Author Produced

Atomik yapısal çalışmaların makromoleküllerin meclisleri tarafından katı hal Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi

Biochemistry
 

Summary

Supramolecular protein derlemeler atomik çözünürlükte yüksek alaka nedeniyle çok önemli rolleri biyolojik olayları çeşitli yapılardır. Burada, biz bir protokol tarafından magic-açı katı hal Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (MAS SSNMR) iplik çözünmez ve kristal makromoleküllerin protein derlemeler üzerinde yüksek çözünürlüklü yapısal çalışmalar gerçekleştirmek için mevcut.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Loquet, A., Tolchard, J., Berbon, M., Martinez, D., Habenstein, B. Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. J. Vis. Exp. (127), e55779, doi:10.3791/55779 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Supramolecular protein derlemeler biyolojik süreçlerin ana bilgisayar-patojen etkileşim, nörodejeneratif hastalıkların yayılması için viral enfeksiyon arasında değişen temel rol oynar. Bu tür derlemeleri çeşitli hücresel işlevler yürütmek veya zararlı sonuçlara neden büyük makromoleküllerin nesneleri oluşturmak için kovalent olmayan şekilde organize birden fazla protein alt oluşur. Atomik yorumlara derleme mekanizmaları ve makromoleküllerin bu derlemelerinin çalıştığını kez onların doğasında insolubility beri kıt kalır ve sigara crystallinity kez büyük ölçüde çoğu teknikleri elde edilen verilerin kalitesini azaltır x-ışını kristalografisi ve çözüm Nükleer manyetik rezonans (NMR) gibi Yapısal Biyoloji kullanılır. Burada atomik çözünürlükte makromoleküllerin derlemeler yapılarının araştırmak için güçlü bir yöntem olarak magic-açı iplik solid-state NMR spektroskopisi (SSNMR) mevcut. SSNMR boyut ve çözünürlük sınırlamalar olmadan montajı karmaşık atomik detayları ortaya çıkarabilir. Burada sunulan protokolü 13C üretiminden önemli adımları açıklar /15N makromoleküllerin protein izotop etiketli derlemeler standart SSNMR spectra ve onların analizi ve yorumu edinimi için. Örnek olarak, boru hattının SSNMR yapısal çözümleme ipliksi protein derleme gösteriyoruz.

Introduction

Büyü-açı katı hal Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (SSNMR) iplik gelişmeler makromoleküllerin protein derlemeler bir atomik çözünürlükte yapısal karakterizasyonu için verimli bir araç sunar. Bu protein derlemeler birçok biyolojik süreçlerinde önemli rol oynarlar her yerde sistemlerdir. Moleküler yapıları, etkileşimleri ve dinamikleri için gösterildiği gibi SSNMR çalışmaları tarafından erişilebilir viral (capsids1) ve bakteriyel enfeksiyon mekanizmaları (salgı sistemleri2,3, pili4), membran protein kompleksleri5,6,7,8 ve fonksiyonel amyloids 9,10,11. Bu moleküler derleme türünü de nerede proteinler misfolded, amiloid Devletleri'nde birleştirin ve anormal hücre davranış veya hücre ölüm 12,13neden nörodejeneratif hastalıklarda gibi patolojiler sebep olabilir. Protein derlemeler kez büyük supramolecular nesneler liflerinde, filamentler, gözenekleri, tüpler veya nano tanecikleri gibi çeşitli şekiller içine protein alt katları kopyasını simetrik Oligomerizasyonda tarafından inşa edilir. Kuvaterner mimari protein alt uzamsal ve geçici derleme düzenlemek ve sofistike biyolojik fonksiyonlar için izin için arasındaki zayıf etkileşimler tarafından tanımlanır. Bu derlemeler atomik bir ölçekte, yapısal araştırmalar yüksek çözünürlüklü teknikleri için bir meydan okuma kendi içsel insolubility beri vardır ve çok sık olmayan kendi crystallinity geleneksel x-ışını kristalografisi veya çözüm NMR kullanımını sınırlar yaklaşıyor. Büyü-açı (MAS) SSNMR iplik çözünmez makromoleküllerin derlemeler üzerinde atomik çözünürlük verileri elde etmek için ortaya çıkan bir tekniği ve giderek artan sayıda dahil olmak üzere karmaşık biyomoleküler sistemleri için 3D atom modelleri gidermek için verimlilik kanıtlamıştır Bakteriyel filamentler, amiloid derlemeler ve viral parçacıkların 14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Yüksek manyetik alanlar, metodolojik gelişmeler ve numune hazırlama teknik gelişmeler onların biyolojik ilgili başta olmak üzere çeşitli ortamlarda çözünmez proteinler makromoleküllerin araştırmak için sağlam bir yönteme MAS SSNMR kurmuştur devlet veya hücresel membranlarda, bu teknik son derece cryo-elektron mikroskobu tamamlayıcı yapım toplandı. Çoğu durumda, bu tür protein derlemeler çok yüksek bir simetri belirtir. MAS SSNMR yararlanan bu özellik, tüm protein alt homomolecular derlemesi içinde aynı yerel yapıya olurdu gibi ve bu nedenle büyük ölçüde analizi karmaşıklığını azaltarak hemen hemen aynı SSNMR imza,.

Makromoleküllerin protein meclisleri tarafından orta MAS yapısal çalışmaları için verimli bir iletişim kuralı (< 25 kHz) SSNMR Bu videoda sunulur ve içine farklı adımlar (şekil 1) bölünmüştür. Biz iş akışı örneği için her protein farklı bir ipliksi protein derleme ( şekil 1' deki vurgulanır bkz: adım), protein alt birimi arıtma dışında bir SSNMR yapısal çalışmanın kritik aşamalarında gösterecektir derleme ama kritik öneme sahip yapısal Etütler ve SSNMR spektroskopisi ve yapısı hesaplama ne özel öğreticiler için teknik/metodolojik ayrıntılarını girmeden olmadan online olarak mevcuttur. Mevcut iletişim kuralı öncelikle MAS koşullar altında gerçekleştirilen solid-state NMR deneyler ele alınacak iken, biyolojik ortamlar 23,24,25,26 kullanımını hizalı , 27, hizalanmış bicelles gibi protein uyum ve dinamik protein-protein etkileşim MAS teknoloji olmadan membran benzeri ortamda incelenmesi için izin verir. Biz çok önemli SSNMR spectra ve onların analizi ve yorumu kayıt yanı sıra protein ifade ve derleme adımları gösterir. Amacımız SSNMR tekniklerle makromoleküllerin derleme bir atomik çözünürlüklü yapısal çalışma gerçekleştirmek için okuyucu etkinleştirme yapısal analiz boru hattı anlayışlar sağlamaktır.

İletişim kuralı 3 bölümleri kapsar:

1. solid-state NMR örnek üretim

Bir solid-state NMR analizi için bir ön koşul, protein bileşenleri ifade edilecek makromoleküllerin derleme gereksiniminin, izotop etiketli, saflaştırılmış ve monte vitro yerli gibi karmaşık duruma (için bir örnek bkz: Şekil 2) . Yüksek NMR hassasiyet sağlamak için izotop zenginleştirme 13C ve 15N etiketleme 13C ve düzgün 13 gibi 15N kaynakları ile takıma en az bakteriyel ifade medya aracılığıyla gereklidir C harfiyle glikoz/gliserol ve 15NH4Cl anılan sıraya göre. İletişim kuralı daha sonraki aşamada, 13C harfiyle örnekleri seçerek C harfiyle kaynakları gibi seçmeli olarak 13ile üretilen (1,3 -13C)- ve (2 -13C)-gliserol (veya (1 -13C)- ve (2 -13C)- glikoz) NMR analizi kolaylaştırmak için kullanılır. Karışık etiketli örnek ekimolar karışımı %50 15N - ve C harfiyle veya %50 %50 13için karşılık gelen (1,3 -13C)- ve % 50 (2 -13C)-glikoz cins tespiti açıklamak için sunulmaktadır etkileşimler. Protein saflık yanı sıra derleme adımı sırasında sıkı koşullar büyük ölçüde son örnek homojen bir yapı sırasını sigortalamak için anahtar faktörler vardır.

2. ön yapısal karakterizasyon tek boyutlu (1 D) solid-state NMR üzerinde dayalı

Biz SSNMR göre yapısal analiz için gerekli deneyleri mevcut. Tek boyutlu (1D) çapraz-polarizasyon (CP) ve INEPT / RINEPT28 deneyler, 13C çekirdeği üzerinde tespit katı ve esnek protein parçaları derlemede, sırasıyla algılamak ve yapısal derecesini tahmin etmek için kullanılır homojenliği ve yerel polimorfizmi (için bir örnek bkz. şekil 3).

Rong > 3. Konformasyon analizi ve 3D belirlenmesi yapısı

Alt bölüm 1 ve 2 olarak kimyasal vardiya yerel çevre için çok hassas probları ve phi/psişik tahmin etmek için kullanılan tüm katı artıkları protein derleme SSNMR rezonans göreve dayalı konformasyon analizi, endişe dihedral açılar ve böylece ikincil yapı belirlemek. Şekil 4 katı çekirdek bir sıralı rezonans atama bir protein derleme. örneği gösterilmiştir Kodlama mesafe kısıtlamaları proximities kapatmak gibi 3D yapı belirlenmesi yapısal veri toplama dayanarak (< 7-9 Å), içi - hem cins bilgi içeren. Alt bölüm 3 ve 4 uzun menzilli uzak tutma toplama ve yorumlama açıklar. Uzun menzilli kişiler doğan kalıntı ben j için ile intramolecular 13C -13C proximities olarak tanımlanır | i-j | ≥4, böylece Tersiyer protein kat bir monomeric alt birimi veya cins 13C -13C proximities olarak tanımlama, protein alt montaj arasında cins arabirimler tanımlama. Intra - ve cins arabirimleri şekil 5' te gösterilmiştir. SSNMR bağlar tespit 13-C -13C ve 15N -13C recoupling deneyler genellikle kodlamak için internuclear mesafeler < 1 nm. Alt bölüm 4 cins mesafe kısıtlamaları tespiti açıklar. Simetrik protein meclisleri, homojen etiketli örnekleri (Yani düzgün veya seçmeli olarak etiketli % 100) kullanımı cins alt birim-alt birim etkileşimleri tanımlayan sınırlı olduğu için her iki Intra - ve arası - molecular olarak kişiler neden algılanabilir sinyalleri. Cins proximities kesin tespiti toplama önce kombine iki farklı etiketli örnek ekimolar bir karışımı içeren karma etiketli örnekleri kullanılarak elde edilir. Alt 5 yapı modelleme kısaca tanıtır.

Figure 1
Resim 1 : İş akışı solid-state NMR tarafından bir atomik çözünürlüklü yapısal çalışmanın. 13 C, 15N izotop etiketli protein üretim, alt birim arıtma, alt birim derleme, derleme oluşumu, SSNMR deneyleri, SSNMR deney analizi ve mesafe kısıtlamaları çıkarımı kontrol ve yapı modelleme gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Protocol

1. solid-state NMR örnek productiona

  1. Üretim düzgün 13 C / 15 N etiketli protein alt
    1. taze dönüştürülmüş, kullanım pET24-peptit-6his plazmid-içeren E. coli BL21 (DE3) hücreleri, onları hazırlanmış agar plakadan hasat.
    2. Bir koloni ile Önceden ısıtılmış LB orta 15 mL öncesi kültürü aşılamak. 37 ° C'de gecede 200 rpm sallayarak ile kuluçkaya.
    3. Transfer öncesi kültür Önceden ısıtılmış M9 orta ana kültürünün 1 L (bkz. Tablo 1 kompozisyon) gerekli izotop etiketli karbon ve azot kaynakları içeren.
      Not: Bu aynı şekilde 13 C harfiyle glikoz, seçici olabilir (1 - 13 C)- veya (2 - 13 C)-glikoz 29 , 30 , 31 veya () etiketli 1,3 - 13 C)- veya (2 - 13 C)-gliserol 32 , 33 etiketli.
    4. Bu 37 ° C'de kuluçkaya ve kültür bulanık geçer geçmez OD 600 ölçün. OD 600 0,8 değeri erişildiğinde protein ifade ile 0,75 mM IPTG 4 h için ikna etmek
      Not: En iyi indüksiyon koşulları bir protein değişebilir.
    5. Tarafından 30 dakika aralıklarla 6000 g x ve 4 hücreleri kurtarmak ° C.
  2. (Video protokolünde gösterilmez) arıtma kroki
    1. sonication veya lizozim tedavisi gibi standart teknikleri kullanarak hücreleri parçalayıcı ve kurulan veya için uyarlanmış teknikleri kullanarak protein alt birimi arındırmak protein meclis soruşturma.
      Not: Protein dahil organları, kontrol protein yerelleştirme için hücre lizis ve sonraki Santrifüjü tarafından belirtilebilir. Protein tortu hücre artıkları ile içinde bulunursa, bu organları eklenmesi birikmiş olan.
    2. Test ifade ve protein örnek örneğin tarafından bir standart 12-%15 Tris-Tricine SDS-sayfa, saflığı bkz: şekil 2A. Saflık protein monte yeterli olduğunu, aksi takdirde bir takıma giren arıtma adım gerçekleştirin.
  3. İn vitro olarak protein filamentler Meclisi
    1. kontrol protein konsantrasyonu arıtılmış çözümde. Protein emici artıkları içeriyorsa, bir UV Spektrofotometre 280, emme ölçmek nm. Spektrofotometre kalibrasyonu olarak saf arabelleği yerleştirin ve sonra protein Absorbans ölçmek.
    2. Hesaplamak adapte bira-Lambert yasa ile protein alt birimi emme katsayısı kullanarak protein konsantrasyonu: bir λ ε λ = x u x c; burada A IS optik yoğunluğu belirli dalga boyu λ; ε olduğunu özgül emilme katsayısı; l optik merminin cm uzunluğundadır; c konsantrasyonu mol/l içinde olduğunu
    3. Protein konsantrasyonu 1 mm bir santrifüj filtre biriminde konsantre ol. Örnek santrifüj filtre birim içine tanıtmak ve 4000 x g 30 dk için de santrifüj kapasitesi, filtre ünitesi çözümde protein ifade filtre, önlemek için bir damlalıklı ile karışımı yavaşça. İstenen konsantrasyon ulaşılana kadar prosedürü tekrarlayın.
      Not: En iyi derleme toplama sistemine bağlıdır ve (genellikle 0,1 arasında - 1 mM) optimize edilmiş olması gerekiyor. Eğer bir ekimolar etiketli karışık örnek iki farklı etiketli protein toplu işlemleri hazırlanır (örneğin (50/50) (U - 15 N)-/ (U - 13 C)-etiketli), karıştırma gerekir yerini alacak önce veya sonra emin olmak için tam konsantrasyon adım homojenizasyon karışık çözüm.
    4. Örnek bir tüpün içine aktarmak ve ajitasyon oda sıcaklığında bir hafta altında kuluçkaya.
    5. Polimerizasyon genellikle filamentler içine alt birimleri, bulanık hale çözüm tarafından eşlik ediyor. Mikroskobik Fibriller morfoloji ve homojenliği örneğin elektron mikroskobu (6300 X - 45000 X büyütme) tarafından kontrol, şekil 2B.
    6. Santrifüj örnek için 1 h 20000 g x ve 4 ° C. Kaldır süpernatant, çoğunluğu sadece yeterli sıvı örnek kurutma önlemek için yüzey kapsayacak şekilde bırakın. Süpernatant olmayan birleştirilmiş alt birimleri üzerinde UV Spektrofotometre için kontrol edin.
    7. Yıkama örnek H 2 O ekleyerek ve dikkatli bir pipet ile içerik resuspend. Değil girdap yapmak. Örnek 22000 g x ve 4 30 dk için spin ° C. çamaşır adım 3 kez tekrarlayın. Pelet korur tüm çamaşır adımları sırasında onun boy Santrifüjü sonra kontrol edin ve süpernatant olmayan birleştirilmiş alt birimleri üzerinde UV Spektrofotometre için kontrol edin.
    8. Bakteriyel kontaminasyon ve örnek depolamak için %0,02 (w/v) sodyum azid (NaN 3) ölçüm 4 kadar eklemek ° C.
  4. Doldurma solid-state NMR rotor
    1. santrifüj kapasitesi, 22000 g ve 4 ° C. Kaldır en fazla süpernatant x 30 dk için iki kere; elde edilen örnek tutarlılık protein derleme üzerinde bağlıdır ve genellikle jel gibi bir şey mevduat.
    2. Örnek SSNMR rotor eklemek için bir kılcal damlalıklı kullanın.
      Not: Burada, bir 4 mm çap rotor üzerinde yordamı mevcut.
      1. Santrifüj rotor bir tabloda santrifüj yavaşça rotor örnek tanıtmak. Rotor doldurulana kadar yordamı yineleyin. Rotor rotor kapağı ile kapatmak için en az alanı tutun. Örnek miktarı yeterli değilse, örnek dağıtım homojenliği Open End sağlamak için kalan alanı doldurmak için piyasada bulunan bir ekleme tanıtmak.
        Not: Bağımlı birleştirilmiş örnek tutarlılık, daha ince bir spatula, özellikle çok yoğun örnekleri kullanmak yeterli olabilir. Rotor çapı 2,5-4 mm orta MAS frekanslarda kullanılır.
    3. İç kimyasal shift ve sıcaklık kalibrasyonu için ekleyin 4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic asit (DSS) izleri.
    4. Bir kapanış aygıtı ile kap kapatmak.
    5. Kap de eklenen ve tamamen kapalı bir büyüteç altında kontrol edin.

Figure 2
Şekil 2: temsilcisi sonuçları için protein alt birimi arıtma ve montaj. A) %15 Tris-tricine SDS-sayfa bir protein alt birimi (onun 6 dahil olmak üzere-etiket) arınma farklı aşamalarında. Lane 1 - Protein molekül ağırlığı işaret; Lane 2 - E. coli BL21 (DE3) hücreleri uninduced kontrolü; Lane 3 - E. coli BL21 (DE3) hücreleri indüklenen 0,75 mM, IPTG; çözündürüldükten lane 4 - dahil organları lane 5 - hücre lysate süpernatant kesirler; Nikel metal benzeşme Kromatografi (IMAC) FPLC ve desalting immobilize sonra saf lane 6 - kesir. B) olumsuz tarafından TEM görüntüleme protein liflerinde lekeli. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

2. ön yapısal karakterizasyon dayalı tek boyutlu (1 D) solid-state NMR

  1. ilk kurulum ve 1 D çapraz-polarizasyon (CP)
    1. rotor NMR mıknatıs içine eklemek
    2. başlar 5 kHz frekans rotor spin ve ±10 Hz bir sabitleme için bekleyin sonra 7 kHz kadar hızlandırmak. Ayarlamak ve 1 H, 13 C ve 15 N kanalları aynı. Sıcaklık 2-10 ° C (275-283 K); ayarla Örnek 7 kHz MAS Isıtma düşük ve sıcaklık ayarı genellikle bu MAS frekansta gerekli değildir.
    3. Tek Geniş puls 1 D 1 H spektrum 16 taramaları kullanarak kaydetmek.
      Not: Güç seviyeleri daha önce bir referans bileşik üzerinde optimize edilmiştir gerekir (bir 13 C gibi / < sup > 15 N histidin veya glisin), hedef örnek üzerinde; deneyler güç seviyelerinde en iyi duruma getirme için başlangıç değerleri sağlamak için Bu yordamı bir rutin görev ve bu nedenle dışarı-in bu protokol kapsamında değil.
    4. Su örneklerinde sıcaklık toplu su 1 H rezonans DSS sinyal 34 ile ilgili göreli kayması yansıtılır 2-10 ° C arasındaki tüm deneyler sırasında sıcaklık tutmak. İlişki δ (H 2 O) takip ısısını ölçmek 7,83-T/96,9 bir duyarlılığa 1-2 ° C 35 =.
    5. Küme istenen kadar MAS frekans ve istikrar ±10 Hz kadar bekleyin.
      Not: Burada bu 11 kHz frekans için gösterilmiştir.
    6. Tune ve maç 1 H ve 13 C tekrar kanalları ve 1 D 1 H deneme yardımıyla sıcaklığı ayarlayın.
    7. Set up 1 D 1 H - 13 C CP 36.
      Not: Kalıntıları katı bir biçimsel kaynaklanan sinyalleri CP deneyler göster. Zaman duyarlılık sinyalleri daha az 32 ~ taramaları sonra gözlemlemek için yüksek darbe kalibrasyon ve parametreleri ayırımı doğrudan örnek üzerinde getirilebilir. İlk optimizasyonu değerleri standart optimizasyonu üzerinde bir başvuru bileşik alınır. CP kişi zaman ve güç seviyeleri maksimal sinyal şiddeti göre seçilir. Protein örnekleri, en uygun CP kişi genellikle 200 µs ve 2 Bayan akıntısındaki parametreleri aynı zamanda bir referans bileşik üzerinde kalibrasyon üzerinden yeniden ayarlanması gereken arasında tam zamanı.
      1. Dikkatle gözlemlemek sidebands verilen MAS frekansta iplik yerelleştirme.
    8. 1 D spektral parmak izi kadar hizmet veren bir başvuru 1 D 13 C CP spektrum kaydetmek. Tipik parametreleridir 128 inceden inceye gözden geçirmek, 1 ms CP temas süresi, ayırımı gücü, bir geri dönüşüm gecikme 3 s ve Alım 25 ms 100 kHz.
    9. 1 H ve 13 C kimyasal vardiya IUPAC öneriler 37 takip kalibre. 1 H DSS sinyal (0 ppm kimyasal kayma); rezonans frekansını belirlemek 13 C kimyasal vardiya 1 H vardiya (genellikle ~ 13 C oranı elde edilen için 1 H rezonans frekansı 37 0.25144,) için başvuruda bulunulan.
    10. 1 D 1 H - 13 C CP apodization deneme süreci (bkz şekil 3A ve B-homojen iyi sipariş edilen protein derleme algılamayı için) fonksiyonu. İzole bir tepe örneğinde, yapısal düzen ve homojenliği gösterge linewidth tahmin etmek için seçin. Tipik 13 C linewidths yüksek manyetik alanlar, MAS altında iyi sipariş edilen biyolojik protein derlemeler için aralığı arasında 20-150 Hz (yarım yükseklikte (FWHH) tam genişlikte olarak ölçülür).
    11. Tahmin sinyal-gürültü (S/N) oranı CP spektrumda.
      Not: S/N oranı esas olarak örnek miktarı rotor, protein yapısına sertlik ve tek bir moleküler uyum varlığı derecesi gibi birçok etkene bağlıdır. Bir sinyal spektrumda 64 inceden inceye gözden geçirmek ile kaydedilen bir en iyi duruma getirilmiş 1 D 1 H - 13 C CP gözlem yapılırsa kural olarak bir örnek çok boyutlu SSNMR spektroskopisi için uygun olmalıdır.
    12. (Çoğunlukla) 165-180 ppm arasında lokalize protein omurga karbonil rezonanslar spektral bölge yakınlaştırmak. Derleme konumunu protein omurga karbonil rezonanslar rezonanslar üzerinden artıkları ile α-Helisel tarafından ikincil yapı içeriğinde tahmin veya β-strand conformation sahanın ortasına doğru kaymıştır ya da dogru, sırasıyla (bkz. şekil 3B çoğunlukla α-Helisel bir alt birim için) 38.
  2. 1 D INEPT deneme
    1. son derece mobil parçalar (alt-µs) protein derleme yoklama için bir 1 D 1 H - 13 kadar C BECERİKSİZ deneme ayarlayın.
      Not: GARP bir kaç kHz edinme 39 sırasında ayırımı sık, kısa interscan gecikmeler için izin vermek için kullanılan (genellikle 1 s) sonda zarar olmadan.
    2. Bu mobil protein kesimleri için parmak izi olarak hizmet veren bir başvuru BECERİKSİZ spektrum kayıt; 128 inceden inceye gözden geçirmek ve bir satın alma süresi 25 Bayan tipik parametreleridir
    3. İşlemi 1 H - 13 C BECERİKSİZ deneme. Tutar ve sinyalleri konumunu sırasıyla mobil artıkları ve amino asit kompozisyonu miktarını işaret etmektedir.
      Not: 1 D BECERİKSİZ spektrumunda sinyalleri varsa aynı zamanda bir 2D 1 H - 13 C BECERİKSİZ deneme kaydı (örnek için bkz: şekil 3 c) daha özel bir amino asit kimlik izin vermek için. Belirsiz atama durumda biz arabelleği bileşeni sinyal pozisyonlar çözüm NMR tarafından kontrol öneririz.
    4. BMRB veritabanı 40 kullanın ve rasgele bobin conformation yakınındaki onların karşılık gelen amino asit rezonanslar atamak için veri 38 Yayınlanan; yalnızca mobil arabellek bileşenleri yüklenmemişse spektrum içerir artıkları vardır son derece mobil rejimin.

Figure 3
şekil 3: temsilcisi sonuçları SSNMR spectra alımı iyi yapılandırılmış protein derleme için. a) 13 C tespit FID 1 H - 13 C çapraz-polarizasyon deney. B) 1 H - 13 C çapraz-polarizasyon denemesi. C) 1 H - 13 katı protein derleme C BECERİKSİZ deneme; yalnızca arabellek bileşenleri tarafından görülebilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

3. konformasyon analizi ve 3D yapı belirlenmesi

  1. sıralı rezonans atama
    1. ayarla kadar 2D 13 C - 13 C proton güdümlü spin Difüzyon (PDSD) 41 deneme Intra-kalıntı 13 C - 13 C korelasyon yan zincirleri de dahil olmak üzere, algılamak için. İlk 1 H - 13 C çapraz-polarizasyon adım 1 D 1 için değerleri üzerinde H - 13 C CP deneyi ele alalım.
      1. C harfiyle örnekleri düzgün 13 C harfiyle örnekleri için 50 ms ve seçmeli olarak 13 100 ms karıştırma saatini ayarlayın. 5-25 ms ve 15-25 ms (örneği içinde ücretsiz indüksiyon çürüme (FID) uzunluğunda görünür sinyal tarafından tahmin edilebilir içsel spektral çözünürlük bağımlı arasında doğrudan satın alma arasında dolaylı edinme süresini ayarlamak şekil 3A).
      2. Spektrumunda sinyal-gürültü ve çözünürlük açısından en uygun değerleri bulmak için çeşitli işleme parametreleri test, genellikle yeterli işleme bir sinüs çan kayması 2.5-4 ile (SSB) qsine penceresi işlevi kullanılarak elde edilebilir.
    2. Bağlanma çoğunlukla ben - i±1, sıralı 13 C - 13 C korelasyon tespit etmek kurmak, kayıt ve işlemi bir 2D 13 C - 13 C PDSD bir ara karıştırma zaman deney ile ama aynı zamanda i±2 ve i±3 artıkları, bağlı olarak protein omurga sertlik ve ikincil yapı elemanları. Karıştırma zamanı düzgün etiketli örnekleri için 100-200 ms arasında ayarlanmalıdır. Diğer tüm değerler zaman 2D 13 C - 13 C PDSD karıştırma kısa alınabilir.
    3. Ayarla kayıt ve bir 2D 15 N - 13 C N ben CA ben ve N ben CO ben deneme bir CP 1 H - 15 N ve belirli bir CP 15 N - 13 C transfer kullanarak işlemi, 42. 1 D moda doğrudan ilgi, sırasıyla CA veya karbonil bölgesindeki maksimal yoğunluk dayalı örnek üzerinde 15 N - 13 C polarizasyon aktarma en iyi duruma getirme. TypiCal belirli CP kişi saat değerleri arasında 2-6 Bayan
    4. , kayıt ve 2D 15 N-(13 C-) 13 C birtakım deneyler atama amacıyla işlem ayarlayın.
      Not: İlk 15 N - 13 C polarizasyon aktarma parametre değeri N ben CA ben alınabilir / N ben CO ben deneyler. Intra-kalıntı korelasyon N ben 43 ve PDSD 13 C - 13 C (CA ben) CB ben ve sırasıyla kullanarak N ben (CA ben) CO ben, hayal kurulur polarizasyon aktarır. Kalıntı (i) için kalıntı (i-1) sıralı bağlantı N ben (CO i-1) CA i-1 ve N ben (CO i-1) CX i-1 deneyler, elde edilen her iki kullanarak bir PDSD 13 C - 13 C polarizasyon transfer.
    5. Seç bir NMR analizi programı CcpNmr analiz 44 veya kabarık tüy 45 gibi
    6. 2D spectra (CcpNmr analizi ile örneği) yazılım yüklemek ve birincil protein sıra yük.
    7. Amino asit türleri içinde kısa karıştırma 13 görülebilir kimlik C - 13 C PDSD spektrum başlayın. Bağlanmak için izin vermek için spin sistemleri karbon atomlarının " kalıntı tipi " belirli atama; şekil 4A treonin kalıntı atama için görürsünüz. Birçok kalıntı mümkün olduğunca tanımlamak; Bu protein alt birimi boyutu, spektral çözünürlüklü ve dağılım bağlıdır.
    8. Yerleşimi kısa-orta-karıştırma 13 C - 13 C PDSD spektrum ile karıştırma.
      Not: Ek doruklarına orta karıştırma PDSD görünür çoğunlukla sıralı üzerinden ortaya (kalıntı ben - kalıntı i±1) kişiler. Örnek 2-kalıntı sıralı atama için şekil 4B ' gösterilmektedir.
      1. Bir spin sistemi rezonans doruklarına işaretlemek ve orta karıştırma PDSD rezonans frekansları diğer spin sistemleri ile korelasyon bulun. Küçük proteinler veya peptidler, 2D 13 C - 13 C PDSD deney dayalı tüm sıralı rezonans atama elde etmek mümkün olabilir.
        Not: β-strand ikincil yapı motifleri kalıntı daha yoğun sinyaller uzayda yakınlıkları nedeniyle sıralı kişiler daha i - kalıntı i±2 13 C - 13 C kişiler gösterebilir; α-Helisel ikincil yapı motifleri kalıntı içinde i - kalıntı i±3 13 C - 13 C kişiler de yoğun sinyaller için neden olabilir.
    9. Orta karıştırma PDSD deneyler seçmeli olarak 13 C harfiyle örnekleri üzerinde yoksa, onları kısa karıştırma spektrum yerleşimi (Eğer elde edilebilir üstünde seçmeli olarak 13 C harfiyle örnek) ve ek atama tepeler, seçici 13 C etiketleme dikkate alarak desen (1,3 - 13 C ve 2 - 13 C gliserol 32 , 33 veya 1 - 13 C ve 2 13 C glikoz 29 , 30 , 31.
      Not: Örneğin, içinde 2 - 13 C gliserin etiketli birkaç amino asit türü etiketli Cα pozisyonu bitişik karbonlar olmadan üzerinde örnek (Cβ ve C ') etiketli, bu nedenle lehine Cα Cα bitişik artıkları arasında aktarın. Seçmeli olarak etiketli örnekleri, uzun menzilli 13 C - 13 C korelasyon zaten Orta karıştırma 13 C - 13 ' te C PDSD deneyler kurmak. Eğer bir tepe tarafından sıralı bir korelasyon açıklanamaz, uzun menzilli bir kişiden çıkabilecek. Son derece homojen alt birimi yapıları makromoleküllerin derlemede sipariş için yalnızca bir kümesi rezonanslar spectra içinde görünür olması bekleniyor. Eğer iki katına (ya da daha fazla çarpılır) rezonanslar 13 C atomları için görülebilir veya protein omurga uzanıyor, iki (veya daha fazla) biçimler atom veya derlemesine birincil sıra streç sırasıyla yok.
    10. İçi-kalıntı 15 N - 13 Cα korelasyon içeren 2D NCA spektrum 15 N rezonans frekansları her kalıntı için tanımlamak için kullanın. 13 C boyut çözünürlük yeterli değilse, Cβ rezonans hakkında ek bilgi içi-kalıntı 15 N rezonans frekansı belirlemek için 2D NCACB kullanın.
    11. (İ) içi-kalıntı 15 N frekans belirlemek ve (ii) 13 C - 13 C belirsizlikleri gidermek için 2D NCACB ve içi-kalıntı 15 N - 13 C - 13 C korelasyon içeren NCACO spectra kullanın Ek 15 N boyut yardımı ile PDSD. RÜYA aktarımı nedeniyle sinyal inversiyon tipik Cα-Cβ korelasyon Cα sinyal pozitif ve negatif Cβ sinyal gözlem için yol açar. Daha fazla yan zinciri 13 C, spektrum içinde görünüyorsa olumlu yeniden.

Figure 4
şekil 4: 2 boyutlu 13 C - 13 C SSNMR PDSD deneyler üzerinde iyi sıralı, liflerin düzenli bir biçimde 13 C, 15 N etiketli protein derleme. A) kısa (50 ms karıştırma) karıştırma zamanı PDSD. B) kaplama kısa karıştırma zaman PDSD kadar karıştırma vakit geçirmek PDSD (200 ms karıştırma) kullanarak 2-kalıntı streç Ile32 - Thr33 atama. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

  1. ikincil yapı belirlenmesi
    1. 13 Cα kullanın, 13 Cβ kimyasal shift değerleri ikincil kimyasal hesaplamak için vardiya 46 ΔδCα-ΔδCβ , ikincil yapı göstergesidir. 13 - 13 Cα (rasgele bobin) ve 13 Cβ(assigned) - Cα(assigned) 13 Cβ (rasgele bobin) hesaplamak.
      Not: Kalıntıları rasgele bobin biçimsel için kimyasal shift değerleri 38 elde edilebilir.
      1. Arsa ΔδCα-ΔδCβ, negatif veya pozitif değerler için > üst üste 3 artıkları belirtmek β-strand veya α-Helisel conformation sırasıyla; glisin ve prolin artıkları alışılmadık kimyasal shift değerleri, olarak göstermek sık sık olarak hareket " ikincil yapı ayırıcılarını ".
    2. --Dan TALOS 48 47 , veya PREDITOR 49 , 50 kullanarak atanan kimyasal vardiya protein dihedral açı tahmin. Tahmin edilen Phi/Psi dihedral açı protein subu ikincil yapısını yansıtmaksirke ve vardır kullanılan modelleme süreci boyunca gibi yapısal bağlar.
  2. Yapısal kısıtlamalar topluluğu
    1. Set up ve 2D 13 C - 13 C PDSD deneme ile uzun menzilli 13 C algılamak için uzun süre karıştırma zamanı - 13 C korelasyon kayıt. Tipik karıştırma--dan 400 Bayan aralığı 1 kez spin seyreltme büyük ölçüde uzak karbonlar arasında polarizasyon aktarma geliştikçe s. 13 örnekleri, C harfiyle seçici kullanın.
    2. Kaplama uzun karıştırma 2D 13 C - 13 C PDSD mümkünse aynı seçmeli olarak etiketli örnek üzerinde kaydedilen C - 13 C PDSD, orta karıştırma 13 üzerine seçmeli olarak etiketli örnek kaydetti. Tamamlayıcı zirveleri daha uzak 13 C atomları arasındaki ilişkiler ortaya. Rezonans atama sırasında göz önünde seçici etiketleme düzeni.
    3. Yani bu sinyal için katkıda bulunabilir belirli bir ppm aralığında spektral çözünürlüklü rezonanslar bağımlı bir ataması tolerans penceresini tanımlamak için çözünürlük yelpazenin dikkatle değerlendirin. Atama hassas standart sapması CcpNmr analiz veya kabarık tüy gibi NMR atama programları otomatik olarak hesaplanır.
    4. Bir sinyal bir sıralı tarafından açıkladı eğer
    5. (kalıntı ben - kalıntı i±1) veya orta menzilli 13 C - 13 C ilgili kişi (kalıntı ben - kalıntı ben ± 2, 3 veya 4), geçirilen polarizasyon beri bu görevi korumak transfer açıklayabilir korelasyon 13 C - 13 C mesafe beklenen görünen kişi aralığın olsa bile.
    6. Frekans kesin ve belirsiz sinyaller uzun menzilli 13 C - 13 C kişiler atamalara sınıflandırmak. Frekans kesin atamaları söz konusu olduğunda, yalnızca bir rezonans atama atama tolerans pencere ile ilgili mümkündür.
      Not: Tüm olası rezonans atamaları tolerans penceresi içinde belirsiz atamalarını içerir. Belirsizlikleri aynı anda yapısı hesaplama sırasında ön yapıları yalnızca benzersiz kısıtlamaları, kullanılarak hesaplanan ARIA gibi hesaplama rutinleri gibi temel anlam ayrımı yinelemeli tur tarafından kaldırılabilir 51 veya UNIO 52. Ayrıca, farklı biyofiziksel kaynaklardan (örneğin mutasyona uğramış veya alt birim yapısı çözüm NMR veya x-ışını kristalografisi, kitle-başına-uzunluk ölçüleri, cryo-EM harita ile kesilmiş) yapısal veri de için belirsizlik, düzeyini azaltmak için kullanılabilir örnekler bkz: 1 , 3 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58.
  3. bir simetrik protein derleme cins mesafe bağlı olarak algılanmasını
    1. bir 2D 15 N - 13 kadar C ağrı-CP 59 deney olarak ayarlayın bir karışık (50/50) U - 15 N - / U - 13 örnek C harfiyle. AĞRI-CP spektrumda tespit sinyalleri arası moleküler 15 N - 13 C proximities ortaya gereken. Cins kişileri atama yapmak için önceden atanmış rezonanslar kullanın.
    2. Ayarla kadar 2D 13 C - 13 C PDSD ile uzun süre karıştırma zamanı (> 600 ms) (50/50 üzerinde) karışık (1,3 - 13 C)-/ (2 - 13 C)-gliserol veya (1 - 13 C)-/ (2 - 13 C)-glikoz örnek.
      Not: Bu 13 C - 13 C spektrumunda tespit sinyalleri C - 13 C proximities içi moleküler ve arası moleküler 13 ortaya çıkmaktadır. Ancak, belirsizliğe yer bırakmadan arası moleküler kişiler, örneğin bir serin CA kaynaklanan belirli rezonans çiftleri iki etiketleme düzeni yüksek tamamlayıcılık sağlar (2 - 13 C)-bir serin CB ilişkilendirmek alt birimleri etiketli glikoz (1 - 13 C)-alt birimleri etiketli glikoz.
      1. Karışık örnek için 2D 13 C - 13 C spectra spektrum kaydedildi üzerinde homojen etiketli bindirme örnekleri ((1,3-13C) - ve (2 - 13 C)-gliserol veya (1 - 13 C)- ve (2 - 13 C)-glikoz örnekleri etiketli olan). Karışık örnek üzerinde kaydedilen spektrumda ek sinyalleri arası moleküler etkileşimleri doğması.
  4. Yapısı SSNMR veri modelleme
    1. yapısı hesaplama için gerekli SSNMR kısıtlama listeleri hazırlamak: (1) protein sıra; (2) intra moleküler kesin mesafe bağlar; (3) intra moleküler belirsiz mesafe bağlar; (4) TALOS tabanlı dihedral açı bağlar; (5) arası moleküler kesin mesafe bağlar; (6) arası moleküler belirsiz mesafe bağlar; (7) ek verileri diğer biyofiziksel teknikleri (örneğin kütle başına uzunluğu, simetri parametreleri).
    2. Birkaç değerlendirme sağlar anlayışlar içine SSNMR veri ve tamamlayıcı yapısal veri 14 , 60 , 15 ile birlikte temel yapı modelleme , 19 , 61 , 62 Not belirsiz mesafe kısıtlamaları yapısı hesaplama ile ilgili başlangıç sırasında disambiguated kesin mesafe kısıtlamaları üzerinde temel yapısal modelleri. Yapısı doğruluğunu sağlamak için dikkatle yapısı tek bir kat için yakınsar gözlemlemek.

Figure 5
şekil 5 : Intra - ve cins simetrik protein derlemeler kişilerde. Intra - vs cins 13 C - 13 C uzun menzilli kişiler Helisel makromoleküllerin derlemesi içinde şematik gösterimi. Alt birimleri beyaz ve alt birimleri karışık etiketleme; Yani iki farklı etiketleme düzeni 1:1 karışımı gerçekleştirilen derleme önce göstermek için kırmızı renkte görünür (örneğin 1 - 13 C glikoz ve 1 - 13 C glikoz). A) Intramolecular 13 C - 13 C uzun menzilli kişiler (mavi çizgili ok); B) cins 13 C - 13 C uzun menzilli kişiler (kırmızı kesik çizgili oklar). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Representative Results

Normal SSNMR iş akışı şekil 1' de gösterildiği birkaç adım içerir. Genellikle protein alt E. coli vitro Contegra ifade tarafından üretilen, saf ve sallayarak altında ama bazen de statik koşullarda toplandı. İfade ve arıtma bir protein alt birimi SDS jel Kromatografi (şekil 2A) tarafından takip edilmektedir. Makromoleküllerin derlemeler oluşumu sonra elektron mikroskobu (EM) analiz tarafından teyit edilmesi (ipliksi derleme bir örneği için bkz: şekil 2B ).

Sonra SSNMR rotor protein derlemesini getirilmesi, rotor Spektrometre eklenir, MAS frekans ve sıcaklık düzenlenmektedir ve spectra kaydedilir. İlk anlayışlar 1 D SSNMR teknikleri ile elde edilebilir. Şekil 3 gösterir bir yapısal olarak homojen protein örneği, katı çekirdek bir protein alt birimi mevcut13C rezonanslar açığa bir 1H13C CP spektrumlu, 13C kanalında tespit tipik bir SSNMR FID derleme ve mobil artıkları temsil eden bir 2D 1H -13C BECERİKSİZ spektrum. Derleme yapı katı çekirdek atom anlayışlar için çok boyutlu SSNMR deneyler üzerinde kaydedilmek üzere düzgün ve seçmeli olarak ilk SSNMR rezonanslar atamak ve uzun menzilli proximities (bkz: şekil 4 algılamak için örnekleri etiketli gerekir ).

Tüm spectra işlenir ve SSNMR rezonanslar atamak ve içi ve cins mesafe kısıtlamaları (şekil 5) ayıklamak için yeterli yazılım ile analiz. SSNMR mesafe kısıtlamaları da tek başına kullanılan veya tamamlayıcı teknikleri verileri ile birlikte, hangi modelleme programa entegre edilebilir.

Atomik yapıları SSNMR teknikleri tarafından çözüldü makromoleküllerin derlemeler için şekil 6 bakteriyel ekleri ve amiloid liflerinde birkaç ipliksi derlemelerden göstermektedir.

Figure 6
Şekil 6:ipliksi makromoleküllerin yapılarının bir solid-state NMR yaklaşım tarafından belirlenir: bakteriyel filamentler ve amiloid protein liflerinde. A) tip 1 pilus, uropathogenic E. coli, PDB kod 2N7H 4; B) ASC filament, PDB kod 2N1F 63; C) Tip III salgı sistemi iğneler, PDB kodları 2MME, 2LPZ ve 2MEX 2,3,64; D) Amiloid beta AB42 liflerinde, PDB kodu 2NAO, 5KK3, 2MXU 65,66,67 ve Osaka mutant PDB kod 2MVX 57, Iowa mutant PDB kod 2MPZ 58; E) Alpha-synuclein liflerinde, PDB kod 2N0A 68; F) HET-s deli dana etki alanı, PDB kodu 2RNM, 2KJ3 69,70. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

Solid-State NMR (SSNMR) makromoleküllerin protein derlemeler bir atomik düzeyde karakterize için bir seçim yöntemidir. Genellikle (ikincil içeren düşük çözünürlüklü modellerinden arasında değişen çeşitli duyarlıkla 3D Yapısal modeller oluşturma sağlayan incelenen sistem, spektral kalitesini SSNMR tabanlı yapı belirlenmesi temel konular biridir yapı elemanları ve küçük 3B bilgileri) sözde atom 3D yapılar. Miktar ve kalitesi çok boyutlu SSNMR deneylerden çıkarılan yapısal bilgi derleme bir yüksek çözünürlüklü NMR yapısını hesaplamak için anahtar.

13C -13C ve çeşitli 2D (ve bazen 3D) spectra yüksek sinyal gürültü ile kayıt gerektiren 15N -13C yapısal bağlar tespiti açıklanan protokol kullanır. Orta MAS frekanslarda (< 25 kHz), örnek bırakmak ilâ ~ 50 mg, örnek hidrasyon üzerinde bağımlı protein miktarları için 3.2-4 mm çap boyutları ile rotor içine giriliyor. Rotor içinde örnek miktarı SSNMR spectra içinde sinyal-gürültü oranı, uzun menzilli mesafe kısıtlamaları tespiti ve onların kesin atama için bir belirleyici faktör için doğrudan orantılıdır.

Sıralı rezonans atama ve bağlar koleksiyon sırasında spektral çözünürlük çok önemli bir parametredir. En iyi sonuçları elde etmek için örnek hazırlama parametrelerinin, özellikle alt birim ve montaj koşulları (pH, tampon, sallayarak, sıcaklık, vb) arıtma içinde en iyi duruma getirilmiş gerekir. Örnek optimizasyonu için etiketlenmemiş örnekleri kendisi için birkaç farklı koşulları için derleme gözlenmiştir hazırlamak ve (2.1. adımda açıklanan) bir 1 D 1H -13C CP spektrumda her hazırlanmış örnek kaydetmek için önerilir. Spectra spektral çözünürlüklü ve dağılım optimal koşullar belirlenebilir üzerine dayalı farklı ürünleri arasında karşılaştırmak için hizmet vermektedir.

SSNMR verilerin kalitesini kesinlikle NMR satın alma parametrelerini, özellikle polarizasyon aktarma adımları seçimi bağlıdır. Yüksek manyetik alan güçlü (≥600 MHz 1H frekans) kullanımı yüksek hassasiyet ve spektral çözünürlük, makromoleküllerin protein derlemeler gibi karmaşık hedefleri Yüzleşirken gerekir gereklidir.

Spektrometre birçok durumda kısıtlayıcı bir faktör olduğunu. Bu nedenle, hazırlanacak akıllıca bir seçim örneklerin Spektrometre oturum önce gelmesi. Her durumda, aynı şekilde 13C, 15N etiketli sıralı ve intra kalan rezonans atama gerçekleştirmek için bir önkoşul örneğidir. Solid-state NMR tarafından atanan proteinler için bkz: teknikleri,71. Orta MAS frekanslarda makromoleküllerin derlemeleri yapı tayini seçmeli olarak 13C harfiyle örnekleri gerektirir; uzun menzilli 13C -13C ve 13C -15N tespiti 1,3 üzerinde tabanlı örnekleri kişiler için13C - ve 2 -13C-gylcerol ve/veya 1 -13C - ve 2 -13C-glikoz etiketleme vardır yaygın olarak kullanılan, yukarıda açıklandığı gibi. İki etiketleme düzeni arasında seçim spektral sinyal-gürültü oranı ve çözünürlük dayanmaktadır. Intra - ve cins uzun menzilli kişiler arasında ayrım yapmak için karışık örnekleri etiketli ve seyreltilmiş verimli koymuştur.

Kısacası, bir atom SSNMR yapısal çalışma için kritik adımlar şunlardır: mükemmel örnek miktar ve kalite elde etmek için (i) hazırlanması alt birimleri ve derleme optimize edilmiş olması gerek, (ii) Spektrometre alan gücü ve satın alma parametrelerini olmak zorunda özenle seçilmiş; (iii) seçmeli etiketleme stratejileri bir 3D yapı belirlenmesi için gerekli olan ve veri kalitesi ve tamamlayıcı verilerin kullanılabilirliğini gerekli veri miktarına bağlıdır.

Membran proteinlerinin homomultimeric nano-nesnelere kadar supramolecular sistemleri geniş bir yelpazesi için onun uygulanabilirliği rağmen SSNMR kez mg-miktarları isotopically etiketli malzeme ihtiyacını ile sınırlıdır. Ultra-Hızlı MAS (≥100 kHz) SSNMR 1H tespit NMR avenue aç son teknolojik gelişmeler ve itme en az örnek miktar sınırı için alt-mg 72,73,74. Yine de, detaylı yapısal çalışmaları için 13C harfiyle SSNMR uygulama örnekleri monte vitro veya üzerinde en az orta yerde hücre içi hayatta organizmalarda ifade sistemlerine sınırlar vazgeçilmez olduğu ( 75,76,77,78değerlendirmeleri görmek için) SSNMR ortaya çıkan bir yöntemdir.

Spektral çözünürlüğü yüksek çözünürlüklü 3D yapılar elde etmek için SSNMR uygulama önemli bir faktör olduğunu: derleme içinde içsel konformasyon heterojenite spektral analiz çözünürlük ve spectra sınırlandırmak. Kalıntı belirli 13C etiketleme bazı durumlarda Yapısal modeller (için bir son örnekler bkz: 79,80) elde etmek için stratejik artıkları üzerinde belirli mesafe bilgilerini elde etmek için bir alternatif sağlar.

SSNMR 3D yapı tayini için hala sofistike aletleri, yaklaşım ve sistem birkaç gün ile hafta 600-1000 MHz (1H frekans) üzerinde bağlı olarak sık sık uzun veri toplama günleri ile çeşitli veri toplama gerektirir Spektrometre. Bu nedenle, Spektrometre zamanına erişimi derinlemesine bir SSNMR çalışma içinde kısıtlayıcı bir faktör olabilir.

Homomultimeric protein derlemeler için yeterli kalitede SSNMR veri 3,57,64,70, SSNMR gibi yapısal bağlı çok sayıda tanımlamak için önde gelen söz konusu olduğunda, hala mikroskobik boyutlara erişimi verir. Bu nedenle, bir de novo SSNMR yapı tayini homomultimeric derleme içinde EM veya kütle başına uzunluğu (MPL) veri ideal simetri parametreleri türetmek için SSNMR veri tamamlıyor. SSNMR veri yalnız atomik Intra - ve cins arabirimleri sağlar

SSNMR son derece EM veya MPL ölçümleri gibi yapısal teknikleri ile tamamlayıcı ama verileri de mükemmel x-ışını kristalografisi veya çözüm NMR mutasyona uğramış veya kesilmiş alt birimleri üzerinde elde edilen atomik yapıları ile kombine edilebilir. Çalışmalar giderek artan sayıda nerede farklı yapısal veri birlikte makromoleküllerin derlemeler (temsilcisi örnek için bkz: şekil 6 ) atom 3D modelleri belirlemek için izin verdi edebiyat bulunabilir.

Yapısal Biyoloji alanında, SSNMR eğitim için umut verici tekniği ortaya çıkıyoratomik düzeyde, Yani sağlayan yapısal veri atomik ölçekli, çözünmez ve kristal olmayan derlemeler. Bu bağlamda, SSNMR çözüm NMR ve x-ışını kristalografisi membran proteinlerinin viral zarf, bakteriyel filamentler veya amyloids gibi RNA gibi kendi yerel çevre ve protein meclisleri dahil olmak üzere moleküler derlemeler için kolyesi ve RNA-protein kompleksleri (örneğin bkz:81). Onun çok yönlü uygulamalar vitro ve ikincil, üçüncül ve Kuvaterner yapısal değişiklikleri izleme gibi hücresel bağlamında ortak molekülleri atom ölçeğinde (örneğin 82) ile etkileşim yüzeyler belirlenmesi ve Moleküler dinamiği bağlamında monte kompleksleri, eşleme, SSNMR önemli potansiyel karmaşık biyomoleküler derlemeler gelecekteki yapısal çalışmalarında gösterir.

Bileşen M9 orta
NaCl 0.5 g/L
KH2PO4 3 g/L
Na2HPO4 6,7 g/L
MgSO4 1 mM
ZnCl2 10 MİKRON
FeCl3 1 MİKRON
CaCl2 100 μM
MEM vitamin karışımı 100 X 10 mL/L
13 C-glikoz 2 g/L
15 NH4Cl 1 g/L

Tablo 1: Çok az ifade orta rekombinant protein bileşimi üretim E. coli BL21 hücreleri.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu eser ANR (13-PDOC-0017-01 B.H. ve ANR-14-CE09-0020-01 al için) tarafından finanse edilen, "Geleceğe yatırım" programı IDEX Bordeaux/CNRS (B.H. için PEPS 2016) başvuru ANR-10-IDEX-03 / 02 için B.H., Fondation pour la Recherche Médicale) FRM-al için AJE20140630090), FP7 programı (FP7-insanlar-2013-çiğ al için) ve Avrupa Birliği'nin ufuk 2020 araştırma ve yenilik programı (ERC başlayan Grant için al, Sözleşme No 639020) kapsamında Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) ve proje " WEAKINTERACT."

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instruments
NMR Spectrometer (> 11.7 Tesla) Bruker -
triple resonance MAS SSNMR probehead  Bruker -
SSNMR rotors 4mm Bruker K1910
Centrifuge 5804 R  Eppendorf 5805000629
GeneQuant 1300 spectrometer Dutscher 28-9182-13
IGS60 INCUBATEUR HERATHERM 75 L Dutscher 228001
MaxQ 4450 bench top orbital shaker Dutscher 78376
Tube Revolver Agitator Dutscher 79547
sonopuls HD 3100 Bandelin 3680
MicroPulser electroporator Biorad 165-2100 
mini-PROTEAN tetra cell system Biorad 165-8000
AKTA pure system GE Healthcare 29-0182-24
capillary microman M25 pipet Gilson  F148502
Name Company Catalog Number Comments
Materials
amiconR ultra-15 sigma Z740199-8EA
capillaries and pistons Gilson  F148112
spatula Fisher 13263799
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
D-glucose 13C6 Sigma 389374
Ammonium-15N-chloride Sigma 299251
1,3 13C2 glycerol Sigma 492639
2 13C glycerol Sigma 489484
Kanamycin Sigma K1876
Carbenicillin Sigma C3416
Sodium phosphate dibasic Sigma S7907
Potassium phosphate monobasic Sigma P5655
Sodium chloride Sigma 71380
calcium chloride Sigma C1016
Magnesium sulfate Sigma 208094
Iron Chloride Sigma 157740
Zinc chloride Sigma 793523
MEM Vitamin Solution (100×) Sigma M68954
IPTG Fisher BP1755
Trizma base  Sigma T1503
Tricine Sigma T0377
SDS Sigma 436143
sodium azide sigma 71289
4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic acid  Sigma 178837
Name Company Catalog Number Comments
Softwares
Unicorn 6.3 GE Healthcare Akta systems
ccpNMR CCPN  spectrometer systems

