketting X X X X
P07585 decorine X X X X
P07737 Profilin 1 X
P07858 Cathepsin B voorloper X
P07900 Hitte schok eiwit HSP 90 alpha X X
P07951 Tropomyosine beta chain X
P07954 Fumaraat hydratase mitochondriale precursor X
P07996 Trombospondine 1 X X X
P08107 Warmte schok 70 kDa eiwit 1A 1B X X X X
P08123 Collageen alfa 2 I ketting X X X X
P08133 Bijlage A6 X X
P08238 Warmte schok eiwit HSP 90 beta X X
P08253 72 kDa type IV collagenase voorloper X
P08294 Extracellulaire superoxide dismutase Cu Zn precursor X X X
P08590 Myosine-lichtpolypeptide 3 X X
P08603 Complement factor H X X X X
P08670 vimentine X X X X
P08729 Keratine type II cytoskeletaal 7 X
P08758 Bijlage A5 X X X X
P09211 Glutathion S transferase P X X X
P09382 Galectin 1 X X X
P09417 Dihydropteridine reductase X
P09493 Tropomyosine 1 alfa ketting X X
P09525 Bijlage A4 X X
P09651 Heterogene nucleaire ribonucleoproteïne Al X
P09871 Component C1s subcomponent voorloper X
P09936 Ubiquitine carboxyl terminale hydrolase isozym L1 X
P09972 Fructose bisfosfaat aldolase C X
P0C0L4 Complement C4 Een voorloper X
P0CG05 IgLambda 2 keten C gebieden X
P0CG38 POTE ankyrine domein familielid I X
P10515 Dihydrolipoyllysine residu acetyltransferase component van pyruvate dehydrogenase complex X
P10768 S-formylglutathionhydrolase X
P10809 60 kDa warmtechok eiwit mitochondriale precursor X
P10909 clusterin X X X X
P10915 Hyaluronan en proteoglycan link eiwit 1 precursor X X
P11021 78 kDa gLucose gereguleerd eiwit X X X
P11047 Laminin subunit gamma 1 precursor X
P11142 Warmte schok cognate 71 kDa eiwit X X X X
P11177 Pyruvate dehydrogenase E1-component subeenheid beta-mitochondriale precursor X
P11217 Glycogeen fosforylase spiervorm X
P11310 Middelketting specifieke acyl CoA dehydrogenase mitochondriale precursor X
P11413 Glucose 6 fosfaat 1 dehydrogenase X
P11766 Alcohol dehydrogenase klasse 3 chi keten X
P12036 Neurofilament zwaar polypeptide X
P12109 Collageen alfa 1 VI ketting X X X X
P12110 Collageen alfa 2 VI ketting X X X X
P12111 Collageen alfa 3 VI ketting X X X
P12277 Creatine kinase B type X
P12429 Bijlage A3 X X
P12814 Alpha actinine 1 X X
P12829 Myosin licht polypeptide 4 X
P12882 Myosin 1 X
P12883 Myosin 7 X X
P12955 Xaa Pro dipeptidase X
P13489 Ribonuclease-remmer X
P13533 Myosin 6 X X
P13611 Versican kern eiwit precursor X X
P13639 Verlengingsfactor 2 X
P13716 Delta-aminolevulinezuurdehydratase X
P13796 Plastin 2 X
P13804 Electron overdracht flavoproteïne subeenheid alfa mitochondriale precursor X
P13929 Beta enolase X X
P14136 Glialfibrillair zuur eiwit astrocyt X
P14314 Glucosidase 2 subeenheid bèta voorloper X
P14550 Alcoholdehydrogenase NADP X
P14618 Pyruvate kinase isozymen M1 M2 X X X
P14625 </ Td> Endoplasmin voorloper X X
P15121 Aldose reductase X
P15259 Fosfoglyceraatmutase 2 X
P16152 Carbonylreductase NADPH 1 X
P17066 Warmte schok 70 kDa eiwit 6 X X X
P17174 Aspartaat aminotransferase cytoplasmatisch X
P17540 Creatine kinase sarcomerische mitochondriale precursor X
P17661 desmine X X X X
P17980 26S protease regulerende subeenheid 6A X
P17987 T complex eiwit 1 subeenheid alfa X
P18206 vinculin X X
P18428 Lipopolysaccharide bindende eiwit precursor X
P18669 Fosfoglyceraatmutase 1 X
P19105 Myosin Regulatory Light Chain 2 X X
P19623 Spermidine synthase X
P19652 Alpha 1 zuur glycoproteïne 2 precursor X X
P19823 Inter alfa trypsine-remmer zware keten H2 X
P19827 Inter alfa trypsine remmer zware keten H1 X X
P20073 Bijlage A7 X
P20618 Proteasome subunit bèta type 1 precursor X
P20774 mimecan X X X X
P21266 Glutathion S transferase Mu 3 X
P21333 Filamin A X X
P21796 Spanningsafhankelijk anion selectief kanaal eiwit1 X
P21810 biglycan X X X X
P21980 Proteïne glutamine gamma glutamyltransferase 2 X X
P22105 Tenascin X X X
P22314 Ubiquitine-activerend enzym E1 X
P22352 Glutathion peroxidase 3 precursor X X
P22626 Heterogene nucleaire ribonucleoproteïnen A2 B1 X
P22695 Ubiquinol cytochroom c reductase complex kern eiwit 2 mitochondriale precursor X
P23141 Levercarboxyesterase 1 voorloper X
P23142 Fibuline 1 X X X X
P23284 Peptidyl prolyl cis trans isomerase B precursor X
P23381 Cytoplasmatische tryptophanyl tRNA synthetase X
P23526 Adenosylhomocysteinase X X
P23528 Cofiline 1 X
P24752 Acetyl CoA acetyltransferase mitochondriale precursor X
P25311 Zink alfa 2 glycoproteiN voorloper X
P25705 ATP synthase subeenheid alfa mitochondriale X
P25788 Proteasome subunit alpha type 3 X X
P25789 Proteasome subunit alpha type 4 X
P26447 Proteïne S100 A4 X
P27348 14 3 3 proteïne theta X X
P27797 Calreticulin precursor X
P28066 Proteasome subunit alpha type 5 X
P28070 X X
P28072 Proteasome subunit beta type 6 precursor X
P28074 Proteasome subunit beta type 5 precursor X
P28331 NADH ubiquinon oxidoreductase 75 kDa subunit mitochondriale precursor X
P28838 Cytosol aminopeptidase X
P29218 Inositol monofosfatase X
P29401 transketolase X
P29692 Verlengingsfactor 1 delta X
P29966 Myristoyleerd alanine-rijk C-kinase substraat X
P30040 Endoplasmatische reticulumproteïne ERp29 voorloper X
P30041 Peroxiredoxine 6 X X
P30043 Flavin reductase X
P30044 Peroxiredoxine 5 mitochondriale precursor X
P30085 UMP CMP kinase X
P30086 Fosfatidylethanolamine bindend eiwit 1 X
P30101 ProteiN disulfide isomerase A3 precursor X X X
P30613 Pyruvate kinase isozymen RL X
P30740 Leukocyt elastase inhibitor X
P31025 Lipocalin 1 voorloper X
P31937 3 hydroxyisobutyraatdehydrogenase mitochondriale voorloper X
P31942 Heterogene nucleaire ribonucleoproteïne H3 X
P31943 Heterogene nucleaire ribonucleoproteïne H X
P31946 14 3 3 eiwit beta alfa X X
P31948 Stress geïnduceerde fosfoproteïne 1 X
P31949 Proteïne S100 A11 X
P32119 Peroxiredoxine 2 X X
P34931 Warmte schok 70 kDa eiwit 1 zoals X X
P34932 Warmte schok 70 kDa eiwit 4 X
P35232 prohibitine X
P35237 Serpin B6 X
P35443 Trombospondine 4 X
P35555 Fibrilline 1 X X
P35579 Myosin 9 X X X
P35580 Myosin 10 X X
P35609 Alpha actinine 2 X
P35625 Metalloproteïnaseremmer 3 X X
P35998 26S protease regulerende subeenheid 7 X
P36871 Fosfoglucomutase 1 X X
P36955 Pigment epithelium afgeleide factor X X
P37802 X X
P37837 transaldolase X
P38117 Electron overdracht flavoproteïne subeenheid beta X
P38646 Stress 70 eiwit mitochondriale voorloper X X
P39687 Zuurzuur leucine rijk nucleair fosfoproteïne 32 familielid A X
P40121 Macrofage capping eiwit X
P40925 Malate dehydrogenase cytoplasmatisch X
P40926 Malate dehydrogenase mitochondriale voorloper X
P41219 periferine X
P42330 Aldo keto reductase familie 1 lid C3 X
P45880 Spanningsafhankelijk anion selectief kanaal eiwit 2 X
P47755 F actin capping eiwit subeenheid alpha 2 X X
P47756 F actin capping eiwit subunit beta X X
P47985 Ubiquinol cytochroom c reductase ijzerzwavel subeenheid mitochondriale precursor X
P48047 ATP synthase O subeenheid mitochondriale precursor X
P48637 Glutathion synthetase X
P48741 Warmte schok 70 kDa eiwit 7 X X
P49189 4 trimethylaminobutyraldehyde dehydrogenase X
P49368 T complex eiwit 1 subeenheid gamma X
P49747 Brokje oligomere matrix eiwit X X X X
P49748 Zeer lange keten specifieke acyl CoA dehydrogenase mitochondriale precursor X
P50395 Rab BBP dissociatie remmer beta X x </ Td>
P50454 Serpin H1 precursor X
P50995 Bijlage A11 X
P51452 Dubbele specificiteit eiwit fosfatase 3 X
P51884 lumican X X X X
P51888 Prolargin voorloper X X X X
P52565 Rho bbp dissociatie remmer 1 X
P52566 Rho BBP-dissociatieremmer 2 X
P54652 Verwarmingschok gerelateerd 70 kDa eiwit 2 X X X X
P55072 Transitional endoplasmatische reticulum ATPase X
P55083 Microfibril geassocieerde glycoproteïne 4 precursor X X
P57053 Histon H2B type F X
P60174 Triosephosphate isomerase X X X
P60660 Myosin-lichtpolypeptide 6 X X
P60709 Actin cytoplasmatische 1 X X X X
P60981 Destrin X
P61086 Ubiquitine conjugerende enzym E2 25 kDa X
P61088 Ubiquitine conjugerende enzym E2 X
P61224 Ras gerelateerde eiwit Rap 1b precursor X
P61978 Heterogeen nucleair ribonucleoproteïne K X X
P61981 14 3 3 eiwit gamma X X X
P62258 14 3 3 eiwit epsilon 14 3 3E X
P62491 Ras gerelateerd eiwit X
P62714 Serine threonine eiwit fosfatase 2A katalytische subeenheid beta-isoform X
P62736 Actin aorta gladde spier X X X
P62805 Histon H4 X
P62826 GTP bindende nucleaire eiwit Ran X
P62873 Guanine nucleotide bindende eiwit GIGSGT subeenheid beta 1 X
P62879 Guanine nucleotide bindende eiwit GIGSGT subeenheid beta 2 X
P62937 Peptidyl prolyl cis trans isomerase A X X
P62987 Ubiquitine 60S ribosomale eiwit L40 X
P63104 14 3 3 proTein zeta delta X X X X
P63241 Eukaryotische vertaling initiatief factor 5A 1 X
P63244 Guanine nucleotide binding eiwit subeenheid beta 2 zoals 1 X
P63267 Actin gamma enterische gladde spier X X
P67936 Tropomyosine alfa 4-keten X
P68032 Actin alfa hartspier 1 X
P68104 Verlengingsfactor 1 alfa 1 X X X
P68133 Actin alfa skeletspier
P68363 Tubulin alfa 1B keten X X X
P68371 Tubuline Bèta 2C keten X X X
P68402 Plateletactiverende factor acetylhydrolase IB subeenheid beta X
P68871 Hemoglobine subeenheid beta X X X
P69905 Hemoglobine subeenheid alpha X X
P78371 T complexe eiwit 1 subeenheid beta X
P78417 Glutathion transferase omega 1 X X
P80748 Ig lambda keten VIII regio LOI X
P98095 Fibuline 2 X X
Q01082 Spectrin bèta keten hersenen 1 X
Q01449 Myosin regulerende lichtketting 2 atriale isoform X
Q01518 Adenylyl cyclase geassocieerd eiwit 1 X
Q01995 Transgelin Gladde spierproteïne 22 alpha X
Q03252 Lamin B2 X X
Q03591 Complement factor H gerelateerde eiwit 1 voorloper X
Q04917 14 3 3 eiwit eta X X
Q06323 Proteasome activator complex subeenheid 1 X
Q06828 fibromoduline X X X X
Q06830 Peroxiredoxine 1 X X
Q07507 Dermatopontin X X X X
Q07960 Rho GTPase-activerend eiwit 1 X
Q08257 Quinone oxidoreductase X
Q08431 Lactadherin X X
Q12765 SEcernin 1 X
Q13011 Delta 3 5 Delta 2 4 dienoyl CoA isomerase mitochondriale precursor X X
Q13228 Selen bindend eiwit 1 X X
Q13404 Ubiquitine conjugerende enzym E2 variant 1 X
Q13409 Cytoplasmische dynein 1 tussenketting 2 X
Q13509 Tubuline Bèta 3-keten X X X
Q13642 Vier en een half LIM domeinen eiwit 1 X
Q13765 Nascent polypeptide geassocieerde complex subeenheid alpha X
Q13885 N tubuline bèta 2A keten X X
Q14194 Dihydropyrimidinase gerelateerd eiwit 1 X
Q14195 Dihydropyrimidinase gerelateerd eiwit 3 X X X X
Q14624 Inter alfa-trypsine-inhibitor zware keten H4 precursor X
Q14697 Neutrale alpha glucosidase AB precursor X
Q14764 Groot kluisproteïne X
Q14767 Latente transformerende groeifactor beta bindend eiwit 2 X X
Q14894 Mu crystalline homolog NADP gereguleerd schildklierhormoon bindend eiwit X
Q15063 Periostin voorloper X X X X
Q15084 Proteïne disulfide isomerase A6 precursor X
Q15113 Procollageen C endopeptidaseversterker 1 voorloper X
Q15181 Anorganische pyrofosfatase X
Q15365 Poly rC bindend eiwit 1 X
Q15366 Poly rC bindend eiwit 2 X
Q15582 Transformeren van groeifactor beta-geïnduceerde eiwitten X X X
Q15819 Ubiquitine conjugerende enzym E2 variant 2 X
Q16352 Alpha internexin X
Q16473 Putative tenascin XA X
Q16555 Dihydropyrimidinase gerelateerd eiwit 2 X X X
Q16698 2 4 dienoyl CoA reductase mitochondriale voorloper X
Q16891 Mitochondriale binnenmembraan X
Q562R1 Betaactine zoals eiwit 2 X
Q6S8J3 POTE ankyrine domein familielid E X
Q6UWY5 Olfactomedine zoals eiwit 1 precursor X X
Q71U36 Tubulin alfa 1A keten X X X
Q7Z7G0 Doel van Nesh SH3 precursor X X X
Q8WUM4 Geprogrammeerde cel dood 6 interactief eiwit X
Q8WWX9 Thioredoxine zoals selenoproteïne M precursor X
Q92597 Proteïne NDRG1 X
Q92945 Verstrengeld element bindend eiwit 2 X
Q96CN7 Isochorismatase-domein dat eiwit 1 bevat X
Q96CX2 BTB POZ-domein bevattende eiwit X
Q96KK5 Histon H2A type 1 H X X
Q96KP4 Cytosolische niet-specifieke dipeptidase X
Q99426 Tubulinspecifieke chaperon B X
Q99497 Proteïne DJ 1 X X
Q99536 Synaptische vesikel membraan eiwit X X X
Q99714 3 hydroxyacyl CoA dehydrogenase type 2 X
Q99715 Collageen alfa 1 XII ketting X X
Q99798 Aconitaat hydratase mitochondriale precursor X
Q9BQE3 Tubulin alfa 6 keten X
Q9BUF5 Tubuline Bèta 6-keten X X
Q9BUT1 3 hydroxybutyraat dehydrogenase type 2 X
Q9BVA1 Tubuline Bèta 2B keten X X X
Q9BXN1 Asporin X x </ Td> X X
Q9H0W9 Ester hydrolase C11orf54 X
Q9H4B7 Tubuline beta 1 keten X
Q9NRN5 Olfactomedine zoals eiwit 3 precursor X X
Q9NRV9 Heme bindend eiwit 1 X
Q9NSB2 Keratine type II cutikulaire Hb4 X X
Q9NVA2 Septin 11 X
Q9UBR2 Cathepsin Z voorloper X
Q9UBX5 Fibuline 5 X X
Q9UK22 F vak alleen eiwit 2 X
Q9Y277 Spanningsafhankelijk anion selectief kanaal proteïne 3 X
Q9Y281 Cofiline 2 X
Q9Y490 Talin 1 X
Q9Y696 Chloride intracellulaire kanaal eiwit 4 X
Q9Y6C2 EMILIN 1 X X

Tabel 1: Lijst van de eiwitten die zijn geïdentificeerd in het mitrale klepweefsel extract wanneer vier verschillende proteomische benaderingen werden toegepast: tweedimensionale elektroforese (2-DE), tweedimensionale LC-MS E (2D-LC / MSE), LC / MSE en vloeibare fase IEF. De methode waarbij elk eiwit werd geïdentificeerd, is gemeld.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Een kritische stap van dit protocol is het gebruik van vloeibare stikstof om het monster te bevriezen en het grindersysteem te chillen. Het gebruik van vloeibare stikstof voorkomt biologische afbraak en zorgt voor efficiënte poedering, maar vereist specifieke training voor veilige hantering.

In dit protocol is een grindersysteem aanwezig voor het slijpen van monsters, omdat kleine monsters moeilijk te herstellen zijn van standaard mortel en stamper. In dit geval verspreiden kleine monsters als een fijn poeder over het morteloppervlak, waardoor de inzameling moeilijk is. Een ander voordeel is dat de grinder gemotoriseerd is, waardoor een groter aantal monsters op een reproduceerbare manier en zonder extra vermoeidheid verwerkt kan worden. Een beperking op het gebruik van een grinder is dat de grootte van het monster klein moet zijn (100 mg of minder) om de stamper effectief tegen de mortel te drukken. Bovendien moeten de maalkomponenten worden verwarmd tot kamertemperatuur tussen toepassingen voor reiniging g. Bijgevolg is de procedure tijdrovend en, als veel monsters dagelijks worden verwerkt, zijn er veel sets nodig.

Een extra kritische stap is de bereiding van de extractiebuffer. De zoutconcentraties, vooral voor het ureum (8 M) en thioureum (2 M), zijn vrij hoog; Dus het volume zout is bijna de helft van het totale volume van de oplossing. Bovendien is de ontbinding niet gemakkelijk, gelet op het feit dat warmte moet worden vermeden, aangezien bij meer dan 37 ° C ureum kan leiden tot eiwitcarbamylering bij de N termini van eiwitten / peptiden en bij de zijketenaminogroepen van lysine- en arginine-resten 17 . Eenmaal opgelost moet de ureumbuffer worden gefiltreerd met 0,22 μm filters en kan gedurende 4 weken bij -80 ° C worden opgeslagen zonder de extractie-effectiviteit ervan te beïnvloeden, maar het moet worden verwarmd tot meer dan 15 ° C voor gebruik om volledige oplossingen mogelijk te maken .

Wijzigingen en probleemoplossing

In dit protocol wordt eiwitxtractie uitgevoerd met behulp van de beschreven ureumbuffer omdat het een van de meest gebruikte eiwit-extractieoplossingen voor proteomische studies is door zijn compatibiliteit met isoelectrofocusing en de efficiëntie daarvan bij het oplossen van spaarzaam oplosbare eiwitten 18 . Aangetoond dat deze buffer zeer efficiënt oplosbare oplosbare eiwitten kan oplossen, zoals integrale membraaneiwitten 19 of eiwitten die zeer gevoelig zijn voor aggregatie, zoals tubuline 18. Bovendien is deze buffer volledig verenigbaar met de Bradford-analyse om eiwitconcentratie te bepalen en Het kan direct worden gebruikt in 2-DE en vloeibare fase IEF analyses.

Deze buffer is echter niet ideaal voor de oplosbaarheid van alle eiwitten die in een monster aanwezig zijn. Het is mogelijk dat verschillende extractiebuffers eiwitten die niet door dit protocol worden gedetecteerd, kunnen onthullen. Bijvoorbeeld, het is goed knoDat ribosomale en nucleaire eiwitten beter kunnen worden geëxtraheerd met zure extractie of trichloorazijnzuur / aceton precipitatie 20 , terwijl alkalische pH niveaus meer geschikt zijn voor membraaneiwitten 21 , 22 . Daarom kan het gebruik van alternatieve buffers extra stappen vereisen voor het neerslaan van eiwitten om zouten te elimineren die interfereren met 2-DE of vloeibare fase IEF.

Beperkingen van de techniek

Het aantal eiwitten dat door dit protocol wordt geïdentificeerd, is relatief laag, maar het aantal identificaties en de dekking van de proteomische analyse kan verder worden verhoogd door het gebruik van modernere instrumenten, waarvan de massa-nauwkeurigheid en sequentie snelheid in de laatste jaren dramatisch zijn toegenomen. 23. Het is mogelijk om een ​​groot deel van het proteoom te bedekken, zonder enige prefractioneringsstappen, door gebruik te maken van een lang gradiënt voor vloeibare chRomatografie scheidingen gekoppeld aan een MS-instrument met hoge resolutie, die een snelle sequentie snelheid 24 heeft .

Betekenis van de techniek met betrekking tot bestaande / alternatieve methoden

Het vermogen om eiwitten in de hartkleppen van de mens te identificeren en kwantificeren, zoals de mitrale klep, is een belangrijke en uitdagende taak die de mechanismen van fysiologische / pathologische processen in klepziekten zal toelichten. Het definiëren van de veranderingen van het mitralklep proteome zal het begrip van de aard van de biologische processen die bij de ziekte staat van het weefsel geassocieerd zijn, aanzienlijk verhogen.

De huidige kennis over de fysiopathologie van de mitralklep is beperkt en wordt in het algemeen verkregen door middel van de analyse van individuele eiwitten die betrokken zijn bij specifieke processen, zoals extracellulaire matrix remodellering, hemostase, ontsteking of oxidatieve stress 25 9 , 10 .

Het gebrek aan uitgebreide proteomische studies kan worden toegeschreven aan de complexiteit van dit laagcellulaire weefsel dat zeer rijk is aan extracellulaire matrix eiwitten ( dat wil zeggen proteoglycanen, collageen en elastine). Deze eiwitten vormen ongeveer 80% van het totale aantal, waardoor de analyse van eiwitten met een laag gehalte wordt belemmerd 26 .

Zo was het noodzakelijk om een ​​efficiënt extractieprotocol op te stellen om eiwitsolubilisatie te maximaliseren teneinde het proteoom van dit weefsel te beschrijven. Dit protocol was toegestaan ​​voor de extractie van ~ 50 μg eiwit uit 1 mg weefsel. Dit is een relatief lage opbrengst in vergelijking met "zacht" weefsel, zoAls lever (~ 135 μg van 1 mg weefsel), maar het is voldoende om een ​​eiwitanalyse op individuele monsters uit te voeren. Dit is vooral relevant bij het definiëren van de intra-individuele variabiliteit van een fenomeen.

Bovendien heeft deze methode het voordeel dat deze compatibel is met veel analytische toepassingen. De mitrale klep eiwitten opgelost in de voorgestelde extractie buffer kunnen direct worden gebruikt voor immunoblotting en proteomische analyse gebaseerd op tweedimensionale elektroforese en vloeibare fase isoelectroforese 11 , 12 of na afzetting van eiwitten om buffercomponent interferentie te elimineren voor andere analyses, zoals Gelvrije massaspectrometrie 15 .

Met de toepassing van dit extractieprotocol is een vollediger karakterisering van de eiwitcomponenten van het normale mitrale klepweefsel verkregen door de identificatie van veel intracelLulaire eiwitten. Deze eiwitten zijn gelokaliseerd in de cytosol of in organellen, niet alleen in de extracellulaire matrix, en hebben verschillende moleculaire en biologische functies. Andere interessante eiwitten ( dwz CryAB, septin-11, FHL-1 en dermatopontine) werden ook geïdentificeerd. Deze eiwitten hebben onbekende functies in de mitrale klep, maar hun biologische eigenschappen suggereren een mogelijke rol in klepziekten.

Toekomstige toepassingen of aanwijzingen na het masteren van deze techniek

Met dit protocol is het mogelijk om gegevens betreffende eiwituitdrukking te correleren met gegevens over kwantitatieve mRNA-expressie en niet-kwantitatieve immunohistochemische analyses. In werkelijkheid zullen deze benaderingen inderdaad leiden tot een uitgebreider begrip van de moleculaire mechanismen die onderliggende ziekte liggen, van mRNA tot post-translational eiwitmodificatie. Zo kan deze methode van belang zijn voor onderzoekers die zich richten op hartklep-fysiopathologie. VinBondgenoot, dit protocol kan ook toegepast worden op de porcine mitralklep, die een nauwe lijkvorming heeft op de menselijke klep 27 en wordt gebruikt als een experimenteel model voor de evaluatie van de klepfunctie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Het Italiaanse Ministerie van Volksgezondheid steunde deze studie (RC 2013-BIO 15). We bedanken Barbara Micheli voor haar uitstekende technische bijstand.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Saline solution 0.9 % NaCl
Eurocollins A SALF 30874046 Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins
Eurocollins B SALF 30874022 Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins
Wisconsin Bridge life RM/N 4081 Balanced organ's transport medium
Biohazard vertical flow air Burdinola Class A GMP classification
Dewar Flask Thermo Scientific Nalgene 4150-1000
Cryogrinder system OPS diagnostics CG 08-01 Grinder system containing mortars, pestles and screwdriver
Stainless steel forceps
Stainless steel spatula
Disposable sterile scalpel Medisafe MS-10
Stainless steel scissors Autoclavable
Stainless steel picks Autoclavable
Disposable sterile drap Mon&Tex 3.307.08
Sterilizing solution with isopropyl alcohol 70% isopropyl alcohol
Sterilizing solution with hydrogen peroxide 6% hydrogen peroxide
Micropipette, 1 mL, with tips
15 mL centrifuge tubes VWR international 9278
1.7 mL centrifuge tubes VWR international PIER90410
Urea buffer 8 M urea, 2 M thiourea, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol
Urea Sigma aldrich U6504-1KG To be used for Urea buffer
Thiourea Sigma aldrich T8656 To be used for Urea buffer
CHAPS Sigma aldrich C3023-5GR To be used for Urea buffer
Dithiotreitol Sigma aldrich D0632-5G To be used for Urea buffer
Syringe 50 mL PIC To be used to filter Urea buffer
0.22 µm filter Millipore SLGP033RB To be used to filter Urea buffer
PFTE Pestle, 2 mL Kartell 6302 Part of Potter-Elvehjem homogenizer
Borosilicate glass mortar Kartell 6102 Part of Potter-Elvehjem homogenizer
Stirrer VELP scientifica Stirrer DLH To be used for homogenization by Potter-Elvehjem
Bradford Protein assay Bio-Rad laboratories 5000006
Tube rotator Pbi International F205
Liquid nitrogen
Aluminum foil
Ice
Polystyrene box
Dry ice
Centrifuge For centrifugation of 1.7 mL centrifuge tubes at 13,000 x g
Freezer -80°C
Precision balance
Autoclave For sterilization
Cryogenic gloves for liquid nitrogen
Gloves
Professional forced ventilation and natural air convection oven For sterilization
Protease inhibitor cocktail Sigma aldrich P8340-5ML 100X solution
ProteoExtract Protein Precipitation Kit Calbiochem 539180
RapiGest Waters 186001861
Cytoscape www.cytoscape.org version 2.7 Software platform for Gene Ontology analysis
BiNGO http://apps.cytoscape.org/apps/bingo version 3.0.3 Plugin for Gene ontology analysis
AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody Novus Biologicals NBP1-97494 Mouse monoclonal antibody against CryAB
Septin-11 Antibody Novus Biologicals NBP1-83824 Rabbit polyclonal antibody against septin-11
FHL1 Antibody Novus Biologicals NBP-188745 Rabbit polyclonal antibody against FHL-1
Dermatopontin Antibody Novus Biologicals NB110-68135 Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin
Goat Anti mouse IgG HRP Sigma aldrich A4416-0.5ML Secondary antibody for immunoblotting
Goat Anti rabbit IgG HRP Bio-Rad laboratories 170-5046 Secondary antibody for immunoblotting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13, (4), 227-232 (2012).
  2. de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expression levels. Mol Biosyst. 5, (12), 1512-1526 (2009).
  3. Hanash, S. Disease proteomics. Nature. 422, (6928), 226-232 (2003).
  4. Ahram, M., Petricoin, E. F. Proteomics Discovery of Disease Biomarkers. Biomark Insights. 3, 325-333 (2008).
  5. Chandramouli, K., Qian, P. Y. Proteomics: challenges, techniques and possibilities to overcome biological sample complexity. Hum Genomics Proteomics. 2009, (2009).
  6. Singleton, C. Recent advances in bioanalytical sample preparation for LC-MS analysis. Bioanalysis. 4, (9), 1123-1140 (2012).
  7. Williams, T. H., Jew, J. Y. Is the mitral valve passive flap theory overstated? An active valve is hypothesized. Med Hypotheses. 62, (4), 605-611 (2004).
  8. Rabkin, E., et al. Activated interstitial myofibroblasts express catabolic enzymes and mediate matrix remodeling in myxomatous heart valves. Circulation. 104, (21), 2525-2532 (2001).
  9. Martins Cde, O., et al. Distinct mitral valve proteomic profiles in rheumatic heart disease and myxomatous degeneration. Clin Med Insights Cardiol. 8, 79-86 (2014).
  10. Tan, H. T., et al. Unravelling the proteome of degenerative human mitral valves. Proteomics. 15, (17), 2934-2944 (2015).
  11. Banfi, C., et al. Proteome of platelets in patients with coronary artery disease. Exp Hematol. 38, (5), 341-350 (2010).
  12. Banfi, C., et al. Proteomic analysis of human low-density lipoprotein reveals the presence of prenylcysteine lyase, a hydrogen peroxide-generating enzyme. Proteomics. 9, (5), 1344-1352 (2009).
  13. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193, (1), 265-275 (1951).
  14. Banfi, C., et al. Very low density lipoprotein-mediated signal transduction and plasminogen activator inhibitor type 1 in cultured HepG2 cells. Circ Res. 85, (2), 208-217 (1999).
  15. Brioschi, M., et al. Normal human mitral valve proteome: A preliminary investigation by gel-based and gel-free proteomic approaches. Electrophoresis. 37, (20), 2633-2643 (2016).
  16. Brioschi, M., Lento, S., Tremoli, E., Banfi, C. Proteomic analysis of endothelial cell secretome: a means of studying the pleiotropic effects of Hmg-CoA reductase inhibitors. J Proteomics. 78, 346-361 (2013).
  17. Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers. Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).
  18. Rabilloud, T., Adessi, C., Giraudel, A., Lunardi, J. Improvement of the solubilization of proteins in two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis. 18, (3-4), 307-316 (1997).
  19. Santoni, V., Molloy, M., Rabilloud, T. Membrane proteins and proteomics: un amour impossible? Electrophoresis. 21, (6), 1054-1070 (2000).
  20. Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. Extraction, purification and analysis of histones. Nat Protoc. 2, (6), 1445-1457 (2007).
  21. Fujiki, Y., Hubbard, A. L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: application to endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 93, (1), 97-102 (1982).
  22. Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4, (12), 3665-3685 (2004).
  23. Mann, M., Kelleher, N. L. Precision proteomics: the case for high resolution and high mass accuracy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (47), 18132-18138 (2008).
  24. Thakur, S. S., et al. Deep and highly sensitive proteome coverage by LC-MS/MS without prefractionation. Mol Cell Proteomics. 10, (8), M110.003699 (2011).
  25. Loardi, C., et al. Biology of mitral valve prolapse: the harvest is big, but the workers are few. Int J Cardiol. 151, (2), 129-135 (2011).
  26. Schoen, F. J. Evolving concepts of cardiac valve dynamics: the continuum of development, functional structure, pathobiology, and tissue engineering. Circulation. 118, (18), 1864-1880 (2008).
  27. Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart. J Am Assoc Lab Anim Sci. 53, (5), 432-438 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics