Murin Makat Boğazlarında Gap, Sıkı ve Aderans Bağlantılarının Bileşenleri Arasındaki Protein-Protein Etkileşimlerinin ve Ortak Lokalizasyon Analizleri

Developmental Biology

GE Global Research must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Hücre içi kavşak, meme bezi aşamasına özgü fonksiyonlar ve gelişim için şarttır. Bu el yazması, protein-protein etkileşimlerinin (PPI'lar) çalışılması ve murin meme bezlerinin birlikte lokalizasyonu için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Bu teknikler, farklı gelişim evrelerinde hücre-içi kavşaklar arasındaki fiziksel ilişkinin dinamiklerinin araştırılmasına olanak tanır.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Dianati, E., Plante, I. Analysis of Protein-protein Interactions and Co-localization Between Components of Gap, Tight, and Adherens Junctions in Murine Mammary Glands. J. Vis. Exp. (123), e55772, doi:10.3791/55772 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Hücre-hücre etkileşimleri doku bütünlüğünü ve meme bezinin farklı bölmeleri arasındaki bariyerin korunmasında önemli bir rol oynamaktadır. Bu etkileşimler, komşu hücreler arasında bağlar oluşturan bağlantılı proteinler tarafından sağlanmaktadır. Junctional protein mislokalizasyonu ve bağlanma partnerleriyle fiziksel birleşmelerin azalması, fonksiyon kaybına ve dolayısıyla organ işlev bozukluğuna neden olabilir. Bu nedenle, normal ve hastalıkla ilişkili dokulardaki protein lokalizasyonunu ve protein-protein etkileşimlerini (PPI'leri) tanımlamak, gelişme durumundaki hastalıkların veya değişikliklerin ilerlemesine yol açan yeni kanıt ve mekanizmalar bulmak için gereklidir. Bu el yazması, murin meme bezlerinde PPI'ları değerlendirmek için iki aşamalı bir yöntem sunmaktadır. Protokol bölüm 1'de, ilgilenilen proteinlere karşı geliştirilen antikorları, ardından florokromlarla etiketlenmiş ikincil antikorları kullanarak birlikte immünofloresans (co-IF) gerçekleştirmek için bir yöntem anlatılmıştır. Hep birlikte olsa daProteinlerin yakınlığının gösterilmesi için, fiziksel etkileşimlerini incelemeyi mümkün kılar. Bu nedenle, birlikte immüno çökelme (co-IP) için ayrıntılı bir protokol, protokol bölüm 2'de sağlanmaktadır. Bu yöntem, bu etkileşimlerin doğrudan veya dolaylı olup olmadığını teyit etmeden proteinler arasındaki fiziksel etkileşimleri belirlemek için kullanılır. Son birkaç yılda birlikte-IF ve birlikte IP teknikleri, hücrelerarası kavşaklardaki belirli bileşenlerin birlikte nöbetleşip birbirleriyle etkileşimde bulunduğunu ve meme bezi gelişiminde değişen aşamaya bağlı bileşke bağları oluşturduğunu göstermiştir.

Introduction

Meme bezi büyüme ve gelişme esas olarak doğumdan sonra gerçekleşir. Bu organ, bir memelinin üreme hayatında kendisini sürekli olarak yeniden şekillendirir 1 . Yetişkin meme bezi epitelyumu luminal epitelyal hücrelerin bir iç tabaka ve esasen miyoepitelyal hücrelerden oluşan, bazal membranla çevrili 2 bir bazal hücre tabakasından oluşur. Meme bezi yapısı ve gelişimiyle ilgili iyi bir inceleme için, okuyucu Sternlicht 1'e başvurabilir. Boşluk (GJ), sıkı (TJ) ve adherens (AJ) kavşakları yoluyla hücre-hücre etkileşimleri, bezin normal gelişimi ve fonksiyonu için 1 , 3 , 4 , 5 , 6 için gereklidir. Bu fare bağırsağındaki bu kavşakların ana bileşenleri Cx26, Cx30, Cx32 ve Cx43'tür (GJ); Claudin-1, -3, -4 ve -7 veZ0-1 (TJ); Ve E-cadherin, P-kadherin ve β-katenin (AJ) 7,8. Bu farklı jonksiyonel proteinlerin ekspresyon seviyeleri, meme bezi gelişimi esnasında aşamaya bağlı bir şekilde değişir ve farklı hücre-hücre etkileşim gereksinimlerini önermektedir 9 . GJ, TJ ve AJ yapısal ve işlevsel olarak birbirine bağlanır ve diğer yapısal veya düzenleyici proteinleri komşu hücrelere komşu bölgelere bağlarlar ve böylece bir bağlantılı bağ 10 oluştururlar. Bağlantılı bağın bileşimi, alttaki hücre iskeletiyle köprü oluşturmayı, ayrıca bağın geçirgenliğini ve stabilitesini etkileyebilir ve dolayısıyla bezin işlevini etkileyebilir 8 , 9 , 10 , 11 . Bileşik bağlarda bulunan veya diferansiyel olarak birbirleri ile etkileşen hücrelerarası kavşak bileşenleriMeme bezi gelişiminin gelişmekte olan aşamaları, yakın zamanda, birlikte immünfloresans (co-IF) ve birlikte immüno çöktürme (co-IP) 9 kullanılarak analiz edildi. Diğer teknikler, proteinler arasındaki fonksiyonel ilişkinin değerlendirilmesini sağlarken, bu metotlar bu elyazmasında sunulmamaktadır.

Proteinlerin sadece işlev için tek başına hareket etmesi nedeniyle, sinyal transdüksiyonları ve biyokimyasal kaskadlar gibi protein-protein etkileşimlerinin (PPI'lar) çalışılması birçok araştırmacı için çok önemlidir ve proteinlerin fonksiyonu hakkında önemli bilgiler sağlayabilir. Eş-IF ve mikroskobik analiz, aynı hücre altı alanı paylaşan birkaç proteinin değerlendirilmesine yardımcı olur. Bununla birlikte, hedeflerin sayısı, farklı hayvanlarda yetiştirilmesi gereken antikorlarla ve farklı dalga boylu lazerler ve çoklama için bir spektral dedektör ile donatılmış bir konfokal mikroskopa erişimle sınırlandırılmıştır. Co-IP, yüksek afiniteli fiziksel etkileşimleri teyit eder veya ortaya çıkarırBir protein kompleksinde bulunan iki veya daha fazla protein. Eşzamanlı olarak proteinlerin lokalizasyonunu ve etkileşimlerini saptayabilen floresans rezonans enerji transferi (FRET) 12 ve yakınlık ligasyonu deneyi (PLA) 13 gibi yeni teknikler geliştirilmesine rağmen, co-IP, arasındaki karşılıklı etkileşimleri incelemek için uygun ve uygun bir teknik olarak kalmaya devam etmektedir Endojen proteinler.

Bu el yazmasında anlatılan adım adım yöntem, protein lokalizasyonu ve ÜFE'lerin incelenmesini kolaylaştıracak ve meme bezlerinde endojen PPI'ları incelerken kaçınmak için tuzaklara işaret edecektir. Metodoloji, her bir teknik için gerekli olan dokular için farklı koruma prosedürlerinin sunulmasıyla başlar. Bölüm 1, üç aşamalı olarak protein ortak lokalizasyonu üzerinde çalışmayı göstermektedir: i) meme bezlerinin kesitlenmesi, ii) ko-IF tekniği kullanılarak farklı proteinlerin çift veya üçlü etiketlenmesi ve iii)Protein lokalizasyonu. Bölüm 2, endojen bir proteinin çökeltilmesi ve etkileşen proteinlerin üç aşamada nasıl belirleneceğini göstermektedir: i) lizat hazırlama, ii) dolaylı protein immunopresipitasyonu ve iii) SDS-PAGE ve Western blot ile partner tanımlamanın bağlanması. Bu protokolün her basamağı kemirgen meme bezi dokuları için optimize edilmiştir ve yüksek kaliteli, spesifik ve tekrarlanabilir sonuçlar üretir. Bu protokol, diğer dokulardaki veya hücre hatlarındaki PPI çalışmalarının başlangıç ​​noktası olarak da kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu çalışmada kullanılan tüm hayvan protokolleri, Üniversite Hayvan Bakımı Komitesi tarafından onaylanmıştır (INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, Kanada).

1. Proteinlerin birlikte lokalizasyonunu tanımlama

  1. Dokudan mikroskopik slaytlara
    NOT: Dokular ve bölümler kuru buz üzerinde ele alınmalıdır.
    1. Memede bezlerini bir hayvandan tüketin (bu prosedürün tam açıklaması için, Plante ve diğerlerine başvurun). 14 .
    2. Çıkarılan dokuyu dondurma / kurulum ortamında kuru buz üzerine katıştırın. Bezi kapatacak kadar orta ekleyin. Ortam katılaştığında, dokuları daha sonra kullanmak üzere -80 ° C'de bir dondurucuya aktarın 9 .
    3. ≤ -35 ​​° C'de bir cryomicrotome seti kullanarak, dokuları 7-10 μm kalınlıkta kesitlere bölün ve mikroskop lamlarına yerleştirin.
      NOT: Mümkün olduğunda her slayta iki bölüm yerleştirin; Sol bölüm birAntikorların özgüllüğünü ve dokunun otofloresansını doğrulamak için egal kontrol, sağ taraf antikorlarla etiketlenecek.
    4. Daha sonra kullanmak için bölümleri -80 ° C'de tutun.
  2. Co-IF boyama
    1. Dondurucudan uygun mikroskopik slaytları alın ve bölümleri oda sıcaklığında (RT) 15 dakika boyunca% 4 formaldehit içine daldırarak hemen sabitleyin.
    2. Daha sonra, slaytları oda sıcaklığında fosfat tamponlu salin (PBS) içine daldırın. Bir sonraki adıma geçinceye kadar plakları RT'de bırakın.
    3. Saydamın her bir bölümünü, piyasada bulunan bir hidrofobik bariyer veya su itici bir laboratuar kalemi kullanarak daire içine alın (bkz . Malzeme Tablosu ). Doku dokunmamaya özen gösterin. Hemen dokuya PBS damlası ekleyin ve sondayı prosedürün geri kalan kısmı için nemli bir histoloji odasına yerleştirin.
      NOT: Doku parçaları nemli kalmalıdır. AlternatifLy, kapaklı bir kutu kullanın ve altına ıslak kağıt havlu koyun.
    4. Her bir doku kesitini oda sıcaklığında 30 dakika süreyle 100-200 μL% 3 sığır serum albümini (BSA) -Tris tamponlu salin (TBS) -0.1% polisorbat 20 ile bloke edin (Malzeme Listesine bakın ). Numuneler bloke ederken, antikorları TBS-% 0.1 polisorbat 20'de sulandırarak primer ve sekonder antikor solüsyonlarını hazırlayın.
      NOT: Antikor için gereken konsantrasyon üretici tarafından sağlanır; Örnekler için Malzeme Tablosu ve Şekil 1 ve 2'ye ve Dianati ve ark. 9 . Çoğu fluorofor konjuge antikoru kullanırken karanlık ortamda çalışmanız gerekmese de, antikor solüsyonlarını veya lekelenmiş dokuları yoğun, parlak ışığa maruz bırakmaktan kaçının.
    5. Engelleme solüsyonunu aspirasyonla çıkartın ve 100-200 μL seyreltilmiş primer antikor içindeki bölümleri RT'de 60 dakika inkübe edin. Seçenek olarakY, birincil antikor ile gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
    6. Aspire edilerek birincil antikor çözeltisini çıkarın ve bölümleri 5 dakika için 250-500 μL TBS-% 0.1 polisorbat 20 ile yıkayın. Yıkama solüsyonunu aspirasyonla çıkartın ve yıkamayı iki kez tekrarlayın.
    7. Yıkama solüsyonunu aspirasyonla çıkartın ve bölümleri oda sıcaklığında 60 dakika boyunca uygun florofor konjuge sekonder antikor ile 100-200 μL inkübe edin.
    8. Aspirasyon ile ikincil antikor çözeltisini çıkarın ve bölümleri 5 dakika için 250-500 mcL TBS-% 0.1 polisorbat 20 ile yıkayın. Yıkama solüsyonunu çıkarın ve iki kez tekrarlayın.
    9. İlgili protein (ler) için birincil ve ikincil antikorların uygun birleşimini kullanarak adım 2.5-2.8'yi tekrarlayın.
    10. Yıkama solüsyonunu aspirasyonla çıkartın ve 100-200 μL 1 mg / mL 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile TBS-% 0.1 polisorbat 20'de 5 dakika inkübe ederek çekirdekler boyama işlemini gerçekleştirin.RT.
    11. DAPI özümünü aspirasyonla çıkartın ve slaytları, suda çözünür, fluoresan olmayan bir montaj ortamı ( Malzeme Tablosuna bakın ) ve lamelleri kullanarak monte edin. Her seferinde bir slaydı ilerleyin.
      NOT: Çekirdek lekesini 5 dakikadan fazla inkübe ederek lekelenme yoğunluğu değişmez. Alternatif olarak, tüm slaytlardaki DAPI özümünü çıkarın ve slaytları takarken dokuları PBS'de inkübe edin.
    12. Slaytları 4 ° C'lik bir buzdolabında düz olarak en az 8 saat bekletin. Floresan mikroskopik görüntülemeye devam edin (bakınız Şekil 1 ve 2 ).
  3. Mikroskobik görüntüleme
    1. Floroforlara konjuge sekonder antikorları, spesifik dalga boylarında fluoroforları uyarmak için gereken çeşitli lazerlerle donatılmış bir konfokal mikroskop kullanarak görselleştirin.
      Not: Kanalları ve alveolleri görselleştirmek için sayısal açıklık 0.95 olan 40X objektif önerilir. Bir örnekE, Şekil 1'de verilmiştir .
    2. O zaman bir dalga boyundaki görüntüyü tarayarak her bir proteinin lokalizasyonunu tek tek doğrulayın.
      Not: Bu aşamada, bağlantı proteinlerinin lokalizasyonunu eleştirel olarak analiz etmek önemlidir. Jonksiyonel bağları oluşturabilmek için bu proteinlerin plazma membranında lokalize edilmesi gerekir.
    3. Farklı dalga boylarındaki lazerlerle taranan görüntüleri birleştirerek proteinlerin birlikte lokalizasyonunu belirleyin.
      Not: Protein ko-lokalizasyonu, aynı yerde iki veya daha fazla floroforun emisyonundan kaynaklanan renk değişikliği ile görülebilir ve uygun yazılım kullanılarak ölçülebilir ( Şekil 1 ve 2 ; ayrıca bkz. Referans 9).

2. ÜFE'lerin incelenmesi

NOT: Göğüs bezleri pektoral ile yakın ilişki içindedir, PPI'ları incelemek için abdominal meme bezleri kullanılmalıdırkaslar. Memeler bezlerini ayırın (bu prosedürün tam bir açıklaması için, Plante ve ark.na bakın) 14 ve daha sonra kullanmak üzere -80 ° C'de tutun.

  1. Lisat hazırlama
    1. Tartı kağıdı ve 2 mL'lik mikrosantrifüj tüplerini bir sonraki adımlara geçmeden önce soğutmak için kuru buz üzerine yerleştirin.
    2. -80 ° C'den meme bezi dokusunu alın ve kuru buzda tutun.
    3. Dokuları önceden soğutulmuş tartım kağıtlarına tartın ve sonra dokuyu 2 mL mikrosantrifüj tüplerine (kuru buz üzerinde tutun) aktarın. Numune başına 50 ila 100 mg arasında doku kullanın. Doku 2.1.5 adıma kadar kuru buzda tutun.
    4. Aşağıdaki formülleri kullanarak, Malzemelerin Tablosunda belirtildiği üzere, NaF, NaVO3 ve proteaz / fosfataz inhibitörü ile takviye edilmiş gerekli üçlü deterjan liziz tamponunu hazırlayın. Fareler: gerekli tampon maddesi (μL) = fare dokusu ağırlığı (mg) x 3; Sıçan: gerekliTampon (μL) = sıçan doku ağırlığı (mg) x 5.
    5. Doku içeren 2 mL'lik tüp içine gereken miktarda buz gibi lizis tamponu (adım 2.1.4'de hesaplanmıştır) ekleyin.
      NOT: Adım 2.1.5-2.1.6'da, aynı anda tek bir boru ile devam edin.
    6. Doku değirmeni üzerinde sürekli homojenleştirme kullanarak dokuyu 30-40 s boyunca homojenize edin; Tüpü daima buzda tutun. Doku homojenleştiricisini orta hıza ayarlayın ve öğütücü tüpün içinde yukarı ve aşağı hareket ettirin.
    7. Diğer tüplerle birlikte 1.6 ve 1.7 adımlarını tekrarlayın.
    8. Lizatları buz üzerinde 10-30 dakika inkübe edin.
    9. Tüpleri 170 xg'de 10 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüjleyin.
    10. Bu arada, her numune için 6-10 mikro santrifüj tüpünü (0.6 mL) belirleyin ve buz üzerinde saklayın.
    11. Santrifüj tamamlandıktan sonra tüpleri kontrol edin. Yağların en üst tabakasını, berrak, sarıdan pembe lizatları (gelişme aşamasına bağlı olarak) ve bir pelet içerdiklerinden emin olun.
    12. Lipid tabakasında bir delik açSıvı faza erişmek için 200 μL'lik bir pipet kullanarak. Ucu değiştirin ve pelleti bozmadan veya lipit katmanını aspiremeden lisatı toplayın. Lizatı önceden etiketli tüpler halinde buz üzerinde paylaştırın (adım 2.1.11) ve -80 ° C'de saklayın.
    13. Uygun bir piyasada bulunan kiti kullanarak protein konsantrasyonunu ölçmek için bir kısım kullanın (Malzeme Tablosuna bakın).
  2. Dolaylı immüno çökelme
    1. Buz üzerinde, daha önce hazırlanan toplam meme bezi lizatlarının iki alikurosunu çözdürün.
      NOT: Hedef proteinin IP'si için bir alikot kullanılırken diğeri negatif kontrol olarak kullanılır.
    2. Her 1,5 mL'lik tüpte 200 μL'lik nihai bir hacme ulaşmak için 500-1,000 μg lizat toplayın ve PBS'de seyreltin.
      NOT: Kullanılacak lisat miktarı, ilgili proteinin bolluğuna ve antikorun etkinliğine bağlıdır (bakınız Şekil 3N örneği ve Malzeme Tablosu ). Her hedef için optimize etmek için, farklı miktarlarda lizat ( örn., 500, 750 ve 1000 μg) ve antikor ( örn., 5, 10 ve 20 μg) kullanılmalıdır. Aşağıdaki adımları uygulayın (2.2.3-2.3.7.4).
    3. Antijeni ilgi antijenine karşı lizatın ilk tüpüne ekleyin ve buz üzerinde tutun.
      NOT: Gerekli miktar genellikle her şirket tarafından verilen talimat sayfasında önerilir (Malzeme Tablosuna bakınız ).
    4. İkinci tüpte, adım 2.2.3'te kullanılan antikor ile aynı konsantrasyonda izotip IgG kontrolü ekleyerek negatif bir kontrol hazırlayın.
    5. Tüpleri gece boyunca 4 ° C'de düşük hızda bir tüp makaralı karıştırıcıda inkübe edin.
    6. Ertesi gün, ön yıkama için yeni 1.5 mL tüplere 50 μL manyetik boncuk ekleyin.
      1. Antikora göreceli yakınlık temelinde Protein A veya Protein G manyetik boncuklardan birini seçin. Birikmiş boncuk kullanmaktan kaçınmak önemlidir; Boncuk süspansiyonunu tüplere eklemeden önce eşit olarak tekrar süspanse edilinceye kadar hafifçe karıştırın.
    7. Boncukları içeren tüpleri manyetik standa yerleştirin ve boncukların mıknatısa geçmesine izin verin. 200 uL'lik bir pipet kullanarak boncuklardan saklama tamponunu çıkarın.
    8. 500 μL PBS-% 0.1 polisorbat 20 ekleyerek boncuk yıkayın ve 10 saniye boyunca şiddetle vorteks tüpleri.
    9. Tüpleri tekrar manyetik standa koyun ve boncukların mıknatısa geçmesine izin verin.
    10. 200 uL'lik bir pipetle pipetle aşırı yıkama tamponunu çıkarın.
    11. Adım 2.2.5'ten gelen reaksiyon kompleksini (lizat-antikor) boncuklara ekleyin ve oda sıcaklığında 90 dakika rulo karıştırıcıda inkübe edin.
    12. Tüpleri manyetik standa yerleştirin ve boncukların mıknatısa geçmesine izin verin. 200 mcL'lik bir pipet kullanarak lisatı aspire edin ve atın ve tüpleri buz üzerine yerleştirin.
    13. Boncuğu yıkaS PBS 500 mcL ekleyerek, manyetik stand tüpler yerleştirerek ve 200 mcL pipet kullanarak sıvı kaldırma. Bu yıkama adımı tekrarlayın. Yıkama basamakları sırasında vorteks oluşumundan kaçının ve örnekleri buzda tutun.
    14. Boncukları bir kez vortekslenmeden PBS-% 0.1 polisorbat 20 ile yıkayın ve 200 μL pipet ucu kullanarak son yıkama tamponunu atın.
    15. Elüte etmek için, tüplere 0.2 M asit glisin (pH = 2.5) 20 uL ekleyin ve silindir mikseri üzerinde 7 dakika boyunca sallayın.
    16. Birkaç saniye yüksek hızda santrifüjleyin (hızlı sıkma) ve süpernatanı taze, buz gibi bir tüp içerisinde toplayın.
    17. Her bir tüp için 2.2.14 ve 2.2.15 adımlarını tekrarlayın.
      NOT: Nihai hacim 40 μL olacaktır.
    18. Adım 2.2.16'dan 40 μL seyreltilmiş numuneye 10 uL 4x Laemmli tamponu ekleyin.
      NOT: Asitik pH nedeniyle renk sarı renge dönecektir.
    19. Hemen adım adım 2.2.18'den çıkan elüsyon örneğine, bir defada bir damla 1 M Tris (pH = 8), renkMaviye dönüyor. Bir sonraki tüplere geçin.
    20. Adım 2.2.18'den 70-90 ° C'de 10 dakika kaynatın. Jel elektroforezine hemen devam edin. Alternatif olarak, numuneleri yükleyene kadar -80 ° C'de bir dondurucuya aktarın.
  3. Aşağı akım uygulaması: jel elektroforezi ardından Western blot
    1. Standart prosedürler izlenerek 15 SDS-PAGE akrilamid jelleri ayırma ve istifleme hazırlayın ( 15 mm kalınlık).
      NOT: Jel seçimi (% 8-15 akrilamid, gradyan: Malzeme Tablosuna bakınız ), çöktürülecek proteinin molekül boyutuna ve analiz edilecek potansiyel bağlanma ortaklarına göre belirlenmelidir. Bu proteinler, uygun bağışıklık tespiti için birbirinden ayrılmalıdır.
    2. İmmünopresipitasyon (IP) ile akıtılmış örnekleri (adım 2.2.20) buz üzerinde çözün.
    3. Aynı numunelerden protein lizatları hazırlayın (yukarıdaki IP prosedürü için kullanılır). 50'yi kullanΜg toplam lizat ilave edin ve 4X Laemmli numune tamponu ilave edin. Numuneleri 70-90 ° C'de 5 dakika kaynatın ve yükleme yapana kadar buz üzerine koyun.
      NOT: Bu numuneler, toplam lisatta çökelen proteinlerin varlığını göstermek için ayrılmış IP örneğinin yanında yüklenecektir.
    4. Adım 2.3.3'ten hazırlanan lizatları ve adım 2.2.20'deki çökelen numuneleri bir akrilamid jeline yükleyin ve akan tamponda (10x akan tampon: 30.3 g Tris, 144.1 g glisin ve 10 G SDS, 1 L damıtılmış su içinde) yaklaşık olarak 95 dakika süreyle 100 V'de veya göç eden proteinlerin kenarı jelin tabanına erişene kadar karıştırın.
    5. Jelleri standart bir protokol 9 , 15 kullanarak bir nitroselüloz veya PVDF zarına aktarın.
    6. Memeyi,% 5 kuru süt-TTBS'de (20 mM Tris, 500 mM NaCl ve% 0.05 polisorbat 20) düşük hızda bir rocker üzerinde 1 saat bloke edin.
    7. Yağışın başarılı olup olmadığını belirleyincessful.
      1. Çökeltilmiş proteine ​​karşı ilk antikoru kullanarak membranı probleyin, üretici tarafından önerilen konsantrasyonda% 5 kuru süt-TTBS'de seyreltin, yavaşça çalkalanarak sallanan bir platformda gece boyunca 4 ° C'de.
        NOT: Öneriler için Malzeme Tablosu'na bakın.
      2. Ertesi gün, membranı yüksek sallanma ile sallanan bir platformda TTBS ile 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
      3. Membranı, yavaş çalkalanarak sallanan bir platformda RT'de 1 saat süreyle, TTBS'de seyreltilmiş yaban turbu peroksidazı (HRP) ile konjüge konmuş uygun sekonder antikorda inkübe edin.
        NOT: Alternatif olarak, bir florokrom ile konjuge edilmiş ikincil bir antikor, sinyali algılamak için uygun bir cihaz bulunduğu takdirde kullanılabilir.
      4. Yüksek çalkalamayla sallanan bir platformda TTBS ile, her biri 5 dakika boyunca 3 ila 6 yıkama gerçekleştirin. Memeyi, ticari olarak bir a ile inkübe etmek suretiyle ikincil antikorun sinyalini analiz edin(Bkz . Malzeme Tablosu ) ve üreticinin talimatlarını izleyin. Bir kemilüminesans görüntüleme sistemi kullanarak sinyali algılayın (Malzeme Tablosuna bakın ).
        NOT: Western blot analizi ile ilgili ayrıntılı bir protokol için Referans 16'ya bakın.
    8. Etkileşen proteinleri tanımlamak için aynı leke uygun antikorları kullanarak 2.3.7.1-2.3.7.4 adımlarını uygulayın.
      NOT: Proteinler etkileşime giriyorsa, bağlanma ortakları hedef protein ile birlikte immüno-çökeltilmiş olacak ve bu nedenle Western blotlama ile saptanabilecektir. Adım 2.3.8, proteinlerin moleküler ağırlıkları jel ve zar üzerinde iyi ayrılmaya yetecek kadar farklı olduğu sürece, diğer proteinlerin aynı protein kompleksinde bulunup bulunmadığını belirlemek için daha fazla antikorla tekrarlanabilir.
    9. Tanımlanan bağlayıcı ortakların eserler olmadığını doğrulamak için karşılıklı IP yapılmalıdır.
      NOT: Bu,Adım 2.2.1-2.2.20'de aynı lizata sahip olmakla birlikte adım 3.8'de tanımlanan bağlayıcı ortaklardan birini tırmandı. Ardından, adımlar 3.1-3.8, ilgilenilen ilk proteine ​​karşı birincil antikor kullanılarak tekrarlanır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

GJ, AJ ve TJ bileşenlerinin meme bezinde birlikte etkileşip etkileşip etkileşip değişime uğramayacağını belirlemek için, ilk önce co-IF testleri gerçekleştirildi. Bir GJ protein olan Cx26 ve bir AJ proteini olan β-Catenin, spesifik antikorlarla araştırıldı ve sırasıyla florofor konjuge fare-647 (yeşil, sahte renkler) ve keçi-568 (kırmızı) antikorları kullandıklarını ortaya koydu ( Şekil 1B ve C ) . Veriler, sarı renkli ( Şekil 1D ) yansıtıldığı gibi, laktasyondaki 7. günde (L7) farelerin meme bezi epitel hücrelerinin hücre zarında birlikte lokalize olduklarını gösterdi. İkincisi, bir TJ proteini olan Claudin-7; E-cadherin, bir AJ proteini; Ve bir GJ proteini olan Connexin26 (Cx26) spesifik antikorları ile incelendi ve fluorofor ile konjuge edilmiş tavşan-488 (yeşil), fare-555 (kırmızı) ve fare-647 (mercan mavisi; psödolor) antikorlarla ortaya çıkarıldı ( Şekil 2B-D ). E-cadherin ve Claudin-7 ortak lokalizasyonuE-cadherin ve Claudin-7 ile birlikte Cx26 ko-lokalizasyonu, gebelik günü 18 (P18) farelerde meme bezlerinde beyaz punctuted boyama ile sonuçlanırken ( Şekil 2E ) sarı-açık-portakal rengi olarak gösterilmiştir.

Hangi junctional proteinlerin hücre zarında birbirine karıştığını ve fiziksel olarak birbirine bağlandığını bulmak için laktasyondan geçen farelerin (L14) meme bezi dokuları kullanılarak birlikte immüno-çökeltme gerçekleştirildi. Sonuçlar, GJ'nin bir bileşeninin Cx43'ün E-Cadherin ve Claudin-7 ile etkileşime girdiğini, ancak Claudin-3 ile etkileşime girmediğini gösterdi ( Şekil 3A ve B ). Bu sonuçlar karşılıklı IP ile doğrulandı; E-Cadherin immüno çökeltildiğinde, Cx43 ve Claudin-7 ile etkileşime girdi ( Şekil 3C ).

Şekil 1
Şekil 1: β-Catenin ve Cx26, hücre memb'sinde birlikte lokalize olurFarelerde meme bezleri. Laktasyon 7 (L7) 'deki farelerin meme bezlerinden alınan dondurma bölgeleri kesildi (7 μm) ve immünofloresan boyama için işlendi. ( A ) Çekirdeği DAPI (mavi) ile boyandı. ( B ) Cx26 (yeşil, sahte renk) ve ( C ) β-katenin (kırmızı), uygun florofor etiketli antikorlar ile birleştirildiğinde gösterilir. ( D ) Birleştirilmiş bir resim. Görüntüler, bir spektral dedektöre sahip bir konfokal mikroskop kullanılarak elde edildi. DAPI aşağıdaki ayarlar kullanılarak görselleştirildi: emisyon dalga boyu, 450.0 nm; Uyarma dalga boyu, 402.9 nm; Lazer gücü, 1.2; Dedektör kazancı, PMT HV 100; PMT ofseti, 0. Cx26 (647) aşağıdaki ayarlar kullanılarak görselleştirildi: emisyon dalga boyu, 700.0 nm; Uyarma dalga boyu, 637.8 nm; Lazer gücü, 2.1; Dedektör kazanımı, PMT HV 110; PMT ofset, 0. β-Catenin (568) aşağıdaki ayarlar kullanılarak görselleştirildi: emisyon dalga boyu, 595.0 nm; Uyarma dalga boyu, 561.6 nm; lazerGüç, 2.1; Dedektör kazanımı, PMT HV 110; PMT ofset, 0. Ölçek çubukları = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2: Connexin26 (Cx26), E-cadherin ve Claudin-7 farenin meme bezlerinde hücre zarı üzerinde birlikte lokalize olur. ( B ) Claudin-7 (yeşil), ( C ) E-cadherin (kırmızı) ve ( D ) Cx26 (mercan) kullanılarak immünofloresan boyama için işlenmiş gebelik haftasında 18 (P18) meme bezlerinden alınan dondurma bölgeleri kesildi (7 μm) Mavi; psödokolor), uygun florofor etiketli antikorlar ile kombine edilmiştir. ( A ) Çekirdeği DAPI (mavi) ile boyandı. Görüntüler, bir spektral dedektöre sahip bir konfokal mikroskop kullanılarak elde edildi. DAPI, fOllowing ayarları: emisyon dalga boyu, 450.0 nm; Uyarma dalga boyu, 402.9 nm; Lazer gücü, 5.4; Dedektör kazancı, PMT HV 65; PMT ofseti, 0. Claudin-7 (488) aşağıdaki ayarlar kullanılarak görselleştirildi: emisyon dalga boyu, 525.0 nm; Uyarma dalga boyu, 489.1 nm; Lazer gücü, 5.0; Dedektör kazancı, PMT HV 12; PMT ofset, 0. E-Cadherin (568) aşağıdaki ayarlarla görselleştirildi: emisyon dalga boyu, 595.0 nm; Uyarma dalga boyu, 561.6 nm; Lazer gücü, 13.5; Dedektör kazancı, PMT HV 45; PMT ofset, 0. Cx26 (647) aşağıdaki ayarlar kullanılarak görselleştirildi: emisyon dalga boyu, 700.0; Uyarma dalga boyu, 637.8; Lazer gücü, 5.0; Dedektör kazancı, PMT HV 55; PMT ofset, 0. Ölçek çubukları = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 3
Şekil 3: Claxdin-3 değil, Cx43, E-Cadherin ve Claudin-7, bir protein kompleksine karışır. Cx43 ( A ve B ) ve E-Cadherin ( C ) laktasyondaki farelerin meme bezlerinden 500 mg toplam lizat kullanarak immüno-çökeltildi. IP'ler ve lisatlar jellere yüklendi ve PVDF zarları üzerine aktarıldı. Claudin-7 ve Claudin-3 aynı molekül ağırlığına sahip oldukları için aynı zar üzerinde analiz edilemedi. Böylece, iki paralel IP, Cx43 için aynı lisat ile gerçekleştirildi, iki jöle üzerine yüklendi ve aktarıldı (membranlar A ve B). Membran A, IP'nin (üst panel) verimliliğini teyit etmek için Cx43 ile ilk olarak tarandı. Ardından membran E-Cadherin ve Claudin-7 ile ardışık olarak tarandı. Western blot analizi, iki proteinin Cx43 ile etkileşime girdiğini gösterdi. Membran B, IP'nin (üst panel) etkinliğini teyit etmek için ilk olarak Cx43 ile tarandı ve daha sonra Claudin-3 ile sondalandı. Western blot analizi, Claudin-3 dCx43 ile IP değil, iki proteinin etkileşime girmediğini gösterir. Membran C, IP (üst panel) verimliliğini teyit etmek için önce E-kadherin ile tarandı. Ardından zar, Cx43 ve Claudin-7 ile ardışık olarak tarandı. Western blot analizi, proteinler arasındaki etkileşimleri doğrulamıştır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bağırsak yoluyla hücre-hücre etkileşimleri, meme bezi gibi birçok organın düzgün işleyişi ve gelişimi için gereklidir. Araştırmalar junctional proteinlerin birbirlerinin işlev ve istikrarını düzenleyebildiğini ve sinyal iletimini hücre zarı 10'da birbirine bağlayarak aktive edebildiğini göstermiştir. Mevcut el yazmasında sunulan protokoller, normal fare bezi gelişiminde junctional protein diferansiyel ifadesi, lokalizasyonu ve etkileşimi hakkında ilginç bulgular sağlamıştır 9 . Birleşmiş protein lokalizasyonunun proteinlerin fonksiyonu için kritik olduğu ve bunların iskele proteinleri ve çok sayıda kinaz 3 ile etkileştiği bilinmesiyle, co-IF ve co-IP hücre-hücre etkileşimleri alanında etkili tekniklerdir. Sadece bu yöntemler, meme bezi gelişiminde ve dys'te junctional nexuses gerekliliğini aydınlatmak için gerekli değildirMeme kanseri düzenlemesi, ancak aynı zamanda diğer dokularda ve deneylerde hücre dizileri kullanılarak da kullanılabilir.

Memeli bezi iki ana bölmeden oluşur: stroma ve epitelyum 4 . Erişkin epitelyum iki kat hücreden oluşur. Bu yaklaşımda, potansiyel bağlanma partnerlerinin yakınlığı birlikte-IF tekniği kullanılarak belirlendi ve fiziksel etkileşimleri co-IP kullanılarak teyit edildi. Co-IF, aynı doku, yapı, hücre veya hücreiçi bölme 17 , 18 içinde proteinlerin birlikte lokalizasyon göstermek için Başkaları tarafından başarıyla kullanılmıştır. Bu tekniğin en önemli avantajı, dokuyu oluşturan farklı hücre tipleri içindeki her bir proteinin hücresel veya subselüler lokalizasyonu hakkında görsel bilgidir. Bu teknik oldukça basit olmasına rağmen bazı tavsiyeler takip edilmelidir. Örneğin dokuların hasar görmesini önlemek için,Her seferinde bir 200 μL pipet veya bir transfer pipet kullanarak bir damla çözümleri ekleyin. Bu, dokulara zarar vermeden doku yüzeyinin daldırılmasına imkan tanır. Benzer şekilde, slaytyı hafifçe eğinerek dokuların yanına yerleştirilen bir Pasteur pipetini kullanarak solüsyonları alın. Ayrıca, depolama çözeltisi gliserol içeren antikorlar için, arka planı azaltmak için yıkama tamponlarının dikkatli bir şekilde emilmesi gerekir. Üstelik, laktasyon sırasında kazeinler gibi süt proteinlerinin bulunması, onları tutarak antikorları etkileyerek yanlış pozitif sonuçlara neden olabilir. Dolayısıyla, özellikle bu aşamada, ortaya çıkan imgenin eleştirel bir analizi gereklidir.

Bu birlikte-IF tekniğinin bazı kısıtlamaları veya tuzaklar da vardır. Birincisi, spesifik antikorlar gerektirir. Daha önce belirtildiği gibi (adım 1.1), yukarıda açıklanan adımları izleyerek lekelenmek için her slaytta bir bölüm ( yani, sağdaki) kullanmanız önerilir;Birincil ve ikincil antikorlar sırayla. Kalan bölüm için ( yani sol taraftaki), birincil antikor solüsyonları yerine% 0.1 TBS-polisorbat 20 kullanarak aynı prosedürü takip edin. Peptid rekabetini kullanarak antikorun spesifik bağlanmasını doğrulamak mümkündür ve hatta daha iyidir, ancak ticari antikorları üretmek için kullanılan peptitler her zaman mevcut değildir. Bu nedenle, pozitif ve negatif kontrolleri ( yani ilgilenilen proteini ifade etmesi veya bulmadığı bilinen dokular veya hücreler) kullanarak bağlanmanın özgüllüğünü doğrulamak önemlidir. Dahası, antijen fiksasyon bölgeleri özellikle de formalinle sabitlenmiş dokular için erişilemez, böylece belirli bir sinyalin olmaması sağlanır. Bu nedenle, bazı dokular için antijen geri alma prosedürü gerekebilir. Hücrenin zarını geçirgen hale getirmek için, antijen alımı öncesinde deterjanlıyla kısa bir inkübasyon gerçekleştirilebilir. İkincisi, çoğullama için antikorlar farklı hayvanlarda yetiştirilmelidir.Örneğin, anti-tavşan adım 1.2.6'da kullanılmışsa, anti-fare adım 1.2.10'da seçilebilir, ancak tavşanda yetiştirilen başka bir antikoru seçemez. Çoğu ticari antikor tavşanlarda, farelerde veya keçilerde yetiştirildiğinden, uygun antikorların olmaması nedeniyle aynı anda iki proteini hedeflemek bazen zordur veya imkansızdır. Bu kısıtlamaların üstesinden gelmek için, ticari olarak temin edilebilen önceden etiketlenmiş antikorları satın alabilir veya ticari olarak temin edilebilir kitleri kullanarak floroforlarla birincil antikorları etiketleyebilir. Üçüncüsü, başka bir eksiklik, farklı fluoroforların uyarım ve emisyonuyla bağlantılıdır. Sinyallerin iki farklı antikordan örtüşmesini önlemek için, her floroforun uyarma-emisyon spektrumu ayrılmalıdır. Böylece, aynı anda analiz edilebilecek hedef sayısı mevcut mikroskopun konfigürasyonuna göre değişir. Son olarak, analizin kalitesi, kullanılan mikroskopa bağlıdır. Daha ayrıntılı ve kesin veriler,Bir epifluorescent mikroskop ile karşılaştırıldığında bir konfokal mikroskop kullanarak elde edilebilir. Süper-çözünürlüklü mikroskopi kullanımı, proteinin birlikte lokalizasyonunu daha ayrıntılı olarak ortaya çıkarabilir 19 .

Eş-IF muhtemel bağlayıcı ortakların yakınlığı hakkında önemli bilgiler verirken, proteinler arasındaki fiziksel etkileşimleri tanımlamak için diğer yöntemlerle tamamlanmalıdır. Mevcut yöntemler arasında, ekipman ve materyale kolayca erişilebileceği için, co-IP muhtemelen en uygun fiyatlı uygulamalardan biridir. Manyetik boncuklara bağlı bir antikor kullanılarak, protein kompleksleri izole edilebilir ve tipik Western leke analizi kullanılarak bu komplekste bulunan bileşenleri tanımlayabilir. Eş-IF'ye benzer şekilde, en iyi uygulamalar için bazı tavsiyeler takip edilmelidir. Örneğin, 2.1.5 ve 2.1.9 arasındaki adımları azaltmak için dokuları homojenize ederken numuneleri en aza indirgemek önerilir. Deneyimli bir kişi en fazla 10 numuneyi şu saatte işleyebilir:Bir başlangıçta 4-6'dan fazla örnek ele alınmamalıdır. Benzer şekilde, IP protokolünü ilk kez gerçekleştirirken boru sayısı sınırlandırılmalıdır. Negatif bir kontrolle ( yani, IgG) ve pozitif bir kontrolle ( yani immüno-çökeltilecek protein ihtiva ettiği bilinen bir doku) başlanması önerilir. İkinci deneme optimizasyona ayrılmış olmalıdır (adım 2.2.2'ye bakınız). Bu adımlar tatmin edici sonuçlar verdiğinde, analiz edilecek numuneler işlenebilir. Prosedüre negatif bir denetimin daima dahil edilmesi gerektiğini unutmayın.

Bu birlikte-IP tekniğinin de potansiyel tuzakları vardır. Birincisi, dokuların proteinler arasındaki bağların korunmasına izin veren koşullarda homojenleştirilmesini gerektirir. Jonksiyonel proteinler gibi zar proteinleri için, çözünürlüklerine izin verilirken proteinler arasındaki bağları koruyacak bir tampon kullanmak da çok önemlidir. İkinci olarak, eş-IF'ye benzer şekilde, yüksek afiniteli antikorlar gerektirirHem hedef protein hem de bağlanma ortakları için. Dahası, proteinler üçüncül konformasyonlarında kalır ve protein kompleksleri homojenizasyon yoluyla ayrılmaz, çünkü eğer antikor bir partnerin bağlanma alanına çok yakın olan veya proteinin doğal yapısı içinde gizlenmiş hedef proteinin bir bölümünü tanır , IP güvenilebilir. Bu nedenle, bağlayıcı ortağın bulunmadığına karar vermeden önce, Western blot kullanan IP'nin verimliliğini her zaman doğrulamanız önemlidir. Üçüncüsü, co-IP, proteinlerin doğrudan boncuklara bağlanması veya kompleksin bir parçası olmaksızın prosedür sırasında çökeltilmesi nedeniyle sahte pozitif sonuçlar doğurabilir. Bu eserleri tanımlamak için sunulan yöntemlerde tarif edildiği gibi karşılıklı bir IP'nin yanı sıra bir IgG kontrolü gereklidir. Proteinlerin boncuklara spesifik olmayan şekilde bağlanmasını önlemek için 2.2.2 ve 2.2.3 adımları arasında bir "ön temizleme" prosedürü eklemek de mümkündür. Bunu yapmak için,Bir rulo karıştırıcıda 4 ° C'de 1 saat süreyle 50 μg boncukla parçalanır. Boncukları manyetik ayak ile çıkarın ve adım 2.2.3'e geçin. Dördüncü olarak, IgG'nin ağır ve hafif zincirleri, ilgilenilen proteinler veya bağlama partneri ile aynı boyutta olabilir ve böylece sinyali maskeleyebilir. Bir çözüm, bu el yazmasında anlatıldığı gibi, IgG zincirlerini glisin ile ayrıştırmaktır. Sadece doğal antikorları tanıyan ikincil antikorları satın almak da mümkündür ve bu nedenle membrana yüklenmiş olan denatüre edilmiş hafif ve ağır zincirlere bağlanmamaktadır (Malzeme Tablosuna bakınız ). İki yöntem bazen birleştirilmelidir. Beşinci olarak, ortak IP, sınırlı olarak bağlayıcı ortakların tanımlanmasına, kısmen membranda taranabilen antikorların sayısına bağlı olarak izin verir. Aynı zamanda, bu bağlayıcı ortakların önceden tanımlanmasını ya eş-IF ya da bir literatür taraması yoluyla yapılmasını gerektirir. Son olarak, co-IP, protein presinin tanımlanmasına imkân tanırIki protein arasındaki doğrudan etkileşim için değil, bir komplekstir.

Ortak IP'den alınan sonuçlar farklı şekillerde analiz edilebilir. Bu elyazmasında anlatıldığı gibi, aynı zarın farklı antikorlarla yeniden problanmasıyla yalnızca etkileşen ortakların saptanması mümkündür. Bu etkileşimi ölçmek de mümkündür. Bunu yapmak için, immüno çökeltilen protein miktarı, membranın bu proteine ​​karşı bir antikorla araştırılmasıyla ölçülür. Sinyal yoğunluğu, bu el yazmasında anlatıldığı gibi bir görüntüleme yazılımı kullanılarak analiz edilir. Daha sonra membran, bağlanma partnerine karşı bir antikor ile yeniden problanır ve sinyal yoğunluğu da nicelleştirilir. İki protein arasındaki etkileşimler daha sonra bağlanma partneri miktarının immüno-çökeltilen proteinin miktarına oranı olarak ifade edilebilir. Bununla birlikte, karşılaştırma yapabilmek için, farklı numunelerin aynı anda işlenmesi ve aynı zara yüklenmesi gerekir. BiologBenzer çoğaltmalar ilerletilebilir ve benzer şekilde analiz edilebilir ve istatistiksel analiz yapılabilir.

Son yıllarda, ÜFE'leri analiz etmek için başka teknikler geliştirildi. Örneğin, FRET, etkileşen proteinlerin bir etiketten diğerine enerji transferi yoluyla tanımlanmasına ancak proteinler etkileşime girmek için yeterince yakın olduğunda olanak tanır. Bununla birlikte, proteinlerin etiketlenmesini gerektirdiğinden, bu teknik dokularda kullanılamaz. Benzer şekilde, PPI'leri bir bakteriyel biotin ligaz, BirA 21 ile kaynaşmış bir protein kullanarak tanımlamak mümkündür. Bu ligaz, kimerik protein ile çok yakın olan ( yani etkileşime giren) proteinlere biyotin ekleyecektir. Bu yöntem yenilikçi ve tarafsızdır, ancak dokularda uygulanamaz. Alternatif olarak, PLA dokularda kullanılabilir. Eş-IF'ye benzer şekilde, bu tahlil, antikor afinitesine dayanmaktadır. Bu deney için, ikincil antikorlar DNA sekansları tha ile etiketlenirT, yakınlarındayken ( yani PPI'ler üzerine) etkileşime girebilir ve dairesel bir DNA molekülü 22 oluştururlar. Bu dairesel DNA molekülü daha sonra çoğaltılır ve floresanla etiketlenmiş tamamlayıcı oligonükleotitler kullanılarak saptanır. Bu tahlil zarif olmasına rağmen, birçok doğrulama aşaması gerektirir ve yine de birincil antikor afinitesine ve potansiyel etkileşim içindeki ortakların bazılarına dayanır. Son olarak, PPI'leri tanımlamak için geleneksel IP tahliline karşı tarafsız bir alternatif geliştirilmiştir. Endojen protein (RIME) analizlerinin hızlı immunopresipitasyon-kütle spektrometrisinde, IP numuneleri, Western blot analizi yerine kütle spektrometresi (IP / MS) 23 ile analiz edilir. Bu yüksek verimli yöntemin başlıca avantajı, az miktarda malzeme kullanarak endojen etkileşen proteinlerin tümü hakkında büyük bilgi sağlamasıdır. Bununla birlikte, bir peptid sıralama aletine 23 erişim gerektirir.

BuÖnemli birkaç ön testten sonra, bu protokolün her bir adımı meme bezi için optimize edilmiştir. Bununla birlikte, yöntem birkaç değişiklik yapıldıktan sonra diğer organlar için kesinlikle kullanılabilir. Eş-IF için, meme bezi bölümlemesi, uygun bloke etme ve yıkama ve solüsyonlar için optimal sıcaklık ve uygun antikor konsantrasyonları test edildi. Ko-IP için çeşitli liziz ve elüsyon tamponları ve ekstraksiyon yöntemleri de test edildi ve IP başarısı üzerinde büyük bir etkisi oldu. Özetle, bu protokolün her adımı mümkün olan en az zemin ve en özgünlükle yüksek kaliteli ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için önemlidir. Diğer yöntemler mevcut olmakla birlikte, birlikte-İB takip eden birlikte IP, ÜİE'leri değerlendirmek için geçerli ve basit yöntemlerle kalmaktadır. Bu iki teknik hem dokularda hem de hücre çizgilerinde kullanılabilir ve yalnızca birkaç doğrulama basamağı ve kontrolü gerektirir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların beyan edecek hiçbir şeyi yok.

Acknowledgements

IP, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi tarafından finanse edilmektedir (NSERC # 418233-2012); Bir Quebec Meme Kanseri Vakfı kariyer ödülü olan bir Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQS) ve Canadian Foundation for Innovation hibe için bir Leader Founds yardımı. ED, Fondation universitaire Armand-Frappier'den bir burs aldı.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mice strain and stage St. Constant, Quebec, Canada C57BL/6 Femals; pregnancy day 18 (P18) and lactation day 14 (L14), Charles River Canada 
PBS 10x (stock) 1) Dissolve 80 g NaCl (F.W.: 58.44), 2 g KCl (F.W. 74.55), 26.8 g Na2HPO4·7H2O (F.W. 268.07) and 2.4 g KH2PO4 (F.W.:136.09) in 800 mL distilled water;
2) Adjust the PH to 7.4;
3) Add water to reach to the 1 L final volume.
TBS 10x (stock) 1) Dissolve 60.5 g TRIS, 87.6 g NaCl in 800 mL distilled water;
2) Adjust the pH to 7.5;
3) Add water to reach to the 1 L final volume.
Part 1: Immunofluorescence
Freezing media VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada 95067-840 VMR frozen sections compound 
Microtome Mississauga, ON, Canada 956640 Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115 V 60 Hz
Blades C.L. Sturkey, Inc. Les Produits Scientifiques ESBE St-Laurent, QC, Canada BLM1001C High profile gold coated blades
Pap pen Cedarlane, Burlington, ON, Canada 8899 Super PAP Pen, Thermo fisher scientific
Microscopic slides Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada 12-550-15 Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides
Formaldehyde BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Canada FOR201.1 Forlmadehyde
Bovine Serum Albumin (BSA) Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA
Blocking solution 3% BSA in TBS
Wash solution TBS-Tween 20 0.1%
Polysorbate 20 Oakville, ON, Canada P 9416 Tween 20, Sigma-Aldrich
Mounting media Cedarlane, Burlington, ON 17984-25(EM) Fluoromount-G
First & secondary antibodies Cell Signaling, Beverly, MA, USA See Comments E-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling 
First & secondary antibodies  Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA See Comments Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) with anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling) 
First & secondary antibodies  Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada  See Comments β-Catenin Antibody (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) with anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific)
First & secondary antibodies  Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA See Comments Connexin26  (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s) 
Nuclei stain Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada D1306 DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1,000 in PBS
Fluorescent microscope Nikon Canada, Mississauga, On, Canada Nikon A1R+ confocal microscopic laser equipped with a spectral detector 
Software of IF images analysis Nikon Canada, Mississauga, On, Canada NIS-elements software (version 4)
Part 2: Immunoprecipitation
Triple-detergent Lysis buffer (100 mL) pH=8.0 1) Mix 50 mM TRIS (F.W.: 121.14), 150 mM NaCl (F.W.: 58.44), 0.02% Sodium Azide, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Sodium Deoxycholate in 80 mL distilled H2O.
2) Adjust the pH to 8.0 with HCl 6 N (~0.5 mL).
3) Adjust the volume to 100 mL. Keep it in fridge.
At the day of protein extraction, use 1/100 NaVo3, 1/100 protease/phosphatase inhibitor and 1/25 NAF in calculated amount of Triple detergent lysis buffer:
Sodium Fluoride (stock) solution 1.25 M (F.W.: 41.98), Sodium Orthovanadate (stock) Solution 1 M (F.W.: 183.9)
Protease/phosphatase inhibitor Fisher Scientific, Burlington, ON 78441 Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x)
Protein dosage Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA 23225 Pierce BCA protein assay kit 
Tissue grinder Fisher Scientific, Burlington, ON FTH-115 Power 125, Model FTH-115
Magnetic beads and stand Millipore, Etobicoke, ON, Canada PureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02)
Wash solution for IP PBS or PBS-Tween20 0.1% depending to the step
Primary antibodies for immunoprecipitation Cell Signaling, Beverly, MA, USA See Comments IgG Rabbit (rabbit (DA1E) mAb IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL
Primary antibodies for immunoprecipitation Cell Signaling, Beverly, MA, USA See Comments IgG Mouse mouse (G3A1) mAb IgG Isotype control (#5415s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL
Primary antibodies for immunoprecipitation Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada See Comments Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4 µL/200 µL
Primary antibodies for immunoprecipitation Cell Signaling, Beverly, MA, USA See Comments E-cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) (Cell Signaling) 1 µL/200 µL
Laemmli buffer  BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada 1610747 4x Laemmli Sample Buffer (Add β-mercaptoethanol following manufacturer recommendation)
Acidic glycine  Fisher Scientific, Burlington, ON PB381-5 0.2 M glycine; adjust pH=2.5 with HCl 
Tris  Fisher Scientific, Burlington, ON BP152-1 1 M (pH=8) 
SDS-PAGE acrylamide gels  BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1610180 -5 TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutionss (7.8%, 10%, 12%)
Running buffer 10x  BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1704272 Tris 30.3 g/glycine 144.1 g /SDS 10 g in 1 L distilled water
Membranes BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1704272 PVDF membranes, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit
Transfer method BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1704155 Trans-Blot Turbo Transfer System
Dry Milk Smucker Food of Canada Co, Markham, ON, Canada Fat Free Instant Skim Milk Powder, Carnation
Blocking solution for blots 5% dry milk in TBS-Tween 20 0.1%
Washing solutions for blots TBS-Tween 20 0.1%
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario & Abcam, Toronto, ON, Canada See Comments Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2,500 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) Cell Signaling, Beverly, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada See Comments E-cadherin (24E10) rabbit mAb 1/1,000 (#3195s) (Cell Signaling) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada See Comments Claudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada See Comments Claudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Luminol solution for signal detection on blots BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1705061 Clarity Western ECL Blotting Substrate
Imaging blots BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1708280 ChemiDoc MP imaging system
Analayzing blots BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada ImageLab 5.2 software 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8, (1), 201 (2006).
  2. Oakes, S. R., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8, (2), 207 (2006).
  3. Stein, T., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8, (2), 207 (2006).
  4. El-Sabban, M. E., Abi-Mosleh, L. F., Talhouk, R. S. Developmental regulation of gap junctions and their role in mammary epithelial cell differentiation. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 8, (4), 463-473 (2003).
  5. Hennighausen, L., Robinson, G. W. Information networks in the mammary gland. Nat Rev Mol Cell Biol. 6, (9), 715-725 (2005).
  6. Gudjonsson, T., Adriance, M. C., Sternlicht, M. D., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Myoepithelial cells: their origin and function in breast morphogenesis and neoplasia. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10, (3), 261-272 (2005).
  7. Nguyen, D. A., Neville, M. C. Tight junction regulation in the mammary gland. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 3, (3), 233-246 (1998).
  8. Stewart, M. K., Simek, J., Laird, D. W. Insights into the role of connexins in mammary gland morphogenesis and function. Reproduction. 149, (6), R279-R290 (2015).
  9. Dianati, E., Poiraud, J., Weber-Ouellette, A., Connexins Plante, I., E-cadherin, Claudin-7 and beta-catenin transiently form junctional nexuses during the post-natal mammary gland development. Dev Biol. 416, (1), 52-68 (2016).
  10. Derangeon, M., Spray, D. C., Bourmeyster, N., Sarrouilhe, D., Herve, J. C. Reciprocal influence of connexins and apical junction proteins on their expressions and functions. Biochim Biophys Acta. 1788, (4), 768-778 (2009).
  11. Hernandez-Blazquez, F. J., Joazeiro, P. P., Omori, Y., Yamasaki, H. Control of intracellular movement of connexins by E-cadherin in murine skin papilloma cells. Exp Cell Res. 270, (2), 235-247 (2001).
  12. Kiyokawa, E., Hara, S., Nakamura, T., Matsuda, M. Fluorescence (Forster) resonance energy transfer imaging of oncogene activity in living cells. Cancer Sci. 97, (1), 8-15 (2006).
  13. Gustafsdottir, S. M., et al. Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses. Anal Biochem. 345, (1), 2-9 (2005).
  14. Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of mammary gland development and function in mouse models. J Vis Exp. (53), (2011).
  15. Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  16. Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of Western blot data. Mol Biotechnol. 55, (3), 217-226 (2013).
  17. Oxford, E. M., et al. Molecular composition of the intercalated disc in a spontaneous canine animal model of arrhythmogenic right ventricular dysplasia/cardiomyopathy. Heart Rhythm. 4, (9), 1196-1205 (2007).
  18. Wang, X., Li, S. Protein mislocalization: mechanisms, functions and clinical applications in cancer. Biochim Biophys Acta. 1846, (1), 13-25 (2014).
  19. Bertocchi, C., et al. Nanoscale architecture of cadherin-based cell adhesions. Nat Cell Biol. 19, (1), 28-37 (2017).
  20. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors (Basel). 16, (9), (2016).
  21. Fredriksson, K., et al. Proteomic analysis of proteins surrounding occludin and claudin-4 reveals their proximity to signaling and trafficking networks. PLoS One. 10, (3), e0117074 (2015).
  22. Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Rev Proteomics. 7, (3), 401-409 (2010).
  23. Malovannaya, A., et al. Streamlined analysis schema for high-throughput identification of endogenous protein complexes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (6), 2431-2436 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics