استخدام إيمونولابيلينج لتحليل Microtubules مستقرة ودينامية، والوليدة في الجنين الزرد

* These authors contributed equally
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

أساليب إيمونولابيلينج لتحليل السكان متميزة من microtubules في الدماغ الزرد يرد هنا، الذي قابلة للتطبيق على نطاق واسع للأنسجة الأخرى. ويحدد البروتوكول الأول أسلوب أمثل ل microtubules إيمونولابيلينج مستقرة ودينامية. البروتوكول الثاني يوفر طريقة للصورة، وتحديد مقدار microtubules الوليدة على وجه التحديد.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

McFarland, R. J., Brown, S. P., Vital, E., Werner, J. M., Brewster, R. M. Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (127), e55792, doi:10.3791/55792 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Microtubules (MTs) هي الهياكل الحيوية والهشة التي تشكل تحديا للصورة في فيفو، لا سيما في أجنة الفقاريات. يرد وصف أساليب إيمونولابيلينج هنا لتحليل السكان مميزة للنظام التجاري المتعدد الأطراف في الأنبوب العصبي النامي الجنين الزرد. في حين يتم التركيز على الأنسجة العصبية، هذه المنهجية نطاق واسع ينطبق على الأنسجة الأخرى. الإجراءات هي الأمثل لأوائل إلى منتصف المرحلة سوميتوجينيسيس الأجنة (سوميتي 1 إلى 12 somites)، إلا أنها يمكن تكييفها وفقا لمجموعة من المراحل الأخرى مع إدخال بعض التعديلات الطفيفة نسبيا. وينص البروتوكول الأول أسلوب لتقييم التوزيع المكاني للنظام التجاري المتعدد الأطراف مستقرة ودينامية، والقيام بتحليل كمي لهؤلاء السكان مع برامج معالجة الصور. ويكمل هذا النهج القائمة أدوات الصورة microtubule ديناميات والتوزيع في خطوط معدلة وراثيا في الوقت الحقيقي، باستخدام أو تعبير عابر من بنيات المعلمة. في الواقع، هذه الأدوات مفيدة للغاية، إلا أنها لا تميز بين سهولة بين دينامية واستقرار النظام التجاري المتعدد الأطراف. القدرة على الصورة وتحليل هؤلاء السكان microtubule متميزة آثار هامة لفهم الآليات الكامنة وراء استقطاب الخلية و morphogenesis. ويحدد البروتوكول الثاني تقنية لتحليل الوليدة النظام التجاري المتعدد الأطراف على وجه التحديد. ويتم ذلك بواسطة التقاط خصائص النمو حيثياته للنظام التجاري المتعدد الأطراف مع مرور الوقت، بعد ديبوليميريزيشن ميكروتوبولي مع نوكودازولي المخدرات وفترة انتعاش بعد تبييض المخدرات. هذا الأسلوب لم تطبق حتى الآن لدراسة النظام التجاري المتعدد الأطراف في الأجنة الزرد، ولكن مقايسة قيماً للتحقيق في الدالة في فيفو البروتينات المتورطين في الجمعية ميكروتوبولي.

Introduction

Microtubules (MTs) هي البوليمرات من α-وبيتا-tubulin أن تجميع إلى بروتوفيلامينتس الخطية، التي تجتمع لتشكل أنبوب أجوف1،2. النظام التجاري المتعدد الأطراف هي هياكل الاستقطاب، مع النمو السريع بالإضافة إلى الغايات وبطيئة النمو ناقص الغايات التي ترتكز سينتروسومي أو أخرى مركز (بعد) microtubule-تنظيم3. دي نوفو هو بدأها MT تشكيل نويات في الحلبة γ-tubulin المعقدة (γ-تورك)، الذي يوفر قالب ل الجمعية MT4. في أي خلية معينة، اثنين من السكان للنظام التجاري المتعدد الأطراف يمكن تمييز ذلك بدوره على مدى بمعدلات مختلفة. استكشاف MTs ديناميكية بيئتها الخلوية بالتبديل بين مراحل النمو والانكماش في عملية تعرف باسم الاستقرار الديناميكي5. خلافا لدينامية النظام التجاري المتعدد الأطراف، هي عدم تزايد استقرار النظام التجاري المتعدد الأطراف ونصف عمر أطول من الحيوي MTs6.

عقود من البحث في بيولوجيا الخلايا وقدم مجموعة متطورة من أدوات لدراسة هيكل النقل المتعدد الوسائط ووظيفة وأسفرت عن قدر كبير من المعرفة بشأن هذه العناصر سيتوسكيليتال. على سبيل المثال، النظام التجاري المتعدد الأطراف تلعب دوراً محوريا في إنشاء وصيانة الخلية القطبية، الذي يعزى إلى ليس فقط على قطبية الجوهرية، بل أيضا إلى توزيع سوبسيلولار التفضيلية مستقرة مقابل الديناميكي MTs7، 8-على النقيض من ذلك، الآن أقل من المفهوم حول هندسة النقل المتعدد الوسائط ووظيفة في بيئات (ثلاثي الأبعاد) ثلاثية الأبعاد أكثر تعقيداً، مثل الجنين الفقارية، جزئيا بسبب التحدي المتمثل في التصوير سيتوسكيليتون طن متري بدقة عالية. وعلى الرغم من هذا القيد، خطوط الجيل الأخير بروتينات فلورية خضراء-الإعراب عن المحورة وراثيا أن تسمية النظام التجاري المتعدد الأطراف أو تعبير عابر لمعلم فلوريسسينتلي طن متري علامات زاد فهمنا للتغيرات الدينامية التي تخضع للنظام التجاري المتعدد الأطراف وعلى الخلوي و الدور التنموي في الجنين الزرد. شبكة النقل المتعدد الوسائط بالكامل يمكن تصويرها في خطوط معدلة وراثيا في tubulin الذي أما مباشرة البوليمرات9 أو tubulin مسماة غير مباشر المسماة البروتينات المرتبطة بالنقل المتعدد الوسائط باستخدام دوبليكورتين--مثل-كيناز (دكلك) أو انسكونسين (امتب)10، 11. خطوط أخرى (و بنيات) قد تم إنشاؤها أن التمكين من تقييم MT قطبية الأصيلة بوصفها على وجه التحديد مليون طن بالإضافة إلى نهايات أو ارتساء centrosome ناقص ينتهي11،،من1213، 14-قوة هذه الأدوات يكمن في القدرة على دراسة ديناميات طن متري في العيش، وضع الكائنات الحية. كشفت هذه الدراسات، على سبيل المثال، بالتوزيع المكاني والديناميكية للنظام التجاري المتعدد الأطراف في السكان خلية معينة، اتجاه الانقسامية spindles في الأنسجة التي تمر morphogenesis (مؤشر لطائرة انقسام الخلية)، الأقطاب البوليمر طن متري كما أنها تتصل بالعمليات مثل استطالة الخلية والهجرة، ومعدل نمو MT يحدده المذنب السرعة9،،من1315. الحد من هذه الأدوات أنها لا تميز سهولة بين مستقرة ودينامية السكان طن متري.

الرسم من الأدب بيولوجيا الخلية الغنية، أساليب إيمونولابيلينج صورة مستقرة ودينامية النظام التجاري المتعدد الأطراف في الجنين الزرد يرد هنا، التي تعتبر مكملة لاستخدام خطوط محوره وراثيا. انتشار استخدام هذه الأساليب إيمونولابيلينج في الزرد قد أعاق نوعا ما الصعوبة في الحفاظ على سلامة النقل المتعدد الوسائط أثناء إجراء التثبيت. 1 بروتوكول يحدد أسلوب أمثل لمجموع إيمونولابيلينج، دينامية، واستقرار النظام التجاري المتعدد الأطراف في عبور أبواب hindbrain الزرد النامي. وعلاوة على ذلك، أسلوب مباشر تجارياً باستخدام البرمجيات المتاحة هو وصف للتحديد الكمي لهؤلاء السكان طن متري. وتتميز عن دينامية النظام التجاري المتعدد الأطراف، استناداً إلى عدة تعديلات α-tubulin، مثل أسيتيليشن وديتيروسينيشن، التي تتراكم على استقرار النظام التجاري المتعدد الأطراف مع مرور الوقت16،17بوستترانسلاشونال استقرار النظام التجاري المتعدد الأطراف. في الجنين الزرد، يحدث أسيتيليشن في الهدبية ومحواري النظام التجاري المتعدد الأطراف ولكن ليس في الطور البيني مستقرة MTs18، يحد من فائدة هذه العلامة إلى مجموعة فرعية من استقرار النظام التجاري المتعدد الأطراف. وفي المقابل، يبدو ديتيروسينيشن تحدث في جميع MTs مستقرة في الجنين الزرد18. هذا التعديل بوستترانسلاشونال الكشف عن حمض الجلوتاميك محطة كاربوكسي α-توبولين (ديتيروسيناتيد توبولين)18 ، ويمكن الكشف عنها باستخدام مكافحة-غلو-tubulin19. على الرغم من أن ديتيروسينيشن يحدث تفضيلي على استقرار النظام التجاري المتعدد الأطراف، الأدلة التجريبية تشير إلى أن هذا التعديل بوستترانسلاشونال نتيجة، بدلاً من سببا ل الاستقرار MT16. ويتميز السكان MT متبادلة، وتتألف من دينامية النظام التجاري المتعدد الأطراف، استخدام جسم مضاد، مكافحة-تير-tubulin، الذي يعترف تحديداً بشكل تيروسيناتيد α-tubulin19. وبعد إيمونولابيلينج مع هذه العلامات وتصوير [كنفوكل]، يمكن إجراء التحليل الكمي للنظام التجاري المتعدد الأطراف (الطول والعدد والوفرة النسبية) في مناطق محددة من الأنبوب العصبي النامي. أسلوب مبسط يتم توفيرها هنا للقيام بهذا التحليل باستخدام برنامج معالجة الصور ثلاثية الأبعاد. يمكن تطبيق هذا الأسلوب لمعالجة المسائل بخصوص morphogenesis وإنشاء أو نضوج الخلية القطبية20. وفي الواقع، ترافق وضع صفائف المستقطبة من استقرار النظام التجاري المتعدد الأطراف العديد من الأحداث التنموية، بما في ذلك مستقبله morphogenesis21، ابيثيلياليزيشن الخلايا في وضع الأنبوب العصبي18 واكسون تشكيل8.

ويصف 2 بروتوكول تكيف في فيفو مقايسة بيولوجيا الخلية لتحليل النظام التجاري المتعدد الأطراف من خلال هذه الجمعية المرحلة (نويات/مرسى والنمو)22،23. MTs الوليدة المنبسطة في سينتروسومي ويرتكز في وقت لاحق إلى الملاحق سوبديستال من مريكز الأم23. يتم وصف أسلوب لتحليل نمو MT الوليدة بعد ديبوليميريزيشن. يوفر هذا البروتوكول التفاصيل المتعلقة بمعاملة نوكودازولي ديبوليميريزي النظام التجاري المتعدد الأطراف والإجراءات تبييض المخدرات وفترة النقاهة بعد العلاج. ويرصد MT إعادة النمو على فترات زمنية منتظمةدا بوست تبييض قبل إيمونولابيلينج مع علامات لمجموع النظام التجاري المتعدد الأطراف (مكافحة β-tubulin) جنبا إلى جنب مع علامات سينتروسومي (مكافحة γ-tubulin) ونواة (4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI))، ووفقا للإجراءات العامة المبينة في البروتوكول الأول. الخطوة ديبوليميريزيشن طن متري من هذا البروتوكول ضروري حيث أنه يمكن تقييم حيثياته MT النمو بدلاً من التمديد للنظام التجاري المتعدد الأطراف الموجودة مسبقاً. هذا الأسلوب لذلك يختلف عن الإجراءات الأخرى المنشورة لقياس معدلات النمو طن متري (في غياب ديبوليميريزيشن) باستخدام علامة زائد نصيحة مثل نهاية ملزمة البروتين 3 تنصهر فيها البروتينات الفلورية الخضراء (EB3-التجارة والنقل)، كما هو موضح في تران et al.، 11من عام 2012. وعلاوة على ذلك، هذا التحليل مفيد بشكل خاص لتحليل الأجنة المعيبة في الجمعية دي نوفو طن متري، مثل طفرات NEDD1 ذكر سابقا الذي تجنيد γ-tubulin سينتروسومي البصر، مما أدى إلى عدم اكتمال تشكيل الأنبوب العصبي والتشوهات العصبية24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

"بيان الأخلاق": الإجراءات الموصوفة أدناه متابعة الجامعة للمبادئ التوجيهية لرعاية الحيوان مقاطعة بالتيمور ميريلاند.

1-تحليل مستقرة ودينامية النظام التجاري المتعدد الأطراف باستخدام إيمونولابيلينج (بروتوكول 1)

طازجة ولدت
  1. ديتشوريونيشن اليدوي للأجنة قبل التثبيت
    1. الحصول على الأجنة بصب قبالة المياه الزائدة من النظام و ثم جمع الأجنة المتبقية في بلاستيك طبق بتري (الرجوع إلى الجدول للمواد)-
    2. إزالة أي حطام من نظام المياه ونقل الأجنة إلى طبق جديدة مليئة بالجنين المتوسطة (الرجوع إلى الجدول للمواد) لضمان تطوير الأجنة في بيئة نظيفة-
    3. السماح للأجنة لتطوير إلى المرحلة المرجوة في حاضنة درجة الحرارة التي تسيطر على 28.5 درجة مئوية.
    4. مكان الأجنة الذين تقل أعمارهم عن 24 ساعة بعد الإخصاب (hpf) في صحن زجاج قبل ديتشوريونيشن-
      ملاحظة: ديتشوريوناتي الأجنة قبل التثبيت إلى أقصى حد الاختراق السريع مثبت والحفاظ على سلامة النقل المتعدد الوسائط. استخدام الأجنة المتوسطة بدلاً من نظام المياه تقديم الإضافية Ca 2 + مطلوب أثناء ديتشوريونيشن.
    5. يدوياً إزالة
    6. تشوريونس من الأجنة بينما في طبق بتري، استخدام الملقط غرامة تحت مجهر تشريح.
      1. قرصه منطقة صغيرة في المشيمة جولة تتسم بالشفافية الذي يطوق الجنين مع زوج من الملقط وسحب الملقط أربا برفق لخلق تمزق في الغشاء.
      2. تكبير الافتتاح بدقة المتطفلين على المشيمة تمزق استخدام الملقط. يجب الحرص على عدم لمس الجنين بالملقط كما أنها يمكن أن تمزق.
  2. تثبيت الأجنة نظموا
    1. نظموا نقل، ديتشوريوناتيد الأجنة إلى 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي. إزالة قدر متوسط الجنين ممكن استخدام زجاج ماصة باستور.
      ملاحظة: إجراء علاجات التثبيت والمخدرات على الأجنة الشباب (منتصف سوميتوجينيسيس)، قبل تشكيل المراكز العصبية التوسط في الإحساس بالألم، التي تتطلب لا الإجراء الإضافي لتخفيف الألم أثناء القتل الرحيم. مراحل النمو كما هو معرف في كيميل et al., 1995 25. واستخدمت في المراحل سميط 4-5 و 11-12 للحصول على صور الأرقام 2 و 3.
    2. إعداد الجمعية/MT بارافورمالدهيد (PFA) 4% المخزن المؤقت (ماب) مثبت (الرجوع إلى الجدول للمواد) عن طريق الجمع بين 1 مل 8% منهاج العمل كل 1 مل 2 × ماب وإضافة 2 ميليلتر 100% X-100 تريتون كل 1 مل من إجمالي حجم.
      تنبيه: ارتداء القفازات أثناء التعامل مع الحلول التي تحتوي على منهاج عمل بيجين و X-100 تريتون، ومهيجات الجلد.
    3. أجنة الإصلاح في 1 مل مثبت PFA/ماب 4% لمدة 5 دقائق في 28.5 ° جيم Aspirate مثبت مع ماصة، استبدله 1 مل مثبت الطازجة، واحتضانها ح 3 في درجة حرارة الغرفة (RT) على الروك.
      ملاحظة: العينات يجب أن تكون ثابتة بسرعة على درجة حرارة البيولوجية (28.5 درجة مئوية الزرد) لمنع ديبوليميريزيشن طن متري تعتمد على درجة الحرارة-
  3. نضح مثبت وإضافة 1 مل 1 × تريس مخزنة المالحة مع NP40 المخزن المؤقت (TBS-NP40). بلطف تحرض على RT على الروك ثلاث مرات لمدة 5 دقائق. تخزين الأجنة في 4 درجات مئوية في 1 مل 1 جديدة X تبس-NP40 لمدة لا تتجاوز 7 أيام-
    تنبيه: ارتداء قفازات عند التعامل مع الحلول التي تتضمن NP-40، مهيجة جلد-
  4. الأجنة سيكتيونينج على إيمونولابيلينج
    1. RT الحرارة 4% نقطة انصهار منخفضة (LMP) [اغروس] التضمين المتوسطة في حاوية مغلقة حتى يصبح الحل واضح باستخدام صفيحة تعيين إلى 50 درجة مئوية في وضع قريب من مجهر تشريح . الاحتفاظ بحاوية مغلقة بين العينات وساخنة في جميع مراحل عملية التضمين (الخطوات 1.4.4-1.4.6)-
    2. الطرد المركزي أنابيب إلى طبق بتري ماصة زجاجية باستخدام نقل الأجنة من مل 1.5 وملء مع 1 X تبس-NP40-
    3. إزالة الخلايا صفار كبيرة من الأجنة مرحلة سوميتوجينيسيس (4-5 و 11-12 somites) في طبق بتري استخدام الملقط خير إطار التكبير المجهر تشريح 26. عقد الجنين ببراعم الذيل مع زوج واحد من الملقط وقشر خارج الخلايا صفار مع الزوج الأخرى بغية الحفاظ على الأنسجة هيندبرين. نقل الأجنة دي يولكيد إلى منطقة طبق بيتري خالية من الحطام صفار.
      ملاحظة: تضمين الأجنة في العفن مليئة [اغروس] على حدة لمنع تصلب سابق لأوانه [اغروس] LMP.
    4. تعبئة واحد 12 مم × 5 مم x 3 مم من العفن تقطيع مع 200 ميليلتر ذاب LMP [اغروس] استخدام ميكروبيبيتي. أداء 1.4.5.-1.4.6 الخطوات. بسرعة (ضمن 20 ثانية لملء القالب) تضمين الجنين قبل [اغروس] LMP يبرد على RT ويتصلب.
    5. استخدام الملقط غرامة لنقل جنينا دي يولكيد قبل تايلبود من طبق بيتري إلى العفن مليئة [اغروس] نحو نهايتها مدبب تحت مجهر تشريح.
    6. استخدام الملقط غرامة لتوجيه الجنين إلى العفن أن فيبرتوم تخفيضات في الطائرة المطلوب. إنشاء مقاطع عرضية بتوجيه الجنين أن الأنسجة hindbrain يمتد موازيا لطول القالب مع سطحه الظهرية التي تواجه الحافة وسطحه الأمامي التي تواجه في نهاية المنطقة مدبب. كرر الخطوات 1.4.4-1.4.6 للأجنة المتبقية.
    7. السماح تضمين [اغروس] يصلب لمدة 5 دقائق في الرايت
    8. توليد 40 ميكرومتر مقاطع أطول محور [اغروس] مضمن الأجنة (الخطوات 1.4.1-1.4.7) باستخدام فيبرتوم مع الطبق تقطيع مليئة 1 × تبس-NP40. نقل أقسام من الفائدة إلى لوحة 24-جيدا في 500 ميليلتر 1 × تبس-NP40 استخدام الملقط غرامة. وضع مقاطع جنين واحد فقط كل بئر-
      ملاحظة: تشير إلى مرجع 18 لمزيد من التفاصيل. ضمان بقاء أبواب رطب في جميع الأوقات في مالا يقل عن 250 ميليلتر من المخزن المؤقت والصخور على سرعة منخفضة (10-25 لفة في الدقيقة) للخطوات المتبقية للحيلولة دون الانفصال عن تضمين [اغروس]. المنظفات الموجودة في عرقلة والحلول يغسل ينبغي خفض التوتر السطحي للسائل المتوسطة والسماح لغمر أقسام. تحقق من أن هناك أقسام في الآبار أثناء وبعد جميع المعالجات. توخي الحذر لمنع بطريق الخطأ تجاهل المقاطع خلال يغسل.
  5. إزالة المخزن المؤقت وإضافة 500 ميليلتر من عرقلة الحل. روك على الأقل 1 ح في الرايت
    ملاحظة: استخدام حل حظر يتضمن سيرا 5% من الأنواع المضيفة لكل جسم الثانوية لاستخدامها (راجع الجدول للمواد)-
  6. إينكوباتي في 300 ميليلتر الأجسام الأولية المخفف في المخزن المؤقت حظر لح 36-72 في 4 درجات مئوية على الروك. أغسل مرتين في 600 ميليلتر 1 × NP40 تبس على الروك مدة كل منها 30 دقيقة في الرايت
    ملاحظة: المقاطع التسمية المزدوجة التي تفرخ في الابتدائي أضداد مجموع النظام التجاري المتعدد الأطراف (مكافحة β-tubulin، أو مكافحة α-tubulin)، واستقرار النظام التجاري المتعدد الأطراف (مكافحة-غلو-tubulin) أو ديناميكية النظام التجاري المتعدد الأطراف (صور لمكافحة tubulin). تحديد الأجسام المضادة الرئيسية التي أثيرت في مضيف مختلف الأنواع عند تسمية مزدوجة للمجموع وبوستترانسلاتيونالي تعديل α-tubulin السكان. الرجوع إلى الجدول للمواد لتخفيف جسم.
  7. إينكوباتي في 300 ميليلتر الأجسام الثانوية مترافق fluorophore المخفف في المخزن المؤقت حظر على الروك ح 16-24، في 4 درجات مئوية في الظلام. أغسل مرتين في 600 ميليلتر 1 × NP40 تبس على الروك مدة كل منها 30 دقيقة في الرايت
    ملاحظة: التفاف الطبق جيدا متعددة تحتوي على جسم الثانوية في إحباط من هذه النقطة فصاعدا، وبعد كل معالجة لمنع تبريد. حدد الثانوي الأجسام المضادة التي تتفاعل مع جسم المضيف من جسم الأولية. اختر fluorophores جسم الثانوية التي تحتوي أطياف الانبعاث منفصلة وغير متداخلة. الرجوع إلى الجدول للمواد لتخفيف جسم.
  8. احتضان الأجنة في 500 ميليلتر DAPI الحل الروك مدة 30 دقيقة، في غسل الرايت ثلاث مرات في NP40 تبس هزاز على RT لمدة 5 دقائق في كل من
  9. -
    ملاحظة: الوسم النووية يوفر سياقا الخلوية للتحديد الكمي طن متري في الخطوة 1، 12-
  10. مكان قطره المتوسطة المتصاعدة مع عامل تتلاشى المضادة في وسط شريحة خالية من الغبار. استخدام الملقط غرامة لنقل المقاطع إلى الحبرية متوسطة المتصاعدة. مكان ساترة خالية من الغبار على رأس النموذج. تخزين الشرائح في مكان جاف ومظلمة وباردة، ملفوفة في إحباط، حتى يتم إجراء تصوير.
    ملاحظة: الدوران حول المقاطع في الجزء الخلفي الشريحة باستخدام علامة دائمة ذات الرؤوس غرامة قبل تصوير سيساعد على تحديد المقاطع عند استخدام المجهر.
  11. التصوير [كنفوكل]
    1. جبل الفروع المتعلقة ليزر مقلوب المسح مجهر [كنفوكل] بلصق الشريحة إلى المرحلة مع ساترة تواجه الهدف. تحديد البصريات الملائمة (الهدف والليزر، وإعدادات القناة مثل كسب وإزاحة) على شريحة تحكم والاحتفاظ بها ومتسقة بين العينات 27. تجنب أوفيرساتوراتينج بكسل لمنع فقدان البيانات-
    2. التقاط الصور [كنفوكل] Z-مداخن استخدام إعدادات القناة ل fluorophores جسم ثانوية مختارة، وحفظ ملفات الصور 27. اكتساب Z-مداخن لكل مقطع.
      ملاحظة: تكرار المعلمات المستخدمة للحصول على الصور الأرقام 2 و 3 باستخدام الإعدادات التالية شراء: وضع = XYZ؛ تكبير الهدف = 63 × النفط غمر عدسة؛ هدف الفتحة العددية = 1.4؛ الخطوة Z = 0.1 ميكرومتر؛ العمق Z = 16.23 ميكرومتر. استخدام إعدادات القناة التالية: الإثارة DAPI مع 20% الأشعة فوق البنفسجية-مجموعة الليزر، الانبعاثات تصفية النطاق = 430 480 نانومتر، كسب ضوئي (PMT) = 525 الخامس، وإزاحة PMT =-1.72%؛ 448 nm fluorophore (الرجوع إلى الجدول للمواد) الإثارة مع 20% 488 نانومتر الليزر، الانبعاثات تصفية النطاق = 493-573 شمال البحر الأبيض المتوسط، وكسب PMT = 689 الخامس، وإزاحة PMT =-0.2%؛ 594 الإثارة فلوروفوري شمال البحر الأبيض المتوسط مع 32% 594 نانومتر الليزر، الانبعاثات تصفية النطاق = 608-706 شمال البحر الأبيض المتوسط، وكسب PMT = 768 الخامس، وإزاحة PMT =-6.8%-
    3. حفظ ملفات البيانات الخام مع أسماء ملفات فريدة من نوعها، وصفية وإنشاء نسخة للتحرير في صورة تحليل البرمجيات.
  12. تجميع مكدسات Z لعرض إسقاطات الحد الأقصى
    1. قم بفتح نسخة ملف البيانات باستخدام برمجيات تحليل الصورة ثلاثية الأبعاد الملكية العامة (مثلاً، إيماجيج). تحقق من أن يظهر كل قناة كتسلسل صورة فردية (Z-المداخن).
    2. تقسيم القنوات الصورة باستخدام تسلسل القائمة التالية: “ الصور/اللون/تقسيم القنوات ”.
    3. بإنشاء صورة مدمجة التي يتراكب قنوات الفائدة باستخدام تسلسل القائمة التالية: " الصور/اللون/دمج القنوات. " حدد 594 في شمال البحر الأبيض المتوسط وشمال البحر الأبيض المتوسط 488 وقنوات DAPI أن تكون كاذبة اللون الأحمر والأخضر والأزرق، على التوالي. تحقق من " إنشاء مركب " وحدد " موافق " 28-
      ملاحظة: حذف القناة DAPI لأفضل أنقل التفاصيل الخاصة بالنظام التجاري المتعدد الأطراف في إسقاط الحد أقصى كما هو الحال في الشكل 2 و 3، حسب اختيار ألوان كاذبة لاثنين من القنوات-
    4. بحث Z-المكدس المدمجة وتقديم مذكرة من البداية والنهاية مواقف أفضل الداخلية Z-طائرات لكافة القنوات المرئية. إقالة الخارجي Z-الطائرات التي عادة ما يكون إشارة الأمثل نظراً للأسطح غير المستوية للمقطع. الرجوع إلى مرجع 29 للحصول على تفاصيل.
    5. تصور Z-المكدس المدمجة كصورة 2-د واحد عن طريق إجراء إسقاطات أقصى شدتها Z-المكدس باستخدام تسلسل القائمة تحليل صورة ثلاثية الأبعاد التالية: " الصور/مكدس/Z-المشروع. " أدخل في البداية والنهاية مواقف أفضل الداخلية Z-طائرات من الخطوة 1.11.3 " شريحة ابدأ " و " إيقاف شريحة، " على التوالي. حدد " كثافة ماكس " كنوع الإسقاط وانقر " موافق ". الرجوع إلى مرجع 28 لمزيد من التفاصيل.
  13. طن متري تحليل العلامات
    1. فتح برنامج التحليل التجاري صورة ثلاثية الأبعاد. حدد " "إنشاء مكتبة" " وتوفير اسماً وصفياً لمكتبة الصور. انقر فوق " إنشاء. " سحب ملفات الصور raw المتولدة من المجهر [كنفوكل] داخل المكتبة. ملفات أكبر حجماً تتطلب المزيد من الوقت لنقل-
    2. حدد ملف لتحليلها. اختر " "الموسعة التركيز" " من " عرض " القائمة لعرض صورة القناة المدمجة في النافذة الرئيسية.
    3. ضبط
    4. العتبة بسحب أداة مربع التمرير لكل قناة إلى اليسار أو إلى اليمين حتى يتم تقليل الإشارات الخلفية والإشارات الحقيقية قوية. نلاحظ أن كل قناة تظهر إشارة حقيقية للجزيء المسمى (مثلاً، قناة DAPI تظهر الأنوية مستطيل أو الانقسامية ولكن ليس تلقائي-الأسفار من السيتوبلازم أو [اغروس]).
    5. حدد " المنطقة مرفوعة للفائدة (ROI) " أداة ومخطط منطقة الفائدة يتم تحليلها. حدد " الإجراءات " متبوعاً بعلامة التبويب " المحاصيل بالتحديد " لاقتصاص الصورة. حفظ ملف الصورة المقتصة تحت اسم جديد. انقر فوق " القياسات " tab لإنشاء البروتوكول المتعلق بتصفية الكائنات المحددة ذات الصلة بتحليل ثلاثي الأبعاد-
    6. سحب " "البحث عن الأجسام" " إلى إطار البروتوكول. قم بإعادة تسمية البروتوكول الأول " DAPI. " حدد قناة DAPI في القائمة المنسدلة. اسحب الإعدادات التالية في بروتوكول DAPI ووضعها أدناه " "العثور على كائنات" " بالترتيب التالي (الجدول 1): " "ملء الثقوب" في ObjectsŔ " منفصلة لمس ObjectsŔ " استبعاد الكائنات قبل SizeŔ " استبعاد عدم لمس رويس ".
      ملاحظة: هدف الإعدادات الموجودة في الجدول 1 أولاً وضع عتبة الذي يتجاهل إشارات له توزيع وحجم غير متناسقة مع حجم الكائنات التي يتم تحليلها. على سبيل المثال، القضاء على إشارة ليست كبيرة بما يكفي لتكون نواة عند عد الأنوية.
    7. إجراء التسلسل (الخطوة 1.12.9) لتجميع المتبقية المرشحات لعلامات أخرى باستخدام الإعدادات الموجودة في الجدول 1 وبيتا-tubulin.
    8. تحديد " التدبير " في الجزء السفلي من كل بروتوكول. اختر " كثافة وقياس حجم " و " "طول الهيكل العظمى" " لوسم جميع توبولين، ولكن فقط السابق للإشارة DAPI.
    9. رسم
    10. دوروا جميع أنحاء المنطقة لقياس. مراقبة القياسات تحت " ملخص " علامة التبويب بعد عمليات البرنامج في المنطقة. نسخ البيانات وحفظها في جدول بيانات قابلة للتطبيق، كما هو الحال في الجدول 2. إنشاء نسخة احتياطية من جدول البيانات لتحليلها في وقت لاحق.
    11. تحديد قياسات للفائدة (على سبيل المثال، طول حزمة طن متري، وعدد من حزم MT/نواة، كما كشفت مع علامات مختلفة) في جدول البيانات وتحليلها لتحديد المعدلات لكل مجموعة.
      ملاحظة: متوسط طول حزمة MT = المجموع ' يعني طول الهيكل العظمى ل β-tubulin ' للجنين كل مقسوماً على العدد الكلي للأجنة. الرجوع إلى صف 20 من الجدول 2. تنسيق جدول البيانات بحيث المتغيرات ومجموعات تجريبية بسهولة رسوم بيانية.

2. دي نوفو MT الجمعية المقايسة (البروتوكول 2)

  1. بناء واختبار متعددة جيدا من خلال تدفق الجهاز ( الشكل 1) 2 أيام قبل التجربة.
    ملاحظة: تمكن الجهاز تبييض متزامن لعدة مجموعات تجريبية بعد العلاج نوكودازولي استخدام الإمدادات من الجدول للمواد. السدادة السيليكون تتطلب مالا يقل عن 24 ساعة وقت التجفيف قبل فإنه يشكل أي خطر السمية للأجنة.
    1. تقسيم أنبوب الطرد مركزي 50 مل في نصف الطول، استخدام الرقصة أو شهدت الفرقة-
    2. مش
    3. الدوائر شبه 7 قطع، مع دائرة نصف قطرها 3 سم، من أصل 70 ميكرومتر النايلون وتقليم لهم لتناسب محكم واحد نصف الانقسام الطرد المركزي الأنبوبة. الصق الدوائر شبه في أنبوب الطرد المركزي موازية إلى علامات تدرج 10 مل باستخدام السدادة السيليكون آمنة للحوض. السماح للجهاز الجاف لمدة يومين وشطف قبل نقع في كوب الماء حاء 2-3
    4. الخط العلوي (الخيوط) نهاية الأنبوب قطع أجهزة الطرد المركزي بنمذجة الطين ارتفاع السائل الاحتفاظ في التدفق من خلال الجهاز له عمق ¼ بوصة ( الشكل 1، وجهات النظر 2 و 3)-
    5. إعداد جهاز تبييض عن طريق إزالة المكبس من حقنه 50 مل وإدراج 12 بوصة من الأنابيب الدقيقة في التلميح. دفع الأنبوب بقدر ما أنه سوف يذهب وختم حول المشترك استخدام الطين النمذجة.
    6. الرطب قبل استخدام شبكة متوسطة الجنين للسماح للسائل للتشغيل من خلال الجهاز من خلال تدفق كامل. إفراغ زاوية الجهاز على الجليد حيث أن السائل تجمعات في جميع الأقسام ولكن لا يزال خارج الجبهة حيث يقع حافة الطين. استخدام موقفا الدائري، تعليق على جهاز تبييض أعلاه من خلال تدفق الجهاز على الجليد ( الشكل 1).
    7. تشيل 200 مل متوسطة الجنين على الجليد وصب ما يكفي في جهاز تبييض لضمان أن يتم مسح جميع فقاعات الهواء وأن معدل تدفق حوالي 7 مل/دقيقة ضبط معدل التدفق بتغيير ارتفاع المحاقن.
  2. انزيماتيكالي ديتشوريوناتي الأجنة
    1. جعل إيجاد حل عملي مبطلات غير محددة بتمييع 1 مل 10 ملغ/مل الأسهم حوزتي غير محددة في المتوسط الجنين 20 مل.
    2. إجراء ديتشوريوناتيون الكيميائية على الأجنة ح 1 قبل تيميبوينت عندما من المتوقع أن تصل إلى مرحلة النمو المنشود. قام تشوريونس دايجست عن طريق إزالة الجنين المتوسطة من 100 ملم بيتري الأطباق التي تحتوي على الأجنة وإضافة 20 مل من محلول العامل حوزتي غير محددة.
    3. إينكوباتي الأجنة في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 5
      ملاحظة: لا تتجاوز 5 دقائق أو استخدام أعلى تركيز للحل حوزتي غير محددة، كما سيؤدي هذا في الأجنة التي تقع بعيداً مرة تعامل مع نوكودازولي-
    4. بسرعة "الماصة؛" بحوزتي غير محددة، وإعادة ملء الأطباق مع حوالي 25 مل الجنين المتوسطة. كرر مرة واحدة.
    5. باستخدام ماصة زجاجية 1 مل، نقل الأجنة الذين تقل أعمارهم عن 24 أطباق هبف للزجاج لحمايتهم من الأضرار-
    6. ديتشوريونيشن كاملة عن طريق إزالة تشوريونس باستخدام زوج من الملقط غرامة، يدوياً كما هو موضح في الخطوة 1.1.5.
    7. مكان الزجاج بيتري الأطباق التي تحتوي على الأجنة ديتشوريوناتيد في حاضنة 28.5 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة حتى تصل إلى مرحلة النمو المنشود.
  3. ديبوليميريزي النظام التجاري المتعدد الأطراف القائم
    1. يعد إيجاد حل عملي من 5 ميكروغرام/مل نوكودازولي عن طريق الجمع بين 50 ميليلتر 1 ملغ/مل نوكودازولي الأسهم مع 10 مل الجليد الباردة الجنين المتوسطة-
      تحذير: استخدام القفازات عند التعامل مع نوكودازولي، مهيجة جلد-
    2. تبادل المتوسطة الجنين من مجموعة العلاج نوكودازولي مع 10 مل نوكودازولي الباردة العامل الحل. وضع أطباق بيتري على الجليد لوقت مناسب لمرحلة النمو (على سبيل المثال، 1 ح للأجنة سوميتي 4-5). جانبا أجنة التحكم غير المعالجة في طبق بتري على الجليد لتكون ثابتة جنبا إلى جنب مع عينات تبييض في خطوة 2.3.4.1-
    3. نقل الأجنة باستخدام ماصة مصقول 1 مل زجاج نار للتدفق من خلال الجهاز، استخدام حجرات منفصلة لكل مجموعة تجريبية. بدء تبييض نوكودازولي بصب المتوسطة الجنين الباردة الجليد في الجزء العلوي من المحاقن 50 مل.
      ملاحظة: استخدام الأجنة 30 على الأقل من كل مجموعة تجريبية. يمكن أن تتكون المجموعات التجريبية لمراقبة الأجنة أو مجموعة متنوعة من morpholino أو حقن الحمض النووي الريبي الأجنة. سيتطلب تبييض ما مجموعة حوالي 150 مل المتوسطة الجنين وتضاف كل دقيقة 8-10 تبييض في نوكودازولي بينما تواصل تكبح النمو طن متري بالجليد. حفظ الأجنة على الجليد أمر ضروري لنجاح هذا الفحص للنظام التجاري المتعدد الأطراف غير مستقرة عند درجات الحرارة الباردة والباردة تأخر التنمية في الأجنة في وقت مبكر.
    4. "تسمح للنظام التجاري المتعدد الأطراف" لتنمو بعد 20 دقيقة من تبييض في RT بنقل الأجنة إلى أطباق بتري الزجاجية التي تحتوي على الحارة المتوسطة الجنين (28.5 درجة مئوية) باستخدام ماصة زجاج مصقول 1 مل نار. حالما يتم نقل الأجنة، وبدء تشغيل جهاز ضبط وقت.
      1. إصلاح أجنة التحكم وتبييض في 1 دقيقة، 5 دقيقة و 10 دقيقة قبل بيبيتينج حوالي 10 أجنة في 1.5 مل الطرد المركزي أنبوب مليء بإصلاح PFA/ماب 4% 1 مل (28.5 درجة مئوية)، وفي أعقاب التوجيهات في خطوة 1.2.3.
  4. إعداد العينات إيمونولابيلينج كما هو موضح في المقاطع 1.3-1.5.
  5. الأقسام إيمونولابيل العائمة والأجنة الصورة كالموضحة في المقاطع 1.6-1.10 مع التغييرات التالية لمواصفات جسم الأولية: استخدام 1: 500 أرنب المضادة-γ-tubulin و 1: 200 الماوس المضادة-β-توبولين.
  6. العملية وتحليل الصور باستخدام برمجيات التحليل صورة ثلاثية الأبعاد، كما هو موضح في الخطوة 1، 12-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تحليل للنظام التجاري المتعدد الأطراف مستقرة وديناميكية باستخدام إيمونولابيلينج
في البروتوكول 1، هو كشف توزيع السكان الفرعية طن متري خلال أوائل (عارضة العصبية) والمتأخرة (رود العصبية) مراحل تطور الأنبوب العصبي، استخدام غلو-tubulin وصور-tubulin كعلامات لمستقرة ودينامية النظام التجاري المتعدد الأطراف، على التوالي. ديناميكية النظام التجاري المتعدد الأطراف الغلبة في هيندبرين في مرحلة عارضة العصبية (4-5 سميتس) (الشكل 2). كما يتطور العارضة إلى قضيب العصبية (سميتس 11-12)، مرحلة من مراحل epithelialization المعززة، MTs نوعيا أقل إيمونوريكتيفي مع جسم مكافحة تير-tubulin (الشكل 2ه-ح)، لا سيما في قضيب البطني. وفي المقابل، غلو-tubulin متناثرة والشروريه في جميع أنحاء العارضة العصبية (الشكل 3ألف-دال)، ولكن هو إثراء في قضيب العصبية البطني على طول مساحات طن متري (الشكل 3ح ه). رؤوس الأسهم أشر إلى حزم MT محددة أو الهياكل حيث ازداد وضع العلامات.

على الرغم من أن الأجسام المضادة-غلو-tubulin ومكافحة تير-tubulin أنتجت في نفس الأنواع المضيفة (منع تجربة وضع العلامات مزدوجة)، تشير هذه النتائج إلى أن علامات MT مستقرة ودينامية نادراً ما تتداخل في hindbrain الزرد. أولاً، لقد قضيب العصبية البطني أكثر استقرارا (الشكل 3و) من دينامية النظام التجاري المتعدد الأطراف (الشكل 2و). يتم عكس الاتجاه في قضيب العصبية الظهرية، تمشيا مع نموذج الزرد neurulation التي تظل الأنسجة الظهرية دينامية حتى الأنبوب العصبي شكلت20. ثانيا، بينما مغزل الانقسامية تماما المسماة بجسم طير-tubulin في العارضة العصبية (الشكل 2د، رؤوس الأسهم)، فقط القاعدة المغزل، المصادف centrosome، يسمى مع علامة الاستقرار (غلو-tubulin الشكل 3 د، رؤوس الأسهم). Β-tubulin الفلورة، مشتركة بين كلا فحوصات، يبلغ المجرب لتوزيع جميع النظام التجاري المتعدد الأطراف ويوفر أساسا لرفض وسم غير محددة.

قياس الكائنات باستخدام برمجيات تحليل الصورة ثلاثية الأبعاد وينتج كمية كبيرة من البيانات التي يمكن تنظيمها في جدول مناسب (الجدول 2). لجعل طول، والعد، وقياسات المجال، نحن نستخدم فقط مجموعة فرعية من البيانات التي تتوفر لتحليل. يعتبر من عناصر البيانات التي لا نحلل زيادة عدد الكائنات المحددة. يتم استخدام هذا الرقم كعنصر تحكم الجودة داخلية، كما ينبغي أن لا يختلف العدد على نطاق واسع بين مثل الفروع، ونسبة نويات للنظام التجاري المتعدد الأطراف يجب أن تبقى مماثلة في حالة معاملة واحدة. عزلاء مؤشرا أما التحليل يحتاج إلى أن إعادة تشغيل باستخدام مرشحات المعدلة أو الذي يسمى الصورة سيئة جداً لتحليل. وهكذا، ينبغي أن ريناليزيد كل من الصور الخارجة مع إعدادات المعدل. وينبغي دراسة المقطع الخارجة لعلامات وسم الفقراء أو الأضرار المادية التي قد تنجم في تهم الكائن غير عادية. وبمجرد الانتهاء من التحليل ومراقبة الجودة، يمكن استرداد معلومات مفيدة من البيانات الخام مثل متوسط الطول من مجموع النظام التجاري المتعدد الأطراف واستقرار النظام التجاري المتعدد الأطراف أو نسبة استقرار النظام التجاري المتعدد الأطراف لمجموع النظام التجاري المتعدد الأطراف (الجدول 3). وبالإضافة إلى هذه القياسات، يمكن الحصول على العديد من المقاييس الأخرى استخدام برمجيات تحليل الصورة ثلاثية الأبعاد التي يمكن استخدامها لاستخلاص استنتاجات حول النظام التجاري المتعدد الأطراف أو علاقتها بالهياكل الخلوية الأخرى (نواة، سينتروسومي، إلخ).

دي نوفو والرزن الجمعية طن متري
علاج نوكودازولي ديبوليميريزيس النظام التجاري المتعدد الأطراف أدى إلى وسم منتشر (الشكل 4أ، د 4، و 4 غرام). كما تنمو النظام التجاري المتعدد الأطراف، التي تمتد من سينتروسومي (الشكل 4باء، 4E، وح 4)، ومع ذلك، قد لا يكون واضحا في طائرة واحدة بسبب مساراتها غير المستوية (الشكل 4ج، 4F، و 4I). ومع ذلك، بعض البرامج تحليل الصورة القادرة على قياس أطوال ثلاثي الأبعاد، مما يتيح إجراء تقييم لنمو طن متري بعد تبييض نوكودازولي (الجدول 4). ملاحظة هامة التي يمكن الحصول عليها من مجموعة البيانات في الجدول 4 أن متوسط طول النظام التجاري المتعدد الأطراف ويبدو أن تتزايد بمرور الوقت بعد تبييض نوكودازولي في جميع المناطق للأنبوب العصبي تحليلها. كما ذكر أعلاه، يمكن أن توفر أنواع أخرى من المقاييس التي تم الحصول عليها من برمجيات تحليل الصورة ثلاثية الأبعاد الخلوية السياق لتفسير البيانات النقل المتعدد الوسائط (على سبيل المثال، نسبة للنظام التجاري المتعدد الأطراف كل نواة).

Figure 1
الشكل 1 : شكل توضيحي لجهاز تبييض ل دي نوفو المقايسة الجمعية MT. اقحم هو صورة مقربة للجهاز من خلال تدفق من عيون لصقها في أنبوب 50 مل الطرد مركزي قطع طولاً. الشبكة كومبارتمينتاليزيس الجهاز من خلال تدفق مثل أنه يمكن معالجة مجموعات تجريبية متعددة في وقت واحد. أثناء الاستخدام، إضافة إلى المحاقن المتوسطة الجنين ويتدفق ببطء عبر الأنابيب لملء التدفق من خلال الجهاز، وتوفير شطف ثابتة لجميع المجموعات التجريبية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2: استخدام إيمونولابيلينج صورة دينامية التجاري المتعدد الأطراف. كانت ثابتة ديتشوريوناتيد الأجنة في المراحل المناسبة (12-13 و 4-5 ألف- دال سميتس في ه-ح)، مقطوع العرض عن طريق هيندبرين، وإيمونولابيليد مع الأجسام المضادة ضد β-tubulin (الأخضر في ألف و هاء) بمناسبة كل من النظام التجاري المتعدد الأطراف وتيروسيناتيد α-tubulin (الأحمر في ب وو) للكشف عن دينامية السكان طن متري. ديناميكية للغاية النظام التجاري المتعدد الأطراف يمكن اعتبار الصور المدمجة (ج، ز) وعلى تكبير أعلى (د، ح) المناطق حيث العلامة الصفراء المرئية (رؤوس الأسهم في د، ح). تغيير حجم أشرطة = 25 ميكرومتر (أ-ج وز ه) و 10 ميكرومتر (دال وحاء). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
وإيجور 3: استخدام إيمونولابيلينج صورة مستقرة mts. ديتشوريوناتيد الأجنة ثابتة، مقطوع عن طريق هيندبرين، وإيمونولابيليد في المراحل المناسبة (4-5 سميتس في أ-سميتس د و 12-13 في ه-H). تتم تسمية MTs مستقرة مع الأجسام المضادة ضد شكل ديتيروسيناتيد α-tubulin (غلو-tubulin) (أحمر في ب وو) بينما كانت تصور مجموع النظام التجاري المتعدد الأطراف مع جسم عامة β-tubulin (أخضر في ألف و هاء). إشارات حمراء وصفراء في الصور المدمجة (ج، ز) وعلى تكبير أعلى (د، ح) تمثل مناطق عالية الاستقرار طن متري (رؤوس الأسهم في د، ح). تغيير حجم أشرطة = 25 ميكرومتر (أ-ج وز ه) و 10 ميكرومتر (دال وحاء). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: استخدام إيمونولابيلينج صورة الوليدة التجاري المتعدد الأطراف. كانت ثابتة في 4-5 سميتس ومقطوع العرض عن طريق هيندبرين الأجنة ديتشوريوناتيد. وكانت أبواب إيمونولابيليد β-tubulin (د، ه، وو) وضع علامة على تزايد النظام التجاري المتعدد الأطراف و γ-tubulin (أ وب وج) لوضع علامة التنو النقطة/سينتروسومي. هو محاصر منطقة الظهرية للأنبوب العصبي في (A، D; ب، ه وج و) وسيظهر في أعلى التكبير (ز، ح، أنا، على التوالي) للكشف عن نوى (DAPI، الأزرق)، centrioles (γ-tubulin، الأحمر) ومجموع النظام التجاري المتعدد الأطراف (β-tubulin، الخضراء). الأبيض رؤوس الأسهم: كولوكاليزيشن للنظام التجاري المتعدد الأطراف و centrioles؛ أصفر رؤوس الأسهم: مريكز الثانية خلية مرئياً. تغيير حجم أشرطة = 25 ميكرومتر (واو) و 10 ميكرومتر (ز--أنا). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Table 1
الجدول 1: الإعدادات الافتراضية لتصفية الكائنات في برمجيات تحليل الصورة ثلاثية الأبعاد.

Table 2
الجدول 2: ممثل مجموعة البيانات الخام التي تم الحصول عليها باستخدام تحليل الصور ثلاثية الأبعاد البرنامج لتحليل استقرار النظام التجاري المتعدد الأطراف. يمثل كل عمود القياسات من مقطع واحد. دقيقة: قياس أصغر؛ ماكس: قياس أكبر؛ التنمية المستدامة: الانحراف المعياري؛ SE: الخطأ القياسي.

Table 3
الجدول 3: برامج التحليل التحديد الكمي لاستقرار النظام التجاري المتعدد الأطراف الصور أمثلة لمجموعات البيانات التي يمكن الحصول عليها من ثلاثي الأبعاد. تحديد قياسات طول يعني المجموع (β-tubulin) ومستقرة MTs (غلو-tubulin) يحسب بأخذ متوسط طول الهيكل العظمى يعني التسمية ذات الصلة من جميع العينات (انظر الجدول 2)، ونسبة ثابتة مجموع (النظام التجاري المتعدد الأطراف جلوتوبولين الشرائط كل الشرائط β-tubulin) يحسب بأخذ متوسط β-tubulin العد مقسوماً على متوسط عدد غلو-tubulin.

Table 4
الجدول 4: أمثلة على مجموعات البيانات التي يمكن الحصول عليها من برنامج تحليل الصور ثلاثي الأبعاد لتحليل دي نوفو الجمعية طن متري. تجربة نتائج تمثيلية من الجمعية حيثياته مليون طن، مقارنة مجموعات البيانات التي تم الحصول عليها لثلاث نقاط وقت الاسترداد (1 و 5 و 10 دقيقة) بعد تبييض نوكودازولي. لكل نقطة من الزمن، تظهر القياسات التي تم الحصول عليها لعد النووي، centrioles (بونكتا γ-tubulin)، وعدد مجموع النظام التجاري المتعدد الأطراف (الشرائط β-tubulin)، لتحديد مناطق المصورة تم تحليلها (المقطع العرضي للأنبوب العصبي النامي).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وهناك حاليا العديد من الأساليب للتصوير ديناميات طن متري في وقت مبكر الزرد التنمية، بدءاً من تصوير مباشر من الجزيئات المعلمة إيمونولابيلينج من ثابتة الأنسجة11،12،،من1314. على الرغم من أن النظام التجاري المتعدد الأطراف في خلية واحدة يمكن أن توجد في الدول أما الديناميكية أو مستقرة، ابيثيلياليزيشن هو عملية التي استقرت MTs تدريجيا مع مرور الوقت. استخدام علامات للنظام التجاري المتعدد الأطراف مستقرة ودينامية ويوفر طريقة لتصور هذه الظاهرة. الطريقة المعروضة هنا روافع قوة برامج التصوير ثلاثي الأبعاد للتحديد الكمي للانتقال من الحيوية إلى السكان MT مستقرة في مقطع عرضي من الأنسجة الجنينية الزرد. في البروتوكول 2، يستخدم الأسلوب لتسمية عدد سكانها متميزة MTs الوليدة واتبع العمل الإضافي التنو والنمو.

النظام التجاري المتعدد الأطراف، يصعب الصورة في حالتها الأصلية بسبب ميلها ديبوليميريزي. وبالتالي، عنصرا أساسيا في هذا الأسلوب من التثبيت السريع للنظام التجاري المتعدد الأطراف في جميع أنحاء الجنين الكامل. ويتحقق ذلك ببدء تشغيل التثبيت في درجات حرارة الفسيولوجية واستخدام المخزن مؤقت أن كل استقرار النظام التجاري المتعدد الأطراف، ويزيد من نفاذية الجنين. وقت التثبيت مهم أيضا كما فشل التثبيت تقليص للقبض على النظام التجاري المتعدد الأطراف أثناء التثبيت المفرط يمكن أن تخفي [ابيتوبس]، تتداخل مع ربط جسم. وقت التثبيت المقترحة ح 3-4 يعمل مع الأجنة الموجودة في منتصف جاسترولاتيون يصل إلى التسميد بعد 24 ساعة. الأجنة نهاية أصغر سنا من مقياس الوقت ينبغي أن تكون ثابتة لأقرب إلى ح 3 بينما الأجنة الأكبر سنا قد تحتاج إلى كامل ح 4. حتى مع التثبيت الصحيح، سوف ديبوليميريزي النظام التجاري المتعدد الأطراف مع مرور الوقت حيث يجب أن يحدث تمزيقها وإيمونولابيلينج خلال أسبوع واحد من تحديد.

مرة واحدة يتم إصلاح الأنسجة بشكل صحيح، يمكن أن تنشأ مشاكل مع إيمونولابيلينج. المشكلة الأكثر شيوعاً التي تواجه قد تغلغل الفقراء من خلال المركز الأنسجة، خاصة، إذا هي المحتضنة أقسام كثيرة جداً في البئر نفسها. زيادة تركيز الوقت جسم والحضانة الأولية للأجسام المضادة الأولية والثانوية، جنبا إلى جنب مع زيادة المنظفات لتحسين permeabilization للأجنة سوف تحسين معظم المشاكل إيمونولابيلينج. إذا العلامات جسم يفشل بسبب مشكلات التثبيت أو مشاكل إيمونولابيلينج، فمن الممكن لتحديد السبب بفحص جسم تسمية النمط. سينتج وسم مكثفة في الغشاء التثبيت الفقراء ونشر العلامات في السيتوبلازم، بينما سيؤدي إلى تثبيت الإفراط في وضع العلامات الضعيفة التي يحتفظ ببنية النقل المتعدد الوسائط. اختراق الفقراء من الأجسام المضادة، ومع ذلك، ستظهر كمناطق في وسط النسيج دون وسم.

القدرة على تحليل الصور طن متري بطريقة ذات مغزى يعتمد على التصوير عالية الجودة. للقبض على طول MT ثلاثي الأبعاد، يجب استخدام الحد الأدنى لحجم Z-خطوة ممكنة للهدف والفتحة العددية. تم القبض على الصور المعروضة هنا مع 63 × النفط انبثاق الهدف مع الفتحة العددية 1.4 إنتاج ما يلي: بكسل = 240 نانومتر، خطوة ض = 0.1 ميكرومتر، حجم مكدس Z = 16.252 ميكرومتر. نظراً لأن عرض طن متري واحد هو 25 نانومتر، تقريبا أدناه 10 مرات لا يمكن أن يكون الحد الأقصى للقرار مجهر ضوء، هذا متري بدقة تقاس باستخدام هذا الأسلوب. بدلاً من ذلك، يمكن أن تقاس أطوال طن متري فقط يساوي أو أكبر من حجم بكسل الحد الأدنى قابلة للتحقيق في جميع الأبعاد الثلاثة. الخط و/أو الإطار المتوسط يمكن تعزيز التعريف إشارة طن متري. ينبغي أن يفرد تحليل طن متري للمقاطع ذات جودة عالية. بينما الأنسجة مع التثبيت الفقيرة لا يمكن تصويرها وتحليلها، أوفيرفيكسيشن خفيفة يمكن أن تعوض عن طريق زيادة كثافة الليزر بدقة والحصول على الكشف عن إشارة ضعيفة مع الحفاظ على مجموعة ديناميكية جيدة. يمكن تصحيح اختراق جسم الفقيرة، بينما لا المثلى، التي تحد من الحصول على الصور للمناطق المسماة جيدا، أسفر عن التصوير مقطع أرق (5-10 ميكرون). خلفية عالية من العلامات يمكن تعويضه عن طريق ضبط إعدادات عامل التصفية. ومع ذلك، إذا كان يتم القيام بأي من هذه التعديلات، أنها ضرورية للتحقق من أن عتبة مرشحات مقبول على كل طائرة من Z-المكدس.

برنامج تحليل الصور ثلاثي الأبعاد يسمح المجرب لقياس طول طن متري ومنطقة وزاوية، ووفرة والمقاييس الأخرى في الفضاء ثلاثي الأبعاد من أقسام الأنسجة الثابتة. الأسلوب الموصوفة هنا يوفر توجيهات للحصول على مثل هذه البيانات باستخدام البرمجيات المتاحة تجارياً. ومع ذلك، قد تكون وحدات تصفية تكييف البرمجيات المشاع معززة مع الإضافات ذات الصلة و/أو وحدات الماكرو، جعل التحليل متاحة للجميع. قبل التحليل، يجب أن تكون الصور الخام ثريشولديد لتجنب بما في ذلك الخلفية وإشارات غير محددة في التحديد الكمي. بمجرد اكتمال التحليل، ويتم نقل البيانات إلى جدول بيانات قابلة للتطبيق، ويمكن إجراء استدلالات كثيرة من مجموعة البيانات. كان أحد الحسابات هنا الشرائط غلو-tubulin كل الشرائط β-tubulin، أو نسبة استقرار النظام التجاري المتعدد الأطراف لمجموع النظام التجاري المتعدد الأطراف حيث يمثل الرقم 1 أن cytoskeleton MT كامل قد استقرت في العائد على الاستثمار. إذا رغبت المجرب لتكملة البيانات الكمية، توليد تنسيق ملف صور ذي علامات مصقول (TIFF) الصورة مع حجم أشرطة جهد مع برمجيات التحليل صورة ثلاثية الأبعاد.

ويسمح هذا الفحص التحليل الوظيفي للبروتينات المتورطين في الجمعية طن متري، فيفو. إذا كان يتم إجراء إيمونولابيلينج على مقاطع المسلسل بالتناوب، يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة دينامية واستقرار النظام التجاري المتعدد الأطراف في الجنين نفسه. في المستقبل، سوف تسمح التعديلات مثل المنظفات زيادة أو تغيير زوايا تضمين استخدام هذه الأساليب للأجنة الأكبر سنا، وطائفة أوسع من الأسئلة التشريحية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

المجهر [كنفوكل] تم شراؤها بأموال من الولايات المتحدة الوطني العلم مؤسسة (NSF)، منحة #DBI-0722569. وأيد البحث بالولايات المتحدة معاهد للصحة الوطنية المعهد الوطني للعامة الطبية العلوم (المعاهد الوطنية للصحة/نيجمس) منحة #GM085290 وإدارة الولايات المتحدة للدفاع (DOD) منحة #W81XWH-16-1-0466 الممنوح لجمهورية مقدونيا بروستر. أيد منحة الحيوية هاء إلى UMBC من معهد هوارد هيوز الطبي من خلال كلية قبل وبرنامج تعليم العلوم الجامعية، ومنحة #52008090. وأيد براون ل. س من "الإدارة الأمريكية للتعليم جانن زمالة"، "زمالة الدراسات العليا ميييرهوف" الممولة من المنح المعاهد الوطنية للصحة/نيجمس #GM055036، ومن أسيستانتشيب البحوث الممولة "وزارة الدفاع الأميركية" منحة #W81XWH-16-1-0466.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Used to treat petridishes.   Prepare 1% agarose
by heating a solution of  1 gram agarose per 100 ml 1X embryo medium in a microwave
until polymerized. 
Kpipes Sigma P7643
NaCl Sigma S7653
Tris-HCl Sigma T3253-500G
KCl Sigma P9333-500G
CaCl2·2H2O Sigma C5080
NP-40 American Bioanalyticals AB01424
EGTA Sigma E3889-25G
MgCl2 Sigma M2670-500G
Bovine serum albumin (BSA) Fisher BP1605
Triton-x American Bioanalyticals AB02025
Anti-Fade mounting medium Invitrogen P10144
Mouse anti-β-tubulin Developmental studies Hybridoma Bank E7 1/200
Rabbit anti-γ-tubulin Genetex GTX113286 1/500
Rabbit anti-α-tubulin Genetex GTX108784 1/1000*
Rabbit anti-detyrosinated-tubulin Millipore AB3201 1/200-1/1000*  Titrate antibody with first use of new lot.
Rabbit anti-tyrosinated-tubulin Millipore ABT171 1/500
Mouse anti-centrin Millipore 04-1624 1/1000
Goat 488 anti-rabbit Thermofisher A11008 1/500
Goat 594 anti-rabbit Thermofisher A11012 1/500
Goat 594 anti-mouse Thermofisher A11005 1/500
Goat 488 anti-mouse Thermofisher A11001 1/500
Vibratome Vibratome 1500
Forceps World Precision Instruments 555227F
100 mm petri dish Cell treat 229693
35 mm petri dish Cell treat 229638
50 ml falcon tube Fisher 14-432-22
Woven nylon mesh 70 um Amazon.com B0043D1SZG 
Micropipette Gilson F123602
Glass pipette Fisher NC-999363-9
Aquarium sealant Amazon.com, by MarineLand Silicone Sealer 1 oz (Tube) 
Ring stand Fisher 14-675BO
Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID Cole-Parmer WU-06417-21
Modeling clay Amazon.com Sargent Art 22-4000 Any wax or oil based non-toxic modeling clay will suffice
Clamp Fisher 02-215-466
60ml syringe Fisher 14-820-11
Embryo medium (E3) 34.8 g NaCl
1.6 g KCl
5.8 g CaCl2·2H2O
9.78 g MgCl2·6H2O

To prepare a 60X stock, dissolve the ingredients in H2O, to a final volume of 2 L. Adjust the pH to 7.2 with NaOH. Autoclave. To prepare 1X medium, dilute 16.5 mL of the 60X stock to 1 L. 
Blocking Solution 50 ml TBS-NP-40
2.5 ml normal goat serum
1 g BSA
625 µl Triton-X
TBS-NP-40 (pH 7.6) 155 mM NaCl
10 mM Tris HCl
0.1% NP-40
2x MAB (pH6.4) 160 mM KPIPES
10 mM EGTA
2 mM MgCl2
Commercial 3-D Image processing Software PerkinElmer Volocity (V 6.2)
Dry block heater  VWR 12621-108 Used as a hot plate to melt agarose in Protocol 1.
Dissecting Microscope Leica MZ12
Confocal Microscope Leica SP5
Flat embedding mold emsdiasum.com BEEM 70904-01
Public domain image processing software NIH ImageJ (V 1.5)
* Success varies by lot number

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, (4), 309-322 (2008).
  2. Conde, C., Cáceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nat Rev Neurosci. 10, (5), 319-332 (2009).
  3. Kaverina, I., Straube, A. Regulation of cell migration by dynamic microtubules. Semin Cell Dev Biol. 22, (9), 968-974 (2011).
  4. Kollman, J. M., Merdes, A., Mourey, L., Agard, D. A. Microtubule nucleation by γ-tubulin complexes. Nat Rev Mol Cell Biol. 12, (11), 709-721 (2011).
  5. Howard, J., Hyman, A. A. Growth, fluctuation and switching at microtubule plus ends. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, (8), 569-574 (2009).
  6. Schulze, E., Kirschner, M. Dynamic and stable populations of microtubules in cells. J Cell Biol. 104, (2), 277-288 (1987).
  7. Gundersen, G. G., Kalnoski, M. H., Bulinski, J. C. Distinct populations of microtubules: Tyrosinated and nontyrosinated alpha tubulin are distributed differently in vivo. Cell. 38, (3), 779-789 (1984).
  8. Li, R., Gundersen, G. G. Beyond polymer polarity: how the cytoskeleton builds a polarized cell. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, (11), 860-873 (2008).
  9. Asakawa, K., Kawakami, K. A transgenic zebrafish for monitoring in vivo microtubule structures. Dev Dyn Off Publ Am Assoc Anat. 239, (10), 2695-2699 (2010).
  10. Wühr, M., Tan, E. S., Parker, S. K., Detrich, H. W., Mitchison, T. J. A model for cleavage plane determination in early amphibian and fish embryos. Curr Biol CB. 20, (22), 2040-2045 (2010).
  11. Tran, L. D., Hino, H., et al. Dynamic microtubules at the vegetal cortex predict the embryonic axis in zebrafish. Development. 139, (19), 3644-3652 (2012).
  12. Butler, R., Wood, J. D., Landers, J. A., Cunliffe, V. T. Genetic and chemical modulation of spastin-dependent axon outgrowth in zebrafish embryos indicates a role for impaired microtubule dynamics in hereditary spastic paraplegia. Dis Model Mech. 3, (11-12), 743-751 (2010).
  13. Yoo, S. K., Lam, P. -Y., Eichelberg, M. R., Zasadil, L., Bement, W. M., Huttenlocher, A. The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish. J Cell Sci. 125, (23), 5702-5710 (2012).
  14. Andersen, E. F., Halloran, M. C. Centrosome movements in vivo correlate with specific neurite formation downstream of LIM homeodomain transcription factor activity. Development. 139, (19), 3590-3599 (2012).
  15. Lee, S. -J. Dynamic regulation of the microtubule and actin cytoskeleton in zebrafish epiboly. Biochem Biophys Res Commun. 452, (1), 1-7 (2014).
  16. Bulinski, J. C., Gundersen, G. G. Stabilization and post-translational modification of microtubules during cellular morphogenesis. BioEssays. 13, (6), 285-293 (1991).
  17. Magiera, M. M., Janke, C. Chapter 16 - Investigating Tubulin Posttranslational Modifications with Specific Antibodies. Methods Cell Biol. 115, 247-267 (2013).
  18. Hong, E., Jayachandran, P., Brewster, R. The polarity protein Pard3 is required for centrosome positioning during neurulation. Dev Biol. 341, (2), 335-345 (2010).
  19. Westermann, S., Weber, K. Post-translational modifications regulate microtubule function. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, (12), 938-948 (2003).
  20. Jayachandran, P., Olmo, V. N., et al. Microtubule-associated protein 1b is required for shaping the neural tube. Neural Develop. 11, 1 (2016).
  21. Nam, S. -C. Role of Tau, a microtubule associated protein, in Drosophila photoreceptor morphogenesis. Genes N Y N 2000. 54, (11), 553-561 (2016).
  22. Abal, M., Piel, M., Bouckson-Castaing, V., Mogensen, M., Sibarita, J. -B., Bornens, M. Microtubule release from the centrosome in migrating cells. J Cell Biol. 159, (5), 731-737 (2002).
  23. Delgehyr, N., Sillibourne, J., Bornens, M. Microtubule nucleation and anchoring at the centrosome are independent processes linked by ninein function. J Cell Sci. 118, (8), 1565-1575 (2005).
  24. Manning, J. A., Lewis, M., Koblar, S. A., Kumar, S. An essential function for the centrosomal protein NEDD1 in zebrafish development. Cell Death Differ. 17, (8), 1302-1314 (2010).
  25. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn Off Publ Am Assoc Anat. 203, (3), 253-310 (1995).
  26. Beck, A. P., Watt, R. M., Bonner, J. Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development. JoVE J Vis Exp. (84), e50703 (2014).
  27. FÖldes-Papp, Z., Demel, U., Tilz, G. P. Laser scanning confocal fluorescence microscopy: an overview. Int Immunopharmacol. 3, (13-14), 1715-1729 (2003).
  28. Ferreira, T., Rasband, W. S. ImageJ User Guide - IJ 1.46. Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/ (2010).
  29. Z-functions - ImageJ. Available from: https://imagej.net/Z-functions (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics