Protocole optimisé pour l'extraction de protéines à partir de la soupape mitrale humaine

Biochemistry

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Summary

La composition protéique de la valvule mitrale humaine est encore partiellement inconnue, car son analyse est compliquée par une faible cellularité et donc par une faible biosynthèse des protéines. Ce travail fournit un protocole pour extraire efficacement les protéines pour l'analyse du protéome de la valvule mitrale.

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Banfi, C., Guarino, A., Brioschi, M., Ghilardi, S., Mastrullo, V., Tremoli, E., Polvani, G. Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve. J. Vis. Exp. (124), e55762, doi:10.3791/55762 (2017).

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Abstract

L'analyse du protéome cellulaire peut aider à élucider les mécanismes moléculaires sous-jacents aux maladies dues au développement de technologies qui permettent l'identification et la quantification à grande échelle des protéines présentes dans les systèmes biologiques complexes. Les connaissances acquises à partir d'une approche protéomique peuvent conduire à une Une meilleure compréhension des mécanismes pathogènes sous-jacents aux maladies, permettant d'identifier de nouveaux marqueurs de diagnostic et de pronostic et, espérons-le, des cibles thérapeutiques. Cependant, la valvule mitrale cardiaque représente un échantillon très difficile pour l'analyse protéomique en raison de la faible cellularité dans le protéoglycane et la matrice extracellulaire enrichie en collagène. Cela rend difficile l'extraction de protéines pour une analyse protéomique globale. Ce travail décrit un protocole qui est compatible avec l'analyse subséquente des protéines, telles que la protéomique quantitative et l'immunoblot. Cela peut permettre la corrélation des données concernantG expression de protéines avec des données sur l'expression quantitative de l'ARNm et l'analyse immunohistochimique non quantitative. En effet, ces approches, lorsqu'elles sont réalisées ensemble, conduiront à une compréhension plus complète des mécanismes moléculaires sous-jacents aux maladies, de l'ARNm à la modification de la protéine post-traductionnelle. Ainsi, cette méthode peut être pertinente pour les chercheurs intéressés par l'étude de la physiopathologie valvulaire cardiaque.

Introduction

Des preuves récentes ont modifié la compréhension des rôles des nombreux mécanismes de régulation qui se produisent après la synthèse de l'ARNm. En effet, les processus translationnels, post-transcriptionnels et protéolytiques peuvent réguler l'abondance et la fonction des protéines. Le dogme - qui indique que les concentrations d'ARNm sont des proxies de celles des protéines correspondantes, en supposant que les niveaux de transcription sont le principal déterminant de l'abondance des protéines - ont été partiellement révisés. En effet, les niveaux de transcription ne prédisent partiellement que l'abondance des protéines, ce qui suggère que les événements post-transcriptionnels Se produisent pour réguler les protéines dans les cellules 1 , 2 .

En outre, les protéines déterminent finalement la fonction de la cellule et dictent donc son phénotype, qui peut subir des changements dynamiques en réponse aux facteurs autocrins, paracrins et endocriniens; Médiateurs transmis par le sang; température; traitement médical; Et la maladie se développeMent. Ainsi, une analyse d'expression axée sur le niveau de protéine est utile pour caractériser le protéome et pour démêler les changements critiques qui lui apparaissent dans le cadre de la pathogenèse de la maladie 3 .

Par conséquent, les opportunités que la protéomique présente pour clarifier la santé et les maladies sont formidables, malgré les défis technologiques existants. Les domaines de recherche particulièrement prometteurs auxquels la protéomique peut contribuer: l'identification de l'expression protéique altérée à n'importe quel niveau ( c.-à-d. Cellules entières ou tissus, compartiments subcellulaires et fluides biologiques); L'identification, la vérification et la validation de nouveaux biomarqueurs utiles pour le diagnostic et le pronostic de la maladie; Et, espérons-le, l'identification de nouvelles cibles protéiques qui peuvent être utilisées à des fins thérapeutiques, ainsi que pour l'évaluation de l'efficacité et de la toxicité du médicament 4 .

Capture de la complexité deLe protéome représente un défi technologique. Les outils protéomiques actuels offrent l'opportunité d'effectuer une analyse à grande échelle et à haut débit pour l'identification, la quantification et la validation des niveaux de protéines altérés. En outre, l'introduction de techniques de fractionnement et d'enrichissement, visant à éviter les interférences causées par les protéines les plus abondantes, a également amélioré l'identification des protéines en incluant les protéines les moins abondantes. Enfin, la protéomique a été complétée par l'analyse des modifications post-traductionnelles, qui apparaissent progressivement comme des modulateurs importants de la fonction protéique.

Cependant, la préparation des échantillons et la récupération des protéines dans les échantillons biologiques en cours d'analyse restent les étapes limitantes du flux de travail protéomique et augmentent le potentiel d'écueils possibles 5 . En effet, dans la plupart des techniques de biologie moléculaire qui doivent être optimisées, les premières étapes sont des tissus homogénéisésLa lyse ionique et cellulaire, en particulier lors de l'analyse de protéines à faible abondance pour lesquelles des méthodes d'amplification n'existent pas. En outre, la nature chimique des protéines peut influencer leur propre récupération. Par exemple, l'analyse des protéines hautement hydrophobes est très difficile car elles se précipitent facilement pendant la focalisation isoélectrique, tandis que les protéines trans-membranaires sont presque insolubles (revues dans la référence 5). En outre, la variabilité de la composition tissulaire crée un obstacle important au développement d'une méthode d'extraction universelle. Enfin, étant donné que la quasi-totalité des spécimens cliniques ont une quantité limitée, il est essentiel de permettre la préparation des protéines avec une récupération maximale et une reproductibilité à partir de quantités minimales d'échantillon 6 .

Ce travail décrit un protocole optimisé pour l'extraction de protéines à partir de la valvule mitrale cardiaque humaine normale, ce qui représente un échantillon très difficile pour l'analyse protéomique. La valvule mitrale normale est une compStructure lex située entre l'oreillette gauche et le ventricule gauche du cœur ( figure 1 ). Il joue un rôle important dans le contrôle du flux sanguin de l'oreillette au ventricule, en évitant le reflux et en assurant le bon niveau d'apport en oxygène à l'ensemble du corps, en maintenant un débit cardiaque adéquat. Cependant, il est souvent considéré comme un tissu «inactif», avec une faible cellularité et peu de composants, principalement dans la matrice extracellulaire. C'est parce que, dans des conditions normales, les cellules interstitielles valvulaires résidentes (VIC) présentent un phénotype quiescent avec un taux de biosynthèse faible en protéines 7 .

Cependant, il a été démontré que, dans un état pathologique, le nombre de VIC dans le spongiosa augmente et que leur synthèse protéique est activée, ainsi que d'autres changements fonctionnels et phénotypiques 8 . Par conséquent, il n'est pas surprenant que les données minimales disponibles dansLa littérature se concentre sur l'analyse des valves mitrales pathologiques 9 , 10 , dans lesquelles le nombre accru de VIC activés pourrait expliquer le nombre relativement élevé de protéines identifiées.

En conclusion, le présent protocole peut servir à développer la compréhension des mécanismes pathogènes responsables des maladies de la valvule mitrale par l'étude des composants des protéines valvulaires mitrales. En effet, une meilleure compréhension des processus pathologiques sous-jacents pourrait aider à améliorer la gestion clinique des maladies des valvules, dont les indications actuelles d'intervention sont principalement fondées sur des considérations hémodynamiques.

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Protocol

Dans ce protocole, les cœurs humains sont recueillis lors d'une explication multiorganique (temps d'ischémie froide de 4-12 h, moyen 6 ± 2 h) provenant de donneurs multi-organes exclus de la transplantation d'organe pour des raisons techniques ou fonctionnelles, malgré des paramètres échocardiographiques normaux. Ils sont envoyés à la Banque de tissus cardiovasculaires de Milan, au Centre cardiologique Monzino (Milan, Italie) pour la banque des valves aortiques et pulmonaires. Les tracts postérieurs mitral ne sont pas utilisés à des fins cliniques, de sorte qu'ils sont recueillis lors de l'isolement valvulaire aortique et pulmonaire après obtention du consentement éclairé des proches des donneurs. Le tissu pour la transplantation et la recherche ne sont recueillis qu'après le consentement des parents; Sur la fiche de consentement, ils autorisent (ou non) l'utilisation du tissu cardiaque pour la recherche uniquement si elle n'est pas adaptée à une utilisation clinique humaine ( c'est-à-dire des problèmes microbiologiques, fonctionnels et sérologiques), conformément aux directives du comité d'éthique deMonzino Cardiologic Center.

1. Préparation de la soupape mitrale

  1. Récolter la valvule mitrale humaine dès que possible après l'explication de l'organe (temps d'ischémie froide de 4-12 h).
  2. Dans une pièce propre, retirez le cœur du sac de transport contenant une solution froide (4 ° C) (solution saline ou milieu équilibré, Eurocollins ou Wisconsin). Mettez-le dans un seau et placez-le dans un coffret de sécurité biologique (flux d'air vertical à risque biologique, classe A, classification des bonnes pratiques de fabrication (BPF)) pour procéder à la préparation de la soupape.
  3. Placez le cœur sur un drap stérile jetable dans le coffret. À l'aide d'un scalpel jetable stérile, couper complètement le cœur, perpendiculairement à son axe principal, au niveau des ventricules gauche et droit, à environ 4 cm de l'apex.
  4. Déplacez l'aorte ascendante et l'artère pulmonaire pour afficher le toit de l'oreille gauche.
  5. Avec des pince et des piquets stériles autoclavables, couper autour de l'oreillette gauche sur leToit auriculaire gauche, rendant la valvule mitrale visible et permettant d'identifier la grande feuillette mitrale (antérieure) et la petite notice mitrale (postérieure).
    NOTE: Les commissures antéro-latérales et postérieures du médium définissent la bordure de la notice antérieure et la zone postérieure.
  6. En utilisant des ciseaux stériles autoclavables et des pinces non traumatiques, disséquer l'oreillette gauche et l'épaisseur de la paroi du ventricule autour de la circonférence de toute la valvule mitrale .
  7. Identifiez la continuité de la valve mitro-aortique.
    NOTE: Le ventricule gauche contient toute la valvule mitrale et les cordes.
  8. Séparez la valvule de la valvule mitrale antérieure de la valvule de la valvule mitrale postérieure, en coupant la notice postérieure le long de l'insertion avec le ventricule (commissure).
  9. Laver la notice postérieure dans la solution saline. Couper la notice en petits morceaux (<1 cm 2 ) et les enrouler individuellement dans du papier d'aluminium. Branchez-les à l'aide d'azote liquide.
    Attention: Suivez les procédures de sécurité organisationnelles lors de l'utilisation d'azote liquide.
    1. Sanitier la table de l'armoire avec une solution d'alcool isopropylique à 70% et une solution à 6% de peroxyde d'hydrogène à la fin de la procédure.

2. Extraction de protéines

  1. Utilisez une pince pour retirer l'échantillon stocké dans de l'azote liquide et placez-le immédiatement sur de la glace carbonique tout en étant encore enroulé dans la feuille d'aluminium. Ne laissez pas l'échantillon décongeler pendant les transferts.
  2. Avant le broyage, refroidissez le mortier de porcelaine / zirconium et les pilons d'un système de broyage ( par exemple, CryoGrinder), ainsi que l'échantillon, en les mettant dans un flacon Dewar contenant de l'azote liquide (~ 500 mL).
    Attention: Suivez les procédures de sécurité organisationnelles lors de l'utilisation d'azote liquide.
  3. Mettez le mortier et les pilons dans une boîte en polystyrène contenant de la glace carbonique. Retirez l'échantillon du papier d'aluminium et placez-le dans le mortier.
  4. Grind tIl échantillonne avec le gros pilon contre le mortier 15 à 20 fois, en utilisant le tournevis pour faire tourner le pilon. Mélanger l'échantillon avec la pointe d'une spatule pré-refroidie pendant le processus de broyage.
    1. Répétez avec le petit pilon.
  5. Transférer l'échantillon de terre à un tube préalablement pesé ( p. Ex., Tube de centrifugation de 15 ml) en inversant le tube, en le plaçant sur le mortier et en les inverse pour déplacer l'échantillon vers le tube. Utilisez une spatule pré-refroidie pour récupérer tout le matériau du mortier.
    1. Gardez le tube avec l'échantillon sur de la glace sèche pour éviter la décongélation de l'échantillon pendant le transfert.
  6. Calculer le poids net de l'échantillon.
  7. Nettoyez le mortier et les pilons après chaque échantillon et décontaminez-les en autoclavant ou en les chauffant à 200 ° C pendant 2 h.
  8. Transférer l'échantillon en poudre du tube centrifuge au tube de verre d'un homogénéisateur par inversion.
  9. Ajouter un buffe d'urée filtréR (8 M d'urée, 2 M de thiourée, 4% p / v CHAPS, 20 mM de Tris et 55 mM de dithiotréitol) au tube de verre, 200 μL de tampon d'urée pour chaque 10 mg de tissu en poudre.
    REMARQUE: L'échantillon de poudre résiduelle laissé dans le tube de centrifugation peut être récupéré en utilisant une partie du volume calculé de tampon d'urée.
  10. Homogénéiser l'échantillon à l'aide d'un agitateur équipé d'un mortier de verre à base de borosilicate et d'un pilon de polytétrafluoroéthylène (PTFE). Appuyez lentement sur le pilon sur l'échantillon avec un mouvement de torsion (1.500 tr / min) 10 fois.
  11. Récupérer le surnageant et le transférer dans un tube de centrifugation propre de 1,7 ml. Encore extraire l'échantillon restant avec du tampon d'urée frais, en ajoutant la moitié du volume utilisé lors de la première extraction.
  12. Répétez l'étape 2.10.
  13. Récupérer le surnageant et le combiner avec le surnageant à partir de l'étape 2.11. Placez le surnageant combiné sur un rotator de tube pendant 30 min.
  14. Centrifuger le tube pendant 30 min à 13 000 xg et 4 ° C.
  15. Récupérer le surnageant etD mesure la concentration de protéines en utilisant le dosage de protéines de Bradford, selon les instructions du fabricant. Conservez l'échantillon à -80 ° C jusqu'à l'utilisation.

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Representative Results

L'extraction et la dissolution des protéines dans le tampon d'urée sont directement compatibles avec les méthodes protéomiques basées sur l'isoélectro-focalisation (électrophorèse bidimensionnelle (2-DE) 11 et la focalisation isoélectrique en phase liquide (IEF) 12 ) et avec immunoblot après dilution dans le tampon Laemmli 13 Contenant un cocktail inhibiteur de protéase 14 .

Pour les méthodes à base de spectrométrie de masse sans gel ( c.-à-d., La chromatographie liquide couplée à une analyse de spectrométrie de masse indépendante de la donnée (LC / MS E ) et LC / MS E bidimensionnelle (2D-LC / MS E )) 15 , les échantillons sont extraits Dans le tampon d'urée décrit, doivent être encore traités pour éliminer l'urée et la thiourée, ce qui pourrait interférer avec la digestion ultérieure des protéines et la séparation par chromatographie liquide. ThiL'étape de dessalage de S peut être réalisée en utilisant les kits commerciaux de précipitation des protéines, en suivant les instructions du fabricant pour précipiter les protéines. L'échantillon peut ensuite être dissous dans du NH 4 HCO 3 25 mM contenant 0,1% de détergents clivables pour la digestion des protéines 16 . La précipitation des protéines peut éliminer les composants tampons, ce qui affecte de manière minimale la teneur en protéines (récupération de protéines:> 85%), ce qui rend l'échantillon approprié pour chaque type d'analyse.

L'application de ce protocole pour l'extraction de protéines à partir de valves mitrales humaines a permis d'identifier un total de 422 protéines, combinant quatre approches protéomiques différentes décrites précédemment en détail 11 , 15 . Plus précisément, 169 protéines ont été identifiées par 2-DE, 330 protéines par phase liquide IEF, 96 protéines par LC / MS E et 148 protéinesPar 2D-LC / MS E (tableau 1).

Pour classer les 422 protéines identifiées en termes de localisation subcellulaire, un logiciel a été utilisé pour l'analyse de l'ontologie du gène (GO) ( p. Ex., Cytoscape). Le réseau créé avec le logiciel et son plug-in correspondant a montré que, outre les protéines attendues localisées dans la région extracellulaire (voir la partie supérieure droite de la figure 2 ), la plupart des protéines identifiées par les approches protéomiques proviennent de la région intracellulaire (C. -à-d. Le cytoplasme, les organites, les vésicules et le cytosquelette). Les protéines de surface cellulaire ont également été identifiées ( figure 2 ).

Les résultats ont encore été confirmés dans trois échantillons mitraux indépendants. L'immunoblot a été utilisé pour analyser un groupe de quatre protéines ( c.-à-d. Septin-11, quatre et demi protéines de domaine LIM 1 (FHL-1), derLa matopontin et l'alpha-cristalline B (CryAB)) qui n'ont jamais été identifiées dans la valvule mitrale normale ( figure 3 ).

Figure 1
Figure 1: structure de la valve mitrale. Vue de dessus du coeur humain montrant la valve mitrale humaine fermée ( A ) ou ouverte ( B ). Vue de face du ventricule gauche d'un coeur humain ( C ). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2: Analyse des protéines de valvule mitrale identifiées en terme de distribution cellulaire. Cytoscape et le plugin BiNGO ont été utilisés pour obtaiN la répartition des termes de l'ontologie du gène (GO) à partir des catégories de composants cellulaires. La taille du cercle est proportionnelle au nombre de composants protéiques associés aux termes GO sélectionnés, et l'échelle de couleur pour la valeur p de la surreprésentation est signalée. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

figure 3
Figure 3: Analyse par immunoblot de septin-11, FHL-1, dermatopontine et CryAB dans l'extrait entier de trois valvules valvulaires mitrovales normales. L'immunoblot a été réalisé en utilisant un anticorps monoclonal de souris contre CryAB et des anticorps polyclonaux de lapin contre les anticorps septin-11, FHL-1 et dermatopontin. S'il vous plaîtCliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

<Td> x <Td> <Td> Protéasome subunité beta type 4 précurseur <Td> </ Tr> <Td> Transgelin 2 <Td> <Tr> <Td>
Accession La description 2-DE 2D-LC LC-MS E Phase liquide IEF
A6NMZ7 Colagène alpha VI X
O00151 PDZ et LIM domain protéine 1 X
O00299 Protéine de canal intracellulaire de chlorure 1 X
O00764 Pyridoxal kinase X
O14558 Protéine de choc thermique beta 6 X
O43399 Protéine tumorale D54 X
O43488 Aflatoxine B1 aldéhyde réductase membre 2 X
O43707 Alpha actinine 4 X X
O43866 Anti-antigène CD5 comme précurseur X
O60493 Tri de nexin 3 X
O60701 UDP glycémie 6 déshydrogénase X
O75223 Protéine non caractéristique X
O75368 Le protéine protéinée par l'acide glutamique du domaine SH3 X
O75390 Citrate synthase mitochondrial precursor X
O75489 NADH déshydrogénase ubiquinone protéine de soufre de fer 3 précurseur mitochondrial X X
O75608 Acyl protein thioesterase 1 X
O75828 Carbonyl réductase NADPH 3 X
O75874 Isocitrate déshydrogénase NADP cytoplasmique X
O75955 Flotillin X
O94760 NG NG diméthylarginine diméthylaminohydrolase 1 X
O94788 Retinal déshydrogénase 2 X
O95865 NG NG diméthylarginine diméthylaminohydrolase 2 X X
P00325 Alcool déshydrogénase 1B X X
P00338 L chaîne de lactate déshydrogénase A X
P00352 Retinal déshydrogénase 1 X
P00441 Superoxyde dismutase Cu Zn X X
P00450 Précurseur de la céruloplasmine X X
P00488 Le précurseur de chaîne du facteur de coagulation XIII A X
P00491 Purine nucleoside phosphorylase X
P00492 Hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase X
P00558 Phosphoglycératine kinase 1 X X
P00568 Isoenzyme 1 d'adénylate kinase X
P00734 Prothrombine X X
P00738 Haptoglobine X X X X
P00739 Précurseur de protéines liées à l'haptoglobine X
P00751 Facteur de complément B X X X
P00915 Anhydrase carbonique 1 X
P00918 Anhydrase carbonique 2 X
P01008 Précurseur antithrombine III X X X
P01009 Alpha 1 antitrypsine X X X X
P01011 Alpha 1 antichymotrypsine X X X X
P01019 Précurseur d'angiotensinogène X X
P01023 Alpha 2 macroglobuline X X
P01024 Complément C3 X X X X
P01033 Le précurseur de l'inhibiteur 1 de la métalloprotéinase X
P01042 Kininogène 1 précurseur X
P01593 Ig kappa chain VI region AG X
P01598 Ig kappa chain VI region EU X
P01600 Ig kappa chaîne VI région Hau X X
P01611 Ig kappa chain VI region Wes X
P01620 Ig kappa chaîne V III région SIE X
P01625 Ig kappa chain V IV region Len X
P01766 Ig de la chaîne lourde Ig III BRO X X
P01781 Ig de la chaîne lourde Ig III GAL X
P01834 Région de la chaîne C kappa d'Ig X X X X
P01842 Régions de la chaîne C de Ig lambda X X X
P01857 Ig Gamma 1 chaîne C région X X X X
P01859 Région Ig de gamma 2 chaîne C X X X X
P01860 Région Ig de gamma 3 chaîne C X X X
P01861 Ig gamma 4 chaîne C région X X X
P01871 Ig mu chaîne C région X X X
P01876 Ig alpha 1 chaîne C région X X X X
P01877 Ig alpha 2 chaîne C région X
P02144 Myoglobine X X
P02452 Chaîne de collagène alpha 1 I X X X X
P02511 Chaîne alpha-cristalline B X
P02545 Lamin AC 70 kDa lamin X X X X
P02647 Apolipoprotéine AI X X X X
P02649 Apolipoprotéine E X X X X
P02671 Chaîne alpha fibrinogène X X X X
P02675 Chaîne bêta fibrinogène X X X X
P02679 Chaîne gamma fibrinogène X X X X
P02689 Protéine Myelin P2 X
P02735 Amyloïde au sérum Un précurseur de protéines X
P02741 Précurseur de protéines réactives C X
P02743 Composant P amyloïde au sérum X X X X
P02746 Sous-unité B de sous-composant C1q Complément X X
P02747 Complément C1q sous-composant sous-unité C précurseur X
P02748 Composante Complément C9 X X X
P02749 Beta 2 glycoprotéine 1 X X X X
P02750 Le précurseur de glycoprotéines alpha 2 riches en leucine X
P02751 Fibronectine X X
P02760 Précurseur de protéine AMBP X X X X
P02763 Alpha 1 glycoprotéine acide 1 X X X
P02765 Alpha 2 HS précurseur de glycoprotéines X
P02766 Précurseur de transthyretin X X X
P02768 Albumine de sérum X X X X
P02774 Précurseur de protéines liant la vitamine D X
P02787 Serotransferrine X X X X
P02788 Précurseur de la lactotransferrine X
P02790 Hemopexine X X X X
P02792 Chaîne légère de ferritine X
P04004 Vitronectine X X X X
P04075 Fructose bisphosphate aldolase A X
P04083 Annexe A1 X X X X
P04179 Super-oxide dismutase Mn précurseur mitochondrial X
P04196 Précurseur de glycoprotéines riches en histidine X
P04217 Alpha 1B précurseur de glycoprotéines X X
P04350 Tubuline bêta 4 chaîne X
P04406 Glyceraldéhyde 3 phosphate déshydrogénase X X X X
P04792 Protéine de choc thermique beta 1 X X X X
P05091 Le précurseur mitochondrial d'Aldehyde Deshydrogenase X X
Le précurseur d'inhibiteur de la protéase C1 de plasma X
P05156 Précurseur de complément de facteur I X
P05413 Coeur de protéine liant les acides gras X
P05452 TNT précurseur de Tetranectine X X
P05787 Cytoskeletal de la kératine de type II 8 X
P06396 Gelsolin X X X X
P06576 ATP synthase sous-unité beta mitochondrial precursor X X
P06732 Type de créatine kinase M X X
P06733 Alpha enolase X X X X
P06753 Chaîne alpha 3 de Tropomyosine X X
P07108 Protéine de liaison Acyl CoA X
P07195 L chaîne de lactase déshydrogénase B X X X
P07196 Polypeptide léger de neurofilament X
P07197 Polypeptide moyen de neurofilament X X
P07237 Protéines disulfure isomérase précurseur X X
P07339 Le précurseur de la cathepsine D X X
P07355 Annexe A2 X X X X
P07360 Complément composant C8 précurseur de chaîne gamma X
P07437 Chaîne bêta de tubuline X X X X
P07585 Decorin X X X X
P07737 Profilin 1 X
P07858 Précurseur de la cathepsine B X
P07900 Protéine de choc thermique HSP 90 alpha X X
P07951 Chaîne bêta de Tropomyosine X
P07954 Le précurseur mitochondrial de l'hydratase de fumarate X
P07996 Thrombospondin 1 X X X
P08107 Choc thermique 70 kDa protéine 1A 1B X X X X
P08123 Chaîne de collagène alpha 2 I X X X X
P08133 Annexe A6 X X
P08238 Protéine de choc thermique HSP 90 beta X X
P08253 Précurseur de collagénase de type 72 kDa type IV X
P08294 Superoxide dismutase extracellulaire Cu Zn précUrsor X X X
P08590 Polypeptide léger à la myosine 3 X X
P08603 Facteur de complément H X X X X
P08670 Vimentin X X X X
P08729 Kertoste type II cytosquelette 7 X
P08758 Annexe A5 X X X X
P09211 Glutathione S transferase P X X X
P09382 Galectine 1 X X X
P09417 Dihydropteridine réductase X
P09493 Tropomyosine 1 chaîne alpha X X
P09525 Annexin A4 X X
P09651 Ribonucléoprotéine nucléaire A1 hyperthermique X
P09871 Complément C1s sous-composant précurseur X
P09936 L'isozyme L1 de l'hydrolase terminal carboxyle d'ubiquitine X
P09972 Fructose bisphosphate aldolase C X
P0C0L4 Complément C4 Un précurseur X
P0CG05 IgLambda 2 chaînes C X
P0CG38 POTE membre de la famille de domaine Ankyrin I X
P10515 Composé d'acétyltransférase de résidu de dihydrolipoyllysine du complexe pyruvate déshydrogénase X
P10768 S formylglutathione hydrolase X
P10809 Protéine mitochondrial de protéines de choc thermique de 60 kDa X
P10909 Clusterin X X X X
P10915 Hyaluronan et proteoglycan link protein 1 precursor X X
P11021 78 kDa gProtéine régulée par lucose X X X
P11047 Sous-unité Laminin gamma 1 précurseur X
P11142 La protéine 71 kDa cognée par choc thermique X X X X
P11177 Le précurseur mitochondrial de la sous-unité des composants de la pyruvate déshydrogénase E1 X
P11217 Forme du muscle glycogène phosphorylase X
P11310 Précédente mitochondrial d'acyl CoA déshydrogénase spécifique de chaîne moyenne X
P11413 Glucose 6 phosphate 1 déshydrogénase X
P11766 Chaîne de chi de la classe 3 de l'alcool déshydrogénase X
P12036 Polypeptide lourd de neurofilament X
P12109 Collagène alpha 1 chaîne VI X X X X
P12110 Chaîne de collagène alpha 2 VI X X X X
P12111 Chaîne de collagène alpha 3 VI X X X
P12277 Type de créatine kinase B X
P12429 Annexe A3 X X
P12814 Alpha actinine 1 X X
P12829 Polypeptide léger à la myosine 4 X
P12882 Myosine 1 X
P12883 Myosine 7 X X
P12955 Xaa Pro dipeptidase X
P13489 Inhibiteur de ribonucléase X
P13533 Myosine 6 X X
P13611 Précurseur de protéines de base de Versican X X
P13639 Facteur d'allongement 2 X
P13716 Delta aminolevulinic acid déshydratase X
P13796 Plastin 2 X
P13804 Le précurseur mitochondrial de la sous-unité alpha de flavoprotéine de transfert d'électrons X
P13929 Beta enolase X X
P14136 Astrocyte de protéines acides fibrillaires gliaires X
P14314 Le précurseur bêta de la sous-unité Glucosidase 2 X
P14550 Alcool déshydrogénase NADP X
P14618 Les isozymes de pyruvate kinase M1 M2 X X X
P14625 </ Td> Précurseur d'endoplasmine X X
P15121 Aldose réductase X
P15259 Phosphoglycerate mutase 2 X
P16152 Carbonyl réductase NADPH 1 X
P17066 Choc thermique 70 kDa protéine 6 X X X
P17174 Aspartate aminotransférase cytoplasmique X
P17540 Le précurseur mitochondrial sarcomérique de la créatine kinase X
P17661 Desmin X X X X
P17980 Sous-unité de régulation de protéase 26S 6A X
P17987 Sous-unité de protéine 1 complexe complexe alpha X
P18206 Vinculin X X
P18428 Le précurseur de protéines liant les lipopolysaccharides X
P18669 Phosphoglycérate mutase 1 X
P19105 Chaîne légère de régulation de la myosine 2 X X
P19623 Spermidine synthase X
P19652 Alpha 1 précurseur de glycoprotéine acide 2 X X
P19823 Inter-alpha trypsine inhibiteur chaîne lourde H2 X
P19827 Inter-alpha trypsine inhibiteur chaîne lourde H1 X X
P20073 Annexin A7 X
P20618 Protéasome subunité beta type 1 précurseur X
P20774 Mimecan X X X X
P21266 Glutathione S transferase Mu 3 X
P21333 Filamine A X X
P21796 Protéine de canal sélectif anion dépendant de la tension1 X
P21810 Biglycan X X X X
P21980 Proteine ​​glutamine gamma glutamyltransferase 2 X X
P22105 Tenascin X X X
P22314 L'enzyme activant l'ubiquitine E1 X
P22352 Le précurseur de glutathion peroxydase 3 X X
P22626 Ribonucléoprotéines nucléaires A2 A2 X
P22695 Le précurseur mitochondrial de la protéine core 2 de la protéine nucléaire 2 de l'ubiquinol cytochrome c réductase X
P23141 Précurseur de la carboxylésterase 1 du foie X
P23142 Fibulin 1 X X X X
P23284 Peptidyl prolyl cis trans isomérase B précurseur X
P23381 Tryptophanyl tRNA synthetase cytoplasmique X
P23526 Adénosylhomocysteinase X X
P23528 Cofilin 1 X
P24752 Acetyl CoA acétyltransférase mitochondrial precursor X
P25311 Zinc alpha 2 glycoproteiN précurseur X
P25705 ATP synthase sous-unité alpha mitochondrial X
P25788 Substance protéasome alpha type 3 X X
P25789 Substance protéasome alpha type 4 X
P26447 Protéine S100 A4 X
P27348 14 3 3 protéine theta X X
P27797 Précurseur de calréticuline X
P28066 Sous-unité Proteasome alpha type 5 X
P28070 X X
P28072 Protéasome subunité bêta type 6 précurseur X
P28074 Protéasome subunité bêta type 5 précurseur X
P28331 NADH ubiquinone oxydoréductase 75 kDa sous-unité précurseur mitochondrial X
P28838 Cytosol aminopeptidase X
P29218 Inositol monophosphatase X
P29401 Transketolase X
P29692 Elta du facteur 1 delta X
P29966 Substrat de C kinase riche en alanine myristoylée X
P30040 Protéine de réticulum endoplasmique Protéine ERp29 X
P30041 Peroxiredoxine 6 X X
P30043 Flavine réductase X
P30044 Peroxiredoxine 5 précurseur mitochondrial X
P30085 UMP CMP kinase X
P30086 Protéine de liaison à la phosphatidyléthanolamine 1 X
P30101 ProteiN précurseur de disulfure isomérase A3 X X X
P30613 Isozymes de pyruvate kinase RL X
P30740 Inhibiteur d'élastase leucocytaire X
P31025 Lipocalin 1 précurseur X
P31937 3 précurseur mitochondrial de l'hydroxyisobutyrate déshydrogénase X
P31942 Honeogène nucléaire ribonucléoprotéine H3 X
P31943 La ribonucléoprotéine nucléaire hétérogène H X
P31946 14 3 3 protéine alpha bêta X X
P31948 Phosphoprotéine induite par le stress 1 X
P31949 Protéines S100 A11 X
P32119 Peroxiredoxine 2 X X
P34931 Choc thermique 70 kDa protéine 1 comme X X
P34932 Choc thermique 70 kDa protéine 4 X
P35232 Prohibition X
P35237 Serpin B6 X
P35443 Thrombospondin 4 X
P35555 Fibrilline 1 X X
P35579 Myosine 9 X X X
P35580 Myosine 10 X X
P35609 Alpha actinine 2 X
P35625 Inhibiteur de la métalloprotéinase 3 X X
P35998 Sous-unité 7S de protection de la protéase X
P36871 Phosphoglucomutase 1 X X
P36955 Facteur dérivé de l'épithélium pigmenté X X
P37802 X X
P37837 Transaldolase X
P38117 Sous-unité de flavoprotéines de transfert d'électrons bêta X
P38646 Stress 70 protéines mitochondrial précurseur X X
P39687 Fiduoproteine ​​nucléaire riche en leucine acidifiée 32 membre de la famille A X
P40121 Protéine de capsule de macropore X
P40925 Malate déshydrogénase cytoplasmique X
P40926 Précurseur mitochondrial malate déshydrogénase X
P41219 Périphérique X
P42330 Aldo keto réductase famille 1 membre C3 X
P45880 La protéine de canal sélectif anion dépendante de la tension 2 X
P47755 Sous-unité de protéines de capsulation de l'actine alpha 2 X X
P47756 Sous-unité de protéines de protection de l'actine beta X X
P47985 Ubiquinol cytochrome c réductase soufre de fer subunité mitochondrial précurseur X
P48047 ATP synthase O subunit mitochondrial precursor X
P48637 Glutathion synthetase X
P48741 Choc thermique 70 kDa protéine 7 X X
P49189 4 triméthylaminobutyraldéhyde déshydrogénase X
P49368 T complexe sous-unité 1 gamma X
P49747 Protéine matricielle oligomérique du cartilage X X X X
P49748 Précurateur mitochondrial spécifique d'acyl CoA déshydrogénase à chaîne très longue X
P50395 Rab inhibiteur de dissociation du PIB bêta X X </ Td>
P50454 Précurseur de Serpin H1 X
P50995 Annexe A11 X
P51452 Spécificité double protéines phosphatase 3 X
P51884 Lumican X X X X
P51888 Prolargin précurseur X X X X
P52565 Rho Inhibiteur de dissociation du PIB 1 X
P52566 Rho Inhibiteur de dissociation du PIB 2 X
P54652 Protéine de 70 kDa associée aux chocs thermiques X X X X
P55072 Réticulum endoplasmique transitoire ATPase X
P55083 Le précurseur associé à la glycoprotéine 4 associé à la microfibril X X
P57053 Histone H2B type F X
P60174 Triosephosphate isomérase X X X
P60660 Polypeptide léger à la myosine 6 X X
P60709 Actine cytoplasmique 1 X X X X
P60981 Destrin X
P61086 L'enzyme de conjugaison d'ubiquitine E2 25 kDa X
P61088 L'enzyme de conjugaison d'ubiquitine E2 X
P61224 Protéine Ras protégée Rap 1b précurseur X
P61978 La ribonucléoprotéine nucléaire nucléaire Heterogène X X
P61981 14 3 3 gamme de protéines X X X
P62258 14 3 3 protéine epsilon 14 3 3E X
P62491 Protéine apparentée à Ras X
P62714 Serine threonine protein phosphatase 2A sous-unité catalytique isoforme bêta X
P62736 Actine aortic smooth muscle X X X
P62805 Histone H4 X
P62826 GTP reliant la protéine nucléaire Ran X
P62873 Substance GIGSGT de liaison de nucléotide de Guanine beta 1 X
P62879 Substance GIGSGT de liaison de nucléotide de guanine bêta 2 X
P62937 Peptidyl prolyl cis trans isomérase A X X
P62987 Proteine ​​ribosomale ubiquitine 60S L40 X
P63104 14 3 3 proTein zeta delta X X X X
P63241 Facteur d'initiation de la traduction eukaryote 5A 1 X
P63244 Sous-unité de protéine de liaison de nucléotide de guanine bêta 2 comme 1 X
P63267 Actine gamma entérique muscle lisse X X
P67936 Chaîne alpha de Tropomyosine 4 X
P68032 Acte alpha muscle cardiaque 1 X
P68104 Facteur d'élongation 1 alpha 1 X X X
P68133 Actine alpha squelettique
P68363 Chaîne de tubuline alpha 1B X X X
P68371 Chaîne de tubuline bêta 2C X X X
P68402 Facteur d'activation des plaquettes sous-unité IB de l'acétylhydrolase IB X
P68871 Sous-unité de l'hémoglobine bêta X X X
P69905 Sous-unité d'hémoglobine alpha X X
P78371 Sous-unité de protéine 1 complexe T bêta X
P78417 Glutathione transferase omega 1 X X
P80748 Chaîne Ig lambda VIII Région LOI X
P98095 Fibulin 2 X X
Q01082 Cerveau de chaîne beta de Spectrin 1 X
Q01449 Chaîne légère de régulation de la myosine 2 isoforme auriculaire X
Q01518 Protéine 1 associée à l'adénylyl cyclase X
Q01995 Transgeline Protéine de muscle lisse 22 alpha X
Q03252 Lamin B2 X X
Q03591 Facteur de compléments H précurseur de protéine 1 apparenté X
Q04917 14 3 3 protéine eta X X
Q06323 Activateur protéasome complexe sous-unité 1 X
Q06828 Fibromoduline X X X X
Q06830 Peroxiredoxine 1 X X
Q07507 Dermatopontin X X X X
Q07960 Rho GTPase activant la protéine 1 X
Q08257 Quinone oxydoréductase X
Q08431 Lactadherin X X
Q12765 SEcernin 1 X
Q13011 Delta 3 5 Delta 2 4 dienoyl CoA isomérase mitochondrial précurseur X X
Q13228 Protéine de liaison au sélénium 1 X X
Q13404 L'enzyme de conjugaison de ubiquitine E2 variante 1 X
Q13409 Chaîne intermédiaire 2 de la dyneine cytoplasmique X
Q13509 Tubuline bêta 3 chaîne X X X
Q13642 Quatre protéines 1 de domaine LIM et demi X
Q13765 Sous-unité complexe alpha associée aux polypeptides naissants X
Q13885 N Tubulin chaîne beta 2A X X
Q14194 Protéine liée à la dihydropyrimidinase 1 X
Q14195 Protéine 3 protégée par la dihydropyrimidinase X X X X
Q14624 Inter-alpha trypsine inhibiteur de chaîne lourde H4 précurseur X
Q14697 Neutral alpha glucosidase AB precursor X
Q14764 Protéine de la voûte principale X
Q14767 Protéine de liaison bêta du facteur de croissance transformant latente 2 X X
Q14894 Protéine de fixation de l'hormone thyroïdienne réglementée par NADP X
Q15063 Précurseur Periostin X X X X
Q15084 Protéines disulfure isomérase A6 précurseur X
Q15113 Procédure de Procollagen C endopeptidase enhancer 1 précurseur X
Q15181 Pyrophosphatase inorganique X
Q15365 Poly RC binding protein 1 X
Q15366 Poly RC binding protein 2 X
Q15582 Transformer la protéine induite par le facteur de croissance beta X X X
Q15819 L'enzyme de conjugaison d'ubiquitine E2 variante 2 X
Q16352 Internexin alpha X
Q16473 Ténascine XA putative X
Q16555 Protéine 2 protégée par la dihydropyrimidinase X X X
Q16698 2 4 précurseur mitochondrial de dienoyl CoA réductase X
Q16891 Membrane interne mitochondriale X
Q562R1 La bêta-actine, comme la protéine 2 X
Q6S8J3 POTE ankyrin domaine membre de la famille E X
Q6UWY5 Olfactomedine comme précurseur de protéine 1 X X
Q71U36 Chaîne de tubuline alpha 1A X X X
Q7Z7G0 Target of Nesh SH3 precursor X X X
Q8WUM4 Mortule cellulaire programmée 6 protéine interagissante X
Q8WWX9 Thioredoxine comme précurseur de sélénoprotéine M X
Q92597 Protéines NDRG1 X
Q92945 L'agent amont en amont qui lient la protéine 2 X
Q96CN7 Domaine de l'isochorismatase contenant la protéine 1 X
Q96CX2 BTB POZ domaine contenant des protéines X
Q96KK5 Histone H2A type 1 H X X
Q96KP4 Dipeptidase non spécifique cytosolique X
Q99426 Tubacul spécifique chaperon B X
Q99497 Protein DJ 1 X X
Q99536 Synaptic vesicle membrane protein X X X
Q99714 3 hydroxyacyl CoA déshydrogénase de type 2 X
Q99715 Collagène alpha 1 chaîne XII X X
Q99798 Aconitate hydratase mitochondrial precursor X
Q9BQE3 Tubuline chaîne alpha 6 X
Q9BUF5 Chaîne bêta 6 de tubuline X X
Q9BUT1 3 hydroxybutyrate déshydrogénase de type 2 X
Q9BVA1 Tubuline bêta 2B chaîne X X X
Q9BXN1 Asporin X X </ Td> X X
Q9H0W9 Ester hydrolase C11orf54 X
Q9H4B7 Tubuline bêta 1 chaîne X
Q9NRN5 Olfactomedin comme précurseur de protéine 3 X X
Q9NRV9 Heme binding protein 1 X
Q9NSB2 Queratin type II cuticulaire Hb4 X X
Q9NVA2 Septin 11 X
Q9UBR2 Précurseur de la Cathepsine Z X
Q9UBX5 Fibulin 5 X X
Q9UK22 F case seulement protéine 2 X
Q9y277 La protéine de canal sélectif anion dépendant de la tension 3 X
Q9Y281 Cofilin 2 X
Q9Y490 Talin 1 X
Q9Y696 Protéine de canal intracellulaire de chlorure 4 X
Q9Y6C2 EMILIN 1 X X

Tableau 1: Liste des protéines identifiées dans l'extrait de tissu de valvule mitrale lorsque quatre approches protéomiques différentes ont été appliquées: électrophorèse bidimensionnelle (2-DE), LC-MS E bidimensionnel (2D-LC / MS E ), LC / MS E et IEF en phase liquide. La méthode par laquelle chaque protéine a été identifiée est signalée.

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Discussion

Une étape cruciale de ce protocole est l'utilisation d'azote liquide pour congeler l'échantillon et refroidir le système de broyage. L'utilisation d'azote liquide empêche la dégradation biologique et permet une pulvérisation efficace, mais elle nécessite une formation spécifique pour une manipulation sûre.

Dans ce protocole, il existe un système de broyage pour le meulage des échantillons car les petits échantillons sont difficiles à récupérer à partir du mortier et des pilons standard. Dans ce cas, de petits échantillons se répandent sous forme de poudre fine sur la surface du mortier, rendant la collecte difficile. Un autre avantage est que le broyeur est motorisé, ce qui permet de traiter un plus grand nombre d'échantillons de manière reproductible et sans fatigue supplémentaire. Une limitation à l'utilisation d'un broyeur est que la taille de l'échantillon qui doit être faible (100 mg ou moins) pour que le pilon soit pressé efficacement contre le mortier. En outre, les composants du broyeur doivent être réchauffés à température ambiante entre les utilisations pour le nettoyage g. Par conséquent, la procédure prend beaucoup de temps et, si de nombreux échantillons sont traités quotidiennement, plusieurs ensembles sont nécessaires.

Une étape critique supplémentaire est la préparation du tampon d'extraction. Les concentrations de sel, en particulier pour l'urée (8 M) et la thiourée (2 M), sont assez élevées; Ainsi, le volume de sel représente près de la moitié du volume total de la solution. En outre, la dissolution n'est pas facile, compte tenu du fait que la chaleur doit être évitée car, à plus de 37 ° C, l'urée peut conduire à une carbamylation des protéines aux extrémités N de protéines / peptides et aux groupes amino à chaîne latérale des résidus lysine et arginine 17 . Une fois dissous, le tampon d'urée doit être filtré avec des filtres de 0,22 μm et peut être conservé à -80 ° C pendant 4 semaines sans affecter son efficacité d'extraction, mais il doit être réchauffé à plus de 15 ° C avant utilisation pour permettre une dissolution complète .

Modifications et dépannage

Dans ce protocole, l'extraction de protéines est effectuée à l'aide du tampon d'urée décrit, car c'est l'une des solutions d'extraction de protéines les plus couramment utilisées pour les études protéomiques en raison de sa compatibilité avec l'isolectrofocus et son efficacité dans la solubilisation de protéines peu solubles 18 . A démontré que ce tampon peut solubiliser de manière très efficace des protéines peu solubles, telles que des protéines membranaires intégrales 19 , ou des protéines fortement propices à l'agrégation, telles que la tubuline 18. En outre, ce tampon est entièrement compatible avec le dosage de Bradford pour déterminer la concentration de protéines et Il peut être utilisé directement dans des analyses de 2-DE et de phase liquide en phase liquide.

Cependant, ce tampon n'est pas idéal pour la solubilisation de toutes les protéines présentes dans un échantillon. Il est possible que différents tampons d'extraction puissent révéler des protéines indétectables par ce protocole. Par exemple, il est bien comprisLorsque les protéines ribosomales et nucléaires pourraient être mieux extraites avec une extraction acide ou une précipitation d'acide trichloroacétique / acétone 20 , alors que les niveaux de pH alcalins sont plus adaptés aux protéines membranaires 21 , 22 . Par conséquent, l'utilisation de tampons alternatifs pourrait nécessiter des étapes supplémentaires pour la précipitation des protéines afin d'éliminer les sels qui interfèrent avec l'IEF à 2-DE ou en phase liquide.

Limitations de la technique

Le nombre de protéines identifiées par ce protocole est relativement faible, mais le nombre d'identifications et la couverture de l'analyse protéomique peuvent être encore accrus grâce à l'utilisation d'instruments plus modernes, dont la précision de masse et la vitesse de séquençage ont considérablement augmenté au cours des dernières années 23. Il est possible de couvrir une grande partie du protéome, sans étapes de prétraction, en utilisant un gradient long pour le liquide chSéparations romatographiques couplées à un instrument MS haute résolution qui a une vitesse de séquençage rapide 24 .

Importance de la technique par rapport aux méthodes existantes / alternatives

La capacité d'identifier et de quantifier les protéines dans les valves cardiaques humaines, telles que la valvule mitrale, est une tâche importante et stimulante qui aidera à élucider les mécanismes des processus physiologiques / pathologiques dans les maladies valvulaires. La définition des changements du protéome de la valvule mitrale augmentera grandement la compréhension de la nature des processus biologiques qui sont associés à l'état pathologique du tissu.

Les connaissances actuelles sur la physiopathologie de la valvule mitrale sont limitées et généralement obtenues grâce à l'analyse de protéines individuelles impliquées dans des processus spécifiques, tels que le remodelage de la matrice extracellulaire, l'hémostase, l'inflammation ou le stress oxydatif 25 9 , 10 .

Le manque d'études protéomiques globales peut être attribué à la complexité de ce tissu à faible cellularité qui est très riche en protéines de la matrice extracellulaire (protéoglycanes, collagène et élastine). Ces protéines représentent environ 80% de la quantité totale, entravant l'analyse des protéines à faible abondance 26 .

Ainsi, il était nécessaire d'établir un protocole d'extraction efficace pour maximiser la solubilisation des protéines afin de décrire le protéome de ce tissu. Ce protocole a permis l'extraction de ~ 50 μg de protéines à partir de 1 mg de tissu. Il s'agit d'un rendement relativement faible par rapport au tissu "doux", telComme foie (~ 135 μg à partir de 1 mg de tissu), mais il suffit d'effectuer une analyse de protéines sur des échantillons individuels. Ceci est particulièrement pertinent lorsque l'on définit la variabilité intra-individuelle d'un phénomène.

En outre, cette méthode présente l'avantage d'être compatible avec de nombreuses applications analytiques. Les protéines de valvule mitrale dissoutes dans le tampon d'extraction proposé peuvent être directement utilisées pour l'immunoblot et l'analyse protéomique basée sur l'électrophorèse bidimensionnelle et l'isoélectrophorèse en phase liquide 11 , 12 ou, après précipitation de la protéine pour éliminer l'interférence des composants tampons, pour d'autres analyses, telles que Spectrométrie de masse sans gel 15 .

Avec l'application de ce protocole d'extraction, une caractérisation plus exhaustive des composants protéiques du tissu de valvule mitrale normale a été obtenue grâce à l'identification de nombreux intracellulesProtéines lombaires. Ces protéines sont localisées dans le cytosol ou dans les organites, non seulement dans la matrice extracellulaire, et ont différentes fonctions moléculaires et biologiques. D'autres protéines intéressantes (CryAB, septin-11, FHL-1 et dermatopontin) ont également été identifiées. Ces protéines ont des fonctions inconnues dans la valvule mitrale, mais leurs propriétés biologiques suggèrent un rôle possible dans les maladies des valvules.

Applications ou directions futures après maîtriser cette technique

Avec ce protocole, il est possible de corréler les données concernant l'expression de la protéine avec des données sur l'expression quantitative d'un ARNm et des analyses immunohistochimiques non quantitatives. En effet, lorsqu'ils sont utilisés ensemble, ces approches conduiront à une compréhension plus complète des mécanismes moléculaires sous-jacents à la maladie, de l'ARNm à la modification de la protéine post-traductionnelle. Ainsi, cette méthode peut intéresser les chercheurs axés sur la physiopathologie valvulaire cardiaque. AiletteCe protocole peut également être appliqué à la valve mitrale porcine, qui ressemble étroitement à la valve 27 humaine et est utilisée comme modèle expérimental pour l'évaluation de la fonction de soupape.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Acknowledgments

Le ministère italien de la Santé a appuyé cette étude (RC 2013-BIO 15). Nous remercions Barbara Micheli pour son excellente assistance technique.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Saline solution 0.9 % NaCl
Eurocollins A SALF 30874046 Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins
Eurocollins B SALF 30874022 Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins
Wisconsin Bridge life RM/N 4081 Balanced organ's transport medium
Biohazard vertical flow air Burdinola Class A GMP classification
Dewar Flask Thermo Scientific Nalgene 4150-1000
Cryogrinder system OPS diagnostics CG 08-01 Grinder system containing mortars, pestles and screwdriver
Stainless steel forceps
Stainless steel spatula
Disposable sterile scalpel Medisafe MS-10
Stainless steel scissors Autoclavable
Stainless steel picks Autoclavable
Disposable sterile drap Mon&Tex 3.307.08
Sterilizing solution with isopropyl alcohol 70% isopropyl alcohol
Sterilizing solution with hydrogen peroxide 6% hydrogen peroxide
Micropipette, 1 mL, with tips
15 mL centrifuge tubes VWR international 9278
1.7 mL centrifuge tubes VWR international PIER90410
Urea buffer 8 M urea, 2 M thiourea, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol
Urea Sigma aldrich U6504-1KG To be used for Urea buffer
Thiourea Sigma aldrich T8656 To be used for Urea buffer
CHAPS Sigma aldrich C3023-5GR To be used for Urea buffer
Dithiotreitol Sigma aldrich D0632-5G To be used for Urea buffer
Syringe 50 mL PIC To be used to filter Urea buffer
0.22 µm filter Millipore SLGP033RB To be used to filter Urea buffer
PFTE Pestle, 2 mL Kartell 6302 Part of Potter-Elvehjem homogenizer
Borosilicate glass mortar Kartell 6102 Part of Potter-Elvehjem homogenizer
Stirrer VELP scientifica Stirrer DLH To be used for homogenization by Potter-Elvehjem
Bradford Protein assay Bio-Rad laboratories 5000006
Tube rotator Pbi International F205
Liquid nitrogen
Aluminum foil
Ice
Polystyrene box
Dry ice
Centrifuge For centrifugation of 1.7 mL centrifuge tubes at 13,000 x g
Freezer -80°C
Precision balance
Autoclave For sterilization
Cryogenic gloves for liquid nitrogen
Gloves
Professional forced ventilation and natural air convection oven For sterilization
Protease inhibitor cocktail Sigma aldrich P8340-5ML 100X solution
ProteoExtract Protein Precipitation Kit Calbiochem 539180
RapiGest Waters 186001861
Cytoscape www.cytoscape.org version 2.7 Software platform for Gene Ontology analysis
BiNGO http://apps.cytoscape.org/apps/bingo version 3.0.3 Plugin for Gene ontology analysis
AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody Novus Biologicals NBP1-97494 Mouse monoclonal antibody against CryAB
Septin-11 Antibody Novus Biologicals NBP1-83824 Rabbit polyclonal antibody against septin-11
FHL1 Antibody Novus Biologicals NBP-188745 Rabbit polyclonal antibody against FHL-1
Dermatopontin Antibody Novus Biologicals NB110-68135 Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin
Goat Anti mouse IgG HRP Sigma aldrich A4416-0.5ML Secondary antibody for immunoblotting
Goat Anti rabbit IgG HRP Bio-Rad laboratories 170-5046 Secondary antibody for immunoblotting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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