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Morag, O., Sgourakis, N. G., Baker, D., Goldbourt, A. The NMR-Rosetta capsid model of M13 bacteriophage reveals a quadrupled hydrophobic packing epitope. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (4), 971-976 (2015).
  2. Loquet, A., et al. Atomic model of the type III secretion system needle. Nature. 486, (7402), 276-279 (2012).
  3. Demers, J. P., et al. High-resolution structure of the Shigella type-III secretion needle by solid-state NMR and cryo-electron microscopy. Nat Commun. 5, (4976), (2014).
  4. Habenstein, B., et al. Hybrid Structure of the Type 1 Pilus of Uropathogenic Escherichia coli. Angew Chem Int Ed Engl. 54, (40), 11691-11695 (2015).
  5. Cady, S. D., et al. Structure of the amantadine binding site of influenza M2 proton channels in lipid bilayers. Nature. 463, (7281), 689-692 (2010).
  6. Park, S. H., et al. Structure of the chemokine receptor CXCR1 in phospholipid bilayers. Nature. 491, (7426), 779-783 (2012).
  7. Kaplan, M., et al. Probing a cell-embedded megadalton protein complex by DNP-supported solid-state NMR. Nat Methods. 12, (7), 649-652 (2015).
  8. Wang, S., et al. Solid-state NMR spectroscopy structure determination of a lipid-embedded heptahelical membrane protein. Nat Methods. 10, (10), 1007-1012 (2013).
  9. Daskalov, A., et al. Signal transduction by a fungal NOD-like receptor based on propagation of a prion amyloid fold. PLoS Biol. 13, (2), e1002059 (2015).
  10. Daskalov, A., et al. Identification of a novel cell death-inducing domain reveals that fungal amyloid-controlled cell death is related to necroptosis. Proc Natl Acad Sci U S A. (2016).
  11. Li, J., et al. The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell. 150, (2), 339-350 (2012).
  12. Knowles, T. P., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, (6), 384-396 (2014).
  13. Aguzzi, A., Lakkaraju, A. K. Cell Biology of Prions and Prionoids: A Status Report. Trends Cell Biol. 26, (1), 40-51 (2016).
  14. Habenstein, B., Loquet, A. Solid-state NMR: An emerging technique in structural biology of self-assemblies. Biophys Chem. (2015).
  15. Meier, B. H., Bockmann, A. The structure of fibrils from 'misfolded' proteins. Curr Opin Struct Biol. 30, 43-49 (2015).
  16. Miao, Y., Cross, T. A. Solid state NMR and protein-protein interactions in membranes. Curr Opin Struct Biol. 23, (6), 919-928 (2013).
  17. Tang, M., Comellas, G., Rienstra, C. M. Advanced solid-state NMR approaches for structure determination of membrane proteins and amyloid fibrils. Acc Chem Res. 46, (9), 2080-2088 (2013).
  18. Weingarth, M., Baldus, M. Solid-state NMR-based approaches for supramolecular structure elucidation. Acc Chem Res. 46, (9), 2037-2046 (2013).
  19. Loquet, A., Habenstein, B., Lange, A. Structural investigations of molecular machines by solid-state NMR. Acc Chem Res. 46, (9), 2070-2079 (2013).
  20. Yan, S., Suiter, C. L., Hou, G., Zhang, H., Polenova, T. Probing structure and dynamics of protein assemblies by magic angle spinning NMR spectroscopy. Acc Chem Res. 46, (9), 2047-2058 (2013).
  21. Tycko, R., Wickner, R. B. Molecular structures of amyloid and prion fibrils: consensus versus controversy. Acc Chem Res. 46, (7), 1487-1496 (2013).
  22. Hong, M., Zhang, Y., Hu, F. Membrane protein structure and dynamics from NMR spectroscopy. Annu Rev Phys Chem. 63, 1-24 (2012).
  23. Jelinek, R., Ramamoorthy, A., Opella, S. J. High-Resolution Three-Dimensional Solid-state NMR Spectroscopy of a Uniformly 15N-Labeled Protein. J Am Chem Soc. 117, 12348-12349 (1995).
  24. Xu, J., et al. Bicelle-enabled structural studies on a membrane-associated cytochrome B5 by solid-state MAS NMR spectroscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 47, (41), 7864-7867 (2008).
  25. Durr, U. H., Gildenberg, M., Ramamoorthy, A. The magic of bicelles lights up membrane protein structure. Chem Rev. 112, (11), 6054-6074 (2012).
  26. Yamamoto, K., et al. Probing the transmembrane structure and topology of microsomal cytochrome-p450 by solid-state NMR on temperature-resistant bicelles. Sci Rep. 3, 2556 (2013).
  27. Huang, R., et al. Probing the transmembrane structure and dynamics of microsomal NADPH-cytochrome P450 oxidoreductase by solid-state NMR. Biophys J. 106, (10), 2126-2133 (2014).
  28. Durr, U. H., Yamamoto, K., Im, S. C., Waskell, L., Ramamoorthy, A. Solid-state NMR reveals structural and dynamical properties of a membrane-anchored electron-carrier protein, cytochrome b5. J Am Chem Soc. 129, (21), 6670-6671 (2007).
  29. Hong, M. Determination of multiple phi-torsion angles in proteins by selective and extensive (13)C labeling and two-dimensional solid-state NMR. J Magn Reson. 139, (2), 389-401 (1999).
  30. Lundstrom, P., et al. Fractional 13C enrichment of isolated carbons using [1-13C]- or [2- 13C]-glucose facilitates the accurate measurement of dynamics at backbone Calpha and side-chain methyl positions in proteins. J Biomol NMR. 38, (3), 199-212 (2007).
  31. Loquet, A., Lv, G., Giller, K., Becker, S., Lange, A. 13C spin dilution for simplified and complete solid-state NMR resonance assignment of insoluble biological assemblies. J Am Chem Soc. 133, (13), 4722-4725 (2011).
  32. Castellani, F., et al. Structure of a protein determined by solid-state magic-angle-spinning NMR spectroscopy. Nature. 420, (6911), 98-102 (2002).
  33. Higman, V. A., et al. Assigning large proteins in the solid state: a MAS NMR resonance assignment strategy using selectively and extensively 13C-labelled proteins. J Biomol NMR. 44, (4), 245-260 (2009).
  34. Bockmann, A., et al. Characterization of different water pools in solid-state NMR protein samples. J Biomol NMR. 45, (3), 319-327 (2009).
  35. Cavanagh, J., Fairbrother, W. J., Palmer, A. G., Skelton, N. J. Protein NMR spectroscopy, principles and practice. Academic. San Diego. (1996).
  36. Hartman, S. R., Hahn, E. L. Nuclear Double Resonance in the Rotating Frame. Phys Rev. 128, (5), 2042-2053 (1962).
  37. Harris, R. K., et al. Further conventions for NMR shielding and chemical shifts IUPAC recommendations 2008. Solid State Nucl Magn Reson. 33, (3), 41-56 (2008).
  38. Wang, Y., Jardetzky, O. Probability-based protein secondary structure identification using combined NMR chemical-shift data. Protein Sci. 11, (4), 852-861 (2002).
  39. Shaka, A. J., Baker, P. B., Freeman, R. Computer-Optimized Scheme for Wideband Applications and Low-Level Operation. J Magn Reson. 64, 547-552 (1985).
  40. BMRB - Biological Magnetic Resonance Bank. http://bmrb.wisc.edu/ (2017).
  41. Szeverenyi, N. M., Sullivan, M. J., Maciel, G. E. Observation of Spin Exchange by Two-Dimensional Fourier-Transform C-13 Cross Polarization-Magic-Angle Spinning. J Magn Reson. 47, 462-475 (1982).
  42. Baldus, M., Petkova, A. T., Herzfeld, J., Griffin, R. G. Cross polarization in the tilted frame: assignment and spectral simplification in heteronuclear spin systems. Mol Phys. 95, (5), 1197-1207 (1998).
  43. Verel, R., Ernst, M., Meier, B. H. Adiabatic dipolar recoupling in solid-state NMR: the DREAM scheme. J Magn Reson. 150, (1), 81-99 (2001).
  44. CcpNmr Analysis — Collaborative Computational Project for NMR. http://www.ccpn.ac.uk/software/analysis (2017).
  45. Sparky - NMR Assignment and Integration Software. https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ (2017).
  46. Luca, S., et al. Secondary chemical shifts in immobilized peptides and proteins: a qualitative basis for structure refinement under magic angle spinning. J Biomol NMR. 20, (4), 325-331 (2001).
  47. TALOS+: Prediction of Protein Backbone Torsion Angles from NMR Chemical Shift. http://spin.niddk.nih.gov/bax/software/TALOS/ (2017).
  48. Shen, Y., Bax, A. SPARTA+: a modest improvement in empirical NMR chemical shift prediction by means of an artificial neural network. J Biomol NMR. 48, (1), 13-22 (2010).
  49. SHIFTOR Dihedral angles from chemical shifts and homology. http://wishart.biology.ualberta.ca/shiftor/ (2017).
  50. Berjanskii, M. V., Neal, S., Wishart, D. S. PREDITOR: a web server for predicting protein torsion angle restraints. Nucleic Acids Res. 34, (Web Server issue), W63-W69 (2006).
  51. Bardiaux, B., Malliavin, T., Nilges, M. ARIA for solution and solid-state NMR. Methods Mol Biol. 831, 453-483 (2012).
  52. Guerry, P., Herrmann, T. Comprehensive automation for NMR structure determination of proteins. Methods Mol Biol. 831, 429-451 (2012).
  53. Vasa, S., et al. beta-Helical architecture of cytoskeletal bactofilin filaments revealed by solid-state NMR. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (2), E127-E136 (2015).
  54. He, L., et al. Structure determination of helical filaments by solid-state NMR spectroscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, (3), E272-E281 (2016).
  55. Tang, M., et al. High-resolution membrane protein structure by joint calculations with solid-state NMR and X-ray experimental data. J Biomol NMR. 51, (3), 227-233 (2011).
  56. Paravastu, A. K., Leapman, R. D., Yau, W. M., Tycko, R. Molecular structural basis for polymorphism in Alzheimer's beta-amyloid fibrils. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (47), 18349-18354 (2008).
  57. Schutz, A. K., et al. Atomic-resolution three-dimensional structure of amyloid beta fibrils bearing the Osaka mutation. Angew Chem Int Ed Engl. 54, (1), 331-335 (2015).
  58. Sgourakis, N. G., Yau, W. M., Qiang, W. Modeling an in-register, parallel "iowa" abeta fibril structure using solid-state NMR data from labeled samples with rosetta. Structure. 23, (1), 216-227 (2015).
  59. Lewandowski, J. R., De Paepe, G., Griffin, R. G. Proton assisted insensitive nuclei cross polarization. J Am Chem Soc. 129, (4), 728-729 (2007).
  60. Carlon, A., et al. How to tackle protein structural data from solution and solid state: An integrated approach. Prog Nucl Magn Reson Spectrosc. 92-93, 54-70 (2016).
  61. Judge, P. J., Taylor, G. F., Dannatt, H. R., Watts, A. Solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy for membrane protein structure determination. Methods Mol Biol. 1261, 331-347 (2015).
  62. Wang, S., Ladizhansky, V. Recent advances in magic angle spinning solid state NMR of membrane proteins. Prog Nucl Magn Reson Spectrosc. 82, 1-26 (2014).
  63. Sborgi, L., et al. Structure and assembly of the mouse ASC inflammasome by combined NMR spectroscopy and cryo-electron microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (43), 13237-13242 (2015).
  64. Loquet, A., et al. Atomic structure and handedness of the building block of a biological assembly. J Am Chem Soc. 135, (51), 19135-19138 (2013).
  65. Walti, M. A., et al. Atomic-resolution structure of a disease-relevant Abeta(1-42) amyloid fibril. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, (34), E4976-E4984 (2016).
  66. Colvin, M. T., et al. Atomic Resolution Structure of Monomorphic Abeta42 Amyloid Fibrils. J Am Chem Soc. 138, (30), 9663-9674 (2016).
  67. Xiao, Y., et al. Abeta(1-42) fibril structure illuminates self-recognition and replication of amyloid in Alzheimer's disease. Nat Struct Mol Biol. 22, (6), 499-505 (2015).
  68. Tuttle, M. D., et al. Solid-state NMR structure of a pathogenic fibril of full-length human alpha-synuclein. Nat Struct Mol Biol. 23, (5), 409-415 (2016).
  69. Wasmer, C., et al. Amyloid fibrils of the HET-s(218-289) prion form a beta solenoid with a triangular hydrophobic core. Science. 319, (5869), 1523-1526 (2008).
  70. Van Melckebeke, H., et al. Atomic-resolution three-dimensional structure of HET-s(218-289) amyloid fibrils by solid-state NMR spectroscopy. J Am Chem Soc. 132, (39), 13765-13775 (2010).
  71. BMRB Solid-state NMR entries. http://www.bmrb.wisc.edu/data_library/solidstate.shtml (2017).
  72. Lamley, J. M., et al. Solid-state NMR of a protein in a precipitated complex with a full-length antibody. J Am Chem Soc. 136, (48), 16800-16806 (2014).
  73. Agarwal, V., et al. De novo 3D structure determination from sub-milligram protein samples by solid-state 100 kHz MAS NMR spectroscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 53, (45), 12253-12256 (2014).
  74. Stanek, J., et al. NMR Spectroscopic Assignment of Backbone and Side-Chain Protons in Fully Protonated Proteins: Microcrystals, Sedimented Assemblies, and Amyloid Fibrils. Angew Chem Int Ed Engl. 55, (50), 15504-15509 (2016).
  75. Baker, L. A., Baldus, M. Characterization of membrane protein function by solid-state NMR spectroscopy. Curr Opin Struct Biol. 27, 48-55 (2014).
  76. Luchinat, E., Banci, L. In-cell NMR: a topical review. IUCrJ. 4, (Pt 2), 108-118 (2017).
  77. Freedberg, D. I., Selenko, P. Live cell NMR. Annu Rev Biophys. 43, 171-192 (2014).
  78. Selenko, P., Wagner, G. Looking into live cells with in-cell NMR spectroscopy. J Struct Biol. 158, (2), 244-253 (2007).
  79. Qiang, W., Yau, W. M., Luo, Y., Mattson, M. P., Tycko, R. Antiparallel beta-sheet architecture in Iowa-mutant beta-amyloid fibrils. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (12), 4443-4448 (2012).
  80. Bateman, D. A., Tycko, R., Wickner, R. B. Experimentally derived structural constraints for amyloid fibrils of wild-type transthyretin. Biophys J. 101, (10), 2485-2492 (2011).
  81. Marchanka, A., Simon, B., Althoff-Ospelt, G., Carlomagno, T. RNA structure determination by solid-state NMR spectroscopy. Nat Commun. 6, 7024 (2015).
  82. Schutz, A. K., et al. The amyloid-Congo red interface at atomic resolution. Angew Chem Int Ed Engl. 50, (26), 5956-5960 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics