Author Produced

固体核磁共振波谱法研究高分子组件的原子尺度结构

Biochemistry
 

Summary

超分子蛋白质的结构在原子分辨率下具有很高的相关性, 因为它们在各种生物现象中具有重要作用。在此, 我们提出了一个协议, 以执行高分辨率结构研究的不溶性和晶大分子蛋白组件的魔术角纺 solid-state 核磁共振光谱学 (MAS SSNMR)。

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Loquet, A., Tolchard, J., Berbon, M., Martinez, D., Habenstein, B. Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. J. Vis. Exp. (127), e55779, doi:10.3791/55779 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

超分子蛋白组件在生物过程中起着基本作用, 从宿主-病原体相互作用、病毒感染到神经退行性疾病的传播。此类组件由多个蛋白质亚基组成, 它们以价的方式组织, 形成大型大分子物, 可以执行多种细胞功能或造成有害后果。原子对组装机制和这些大分子组件的功能的洞察力仍然很稀少, 因为它们固有的不和 non-crystallinity 常常大大降低从大多数技术获得的数据的质量用于结构生物学, 如 x 射线晶体学和溶液核磁共振 (NMR)。我们在这里提出了魔术角旋转 solid-state 核磁共振光谱学 (SSNMR) 作为一个强有力的方法来研究大分子组件的结构在原子分辨率。SSNMR 可以在没有尺寸和溶解度限制的情况下揭示组装复合体的原子细节。此处介绍的协议描述了从生产13C/15N 同位素标记的大分子蛋白组件到获取标准 SSNMR 谱及其分析和解释的基本步骤。举例来说, 我们展示了一个丝状蛋白组装的 SSNMR 结构分析的管道。

Introduction

魔术角纺 solid-state 的研究进展核磁共振光谱学 (SSNMR) 为大分子蛋白质组件的结构表征提供了一个原子分辨率的有效工具。这些蛋白质组件是无处不在的系统, 在许多生物过程中扮演着重要的角色。他们的分子结构、相互作用和动力学由 SSNMR 研究是可接近的, 如已经显示为病毒 (衣1) 和细菌感染机制 (分泌系统2,3, 毛4), 膜蛋白质复合物5,6,7,8和功能 amyloids 9,10,11。这种类型的分子组装也可以引发病理, 如在神经退行性疾病的蛋白质聚集在错误, 淀粉样状态和导致异常细胞行为或细胞死亡12,13。蛋白质组合通常是由蛋白质亚基的倍数拷贝的对称齐聚物形成的, 包括纤维、细丝、孔、管或纳米颗粒等各种形状的超分子。第四级体系结构是由蛋白质亚基之间的弱相互作用来组织空间和时间组装, 并允许复杂的生物功能。在这些组件的原子尺度上进行结构上的调查是对高分辨率技术的挑战, 因为它们的内在不, 而且常常是它们的 non-crystallinity 限制了常规 X 射线晶体学或溶液核磁共振的使用方法.魔术角纺 (MAS) SSNMR 是一种新兴的技术, 获得原子分辨率数据的不溶性高分子组件, 并已证明它的效率, 以解决3D 原子模型的越来越多的复杂生物分子系统, 包括细菌丝, 淀粉样蛋白组件和病毒颗粒14,15,16,17,18,19,20, 21,22。在高磁场、方法学发展和样品制备方面的技术进步, 已经建立了 MAS SSNMR, 成为一种健壮的方法, 在各种环境中研究不溶性蛋白质, 特别是在其生物相关大分子组装状态或细胞膜, 使该技术的高度互补的低温电子显微镜。在许多情况下, 这样的蛋白质组合具有很高的对称性。MAS SSNMR 利用这一特性, 因为 homomolecular 组件中的所有蛋白质亚基都具有相同的局部结构, 因此几乎相同的 SSNMR 签名, 大大降低了分析的复杂性。

一种有效的协议结构研究大分子蛋白组件由适度 MAS (和 #60; 25 赫) SSNMR 介绍了在这个视频, 并可以细分为不同的步骤 (图 1)。我们将展示 SSNMR 结构研究的工作流程的关键阶段, 例如丝状蛋白组件 (参见图 1中突出显示的步骤), 除蛋白质亚基纯化外, 不同的蛋白质大会, 但对结构研究至关重要, 而不进入 SSNMR 光谱学的技术/方法细节, 并在网上提供专门教程的结构计算。虽然本议定书将主要集中在 MAS 条件下进行的 solid-state 核磁共振实验, 使用对齐的生物环境23,24,25,26,27, 如对齐的 bicelles, 允许在无 MAS 技术的情况下研究蛋白质构象和动态蛋白质-蛋白质相互作用。我们将显示蛋白质的表达和组装步骤, 以及关键的 SSNMR 谱的记录和他们的分析和解释。我们的目标是提供对结构分析管道的洞察力, 使读者能够通过 SSNMR 技术对大分子组装进行原子解析结构研究。

该协议包含3部分:

1. 固态核磁共振样品生产

作为一个 solid-state 核磁共振分析的先决条件, 大分子组装的蛋白质组分需要表达, 同位素标记, 纯化和组装体外到本机一样的复杂状态 (例如, 请参见图 2).为确保高核磁共振灵敏度, 在13c 和15n 标记中的同位素富集需要通过使用最小细菌表达介质, 并辅以13c 和15n 源, 如一致的13分别标有葡萄糖/甘油和15NH4Cl。在议定书的后期阶段, 有选择地使用13c 标记的示例生成的带有选择性13c 标记的源 (如 13-13c) 和 (2-13c)-甘油 (或 (1-13c)-和 (2-13c)-葡萄糖) 用于促进核磁共振分析。混合标记的样品对应于 50% 15N 和 50% 13c 标记或 50% (13-13c)-和 50% (2-13c)-葡萄糖的摩尔混合物, 以描述分子间的检测相互.在组装过程中, 高度的蛋白质纯度以及严格的条件是确保最终样品的均匀结构顺序的关键因素。

2. 基于 one-dimensional (1D) solid-state 核磁共振的初步结构表征

我们为 SSNMR 的结构分析提供了必要的实验。在13C 上检测到的一维 (1D) 极化 (CP) 和笨拙/RINEPT28实验, 分别用于检测组件中的刚性和挠性蛋白质片段, 并估计结构同质和局部多态性 (例如, 请参见图 3)。

rong>3构象分析与3D 结构确定

第1和2节涉及的构象分析, 这是基于 SSNMR 共振分配的所有刚性残留的蛋白质组装, 因为化学转移是非常敏感的探针, 对当地环境和可用于预测的 phi/psi二面角, 从而决定第二结构。图 4说明了蛋白质组件的刚性内核中的顺序共振分配的示例.3D 结构的确定是基于结构数据的收集, 如距离限制编码关闭 proximities (和 #60; 7-9 Å), 包含两个内部和分子间的信息。第3和4节描述了远距离限制的收集和解释。远距离接触被定义为分子内的13c-13c proximities 产生于残留 i 到 j, 与 |4, 定义从而单体亚基的三重蛋白质折叠, 或者作为分子间的13c-13c proximities, 定义在组件中蛋白质亚基之间的分子之间的接口。在图 5中说明了内部和分子间的接口。SSNMR 的约束检测通过13c-13c 和15N13c 挂钩实验通常编码为核距离和 #60; 1 nm。4小节解释了分子间距离限制的检测。在对称的蛋白质组件中, 使用均匀标记的样本 (100% 一致或有选择地标记) 来识别分子间亚基-亚基相互作用是有限的, 因为内部和分子接触导致探测信号。分子间 proximities 的明确检测是通过使用混合标记样品来实现的, 它包含了两种不同标记样品的摩尔混合物, 并在聚合之前结合在一起。5小节简要介绍了结构建模。

Figure 1
图 1:solid-state 核磁共振的原子解析结构研究的工作流.13C、 15N 同位素标记蛋白质生产、亚基纯化、亚基组装、装配形成控制、SSNMR 实验、SSNMR 实验分析和距离约束提取、结构建模等。请单击此处查看此图的较大版本.

Protocol

1. 固态核磁共振样品 productiona

  1. 生产一致的 13 C/ 15 N 标记蛋白亚基
      使用新转换的, pET24-peptide-6his 质粒包含 大肠杆菌 BL21 (DE3) 细胞, 从准备好的琼脂板中收获它们.
    1. 接种15毫升培养 5ml LB 培养基与一个菌落。孵育在37和 #176; C 与 200 rpm 颤抖过夜.
    2. 将培养转换为 5ml M9 培养基的主要培养物中的 1 L (见表 1 ), 其中含有所需的同位素标记碳和氮源.
      注意: 这可以是一致的 13 c 标记的葡萄糖, 有选择地 (1- 13 c)-或 (2- 13 c)-标有葡萄糖 29 , 30 , 31 或 (13- 13 c)-或 (2- 13 c)-标记甘油 32 , 33
    3. 在37和 #176 中孵育此值, 并测量 OD 600 一旦文化变得混浊。当 OD 600 达到0.8 的值时, 会在4小时内诱导蛋白质表达式为 0.75 mM IPTG.
      注意: 最佳诱导条件可能因蛋白质而异.
    4. 在 6000 x g 和4和 #176 中通过离心法恢复细胞30分钟; C.
  2. 纯化示意图 (未显示在视频协议中)
    1. 溶解细胞使用标准技术, 如超声或溶菌酶处理和纯化蛋白质亚基使用的技术建立或适应调查蛋白组装.
      注意: 蛋白质可以在包涵体中表达, 通过细胞裂解和随后的离心来检查蛋白质的定位。如果在含细胞碎片的沉积物中发现蛋白质, 则在包涵体中积聚.
    2. 蛋白质样品的测试表达和纯度例如由标准12-15% 聚丙烯 SDS-页, 请参见 图 2A 。如果纯度足够, 蛋白质可以组装, 否则执行补充纯化步骤.
  3. 在体外 蛋白质丝的组装
      检查纯化溶液中的蛋白质浓度。如果蛋白质含有吸收残留物, 在 280 nm 的紫外分光光度计中测量吸收。将纯缓冲器插入分光光度计中作为校准, 然后测量蛋白质的吸收率.
    1. 使用蛋白质亚基的吸收系数计算蛋白质浓度与适应的啤酒-兰伯特定律: and #955; = 和 #949; 和 #955; x l x c; 这里是一个给定的波长和 #955 的光学密度;; #949;特定吸收系数;l 是在 cm 中的光学轨迹的长度;c 是摩尔/L 的浓度.
    2. 将蛋白质浓缩到离心过滤装置中的1毫米浓度。将样品引入离心过滤装置, 离心机在 4000 x g 为30分钟, 用吸管轻轻地将溶液混合在过滤器单元中, 以避免过滤器上的蛋白质沉淀。重复该过程, 直到达到所需浓度.
      注: 最佳装配浓度取决于系统, 需要优化 (通常在 0.1-1 mM 之间)。如果将两个不同标记的蛋白质批次的摩尔混合标记样品准备好 ( 例如 (50/50) (u- 15 N)-/(u- 13 C)-标记), 混合必须在浓缩步骤之前或右侧发生, 以确保混合溶液的均匀性.
    3. 将样品转移到试管中, 在室温下搅拌一周.
    4. 通常, 亚单位的聚合成花丝伴随溶液变得混浊。以电子显微镜 (放大倍数 6300X-45000X) 为例, 检查显微纤维的形态和均匀性, 请参阅 图 2B .
    5. 离心样品1小时在 20000 x g 和4和 #176; c. 除去大多数上清液, 只留下足够的液体覆盖表面, 以避免样品干燥。在紫外分光光度计上检查上清 non-assembled 亚基.
    6. 通过添加 H 2 O 并仔细重吸管中的内容来清洗样品。不要涡流。旋转样品30分钟在 22000 x g 和4和 #176; c. 重复洗涤步骤3次。检查所有洗涤步骤, 如果颗粒在离心后保持其方面, 并检查上清 non-assembled 亚基在紫外分光光度计上.
    7. 添加 0.02% (w/v) 叠氮化钠 (NaN 3 ) 以避免细菌污染并将样品保存到4和 #176; C.
  4. 固态核磁共振转子填充
    1. 离心机两次, 在 22000 x g 和 4 #176; c. 除去上清液的最大量; 结果样品的一致性取决于蛋白质的组装, 通常是凝胶状存款.
    2. 使用毛细管吸管将样品插入 SSNMR 转子.
      注: 在这里, 我们提出的程序在一个4毫米直径转子。
      1. 离心机上的转子离心机轻轻地将样品引入转子。重复此步骤, 直到转子填满。保持最小空间用转子盖关闭转子。如果样品数量不够, 引入一个商业可利用的插入物填满剩余的空间, 以确保样品分布均匀性在转子.
        注意: 依赖于组装样品的一致性, 它可能更适合使用薄刮刀, 特别是对于非常稠密的样品。转子与直径2.5 到4毫米使用在适度 MAS 频率.
    3. 为内部化学位移和温度校准添加 44-二甲基-4-silapentane-1-磺酸 (DSS) 的踪迹.
    4. 用关闭设备关闭 cap.
    5. 如果盖很好地插入并完全关闭, 请在放大镜下检查.

Figure 2
图 2 : 代表结果蛋白质亚基纯化和组装。A) 15% 聚丙烯 SDS 页的蛋白质亚基 (包括他的 6 标签) 在不同的纯化阶段。车道 1-蛋白质分子量标记;车道 2- 大肠杆菌 BL21 (DE3) 细胞 uninduced 控制;车道 3- 大肠杆菌 BL21 (DE3) 细胞诱导与0.75 毫米 IPTG;车道 4-溶解包含身体车道 5-上清分数的细胞裂解物;在镍固定化金属亲和层析 (IMAC) FPLC 和脱盐后的 6-纯化馏分。B) 通过 TEM 成像对蛋白质纤维进行负染色。 请单击此处查看此图的较大版本.

2. 基于 one-dimensional (1D) solid-state 核磁共振

的初步结构表征
  1. 初始设置和1D 极化 (CP)
    1. 将转子插入核磁共振磁体
    2. 开始旋转转子在5赫的频率, 并等待稳定的和 #177; 10 赫兹, 然后加速, 直到7赫。调整并匹配 1 H、 13 C 和 15 N 通道。将温度设置为2-10 和 #176; C (275-283 K);样品加热在7赫 mas 是低和温度调整通常不需要在这个 mas 频率.
    3. 记录 single-pulsed 1D 1 H 频谱使用16扫描.
      注意: 在参照化合物上必须对电源级别进行过优化 (如 13 C/sup>15 N 组氨酸或甘氨酸), 提供初始值, 以优化在目标样品的实验中的功率水平;此过程是常规任务, 因此超出了本协议的范围.
    4. 在2-10 和 #176 之间的所有实验中保持温度; C, 在水合样品中温度反映在大体积水的相对转移上 1 H 共振与 DSS 信号有关 34 。测量关系后的温度, #948;(H 2 O) = 7.83-96.9, 精度为 1-2 和 #176; C 35 .
    5. 设置所需的 MAS 频率, 然后等待和 #177 的稳定; 10 Hz
      注: 这里是11赫频率的演示.
    6. 调整并匹配 1 H 和 13 C 通道, 并在 1D 1 H 实验的帮助下调节温度.
    7. 设置 1D 1 H- 13 C CP 36 .
      注: CP 实验显示了在刚性构象中残留物产生的信号。脉冲校准和解耦参数可以直接优化的样品时, 灵敏度高到足以观察信号后少于32扫描。初始优化值从参照化合物的标准优化中接管。根据最大信号强度选择 CP 接触时间和功率电平。在蛋白质样本中, 最佳 CP 接触时间通常介于200和 #181; s 和2毫秒之间. 从参考化合物的标定也应调整解耦参数。
      1. 在给定的 MAS 频率下仔细观察旋转边的本地化.
    8. 记录参考 1D 13 C CP 频谱, 用作1D 光谱指纹。典型的参数有128扫描, 1 ms CP 接触时间, 100 赫解耦强度, 回收延迟 3 s 和 25 ms 的收购.
    9. 校准 1 H 和 13 C 在 IUPAC 建议 37 之后的化学位移。确定 1 H DSS 信号的共振频率 (化学位移为 0 ppm); 13 C 化学位移被引用到 1 H 移位 (通常为 0.25144, 从 13 c 到 1 H 共振频率 37 的比率派生.
    10. 处理 1D 1 H 13 C CP 实验, 不带切函数 (参见 图 3A B , 用于检测一个均匀有序的蛋白质组件)。选择一个孤立的峰值来估计样本中的线宽, 指示结构顺序和同质性。典型的 13 C 线为在 MAS 下的有序生物蛋白组件在高磁场范围内的 20-150 赫兹 (测量为全角在半 (FWHH)).
    11. 估计 CP 频谱中的信噪比 (S/N).
      注: S/N 的比值取决于许多因素, 其中主要包括在转子的样品量, 蛋白质结构的刚性程度和存在的单一分子构象。作为一条经验法则, 如果在经过优化的 1D 1 H- 13 C CP 频谱中记录有64扫描的信号, 则样本应适用于多维 SSNMR 光谱学.
    12. 放大到蛋白质骨架羰基共振的光谱区域 (主要) 在165和 #160 之间定位; 180 ppm。用 #945 中残留共振的蛋白质骨架羰基共振的位置来估计装配中的二级结构含量;-螺旋或 #946;-链构象分别移位前场或前场 (参见 图 3B 主要和 #945;-螺旋亚基) 38
  2. 1D 笨拙实验
    1. 设置 1D 1 H- 13 C 笨拙的实验, 以探测蛋白质组件的高度移动部件 (子和 #181).
      注意: 在获取 39 期间, 通常使用 GARP 解耦的几赫, 以允许短 interscan 延迟 (通常为1秒), 而不会损坏探测器.
    2. 记录作为移动蛋白片段的指纹的参考无能频谱; 典型参数是128扫描和25毫秒的捕获时间
    3. 处理 1 H- 13 C 笨拙的实验。信号的数量和位置分别指示了移动残留量和氨基酸组成.
      注意: 如果信号出现在1D 的不称职的频谱中 (请参见 图 3C 为例), 也记录 2D 1 H- 13 C 的不称职的实验, 以允许更具体的氨基酸识别。在不明确的赋值情况下, 我们建议通过解核磁共振来检查缓冲元件的信号位置.
    4. 使用 BMRB 数据库 40 和已发布的数据 38 在近似随机线圈构象下将共振赋给其相应的氨基酸; 频谱只包含移动缓冲区组件 (如果没有)残滓在一个高度流动的政权.

Figure 3
图 3 : 代表性结果SSNMR 谱获得一个结构良好的蛋白质组装。a) 13 检测到的 1 H- 13 c 极化实验。B) 1 H- 13 C 极化实验。c) 1 H- 13 C 不称职的刚性蛋白组装实验;只有缓冲区组件可见。 请单击此处查看此图的较大版本.

3. 构象分析和3D 结构确定

  1. 顺序共振分配
    1. 设置 2D 13 c- 13 c 质子驱动的自旋扩散 (PDSD) 41 实验检测 intra-residue 13 c- 13 C 的相关性, 包括侧链。从 1D 1 h- 13 c CP 实验中, 接管初始 1 H- 13 c 极化步骤的值。
      1. 将混合时间设置为50毫秒, 用于统一的 13 c 标记的示例, 并为有选择地 13 c 标记的示例添加100毫秒。设置在 5-25 ms 之间的间接捕获时间和直接获取之间的 15-25 ms 依赖于固有的光谱分辨率, 可以估计的可见信号在自由感应衰变 (半) 长度 (例证 图 3A ).
      2. 测试几个处理参数, 以查找有关频谱中的信噪比和分辨率的最佳值, 通常可以使用具有正弦响铃移位 (单边带) 2.5-4 的 qsine 窗口函数来实现适当的处理.
    2. 设置, 记录和处理 2D 13 c- 13 c PDSD, 并进行中间混合时间实验, 以检测顺序 13 c- 13 c 相关连接, 主要是 i 和 #177; 1, 还有 i 和 #177; 2 和 i 和 #177; 3残余物, 取决于蛋白质骨干刚性和次要结构元素。混合时间应设置在100-200 毫秒的统一标记的样本。所有其他值都可以从短混合时间中接管 2D 13 c- 13 c PDSD.
    3. 设置、记录和处理 2D 15 N- 13 C N i CA i 和 n i CO i 实验使用 cp 1 H 15 n 和特定 cp 15 n- 13 C 传输 42 . 根据在 CA 或羰基区域中的最大强度, 将1D 时尚中的 15 N- 13 C 的极化传输优化为直接基于感兴趣的样本。典型特定 CP 接触时间的 cal 值介于2-6 毫秒
    4. 设置、记录和处理一系列 2D 15 N-( 13 c) 13 c 实验中, 用于分配目的.
      注意: 第一个 15 n- 13 C 的偏振传递参数值可以从 n i CA i /n CO i 实验中接收。剩余的相关性是建立从 N i (ca ) CB i 和 n i (ca ) CO i , 分别使用梦想 43 和 PDSD 13 c- 13 c极化转移。残留 (i) 至残渣 (i-1) 顺序连通性是从 n i (co i-1 ) CA i-1 和 n i (co i-1 ) CX i-1 实验中获得的, 均使用 PDSD 13 c- 13 c极化转移.
    5. 选择核磁共振分析程序, 如 CcpNmr 分析 44 或火花 45
    6. 将2D 频谱加载到软件中 (以 CcpNmr 分析为例), 并加载主蛋白质序列.
    7. 从 short-mixing 中可见的氨基酸类型的标识开始 13 C- 13 c PDSD 频谱。连接自旋系统的碳原子, 以允许 #34; 残渣型和 #34; 特定分配;有关苏氨酸残留物的分配, 请参见 图 4A 。识别尽可能多的残留物;这将取决于蛋白质亚基的大小, 光谱分辨率和分散.
    8. 覆盖 short-mixing 与中间混合 13 c- 13 c PDSD 频谱.
      注: 中间混合 PDSD 中可见的补充峰主要来源于连续 (残留 i. 残留 i. #177; 1) 接触。在 图 4B 中说明了两个剩余顺序分配的示例。
      1. 标记自旋系统的共振峰, 并在中间混合 PDSD 中找到与其他自旋系统共振频率的相关性。在小蛋白质或多肽中, 可以根据 2D 13 c- 13 c PDSD 实验来实现整个顺序共振分配.
        注: 在和 #946;-链二次结构主题残留 i.-残余 i 和 #177; 2 13 c- 13 c 触点可能比顺序接触显示更强的信号由于他们的接近度在空间;在和 #945;-螺旋二次结构主题残滓 i 和 #177; 3 13 c- 13 c 联系人也可能导致强烈信号.
    9. 如果有选择地进行中间混合的 PDSD 实验, 则可以使用 13 c 标记的示例, 将它们叠加到 short-mixing 频谱上 (如果有选择的 13 c 标记的示例), 并分配补充峰值, 考虑到选择性 13 c 标记模式 (13- 13 c 和 2- 13 c 甘油 32 , 33 或 1- 13 c 和 2 13 c 葡萄糖 29 , 30 , 31 .
      注意: 例如, 在 2- 13 c 甘油标记的样品中, 有几种氨基酸类型在 c 和 #945 上标注; 没有相邻碳的位置 (c 和 #946; c 和 #39;) 标记, 因此有利于 c 和 #945;-c 和 #945;相邻残留物之间的转移。在选择性标记样本中, 远程 13 c- 13 c 之间的相关性可能已经在中间混合 13 c- 13 c PDSD 实验中建立。如果一个峰值不能用顺序相关性来解释, 那么它可能是由长程接触引起的。对于高分子组件中的高度有序的亚单位结构, 只有一组共振有望在光谱中可见。如果为 13 C 原子或蛋白质骨架拉伸, 两倍 (或进一步相乘) 的共振是可见的, 则分别为原子或组件中的主序列拉伸的两个 (或更多) 构象存在.
    10. 使用包含 intra-residue 的 2D NCA 频谱 15 N- 13 C 和 #945; 关联以识别每个残余物的 15 n 共振频率。如果 13 c 维度中的分辨率不足, 请使用有关 c 和 #946 的补充信息; 2D NCACB 中的共振以识别 intra-residue 的 15 N 谐振频率.
    11. 使用包含 intra-residue 的 2D NCACB 和 NCACO 光谱 15 N- 13 c- 13 c 关联到 (i) 标识 intra-residue 15 N 频率, (ii) 解决 13 c- 13 c 中的多义性在附加的 15 N 维度的帮助下 PDSD。由于梦的传递导致信号的反转, 引起了典型的 c 和 #945 的观察; c 和 #946; c 和 #945 的相关性; 信号是正的, 而 c 和 #946; 信号为负。进一步的侧链 13 C, 如果在频谱中可见, 则再次为正数.

Figure 4
图 4 : 2 维 13 c- 13 c SSNMR PDSD 实验在一个良序, 一致的 13 c, 15 N 标记蛋白组件。A) 短混合时间 PDSD (50 ms 混合)。B) 利用短混合时间 PDSD PDSD (200 ms 混合) 的叠加, 对 2-残余拉伸 Ile32 Thr33 进行分配。 请单击此处查看此图的较大版本.

  1. 辅助结构确定
    1. 使用 13 c 和 #945;, 13 c 和 #946; 化学位移值计算二级化学位移 46 和 #916; #948; #945;-和 #916; #948; #946;, 表明二级结构。计算 13 c 和 #945;(分配)- 13 c 和 #945;(随机线圈) 和 13 c 和 #946;(分配)- 13 c 和 #946;(随机线圈).
      注: 随机线圈构象中残留物的化学位移值可从 38 获得。
      1. 绘图和 #916; #948; c 和 #945;-和 #916; #948; c 和 #946; #62 的负值或正值; 连续的3残留量表示和 #946;-链或 #945;-螺旋构象; 甘氨酸和脯氨酸残留可能显示异常的化学位移值, 如他们经常充当和 #34; 二次结构断路器和 #34;.
    2. 通过使用塔洛斯 + 47 48 或 PREDITOR 49 50 , 从指定的化学位移中预测蛋白质的角度。预测的皮/Psi 二面角反映蛋白质苏布的次生结构在整个建模过程中被用作结构约束.
  2. 结构约束的
  3. 集合
    1. 设置和记录 2D 13 c- 13 c PDSD 实验, 具有长期的混合时间来检测远程 13 c- 13 c 的相关性。典型的混合时间从400毫秒到1秒不等. 使用有选择地 13 C 标记的样本, 由于自旋稀释大大改善了远距离碳的偏振传递.
    2. 覆盖 long-mixing 2D 13 c- 13 c PDSD 记录在有选择标记的样品上的中间混合 13 c- 13 c PDSD, 如果可能的话记录在相同的选择性标记样本。补充峰值产生于较远的 13 C 原子之间的相关性。在共振分配时, 考虑到选择性标记方案.
    3. 仔细评估频谱的分辨率以定义分配公差窗口 , 即 依赖于特定 ppm 范围内的光谱分辨率共振, 这可能有助于信号。分配精度的标准偏差是在核磁共振分配程序中自动计算的, 如 CcpNmr 分析或火花.
    4. 如果一个信号可以由一个序列 (残留 i 残留 i 和 #177 解释; 1) 或中等范围的 13 c- 13 c 联系人 (残余 i-残渣 i 和 #177; 2, 3 或 4), 保持此分配, 因为中继极化转移可以解释即使 13 c- 13 c 的距离超出预期的可见联系范围.
    5. 将远程分配 13 c- 13 c 的联系人划分为频率明确且不明确的信号。在频率无歧义的情况下, 只有一个共振分配可以相对于分配公差窗口.
      注意: 不明确的赋值包含了公差窗口中所有可能的共振分配。在结构计算过程中, 可以同时解除歧义, 方法是在计算例程 (如咏叹调 51 或工会 52 。此外, 来自不同生物物理来源的结构数据 ( 例如 由溶液核磁共振或 X 射线晶体学、质量每长度测量、冷冻 em 图) 的突变或截断的亚单位结构, 也可用于降低模糊度,示例请参见 1 , 3 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 .
  4. 检测对称蛋白质组中的分子间距离约束
    1. 设置 2D 15 N- 13 C 疼痛 CP 59 实验混合 (50/50) u- 15 N/u- 13 C 标记的示例。在疼痛 CP 频谱上检测到的信号应该来自分子 15 N- 13 C proximities。使用先前分配的共振来执行分子间接触的分配.
    2. 设置 2D 13 c- 13 c PDSD, 混合时间长 (#62; 600 毫秒) 在 a (50/50) 混合 (13- 13 c)-/(2- 13 c)-甘油或 (1- 13 c)-/(2- 13 c)-葡萄糖样本.
      注意: 在此 13 c- 13 c 频谱中检测到的信号来自内和分子 13 c- 13 c proximities。然而, 这两种标记方案的高互补性让特定的共振对从分子接触中明确产生, 例如 (2- 13 C) 中的丝氨酸 CA-葡萄糖标记的亚基在 (1- 13 C)-葡萄糖标记亚基。
      1. 将混合样本的频谱叠加到 2D 13 c- 13 c 中记录在均匀标记的样本上的光谱 (13- 13 c)-和 (2- 13 c)-甘油或 (1- 13 c)-和 (2- 13 c)-葡萄糖标记的示例)。在混合样本中记录的频谱中的附加信号应该来自分子的相互作用.
  5. 从 SSNMR 数据进行结构建模
    1. 准备结构计算所需的 SSNMR 约束列表: (1) 蛋白质序列;(2) 内明确的距离约束;(3) 内模糊距离约束;(4) TALOS-based 面角约束;(5) 分子明确的距离约束;(6) 分子模糊距离约束;(7) 其他生物物理技术 ( 例如 质量/长度、对称性参数) 的其他数据.
    2. 多项评论提供了基于 SSNMR 数据的结构建模以及与互补结构数据的结合 14 60 15 , 19 61 62 注意, 在结构计算期间, 可以歧义不明确的距离限制。基于明确距离约束的结构模型。为了保证结构的准确性, 仔细观察结构是否收敛到一个单一的折叠.

