성숙한 슈반 세포 생성을위한 골수 유래 선조 세포의 저산소 전처리

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Developmental Biology

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Summary

골수 내에서 골수 간질 세포 (MSC)가 존재합니다. 우리의 프로토콜은 hypoxic preconditioning을 통해 세포의 인구를 풍요롭게하고 이후 그들이 성숙한 Schwann 세포가되도록 지시합니다.

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Tsui, Y. P., Mung, A. K., Chan, Y. S., Shum, D. K., Shea, G. K. Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells. J. Vis. Exp. (124), e55794, doi:10.3791/55794 (2017).

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Abstract

이 원고는 골수 간질 세포 (MSC) 집단으로부터 신경 전구 세포를 풍부하게하고 나중에 성숙한 슈반 세포 운명으로 인도하는 방법을 설명합니다. 우리는 랫드 및 인간 MSC에 일과성 저산소 상태 (16 시간 동안 1 % 산소)를 투여 한 후 상피 세포 성장 인자 (EGF) / 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF) 보충과 함께 낮은 부착 기질에 신경근으로 확장시켰다. Neurospheres는 poly-D-lysine / laminin 코팅 조직 배양 플라스틱에 뿌리고 Schwann cell-like cells (SCLCs)를 생성하기 위해 β-Heregulin, bFGF 및 혈소판 유도 성장 인자 (PDGF)가 포함 된 gliogenic cocktail에서 배양 하였다. SCLC는 E14-15 임신 Sprague Dawley 쥐에서 얻은 정제 된 Dorsal root ganglia (DRG) 뉴런으로 2 주간 공동 배양을 통한 운명을 유도했다. 성숙한 Schwann 세포는 S100β / p75 발현에 지속성을 나타내며 미엘린 분절을 형성 할 수 있습니다. 이러한 방식으로 생성 된 셀은 잠재적 인 a질병 모델링뿐만 아니라 척수 손상 후자가 세포 이식에서의 응용.

Introduction

신경 progenitors과 그 유도체의 이식은 외상성 신경 손상 1 , 2 및 neurodegeneration 3 , 4 후 치료 전략으로 약속을 보여줍니다. 임상 적용 전에, i) 줄기 / 전구 세포의자가 공급원에 접근하고 확대하기위한 방법과 ii) 관련성이 있고 성숙한 세포 유형으로 그들을 안내하는 수단 3)을 보장하는 것이 필수적이다. 척수 손상에 대한 세포 치료에 대한 우리의 관심은 성인 조직으로부터의 강력한 신경 전구 세포 공급원을 찾기 위해 노력했다.

MSCs의 subpopulation은 신경 볏에서 유래하고 쉽게 골수강에서 접근 가능합니다. 이 세포들은 뉴런과 glia 5 를 생성 할 수있는 신경 전구 세포입니다. 뇌 허혈의 동물 모델은 저산소증이 prol 뇌 내부의 신경 progenitors의 iferation 및 multipotency 6 . 이것은 골수 유래 신경 전구 세포를 확장시키는 수단으로서 저산소 전처리를 이용하는 기초였다.

손상된 척수에 Schwann 세포를 이식하면 재생이 촉진됩니다 2 . SCLCs는 gliogenic 요인 ( ie, β-Heregulin, bFGF, 및 PDGF-AA)에 보충 교재에 의하여 MSCs에서 생성 할 수 있고 그러나 표현형 불안정성을 설명 할 수있다. 성장 인자를 제거하면 섬유 아세포 유사 표현형으로 되돌아 간다. 표현형의 불안정성은 세포 이식에서 바람직하지 않은데, 이는 분화 및 발암의 위험이 있기 때문이다. Schwann 세포 전구체는 배아 말초 신경 8 내의 축삭 번들과 관련이 있기 때문에, 우리는 정화 배아 DRG 뉴런과 함께 공동 배양 SCLCs 7 ,ass = "xref"> 9. 결과 성숙 Schwann 세포는 운명 - 약혼 및 시험관 기능 7 , 9생체 내 10 기능을 보여 줍니다.

MSCs에서 신경 progenitors의 농축에 대한 우리의 프로토콜은 간단하고 효율적이며 이후의 assays에 대한 세포 번호의 증가 결과입니다. coculture 플랫폼을 통한 운명을 결정한 Schwann 세포의 유도는 glial differentiation의 연구와 잠재적 인 임상 적용을위한 안정되고 기능적인 Schwann 세포의 생성을 가능하게합니다.

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Protocol

동물을 포함한 모든 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용에 관한 NIH 지침에 따라 엄격히 수행되었으며, 홍콩 대학교 의과 대학 Li Ka Shing 학부의 교수 및 연구 실용 동물 사용위원회의 승인을 받았습니다. 인간 골수 샘플은 정보 제공자의 동의를 얻은 후 건강한 공여자의 장골 크레스트로부터 얻어졌다. 의정서는 홍콩 대학 (Institutional Review Board)의 승인을 받았습니다.

1. 래트 MSC 배양 물의 제조

  1. 대퇴골에서 MSCs 수확
    1. 사용 전 적어도 2 시간 동안 180 ° C에서 모든 해부 툴 ( 즉, 잘게 깎은 가위, 무뚝뚝한 뾰족한 절단 가위 및 이빨 집게)을 고압 살균하십시오.
    2. 15 % 태아 소 혈청 (FBS)과 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S, 1 % v / v)이 보충 된 최소 필수 중 알파 - 알파 변형 (αMEM)을 포함하는 MSC 성장 배지를 준비한다.).
    3. 펜토 바르 비톤 과다 투여 (240 mg / kg 체중, 복강 내)하여 젊은 수컷 Sprague Dawley 쥐 (체중 200-250 g)를 희생시킨다.
      참고 : 다른 쥐의 골수 샘플은 별도로 처리해야합니다.
    4. 희생 된 동물을 앙와위로 두십시오. 70 % 에탄올로 복부와 팔다리를 깨끗이 닦으십시오.
    5. 미세 해부 가위 및 포 셉를 사용하여 중간 허벅지를 통해 피부와 피하 조직을 제거합니다. 대퇴부가 노출 될 때까지 허벅지 근육을 원주 방향으로 제거합니다. 무릎 및 엉덩이 관절이 보일 때까지이 근위 및 원위로 계속하십시오. 뾰족한 뾰족한 절단 가위를 사용하여 둔부와 무릎 관절을 통해 대퇴골을 분리하십시오.
      참고 :이 단계에서 골수강을 노출시키기 위해 대퇴골을 가로 지르지 마십시오. 손상되지 않은 대퇴골을 층류 조직 배양 후드로 옮겨 추가 처리합니다.
    6. metaphysis를 통해 대퇴골의 원위 및 근위 끝을 transect하는 무딘 팁 절단 가위를 사용.
    7. 50 ML 원추형 튜브 위에 70 μm의 셀 스트레이너를 놓으십시오. 인산염 완충 식염수 (PBS, 10 MM Na 2 HPO 4 , 산도 7.4)가 들어있는 21G, 10mL 주사기를 노출 된 대퇴부에 삽입하고 플러시를 반복하여 원뿔 튜브에 골수 내용물을 플러시하십시오.
      참고 : 각 대퇴부를 세척하기 위해 약 20 mL의 PBS를 사용합니다. 플러시 된 내용의 색이 혈액 염색 및 탁한 상태로 유지되면 더 큰 볼륨을 사용할 수 있습니다.
    8. 5 분 480 XG에서 원심 분리하여 세포를 수집합니다. 뜨는 물을 버린다. MSC 성장 매체 10 ML에 세포 펠렛을 Resuspend. 10cm 조직 배양 dish.Place 세포 배양기 (37 ° C, 5 % CO 2 )에 조직 문화 요리에 세포를 플레이트. 0 일째로 도금 첫 날을 기록한다.
      참고 : 원심 분리를 포함한 모든 단계에서 최대 감속을 위해 브레이크를 설정하십시오.
  2. MSC 식민지의 확립과 확장
    참고 :이 프로토콜 r골수강 내에서 MSCs를 선택하는 수단으로서의 조직 배양 플라스틱 접착에 관한 연구 11 . 골수 양은 조직 배양 플라스틱에 2 일 동안 고착시킬 수 있습니다.
    1. 2 일째, 10 mL의 PBS로 배양 판을 3 회 씻어서 비 부착 성 세포를 제거합니다. 린스 후 MSC 성장 매체 10 ML와 PBS를 교체하십시오. PBS로 세포를 씻어서 매 3 일마다 MSC 성장 배지로 보충하십시오.
      참고 : MSC 콜로니는 6-7 일까지 볼 수 있어야합니다 ( 그림 2A ).
    2. 성장 매체를 제거하고 PBS로 세포를 씻어서 일 10까지 세포를 통과하십시오. 재조합 효소 세포 해리 시약 1.5 ML을 추가하고 37에서 품어 ° C 5 분. 반응을 중화시키기 위해 3 mL의 MSC 성장 배지를 첨가한다. 5 분 250 XG에서 원심 분리하여 분리 된 세포를 수집합니다.
    3. PBS에서 적절한 희석 후 hemocytometer를 사용하여 펠렛 내의 세포를 정량.
    4. 종자는 MSC 성장 배지에서 10-cm 배양 플레이트에 40,000 세포 / cm 2 의 밀도로 세포를 계대시켰다.
      참고 : 랫 MSC는 계대 2 일 이내에 80-90 %의 합류에 도달해야합니다 ( 그림 2B ). 세포는 단계 1.2.2에서 설명한대로 8 계대까지 계대 할 수 있습니다. MSCs는 면역 세포 화학과 trilineage 분화 ( 그림 3 ) 12 에 대한 그들의 능력의 수단으로 특성 수 있습니다. 통로 3과 통로 8 사이의 MSC 배양 만이 후속 저산소증 전 조건화 및 신경 전구 조기 농축의 대상이됩니다. 더 큰 계통 번호의 MSC는 평평한 형태를 취하고 ( 그림 2C ) 충분한 수의 신경 전구 세포를 생성하지 않습니다. 이러한 문화는 폐기해야합니다.

2. 인간 BMSC 배양 물의 제조

  1. 인간 골수 1 mL를 MSC 성장 배지 9 mL로 희석하고 플레이트10cm 조직 배양 접시에있는 세포. 세포 배양기 (37 ° C, 5 % CO 2 )에서 배양 물을 유지하십시오.
  2. 2 일 후 배지를 제거하고 비 점착성 세포를 제거하기 위해 PBS 10 mL로 배양액을 3 회 부드럽게 씻어냅니다. 최종 린스 후 PBS를 제거하고 10 mL의 MSC 성장 배지로 교체하십시오. PBS 린스 후 배양 3 일마다 성장 배지를 보충하십시오.
    참고 : MSC 콜로니는 6-7 일까지 볼 수 있어야합니다. 식민지의 수는 개체간에 다를 수 있습니다.
  3. 단계 1.2.2에서 설명한대로 10 일째에 세포를 통과시킵니다. PBS에서 적절한 희석 후 hemocytometer를 사용하여 펠렛 내의 세포를 정량. MSC 성장 매체에서 10cm 문화 플레이트에 40,000 세포 / cm 2 의 밀도에서 계대 세포를 씨앗.
    참고 : 인간 MSC ( 그림 2D )는 랫 MSC와 유사한 형태를 나타내며 마찬가지로 통과 2 일 이내에 80-90 %의 합류에 도달해야합니다. 그들은 chara이어야한다.immunocytochemistry 및 trilineage 차별화를위한 그들의 능력에 의해 cterized 12 . 쥐의 MSC와 마찬가지로, 3 ~ 8 단계의 인간 MSC는 후속 저산소 조건화 및 신경 전구 조기 농축의 대상이됩니다.

3. 저산소 사전 컨디셔닝

  1. 링 클램프를 풀고 hypoxia 챔버 구성 요소 ( 즉, 베이스, 뚜껑, 쟁반)를 분해하고 70 % 에탄올로 각 부품을 깨끗이 닦아냅니다. 15 분 동안 자외선 아래 살균을위한 층류 조직 문화 후드 내에 챔버 구성 요소를 놓습니다.
  2. hypoxic preconditioning하기 전에, 매체를 제거하고 10 ML의 PBS로 쥐와 인간 MSC 문화 (섹션 1과 2)을 씻어. 25 MM HEPES로 보충 MSC 성장 매체 10 ML와 PBS를 교체하십시오.
    참고 : 10cm dish에서 배양 된 MSC는 저산소 조건화를 받기 전에 80-90 %의 confluency에 도달해야합니다.
  3. 줄을 놓으십시오.저산소실에서 요리를합니다. 챔버 부품을 다시 조립하고 링 클램프를 조입니다. 99 % N 2 / 1 % O 2 의 가스 혼합물을 5 분 동안 10L / min의 유속으로 챔버로 흘려 보내십시오.
  4. 가스 누설이 없도록 저산소 챔버의 연결 끝 부분을 밀봉하십시오. 16 시간 동안 세포 배양기 (37 ° C, 5 % CO 2 ) 안에 챔버를 놓습니다.
  5. hypoxic preconditioning 완료되면, 후속 신경 전구체 농축 문화에 대비하여 챔버에서 문화를 제거합니다.

4. 신경 전구 세포 농축 배양

  1. B27 (2 % v / v), 염기성 섬유 모세포 성장 인자 (bFGF, 20 ng / ml), 상피 세포 성장 인자 (EGF, EGF)가 보충 된 Dulbecco 's modified eagle medium / Ham의 영양 혼합물 F12 (DMEM / F12) 20 ng / mL) 및 P / S (1 % v / v)를 포함한다.
  2. 단계 1.2.2에서 설명한대로 hypoxic preconditioned 쥐 / 인간 MSC를 분리합니다.5 분 250 XG에서 원심 분리하여 분리 된 세포를 수집합니다. PBS에서 적절한 희석 후 hemocytometer를 사용하여 펠렛 내의 세포를 정량.
  3. 6,000 셀 / cm 2 의 밀도로 낮은 부착, 6 잘 접시에 신경 progenitor 매체와 종자에있는 세포를 Resuspend. 12 일 동안 세포 배양기 (37 ° C, 5 % CO 2 )에 문화를 놓으십시오. 3 일마다 75 %의 신경 전구 세포를 보충하십시오.
    참고 : 크기가 큰 비 부착 성 세포 클러스터는 6-7 일까지 관찰해야합니다. 10-12 일까지, 직경 ≥ 100 μm의 뉴로 필어를 관찰 할 수 있습니다 ( 그림 4 ). 저산소 상태의 전처리 된 MSC는 정상 산소 상태에서 배양 된 MSC와 비교하여 더 많은 신경 세포를 생성합니다 9 .
  4. 12 일에 10-mL 피펫으로 흡입하고 15 mL 원뿔 튜브로 옮겨 neurospheres를 모으십시오. 5 분 250 XG에서 neurospheres를 원심 분리기.
    참고 : Neurospheres 수 있습니다네 스틴 (nestin) 및 GFAP 7 과 같은 신경 전구 마커에 대해 12 일째에 특징 지워진다.

5. DRG 뉴런과 공동 배양을 통한 운명의 결정을받은 Schwann 세포의 생성

  1. 정제 된 래트 DRG 뉴런의 제조
    1. 사용하기 전에 적어도 2 시간 동안 180 ° C에서 모든 해부 도구 ( 즉, 해부 가위, 포셉, 두 microdissection 집게 및 microdissecting 가위)을 고압.
    2. 하룻밤 동안 4 ℃에서 poly-D-lysine (PDL, PBS에 10 μg / mL)을 코팅 한 6- 웰 조직 배양 플레이트. PDL을 제거하고 잘 PBS 당 1.5 ML로 씻으십시오.
    3. 37 ℃에서 2 시간 동안 라미닌 (PBS 중의 10㎍ / mL)으로 플레이트를 코팅하는 것으로 진행한다. 1 well 당 1.5 mL의 PBS로 플레이트를 헹군다.
    4. B27 (2 % v / v), L- 글루타민 (1 % v / v), 신경 성장 인자 (NGF, 20 ng / mL) 및 P / S (1 % v / v)가 보충 된 신경근 배지로 구성된 DRG 뉴런 유지 배지를 준비한다. % v / v).
    5. B27 (2 % v / v), L-glutamine (1 %), NGF (20 ng / mL), P / S (1 %), fluorodeoxyuridine (FDU, 10)을 보충 한 신경 섬유 배지로 구성된 DRG 뉴런 정화 배지 μg / mL), 우리 딘 (10μg / mL).
    6. 임신 14- 15 일에 임신 한 쥐를 pentobarbital 과량 투여 (240 mg / kg bodyweight, intraperitoneal)하여 희생시킨다.
    7. 희생 된 동물을 앙와위로 두십시오. 70 % 에탄올로 복부를 깨끗이 닦습니다.
    8. 벌금 해부 가위와 포 셉를 사용하여 동물의 하복부 벽을 세로로 자르십시오. 해부 가위를 사용하여 자궁을 확인하고 제거하십시오. 자궁 벽을 잘라 배아를 노출시키고 추출하십시오. 배아를 PBS로 가득 찬 멸균 10 cm 문화 접시에 옮기십시오. 얼음에 문화 접시를 놓으십시오.
    9. 해부를위한 배아를 PBS (실온)로 가득 찬 멸균 10 cm 문화 접시에 옮기고 해부 현미경 아래에 위치시킵니다. 배아가 엎드리는 자세에있게하십시오.
      아니E : 희끄무레 한 척수와 부착 된 DRG는 반투명 한 피부를 통해 배아의 지느러미 측면에서 볼 수 있습니다.
    10. 척수의 양쪽을 따라 microdissecting 집게를 삽입하고 주변 연조직에서 척수를 분리 시작하기 위해 무딘 절개를 사용합니다. 목 개방과 꼬리 스텁을 따라 microdissecting 집게를 사용하여 동물에서 척수를 무료로 잘라. 주변의 연조직에서 코드를 제거하기 위해 코드의 복부 측면에 대해 추가 무딘 절개를 수행하십시오.
    11. microdissecting 집게를 사용하여 해제 척수의 지느러미 측면 이상의 잔여 연조직을 제거합니다.
      참고 :이 단계에서는 척수, 신경 뿌리 및 부착 된 DRG 만 남아 있어야합니다.
    12. microdissecting 집게를 사용하여 연결 신경 뿌리에서 개별 DRGs를 분리합니다. PBS가 포함 된 1.5 ML, 살균 원심 분리기 튜브에 DRG를 전송하는 1 ML 팁에 연결된 피펫 펜을 사용합니다.
      참고 : 각 1.5 mL 튜브의 경우 최대100 개의 DRG를 수용 할 수 있습니다.
    13. 5 분 250 XG에서 DRGs를 원심 분리기 및 재조합 효소 세포 해리 시약 (튜브 당 200 μL)에 그들을 resuspend. 10 분 동안 37 ℃, 5 % CO 2를 인큐베이션한다. 5 분 250 XG에서 DRG를 원심 분리기, 뜨는을 제거하고 DRG 뉴런 유지 관리 매체에 resuspend. 200 μL 피펫 팁을 사용하여 부드러운 마찰로 펠렛을 떼어. 적절한 희석 후 hemocytometer를 사용하여 펠렛 내의 세포를 정량.
    14. 잘 당 DRN 뉴런 유지 매체 1.5 ML PDL / laminin - 코팅 6 잘 판에 5,000 세포 / cm 2 의 밀도로 세포를 씨앗. 배양 2 일 후, DRG 뉴런 유지 매체를 제거하고 PBS로 헹구고 DRG 뉴런 정화 배지로 교체하십시오.
      참고 : 각 정화 사이클에 대해 DRG 배양 물을 정화 배지로 2 일 동안 처리 한 다음 유지 관리 배지에서 1 일 배양합니다. 3-4 정화 사이클 후에, rem모든 내인성 glia의 타원형이 예상된다. 이것은 약 14 일 소요됩니다. 정제 된 문화는 연결 표지 TUJ1에 대해 양성이며 S100β 발현에는 결핍되어있다 ( 그림 5 ).
  2. 슈반 세포 - 유사 세포의 생성
    1. β-Heregulin (100 ng / mL), bFGF (10 ng / ml), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF-AA, 5 ng / mL), FBS (10 %), P / S (1 % v / v).
    2. PDL / laminin - 코팅 6 - 웰 플레이트에서 웰당 1.5 ML의 glial 유도 매체 cm 2 당 5-10 구의 밀도에서 섹션 4에서 준비 neurospheres를 판다. PBS로 세포를 헹구어 glial 유도 매체를 2 일마다 교체하십시오.
      참고 : 시드 neurospheres에서 세포가 2 일까지 바깥쪽으로 마이 그 레이션 것으로 나타났습니다. 7 일까지, 철근 모양이 테이퍼 모양과 Schwann 세포에 대한 immunoposivity을 보여야한다마커 p75 뉴로 트로 핀 수용체 (p75) 및 S100β 7 . 이러한 셀을 SCLC라고합니다.
  3. SCLC와 DRG 뉴런의 공동 배양
    1. DRG 뉴런 유지 매체 (단계 5.1.4)와 glial 유도 매체 (단계 5.2.1)로 구성된 공동 배양 배지를 1 : 1 부피비로 준비합니다.
    2. FBS (5 %), β- 헤레 구린 (10 ng / mL), P / S (1 % v / v)가 보충 된 DMEM / F12로 구성된 Schwann 세포 유지 배지를 준비한다.
    3. 7 일 SCLC에서 배양 배지를 제거하고 PBS로 씻어 내고 37 ℃에서 0.5 mL / well의 재조합 효소 세포 해리 시약으로 5 분 동안 배양합니다. 공동 배양 배지에 SCLC를 재현 탁한다.
    4. 적절한 희석 후 hemocytometer를 사용하여 세포를 정량.
    5. 1,000 셀 / cm 2 의 밀도로 SCLC를 정화 DRG 뉴런 문화에 종자. 2 일 간격으로 배지 교환을 실시하여 14 일 동안 공동 배양 물을 유지하십시오.
      참고 : 공동 배양하는 동안 SCLCs는 성숙 Schwann 세포의 전형적인 스핀들 모양의 형태를 획득했습니다 ( 그림 6 ). 이러한 세포는 성장 인자의 철수 후 그들의 표현형에서 유지하고 체외생체 내 axons myelinate 수 있습니다 7 , 10 . Schwann 세포 마커 ( 즉, p75 및 S100β)의 양성 여부는 면역 형광법으로 모니터링해야합니다.
    6. 공동 배양이 완료되면 단계 1.2.2에서 설명한대로 숙주가 수행 한 Schwann 세포를 통과시킨다. 1 웰 당 0.5 mL의 해리 시약을 사용한다. 적절한 희석 후 hemocytometer를 사용하여 세포를 정량.
    7. Schwann 세포 유지 배지에서 10,000 세포 / cm 2 의 밀도로 운명의 결정을 한 Schwann 세포를 Resuspend하십시오. immunofluorescence위한 PDL / laminin - 코팅 6 잘 판에 세포를 시드.
      참고 : 공동 배양은 필연적으로 섬유 아세포를 채택한 MSCs를 포함합니다세포 운명 7 . 이 세포들은 공동 배양의 완료시 운명 - 확약 Schwann 세포와 함께 계대된다. 이 fibroblast substratum의 꼭대기에있는 Schwann 세포는 PBS (4 ℃)의 "콜드 제트 (cold jets)"를 사용하여 헹구어 낸 후 쉽게 분리되어 추가로 팽창 될 수있다. 운명을 약속 한 Schwann 세포는 1 달 동안 유지 매체에서 확장 될 수 있습니다.

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Representative Results

프로토콜의 핵심 단계에 대한 개요가 그림 1나와 있습니다. 요약하면, 랫 및 인간 MSC는 조직 배양 플라스틱을 준수하여 선택됩니다. 확장 된 MSC는 저산소 상태로 전제 조건을 지키고 뉴로 스피어 형성 조건의 영향을받습니다. Neurospheres는 도금되어 SCLCs로 분화 할 수 있습니다. SCLC는 정제 된 DRG 뉴런과 함께 배양되어 운명의 확약 된 Schwann 세포를 생성합니다.

배양 된 랫 및 인간 MSC의 형태가 도 2 에 예시되어 있다 . 그들의 건강한 테이퍼 형태는 다발성을 잃은 높은 계통 번호에 대해 유지 된 MSC의 사각 모양과 대조적으로 나타납니다. 확장 된 랫 및 인간 식민지는 조혈 줄기 세포 마커가없는 MSC 마커의 발현을 입증해야하며, trilineage differentiation ( 그림 3 ). 통로 3과 8 사이의 건강한 MSC는 저산소 상태의 전처리를 16 시간 동안받으며 그 후 EGF / bFGF 보충제가 함유 된 저 부착 성 배양 판에 계대된다. 저산소 조건화 (hypoxic preconditioning)는 더 많은 평균 뇌척수 크기뿐만 아니라 더 많은 수의 신경근을 초래합니다 ( 그림 4 ).

Neurospheres는 PDL / laminin 코팅 문화 플레이트에 도금하고 β - Heregulin, bFGF 및 PDGF - AA를 포함 glial 유도 매체의 문화에 의해 SCLCs가 될 유도. SCLC는 Schwann 세포의 특징적인 테이퍼 형태와 상응하는 마커 발현을 나타내지 만 표현형 적으로 불안정하고 성장 인자의 중단시 섬유 아세포 표현형으로 되돌아 간다

감각 뉴런과 함께하는 배양은 세포 - 내재적 인 sw가렵고 운명을 약속합니다. 정화 DRG 네트워크의 설립은 내생 glia를 제거하기 위해 FDU와 uridine의 펄스 처리를 통해 이루어지며 S100β 면역 양성 부재로 확인해야합니다 ( 그림 5 ). 7 일째, SCLC를 계대 배양하고 정제 된 DRG 뉴런과 14 일간 배양한다 ( 도 6 ). 공동 배양이 완료되면 성숙한 운명의 슈반 세포가 나타나야한다.

그림 1
그림 1 : 프로토콜 개요. 골수는 쥐의 대퇴골 또는 인간의 장골 흉부 흡인에서 얻어집니다. 골수 내에서 MSCs는 조직 배양 플라스틱을 부착하고 팽창시킬 수 있습니다. 신경 잠재력을 가진 MSC를 풍부하게하기 위해, 세포를 1 % O 2 에서 16 시간 동안 전처리 한 다음 저 순응 배양 plbFGF / EGF 보충제와 함께 투여한다. 이것은 PDL / 라미닌 코팅 된 조직 배양 플라스틱 상에 도금되고 신경 교세포 유도 배지에서 배양되어 SCLC를 생성하는 뉴로 구 (neurospheres)의 형성을 초래한다. SCLCs를 계대시키고 정화하기 위해 정화 된 DRG 뉴런과 함께 2 주간 공동 배양하여 성숙시킨다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
도표 2 : MSC 식민지의 설립. 크기가 큰 MSC 콜로니는 골수 세포를 조직 배양 플라스틱에 도금 한 후 6 ~ 7 일 후에 볼 수 있어야합니다. 쥐 MSC 식민지의 대표적인 이미지가 표시되어 있지만 ( A ), 인간의 식민지는 비슷한 모양을 보여줍니다. 10 일째에 콜로니를 계대 배양 할 수있다. 배율이 높을수록,B ) 및 인간 ( D ) MSC는 계대 배양 후 특징적인 섬유 모세포 유사 형태를 나타낸다. 높은 통과 숫자로 유지되는 MSC는 평평하고 사각 형태 ( C )를 가지며 폐기되어야한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : MSC의 특성. ( A - D ) 인간 MSC의 대표 이미지. MSC는 CD90 ( A ), CD73 ( B ) 및 Stro-1 ( C )와 같은 적절한 마커의 발현 및 CD45 ( D )와 같은 조혈 줄기 세포 마커의 부재에 의해 특징 지어 질 수 있습니다. ( E - G ) 쥐 M이 프로토콜에 기술 된대로 분리되고 확장 된 지방 줄기 세포는 지방 세포 형성 능력 ( E ; 수단 적색으로 염색 된 지방질 축적 물), 골아 세포 ( F ; Alizarin Red로 염색 된 세포 간 매트릭스) 및 연골 세포 ( G ; Safranin- O)를 배양 하였다. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 : MSC의 신경 전구 세포 농축. 랫드 ( A )와 인간 ( C ) MSC는 EGF / bFGF가 보충 된 배지에서 저 흡착 조직 배양 플라스틱에서 배양 될 때 신경 피스 (neurospheres)를 형성한다. 쥐의 수와 평균 직경 ( D ) 구체는 구 유도 이전에 MSC (16 시간, 1 % O 2 )의 저산소 전처리를 통해 향상됩니다. 스케일 바 = 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 5 : 정제 된 래트 DRG 네트워크 구축. 정제 된 DRG 네트워크는 항진균제 인 FDU와 uridine (A)을 펄스로 처리 한 후에 확립됩니다. S100β 발현 내인성 glia (B)가없는 신경 회로망은 SCLC와 함께 공동 배양 할 준비가되어 있습니다. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.


그림 6 : DRG 뉴런과 함께 공동 배양을 통한 골수 유래 Schwann 세포의 생성. 정화 된 DRG 뉴런과 사람 SCLCs와 함께 2 주간의 공동 배양을 완료하면 스핀들 모양의 운명의 슈반 세포가 정상 산소와 저산소 치료 그룹 ( AD )에서 나옵니다. 이 세포들은 Schwann 세포 마커 p75 (B와 E)와 S100β (C와 F)를 발현합니다. 인간 핵 항원 (HuNeu)의 발현은 S100β- 양성 세포가 쥐 DRG에서 유래 된 신경아 교세포를 오염시키지 않았다는 것을 입증한다. 스케일 바 = 100 μm.

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Discussion

저산소 전처리 및 신경 구형 문화를 통해 신경 전구 세포를 풍부하게하기 전에 MSC의 "줄기 (stemness)"를 보존하는 것이 중요합니다. 우리의 경험으로부터 다 분화 MSC는 길쭉한 섬유 모세포와 같은 형태로 확실하게 확인 될 수 있습니다. 대조적으로, 현저한 세포 골격 스트레스 섬유를 갖는보다 편평한 사각 형태를 채택한 MSCs는 신경 세포의 운명을 쉽게 받아들이지 않으므로 버려야한다. 일반적으로, 우리는 통과 번호가 8보다 큰 MSC를 사용하지 않습니다. 그들의 줄기를 보존하기 위해 MSC가 100 % 합류하기 전에 신속하게 통과시키는 것이 중요합니다. 반대로, MSC를 너무 낮은 합류점으로 유지하는 것은 바람직하지 않습니다. 우리의 경험으로부터 MSC를 40,000 세포 / cm 2 의 밀도로 파종 시키거나 1 : 2 비율로 80 % 합류하는 세포를 간단히 통과시켜 최상의 결과를 얻을 수 있습니다.

DRG 네트워크의 적절한 수립 및 유지 관리는 비평가입니다.coculture 성공의 결정 요인. DRG 수확에 필요한 시간은 최소로 유지되어야합니다. 개별 신경절은 신경 외상을 치료하는 것이 가장 좋은 경우에 특히 척수로부터 박리하는 동안 외상으로 치료해야합니다. 일반적으로 동물의 희생과 수확 된 DRG의 효소 분해 사이에서 2 시간 미만의 기간을 목표로합니다. 장기간의 수확은 조직 침용과 세포 생존 능력의 상실을 초래하기 때문입니다. 배양 중 기저부에서 DRG 뉴런이 분리되는 경우가 종종 있습니다. 이러한 현상을 방지하기 위해 코팅제는 조직 수거 시간 근처에서 새로 준비하고 수행해야합니다. 일반적으로 크고 소화되지 않은 DRG 클러스터는 더 자주 분리되며 공동 배양 성공을 가져 오지 않습니다. 효소 소화의 기간과 분쇄의 양은 그림 5 와 유사한 모양의 네트워크를 달성하기 위해 조정할 수 있습니다.

우리 cocu 동안lture 플랫폼은 일관되게 운명 약속을 유도하며, 병렬로 수행되는 문화의 단지 20-30 %만이 운명에 의존 한 Schwann 세포를 생산합니다 7 , 13 . 따라서 우리는 3 ~ 4 개의 6-well 배양 플레이트에서 동시 배양을 수행하기에 충분한 DRG와 SCLC를 준비합니다. 우리는 배아의 나이, 세포 생존력, 밀도 및 지형을 포함하여 근원적 인 DRG 네트워크와 관련된 요소의 조합이 공동 배양 성공에 영향을 미친다 고 가정합니다. 이러한 기본 변수는 추가 조사와 표준화가 필요합니다. coculture yield의 제한과 별개로, 쥐에서 유래 된 DRG 뉴런과 동물성 제품에 대한 요구 조건을 대체하는 수단을 찾아야한다. 또한, 프로토콜의 지속 기간을 단축해야합니다. 우리 프로토콜의 약식 수정으로, 우리는 SCLCs의 이전 세대없이 정제 DRG 뉴런에 직접 시드 10 일 neurospheres에서 성숙 Schwann 세포를 파생에서 성공했다 , 10 .

우리의 방법을 통해 풍부한 Neurospheres는 신경 및 신경교 계통의 세포의 강력한 소스 역할을합니다. 전조 세포를 운명에 맡기기위한 우리의 플랫폼은 유전 적 조작을 피할 수있는 고유 한 위험성을 가지고 있으며 결과 세포는 세포 이식, 질병 모델링 및 신경 교세포 분화의 연구에 적절합니다.

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Disclosures

이 원고의 모든 저자는 신고 할 공개가 없습니다.

Acknowledgments

저자는 저산소 챔버 장치를 제공 한 Dr. Nai-Sum Wong과 기술 지원을 담당 한 Ms. Alice Lui를 인정하고자합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
αMEM Sigmaaldrich M4526
DMEM/F12 Thermofisher scientific 12400-024
Neurobasal medium Thermofisher scientific 21103-049
FBS Biosera FB-1280/500
B27 Thermofisher scientific 17504-001
Epidermal growth factor (EGF) Thermofisher scientific PHG0313
Basic fibroblast growth factor (bFGF)  Peprotech 100-18B/100UG
Nerve growth factor (NGF)  Millipore NC011
Platelet-derived growth factor-AA (PDGF-AA) Peprotech 100-13A
Heregulin beta-3, EGF domain (β-Her) Millipore 01-201
Uridine Sigmaaldrich U3003
5-Fluro-2' - deoxyuridine (FDU) Sigmaaldrich F0503
Poly-D-lysine (PDL) Sigmaaldrich P7886-1G
Laminin Thermofisher scientific 23017015
GlutaMAX Thermofisher scientific 35050061
Penicillin / streptomycin (P/S) Thermofisher Scientific 15140-122
TrypLE Express Thermofisher Scientific 12604-013
10 cm plate for adherent culture TPP 93100 Used for selection of MSCs by tissue culture adherence
6-well plate for adherent culture TPP 92006 Used for expansion of MSCs following passaging
UltraLow 6-well plate for non-adherent culture Corning 3471 Used for neural progenitor enrichment
anti-human CD90(Thy-1) BD Biosciences 555593
anti-human CD73 BD Biosciences 550256
anti-human/rat STRO-1 R&D Systems MAB1038
anti-human nestin R&D Systems MAB1259
anti-human CD45 BD Biosciences 555480
anti-rat CD90(Thy-1) BD Biosciences 554895
anti-rat CD73 BD Biosciences 551123
anti-rat nestin BD Biosciences MAB1259
anti-rat CD45 BD Biosciences 554875
Anti-S100β Dako Z031101
Anti-p75 Millipore MAB5386
Anti-GFAP Sigmaaldrich G3893
Anti-Class III-beta tubulin (Tuj-1) Covance MMS-435P
Anti-Human nuclei Millipore MAB1281
Hypoxia chamber Billups-Rothenberg MIC-101
HEPES buffer Sigmaaldrich H4034-100G

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References

  1. Wiliams, R. R., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation: a repair strategy for spinal cord injury? Prog Brain Res. 201, 295-312 (2012).
  2. Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: its significant therapeutic potential and prospectus. Rev Neurosci. 26, (2), 121-128 (2015).
  3. Lindvall, O., Kokaia, Z. Stem cells in human neurodegenerative disorders--time for clinical translation? J Clin Invest. 120, (1), 29-40 (2010).
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