Figure 5
图 5 : 内部和分子间对称蛋白组件中的触点. #160; 内部和 #160; vs. 和 #160; 分子间和 #160; 13 c- 13 c 在螺旋高分子组件中的长程接触。亚基的颜色为白色和红色, 以说明亚基的混合标记; 和 #160; 和 #160; 在组装之前, 执行了两种不同标记方案的1:1 混合物 ( 例如 和 #160; 1- 13 C 葡萄糖和 1- 13 C 葡萄糖). #160; ) 分子内和 #160; 13 c- 13 c 远程触点 (蓝色虚线箭头); 和 #160; B ) 分子间和 #160; 13 c- 13 c 远程触点 (红色虚线箭头). 和 #160; 请单击此处查看此图的较大版本.

Representative Results

典型的 SSNMR 工作流包括图 1中说明的几个步骤。通常, 蛋白质亚基是由体外产生的, 在大肠杆菌, 纯化和组装在震动, 但有时也在静态条件。蛋白质亚基的表达和纯化遵循 SDS 凝胶层析 (图 2A)。高分子组件的形成可以通过电子显微镜 (EM) 分析得到证实 (参见图 2B以得到一个丝状组件的例子)。

将该蛋白组件引入 SSNMR 转子后, 将转子插入光谱仪中, 对 MAS 频率和温度进行调节, 并记录频谱。第一个洞察力可以通过 1D SSNMR 技术获得。图 3显示了在结构均质蛋白质样本上的13c 通道上检测到的典型 SSNMR 裂, 一个1H-13c CP 频谱, 揭示了在蛋白质亚基的刚性核心中存在的13c 共振程序集和一个 2D 1H-13C 不称职的频谱, 表示移动残滓。为了原子洞察到装配结构的刚性核心, 多维 SSNMR 实验需要被记录在一致和有选择地标记的样品上, 首先分配 SSNMR 共振, 然后检测长程 proximities (参见图4).

所有的光谱都是用适当的软件来处理和分析的, 以分配 SSNMR 共振和提取内部和分子间距离限制 (图 5)。SSNMR 距离限制要么单独使用, 要么与互补技术的数据结合起来, 可以集成到建模程序中。

对于由 SSNMR 技术解决的大分子组件的代表性原子结构,图 6演示了从细菌附件和淀粉样纤维中得到的几个丝状组件。

Figure 6
图 6:由 solid-state 核磁共振方法确定的丝状大分子结构: 细菌丝和淀粉样蛋白纤维.A)类型1毛肾炎大肠杆菌, PDB 代码 2N7H 4;B) ASC 纤, PDB 代码 2N1F 63;C) III 型分泌系统针, PDB 代码 2MME, 2LPZ 和 2MEX 2,3,64;D) 淀粉样蛋白-β AB42 纤维, PDB 代码 2NAO, 5KK3, 2MXU 65,66,67和大阪变种 pdb 代码 2MVX 57, 爱荷华州变种 pdb 代码 2MPZ 58;E) α-核纤, PDB 代码 2N0A 68;F)-s 朊病毒域, PDB 代码 2RNM, 2KJ3 69,70请单击此处查看此图的较大版本.

Discussion

固态核磁共振 (SSNMR) 是一种在原子水平上表征大分子蛋白组件的方法。SSNMR-based 结构确定的核心问题之一是被调查系统的频谱质量, 它允许建立各种精度的3D 结构模型, 通常包括低分辨率模型 (包含次结构元素和小3D 信息) 到 pseudo-atomic 3D 结构。从多维 SSNMR 实验中提取的结构信息的数量和质量是计算装配的高分辨率核磁共振结构的关键。

所描述的协议依赖于检测13c-13c 和15N13c 结构限制, 要求记录多个 2D (有时 3D) 高信噪比的频谱。在适度 MAS 频率 (和 #60; 25 赫), 样品被引入到转子的大小为 3.2-4 毫米直径允许蛋白质数量高达〜50毫克, 依赖于样品水合。转子内的样品量与 SSNMR 谱中的信噪比成正比, 这是检测远距离约束的决定性因素, 是其明确的赋值。

在序列共振分配和约束集合中, 谱分辨率是一个关键参数。为了获得最佳的结果, 需要优化样品制备参数, 特别是在纯化亚基和组装条件 (pH, 缓冲, 震动, 温度,)。对于样本优化, 建议为已观察到的几个不同的条件准备未标记的样本, 并在每个准备好的样本上记录 1D 1H-13C CP 频谱 (在步骤2.1 中描述)。光谱用于比较光谱决议和分散在不同的准备, 根据哪些最佳的条件可以被确定。

SSNMR 数据的质量在很大程度上取决于核磁共振采集参数的选择, 特别是极化转移步骤。高磁场强度 (≥600 MHz 1H 频率) 的使用对于高灵敏度和光谱分辨率是非常重要的, 在面对复杂目标 (如大分子蛋白组件) 时需要。

在许多情况下的限制因素是光谱仪的可用性。因此, 在光谱仪会议之前, 明智地选择要准备的样品。无论如何, 一个统一的13C、 15N 标记的示例是执行顺序和 intra-residual 共振分配的先决条件。为 solid-state 核磁共振技术分配的蛋白质参见71。在中等 MAS 频率下的高分子组件的结构测定需要有选择的13C 标记的样本;用于检测远程13c-13c 和13c-15N 联系人示例基于 13-13c 和 2-13c-gylcerol 和/或 1-13c-和 2-13c-葡萄糖标记是通常使用, 如上所述。两种标记方案之间的选择是基于频谱信噪比和分辨率。为了区分内部和分子间的长程接触, 混合标记和稀释样品已显示有效。

简而言之, 原子 SSNMR 结构研究的关键步骤是: (i) 需要优化亚基和组件的制备, 以获得优异的样品数量和质量, (ii) 光谱仪场强度和采集参数必须慎重选择;(三) 3D 结构确定需要有选择性的标记策略, 所需数据的数量取决于数据质量和补充数据的可用性。

尽管它适用于范围广泛的超分子系统, 从膜蛋白到 homomultimeric 纳米物质, 但 SSNMR 通常受限于镁量的 isotopically 标记材料的需要。最近的技术发展在超快 MAS (小时赫) SSNMR 开辟了大道到1H 检测到的核磁共振, 并将最小样本量的极限推到 sub-mg 72,73,74。然而, 对于详细的结构研究, 13C 标记的样本是必不可少的, 这限制了 SSNMR 的应用, 以样本组装的体外或系统中所表达的生物生存在最小的培养基上的细胞SSNMR 是一种新兴的方法 (用于审阅, 请参阅75,76,77,78)。

在 SSNMR 应用中获得高分辨率3D 结构的一个重要因素是光谱分辨率: 组件内的固有构象异质性可以限制光谱分辨率和频谱分析。剩余的特定13C 标记在某些情况下可能提供一种替代方法, 以获取有关战略残滓的特定距离信息, 以便获得结构模型 (最近的示例见79,80)。

SSNMR 为3D 结构决心仍然要求收集几个数据集以经常长的数据采集时间在老练仪器, 取决于方法和系统几天到星期在600-1000 兆赫 (1H 频率)光谱仪.因此, 在 in-depth SSNMR 的研究中, 获得光谱仪的时间可能是一个限制因素。

在 homomultimeric 蛋白组件的情况下, 导致 SSNMR 数据足够的质量, 以确定大量的结构限制, 如在3,57,64,70, SSNMR仍然无法进入微观维度。因此, 在de 从头SSNMR 结构确定 homomultimeric 组件、EM 或每长度 (MPL) 数据时, 理想地补充 SSNMR 数据以导出对称参数。SSNMR 数据仅提供原子和分子间的界面

SSNMR 是高度互补的结构技术, 如 EM 或 MPL 测量, 但数据也可以完美地结合的原子结构获得 X 射线结晶学或解决核磁共振的突变或截断亚基。越来越多的研究可以在文献中发现, 不同结构数据的结合允许确定大分子组件的原子3D 模型 (参见图 6中的典型例子)。

在结构生物学领域, SSNMR 作为一种有前途的研究方法应运而生。原子级的不溶和晶的组件,提供原子尺度的结构数据。在这方面, SSNMR 是为分子组装的溶液核磁共振和 X 射线结晶学的垂饰, 包括其原生环境中的膜蛋白和蛋白质组合, 如病毒包络、细菌丝或 amyloids, 以及 RNA 和RNA 蛋白质复合体 (参见例如81)。它的高度多才多艺的应用在体外和在细胞的上下文, 例如跟踪次要, 第三和第四纪结构变动, 辨认相互作用表面与伙伴分子在原子尺度 (例如82) 和映射分子动力学在装配的复合体的上下文, 表明 SSNMR 的重要潜力在未来结构研究复杂生物分子汇编。

组件 M9 培养基
nacl 0.5 克/升
2PO4 3克/升
Na2HPO4 6.7 克/升
MgSO4 1毫米
ZnCl2 10μ m
FeCl3 1μ m
CaCl2 100μ m
记忆维生素混合100X 10毫升/升
13C-葡萄糖 2克/升
15NH4Cl 1克/升

表 1:重组蛋白最低表达培养基的组成生产于 大肠杆菌 BL21 单元格.

Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作由 PDOC (13-0017-01 至钲和 ANR-14-CE09-0020-01 至 a.1)、"未来投资" 方案达思波尔多/CNRS (pep 2016 至钲) 供资, ANR-10-IDEX-03-02 钲, 研究, 基金会倾吐 la Médicale () 的资助 (FRM-AJE20140630090 到 a.1), FP7 计划 (FP7-PEOPLE-2013-CIG 到 a.1) 和欧洲研究理事会 (紧急救济委员会) 根据欧洲联盟的地平线2020研究和创新计划 (紧急救济协调员开始授予 a.1, 协议 639020) 和项目 "WEAKINTERACT。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instruments
NMR Spectrometer (> 11.7 Tesla) Bruker -
triple resonance MAS SSNMR probehead  Bruker -
SSNMR rotors 4mm Bruker K1910
Centrifuge 5804 R  Eppendorf 5805000629
GeneQuant 1300 spectrometer Dutscher 28-9182-13
IGS60 INCUBATEUR HERATHERM 75 L Dutscher 228001
MaxQ 4450 bench top orbital shaker Dutscher 78376
Tube Revolver Agitator Dutscher 79547
sonopuls HD 3100 Bandelin 3680
MicroPulser electroporator Biorad 165-2100 
mini-PROTEAN tetra cell system Biorad 165-8000
AKTA pure system GE Healthcare 29-0182-24
capillary microman M25 pipet Gilson  F148502
Name Company Catalog Number Comments
Materials
amiconR ultra-15 sigma Z740199-8EA
capillaries and pistons Gilson  F148112
spatula Fisher 13263799
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
D-glucose 13C6 Sigma 389374
Ammonium-15N-chloride Sigma 299251
1,3 13C2 glycerol Sigma 492639
2 13C glycerol Sigma 489484
Kanamycin Sigma K1876
Carbenicillin Sigma C3416
Sodium phosphate dibasic Sigma S7907
Potassium phosphate monobasic Sigma P5655
Sodium chloride Sigma 71380
calcium chloride Sigma C1016
Magnesium sulfate Sigma 208094
Iron Chloride Sigma 157740
Zinc chloride Sigma 793523
MEM Vitamin Solution (100×) Sigma M68954
IPTG Fisher BP1755
Trizma base  Sigma T1503
Tricine Sigma T0377
SDS Sigma 436143
sodium azide sigma 71289
4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic acid  Sigma 178837
Name Company Catalog Number Comments
Softwares
Unicorn 6.3 GE Healthcare Akta systems
ccpNMR CCPN  spectrometer systems

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Morag, O., Sgourakis, N. G., Baker, D., Goldbourt, A. The NMR-Rosetta capsid model of M13 bacteriophage reveals a quadrupled hydrophobic packing epitope. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (4), 971-976 (2015).
  2. Loquet, A., et al. Atomic model of the type III secretion system needle. Nature. 486, (7402), 276-279 (2012).
  3. Demers, J. P., et al. High-resolution structure of the Shigella type-III secretion needle by solid-state NMR and cryo-electron microscopy. Nat Commun. 5, (4976), (2014).
  4. Habenstein, B., et al. Hybrid Structure of the Type 1 Pilus of Uropathogenic Escherichia coli. Angew Chem Int Ed Engl. 54, (40), 11691-11695 (2015).
  5. Cady, S. D., et al. Structure of the amantadine binding site of influenza M2 proton channels in lipid bilayers. Nature. 463, (7281), 689-692 (2010).
  6. Park, S. H., et al. Structure of the chemokine receptor CXCR1 in phospholipid bilayers. Nature. 491, (7426), 779-783 (2012).
  7. Kaplan, M., et al. Probing a cell-embedded megadalton protein complex by DNP-supported solid-state NMR. Nat Methods. 12, (7), 649-652 (2015).
  8. Wang, S., et al. Solid-state NMR spectroscopy structure determination of a lipid-embedded heptahelical membrane protein. Nat Methods. 10, (10), 1007-1012 (2013).
  9. Daskalov, A., et al. Signal transduction by a fungal NOD-like receptor based on propagation of a prion amyloid fold. PLoS Biol. 13, (2), e1002059 (2015).
  10. Daskalov, A., et al. Identification of a novel cell death-inducing domain reveals that fungal amyloid-controlled cell death is related to necroptosis. Proc Natl Acad Sci U S A. (2016).
  11. Li, J., et al. The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell. 150, (2), 339-350 (2012).
  12. Knowles, T. P., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, (6), 384-396 (2014).
  13. Aguzzi, A., Lakkaraju, A. K. Cell Biology of Prions and Prionoids: A Status Report. Trends Cell Biol. 26, (1), 40-51 (2016).
  14. Habenstein, B., Loquet, A. Solid-state NMR: An emerging technique in structural biology of self-assemblies. Biophys Chem. (2015).
  15. Meier, B. H., Bockmann, A. The structure of fibrils from 'misfolded' proteins. Curr Opin Struct Biol. 30, 43-49 (2015).
  16. Miao, Y., Cross, T. A. Solid state NMR and protein-protein interactions in membranes. Curr Opin Struct Biol. 23, (6), 919-928 (2013).
  17. Tang, M., Comellas, G., Rienstra, C. M. Advanced solid-state NMR approaches for structure determination of membrane proteins and amyloid fibrils. Acc Chem Res. 46, (9), 2080-2088 (2013).
  18. Weingarth, M., Baldus, M. Solid-state NMR-based approaches for supramolecular structure elucidation. Acc Chem Res. 46, (9), 2037-2046 (2013).
  19. Loquet, A., Habenstein, B., Lange, A. Structural investigations of molecular machines by solid-state NMR. Acc Chem Res. 46, (9), 2070-2079 (2013).
  20. Yan, S., Suiter, C. L., Hou, G., Zhang, H., Polenova, T. Probing structure and dynamics of protein assemblies by magic angle spinning NMR spectroscopy. Acc Chem Res. 46, (9), 2047-2058 (2013).
  21. Tycko, R., Wickner, R. B. Molecular structures of amyloid and prion fibrils: consensus versus controversy. Acc Chem Res. 46, (7), 1487-1496 (2013).
  22. Hong, M., Zhang, Y., Hu, F. Membrane protein structure and dynamics from NMR spectroscopy. Annu Rev Phys Chem. 63, 1-24 (2012).
  23. Jelinek, R., Ramamoorthy, A., Opella, S. J. High-Resolution Three-Dimensional Solid-state NMR Spectroscopy of a Uniformly 15N-Labeled Protein. J Am Chem Soc. 117, 12348-12349 (1995).
  24. Xu, J., et al. Bicelle-enabled structural studies on a membrane-associated cytochrome B5 by solid-state MAS NMR spectroscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 47, (41), 7864-7867 (2008).
  25. Durr, U. H., Gildenberg, M., Ramamoorthy, A. The magic of bicelles lights up membrane protein structure. Chem Rev. 112, (11), 6054-6074 (2012).
  26. Yamamoto, K., et al. Probing the transmembrane structure and topology of microsomal cytochrome-p450 by solid-state NMR on temperature-resistant bicelles. Sci Rep. 3, 2556 (2013).
  27. Huang, R., et al. Probing the transmembrane structure and dynamics of microsomal NADPH-cytochrome P450 oxidoreductase by solid-state NMR. Biophys J. 106, (10), 2126-2133 (2014).
  28. Durr, U. H., Yamamoto, K., Im, S. C., Waskell, L., Ramamoorthy, A. Solid-state NMR reveals structural and dynamical properties of a membrane-anchored electron-carrier protein, cytochrome b5. J Am Chem Soc. 129, (21), 6670-6671 (2007).
  29. Hong, M. Determination of multiple phi-torsion angles in proteins by selective and extensive (13)C labeling and two-dimensional solid-state NMR. J Magn Reson. 139, (2), 389-401 (1999).
  30. Lundstrom, P., et al. Fractional 13C enrichment of isolated carbons using [1-13C]- or [2- 13C]-glucose facilitates the accurate measurement of dynamics at backbone Calpha and side-chain methyl positions in proteins. J Biomol NMR. 38, (3), 199-212 (2007).
  31. Loquet, A., Lv, G., Giller, K., Becker, S., Lange, A. 13C spin dilution for simplified and complete solid-state NMR resonance assignment of insoluble biological assemblies. J Am Chem Soc. 133, (13), 4722-4725 (2011).
  32. Castellani, F., et al. Structure of a protein determined by solid-state magic-angle-spinning NMR spectroscopy. Nature. 420, (6911), 98-102 (2002).
  33. Higman, V. A., et al. Assigning large proteins in the solid state: a MAS NMR resonance assignment strategy using selectively and extensively 13C-labelled proteins. J Biomol NMR. 44, (4), 245-260 (2009).
  34. Bockmann, A., et al. Characterization of different water pools in solid-state NMR protein samples. J Biomol NMR. 45, (3), 319-327 (2009).
  35. Cavanagh, J., Fairbrother, W. J., Palmer, A. G., Skelton, N. J. Protein NMR spectroscopy, principles and practice. Academic. San Diego. (1996).
  36. Hartman, S. R., Hahn, E. L. Nuclear Double Resonance in the Rotating Frame. Phys Rev. 128, (5), 2042-2053 (1962).
  37. Harris, R. K., et al. Further conventions for NMR shielding and chemical shifts IUPAC recommendations 2008. Solid State Nucl Magn Reson. 33, (3), 41-56 (2008).
  38. Wang, Y., Jardetzky, O. Probability-based protein secondary structure identification using combined NMR chemical-shift data. Protein Sci. 11, (4), 852-861 (2002).
  39. Shaka, A. J., Baker, P. B., Freeman, R. Computer-Optimized Scheme for Wideband Applications and Low-Level Operation. J Magn Reson. 64, 547-552 (1985).
  40. BMRB - Biological Magnetic Resonance Bank. http://bmrb.wisc.edu/ (2017).
  41. Szeverenyi, N. M., Sullivan, M. J., Maciel, G. E. Observation of Spin Exchange by Two-Dimensional Fourier-Transform C-13 Cross Polarization-Magic-Angle Spinning. J Magn Reson. 47, 462-475 (1982).
  42. Baldus, M., Petkova, A. T., Herzfeld, J., Griffin, R. G. Cross polarization in the tilted frame: assignment and spectral simplification in heteronuclear spin systems. Mol Phys. 95, (5), 1197-1207 (1998).
  43. Verel, R., Ernst, M., Meier, B. H. Adiabatic dipolar recoupling in solid-state NMR: the DREAM scheme. J Magn Reson. 150, (1), 81-99 (2001).
  44. CcpNmr Analysis — Collaborative Computational Project for NMR. http://www.ccpn.ac.uk/software/analysis (2017).
  45. Sparky - NMR Assignment and Integration Software. https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ (2017).
  46. Luca, S., et al. Secondary chemical shifts in immobilized peptides and proteins: a qualitative basis for structure refinement under magic angle spinning. J Biomol NMR. 20, (4), 325-331 (2001).
  47. TALOS+: Prediction of Protein Backbone Torsion Angles from NMR Chemical Shift. http://spin.niddk.nih.gov/bax/software/TALOS/ (2017).
  48. Shen, Y., Bax, A. SPARTA+: a modest improvement in empirical NMR chemical shift prediction by means of an artificial neural network. J Biomol NMR. 48, (1), 13-22 (2010).
  49. SHIFTOR Dihedral angles from chemical shifts and homology. http://wishart.biology.ualberta.ca/shiftor/ (2017).
  50. Berjanskii, M. V., Neal, S., Wishart, D. S. PREDITOR: a web server for predicting protein torsion angle restraints. Nucleic Acids Res. 34, (Web Server issue), W63-W69 (2006).
  51. Bardiaux, B., Malliavin, T., Nilges, M. ARIA for solution and solid-state NMR. Methods Mol Biol. 831, 453-483 (2012).
  52. Guerry, P., Herrmann, T. Comprehensive automation for NMR structure determination of proteins. Methods Mol Biol. 831, 429-451 (2012).
  53. Vasa, S., et al. beta-Helical architecture of cytoskeletal bactofilin filaments revealed by solid-state NMR. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (2), E127-E136 (2015).
  54. He, L., et al. Structure determination of helical filaments by solid-state NMR spectroscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, (3), E272-E281 (2016).
  55. Tang, M., et al. High-resolution membrane protein structure by joint calculations with solid-state NMR and X-ray experimental data. J Biomol NMR. 51, (3), 227-233 (2011).
  56. Paravastu, A. K., Leapman, R. D., Yau, W. M., Tycko, R. Molecular structural basis for polymorphism in Alzheimer's beta-amyloid fibrils. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (47), 18349-18354 (2008).
  57. Schutz, A. K., et al. Atomic-resolution three-dimensional structure of amyloid beta fibrils bearing the Osaka mutation. Angew Chem Int Ed Engl. 54, (1), 331-335 (2015).
  58. Sgourakis, N. G., Yau, W. M., Qiang, W. Modeling an in-register, parallel "iowa" abeta fibril structure using solid-state NMR data from labeled samples with rosetta. Structure. 23, (1), 216-227 (2015).
  59. Lewandowski, J. R., De Paepe, G., Griffin, R. G. Proton assisted insensitive nuclei cross polarization. J Am Chem Soc. 129, (4), 728-729 (2007).
  60. Carlon, A., et al. How to tackle protein structural data from solution and solid state: An integrated approach. Prog Nucl Magn Reson Spectrosc. 92-93, 54-70 (2016).
  61. Judge, P. J., Taylor, G. F., Dannatt, H. R., Watts, A. Solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy for membrane protein structure determination. Methods Mol Biol. 1261, 331-347 (2015).
  62. Wang, S., Ladizhansky, V. Recent advances in magic angle spinning solid state NMR of membrane proteins. Prog Nucl Magn Reson Spectrosc. 82, 1-26 (2014).
  63. Sborgi, L., et al. Structure and assembly of the mouse ASC inflammasome by combined NMR spectroscopy and cryo-electron microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (43), 13237-13242 (2015).
  64. Loquet, A., et al. Atomic structure and handedness of the building block of a biological assembly. J Am Chem Soc. 135, (51), 19135-19138 (2013).
  65. Walti, M. A., et al. Atomic-resolution structure of a disease-relevant Abeta(1-42) amyloid fibril. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, (34), E4976-E4984 (2016).
  66. Colvin, M. T., et al. Atomic Resolution Structure of Monomorphic Abeta42 Amyloid Fibrils. J Am Chem Soc. 138, (30), 9663-9674 (2016).
  67. Xiao, Y., et al. Abeta(1-42) fibril structure illuminates self-recognition and replication of amyloid in Alzheimer's disease. Nat Struct Mol Biol. 22, (6), 499-505 (2015).
  68. Tuttle, M. D., et al. Solid-state NMR structure of a pathogenic fibril of full-length human alpha-synuclein. Nat Struct Mol Biol. 23, (5), 409-415 (2016).
  69. Wasmer, C., et al. Amyloid fibrils of the HET-s(218-289) prion form a beta solenoid with a triangular hydrophobic core. Science. 319, (5869), 1523-1526 (2008).
  70. Van Melckebeke, H., et al. Atomic-resolution three-dimensional structure of HET-s(218-289) amyloid fibrils by solid-state NMR spectroscopy. J Am Chem Soc. 132, (39), 13765-13775 (2010).
  71. BMRB Solid-state NMR entries. http://www.bmrb.wisc.edu/data_library/solidstate.shtml (2017).
  72. Lamley, J. M., et al. Solid-state NMR of a protein in a precipitated complex with a full-length antibody. J Am Chem Soc. 136, (48), 16800-16806 (2014).
  73. Agarwal, V., et al. De novo 3D structure determination from sub-milligram protein samples by solid-state 100 kHz MAS NMR spectroscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 53, (45), 12253-12256 (2014).
  74. Stanek, J., et al. NMR Spectroscopic Assignment of Backbone and Side-Chain Protons in Fully Protonated Proteins: Microcrystals, Sedimented Assemblies, and Amyloid Fibrils. Angew Chem Int Ed Engl. 55, (50), 15504-15509 (2016).
  75. Baker, L. A., Baldus, M. Characterization of membrane protein function by solid-state NMR spectroscopy. Curr Opin Struct Biol. 27, 48-55 (2014).
  76. Luchinat, E., Banci, L. In-cell NMR: a topical review. IUCrJ. 4, (Pt 2), 108-118 (2017).
  77. Freedberg, D. I., Selenko, P. Live cell NMR. Annu Rev Biophys. 43, 171-192 (2014).
  78. Selenko, P., Wagner, G. Looking into live cells with in-cell NMR spectroscopy. J Struct Biol. 158, (2), 244-253 (2007).
  79. Qiang, W., Yau, W. M., Luo, Y., Mattson, M. P., Tycko, R. Antiparallel beta-sheet architecture in Iowa-mutant beta-amyloid fibrils. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (12), 4443-4448 (2012).
  80. Bateman, D. A., Tycko, R., Wickner, R. B. Experimentally derived structural constraints for amyloid fibrils of wild-type transthyretin. Biophys J. 101, (10), 2485-2492 (2011).
  81. Marchanka, A., Simon, B., Althoff-Ospelt, G., Carlomagno, T. RNA structure determination by solid-state NMR spectroscopy. Nat Commun. 6, 7024 (2015).
  82. Schutz, A. K., et al. The amyloid-Congo red interface at atomic resolution. Angew Chem Int Ed Engl. 50, (26), 5956-5960 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics