Le préconditionnement hypoxique des cellules progénitrices dérivées de la moelle en tant que source pour la génération de cellules Schwann mûres

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Developmental Biology

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Summary

Les cellules stromales de la moelle (MSC) avec potentiel neuronal existent dans la moelle osseuse. Notre protocole enrichit cette population de cellules par un préconditionnement hypoxique et les dirige ensuite pour devenir des cellules Schwann matures.

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Tsui, Y. P., Mung, A. K., Chan, Y. S., Shum, D. K., Shea, G. K. Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells. J. Vis. Exp. (124), e55794, doi:10.3791/55794 (2017).

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Abstract

Ce manuscrit décrit un moyen d'enrichir les progéniteurs neuronaux de la population de cellules stromales de la moelle (MSC) et ensuite de les diriger vers le sort de la maladie de Schwann mûr. Nous avons soumis les MSC de rat et humains à des conditions hypoxiques transitoires (1% d'oxygène pendant 16 h), suivies d'une expansion sous forme de neurosphères sur un substrat à faible adhérence avec un supplément de facteur de croissance épidémique (EGF) / supplément de fibroblaste basique (bFGF). Les neuro-sphères ont été ensemencées sur du plastique de culture de tissu revêtu de poly-D-lysine / laminine et cultivées dans un cocktail gliogénique contenant la β-Hereguline, le bFGF et le facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF) pour générer des cellules de type Schwann (SCLC). Les SCLC ont été dirigés vers l'engagement du devenir par coculture pendant 2 semaines avec des neurones de ganglions de racines dorsales purifiés (DRG) obtenus à partir de rats Sprague Dawley enceintes E14-15. Les cellules Schwann d'âge mûr démontrent une persistance dans l'expression de S100β / p75 et peuvent former des segments de myéline. Les cellules générées de cette manière ont un potentielPplications dans la transplantation de cellules autologues après une lésion de la moelle épinière, ainsi que dans la modélisation de la maladie.

Introduction

La transplantation de progéniteurs neuronaux et leurs dérivés se révèle prometteuse en tant que stratégie de traitement suite à une lésion du nerf traumatique 1 , 2 et une neurodégénérescence 3 , 4 . Avant l'application clinique, il est essentiel d'assurer: i) une méthode pour accéder et développer une source autologue de cellules souches / progénitrices et ii) un moyen de les diriger vers des types de cellules adultes pertinents 3 . Notre intérêt pour la thérapie cellulaire pour la lésion de la moelle épinière nous a permis de rechercher une source cellulaire autologue robuste de progéniteurs neuronaux à partir de tissus adultes.

Une sous-population de MSC provient de la crête neurale et est facilement accessible à partir de la cavité de la moelle. Ces cellules sont des progéniteurs neuronaux qui peuvent générer des neurones et de la glie 5 . Les modèles animaux d'ischémie cérébrale démontrent que l'hypoxie favorise le prolapsus L'infiltration et la multiplicité des progéniteurs neurologiques dans le cerveau 6 . Ceci a servi de base à l'utilisation du préconditionnement hypoxique comme moyen d'expansion sur les progéniteurs neurologiques dérivés de la moelle.

La transplantation de cellules de Schwann dans la moelle épinière lésée favorise la régénération 2 . Les SCLC peuvent être générés à partir de MSC au moyen de suppléments avec des facteurs gliogéniques ( p. Ex., Β-Heregulin, bFGF et PDGF-AA) mais démontrent une instabilité phénotypique. Lors du retrait des facteurs de croissance, ils reviennent à un phénotype de type fibroblaste 7 . L'instabilité phénotypique est indésirable dans la transplantation cellulaire en raison du risque de différenciation aberrante et de carcinogenèse. Comme les précurseurs de cellules de Schwann sont associés à des faisceaux d'axones dans le nerf périphérique embryonnaire 8 , nous avons été conduits à des SCLC de coculture avec des neurones DRG embryonnaires purifiés 7 ,Ass = "xref"> 9. Les cellules Schwann matures résultantes sont engagées et démontrent une fonction in vitro 7 , 9 et 10 in vivo .

Notre protocole pour l'enrichissement des progéniteurs neuronaux des MSC est simple et efficace et entraîne une augmentation du nombre de cellules pour les tests ultérieurs. La dérivation des cellules Schwann engagées par le biais de la plate-forme coculture permet l'étude de la différenciation gliale et la génération de cellules Schwann stables et fonctionnelles pour une application clinique potentielle.

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Protocol

Toutes les procédures impliquant des animaux ont été effectuées en stricte conformité avec le Guide NIH pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et approuvé par le Comité sur l'utilisation des animaux vivants pour l'enseignement et la recherche, la Faculté de médecine Li Ka Shing, l'Université de Hong Kong. Des échantillons humains de moelle osseuse ont été obtenus à partir de la crête iliaque de donneurs sains après avoir obtenu leur consentement éclairé. Les protocoles ont été approuvés par le Conseil d'examen institutionnel, l'Université de Hong Kong.

1. Préparation des cultures de rat MSC

  1. Récolte de CSM du fémur
    1. Autoclavez tous les outils de dissection ( p. Ex., Ciseaux à dissection fine , ciseaux à coupe oblique et pinces dentées) à 180 ° C pendant au moins 2 h avant utilisation.
    2. Préparer le milieu de croissance MSC comprenant une modification minimale du milieu essentiel - alpha (αMEM) complétée par 15% de sérum bovin fœtal (FBS) et de pénicilline / streptomycine (P / S, 1% v / v).
    3. Sacrifiez les jeunes rats mâles Sprague Dawley (200-250 g de poids corporel) par overdose au pentobarbitone (240 mg / kg de poids corporel, par voie intrapéritonéale).
      REMARQUE: Les prélèvements de moelle de différents rats doivent être traités séparément.
    4. Placez les animaux sacrifiés en position couchée. Nettoyez soigneusement leur abdomen et les membres inférieurs avec 70% d'éthanol.
    5. Retirez la peau et le tissu sous-cutané sur les cuisses médianes en utilisant des ciseaux et des pinces à dissection fine. Retirer les muscles de la cuisse circonférentiellement jusqu'à ce que le fémur soit exposé. Continuez ceci de manière proximale et distale jusqu'à ce que les articulations du genou et de la hanche soient observées. Désarticuler le fémur à travers l'articulation de la hanche et du genou en utilisant des ciseaux à coupe oblique.
      REMARQUE: Ne pas transposer le fémur pour exposer la cavité de la moelle à ce stade. Transférer les fémurs intacts dans un capuchon de culture de tissu à flux laminaire pour un traitement ultérieur.
    6. Utilisez des ciseaux à coupe oblique pour transposer les extrémités distale et proximale du fémur par la métaphyse.
    7. Placez un filtre cellulaire de 70 μm sur un tube conique de 50 ml. Insérez une seringue de 21 G, 10 mL contenant une solution salée tamponnée au phosphate (PBS, 10 mM Na 2 HPO 4 , pH 7,4) dans le canal fémoral exposé et rincer la teneur en moelle dans le tube conique par un rinçage répété.
      REMARQUE: Environ 20 ml de PBS sont utilisés pour éliminer chaque fémur. Si la couleur du contenu rincé reste colorée au sang et trouble, un volume plus important peut être utilisé.
    8. Recueillir les cellules par centrifugation à 480 xg pendant 5 min. Jeter le surnageant. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 10 ml de milieu de croissance MSC. Placer les cellules sur un plat de culture tissulaire de 10 cm. Placer les plats de culture tissulaire dans un incubateur cellulaire (37 ° C, 5% de CO 2 ). Enregistrez le jour initial du placage au jour 0.
      REMARQUE: Dans toutes les étapes de centrifugation, régler le frein pour une décélération maximale.
  2. Établissement et expansion des colonies MSC
    NOTE: Ce protocole estÉlimine l'adhérence plastique de la culture des tissus comme moyen de sélectionner des MSC dans la cavité de la moelle 11 . La teneur en moelle osseuse est autorisée à adhérer à la culture de culture tissulaire pendant 2 jours.
    1. Le jour 2, rincer les plaques de culture trois fois avec 10 ml de PBS pour éliminer les cellules non adhérentes. Remplacer le PBS avec 10 ml de milieu de croissance MSC après rinçage. Lavez les cellules avec du PBS et rallumez avec un milieu de croissance MSC tous les 3 jours.
      NOTE: Les colonies MSC devraient être visibles au jour 6-7 ( Figure 2A ).
    2. Passer les cellules au jour 10 en enlevant le milieu de croissance et en rinçant les cellules avec du PBS. Ajouter 1,5 ml de réactif de dissociation de cellules enzymatiques recombinantes et incuber à 37 ° C pendant 5 min. Ajouter 3 ml de milieu de croissance MSC pour neutraliser la réaction. Recueillir les cellules détachées par centrifugation à 250 xg pendant 5 min.
    3. Quantifier les cellules dans la pastille en utilisant un hémocytomètre après une dilution appropriée dans du PBS.
    4. Cellules passées à la semence à une densité de 40 000 cellules / cm 2 dans une plaque de culture de 10 cm dans un milieu de croissance MSC.
      NOTE: Les MSC de rat doivent atteindre 80 à 90% de confluence dans les 2 jours suivant le passage ( figure 2B ). Les cellules peuvent être passées comme décrit à l'étape 1.2.2 pour jusqu'à 8 passages. Les MSC peuvent être caractérisés par l'immunocytochimie et leur capacité à la différenciation trilineuse ( figure 3 ) 12 . Seules les cultures MSC entre les passages 3 et 8 sont soumises au préconditionnement hypoxique et à l'enrichissement des progéniteurs neuronaux. Les MSC de plus grand nombre de passages adoptent une morphologie aplatie ( Figure 2C ) et ne produisent pas un nombre suffisant de progéniteurs neuronaux. Ces cultures devraient être abandonnées.

2. Préparation des cultures humaines BMSC

  1. Diluer 1 mL d'aspiration de moelle osseuse humaine avec 9 mL de milieu de croissance MSC et plaquer leCellules sur un plat de culture de tissu de 10 cm. Maintenir les cultures dans un incubateur cellulaire (37 ° C, 5% de CO 2 ).
  2. Retirez le milieu après 2 jours et rincez doucement les cultures trois fois avec 10 ml de PBS pour éliminer les cellules non adhérentes. Après le rinçage final, retirer le PBS et le remplacer par 10 ml de milieu de croissance MSC. Remplacer le milieu de croissance après chaque 3 jours de culture après le rinçage PBS.
    NOTE: Les colonies MSC devraient être visibles au jour 6-7. Le nombre de colonies peut varier selon les sujets.
  3. Passer les cellules au jour 10, comme décrit à l'étape 1.2.2. Quantifier les cellules dans la pastille en utilisant un hémocytomètre après une dilution appropriée dans du PBS. Graisser les cellules passées à une densité de 40 000 cellules / cm 2 sur une plaque de culture de 10 cm dans un milieu de croissance MSC.
    NOTE: Les MSC humains ( Figure 2D ) démontrent une morphologie similaire aux MSC de rat et devraient également atteindre 80 à 90% de confluence dans les 2 jours suivant le passage. Ils devraient être charaCtérite par immunocytochimie et leur capacité de différenciation trilineuse 12 . Comme pour les MSC de rat, les MSC humains qui se situent entre le passage 3 et le 8 sont soumis à un préconditionnement hypoxique et à un enrichissement de progéniteurs neuronaux.

3. Préconditionnement hypoxique

  1. Démonter les composants de la chambre d'hypoxie ( c.-à-d. Base, couvercle, plateaux) après avoir relâché la pince de l'anneau et essuyer les pièces individuelles à l'aide d'éthanol à 70%. Placez les composants de la chambre dans un capot de culture de tissu à flux laminaire pour la stérilisation sous la lumière UV pendant 15 minutes.
  2. Avant le préconditionnement hypoxique, enlever le milieu et rincer les cultures de rat et MSC humaines (sections 1 et 2) avec 10 mL de PBS. Remplacer le PBS avec 10 ml de milieu de croissance MSC complété par 25 mM d'HEPES.
    NOTE: Les MSC cultivés sur des plats de 10 cm devraient avoir atteint 80 à 90% de confluence avant d'être soumis à un préconditionnement hypoxique.
  3. Placez le culDans la chambre d'hypoxie. Remontez les composants de la chambre et serrez la pince de l'anneau. Rincer un mélange gazeux de 99% N 2 /1% O 2 dans la chambre à un débit de 10 L / min pendant 5 min.
  4. Sceller les extrémités de connexion de la chambre d'hypoxie pour s'assurer qu'il n'y a pas de fuite de gaz. Placer la chambre à l'intérieur de l'incubateur cellulaire (37 ° C, 5% de CO 2 ) pendant 16 h.
  5. Après achèvement du préconditionnement hypoxique, retirer les cultures de la chambre en prévision de la culture d'enrichissement des progéniteurs neuronaux.

4. Culture d'enrichissement de progéniteurs névralgiques

  1. Préparer le milieu progéniteur névralgique composé du milieu aigle modifié de Dulbecco / mélange nutritif de jambon F12 (DMEM / F12) complété par B27 (2% v / v), facteur de croissance de fibroblastes basique (bFGF, 20 ng / mL), facteur de croissance épidermique (EGF, 20 ng / mL) et P / S (1% v / v).
  2. Détacher le rat préconditionné hypoxique / MSC humain, comme décrit à l'étape 1.2.2.Recueillir les cellules détachées par centrifugation à 250 xg pendant 5 min. Quantifier les cellules dans la pastille en utilisant un hémocytomètre après une dilution appropriée dans du PBS.
  3. Remettre en suspension les cellules dans le milieu progéniteur neural et les semences sur des plaques à faible collage, à 6 puits à une densité de 6 000 cellules / cm 2 . Placer la culture dans un incubateur cellulaire (37 ° C, 5% de CO 2 ) pendant 12 jours. Remplacer 75% du milieu progéniteur neural tous les 3 jours.
    REMARQUE: Des grappes de cellules non adhérentes importantes doivent être observées au jour 6-7. Au jour 10-12, on peut observer des neurosphères d'un diamètre ≥ 100 μm ( figure 4 ). Les MSC préconditionnés hypoxiques devraient produire plus de neurosphères par rapport aux MSC cultivés dans des conditions normoxiques 9 .
  4. Recueillir des neurosphères au jour 12 en les aspirant dans une pipette de 10 ml et en les transférant dans un tube conique de 15 ml. Centrifuger les neurosphères à 250 xg pendant 5 min.
    NOTE: Les neurosphères peuvent êtreCaractérisé le jour 12 pour les marqueurs de progéniteurs neuronaux, tels que le nestin et le GFAP 7 .

5. Génération de cellules Schwann commises par le destin par coculture avec DRG Neurones

  1. Préparation de neurones DRG de rat purifiés
    1. Autoclavez tous les outils de dissection ( p. Ex. Ciseaux à dissection, pinces, deux pince à microdissection et ciseaux à microdissection) à 180 ° C pendant au moins 2 h avant utilisation.
    2. Incorporer des plaques de culture tissulaire de 6 puits avec de la poly-D-lysine (PDL, 10 μg / mL dans PBS) à 4 ° C pendant la nuit. Retirer le PDL et rincer avec 1,5 ml de PBS par puits.
    3. Procéder au revêtement des plaques avec de la laminine (10 μg / mL dans PBS) à 37 ° C pendant 2 h. Rincer les plaques avec 1,5 ml de PBS par puits.
    4. Préparer le milieu de maintien des neurones DRG, composé de milieu neurobasal complété par B27 (2% v / v), L-glutamine (1% v / v), facteur de croissance nerveuse (NGF, 20 ng / mL) et P / S (1 % V / v).
    5. Préparer le milieu de purification des neurones DRG, composé de milieu neurobasal complété par B27 (2% v / v), L-glutamine (1%), NGF (20 ng / mL), P / S (1%), fluorodésoxyuridine (FDU, 10 Μg / mL) et de l'uridine (10 μg / mL).
    6. Sacrifiez des rats enceintes au jour de gestation 14-15 par overdose au pentobarbital (240 mg / kg de poids corporel, par voie intrapéritonéale).
    7. Placez les animaux sacrifiés en position couchée. Nettoyez soigneusement leur abdomen avec 70% d'éthanol.
    8. Couper la paroi abdominale inférieure de l'animal longitudinalement à l'aide de ciseaux et de pinceaux à dissection fine. Identifiez et retirez l'utérus à l'aide de ciseaux à dissection. Couper le mur utérin pour exposer et extraire les embryons. Transférer les embryons dans un plat de culture stérile de 10 cm rempli de PBS. Placez le plat de culture sur de la glace.
    9. Transférer l'embryon destiné à la dissection dans un plat de culture stérile de 10 cm rempli de PBS (température ambiante) et le positionner sous un microscope à dissection. Avoir l'embryon en position vulnérable.
      NE PASE: La moelle épinette blanchâtre et les DRG attachés peuvent être vus sur l'aspect dorsal de l'embryon, à travers sa peau translucide.
    10. Insérez une pince à microdissection entre les deux côtés de la moelle épinière et utilisez une dissection émoussée pour commencer à séparer la moelle épinière des tissus mous environnants. Couper la moelle épinière sans l'animal en utilisant des pinces microdissantes le long de l'ouverture du cou et du talon de la queue. Effectuer une dissection brusque sur l'aspect ventral du cordon pour le libérer des tissus mous environnants.
    11. Utilisez un pince à microdissection pour éliminer les tissus mous résiduels sur l'aspect dorsal de la moelle épinière.
      REMARQUE: à ce stade, seule la moelle épinière, les racines nerveuses et le DRG attaché devraient rester.
    12. Détachez les DRG individuels de leurs racines nerveuses en utilisant des pince à microdissection. Utilisez un stylo à pipette attaché à une pointe de 1 ml pour transférer les DRG dans un tube de centrifugation stérile de 1,5 ml contenant du PBS.
      NOTE: Pour chaque tube de 1,5 mL, un maximum de100 DRG peuvent être logés.
    13. Centrifuger les DRG à 250 xg pendant 5 min et les réinstaller dans un réactif de dissociation des cellules enzymatiques recombinantes (200 μL par tube). Incuber (37 ° C, 5% de CO 2 ) pendant 10 min. Centrifuger les DRG à 250 xg pendant 5 min, enlever le surnageant et ré-endiguer dans le milieu de maintenance des neurones DRG. Dissocier la pastille par trituration douce à l'aide d'une pointe de pipette de 200 μL. Quantifier les cellules dans la pastille en utilisant un hémocytomètre après une dilution appropriée.
    14. Graisser les cellules à une densité de 5 000 cellules / cm 2 dans des plaques de 6 puits revêtues de PDL / laminine dans 1,5 ml de milieu de maintenance de neurone DRG par puits. Après deux jours de culture, retirer le milieu de maintien des neurones DRG, rincer avec du PBS et le remplacer par un milieu de purification des neurones DRG.
      NOTE: Pour chaque cycle de purification, traiter les cultures DRG avec un milieu de purification pendant 2 jours, suivi d'un jour d'incubation en milieu de maintenance. Après 3-4 cycles de purification, le remL'ovale de toute la glande endogène est attendue 7 . Cela devrait prendre environ 14 jours. Les cultures purifiées testent positivement le marqueur neuronal TUJ1 et sont absentes pour l'expression de S100β ( figure 5 ).
  2. Génération de cellules cellulaires de Schwann
    1. Préparer un milieu d'induction glial composé d'αMEM complété par β-Heregulin (100 ng / mL), bFGF (10 ng / ml), facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF-AA, 5 ng / mL), FBS (10%) et P / S (1% v / v).
    2. Placer les neurosphères préparées dans la section 4 dans des plaques à 6 puits revêtues de PDL / laminine à une densité de 5-10 sphères par cm 2 dans 1,5 ml de milieu d'induction gliale par puits. Remplacer le milieu d'induction gliale tous les 2 jours après le rinçage des cellules avec du PBS.
      NOTE: Les cellules provenant des neurosphères ensemencées sont migrées vers l'extérieur au jour 2. Au jour 7, les cellules migratrices ont un aspect effilé et devraient démontrer une immunopostivité pour la cellule de SchwannMarqueurs p75 neurotrophin récepteur (p75) et S100β 7 . Ces cellules sont appelées SCLC.
  3. Coculture de SCLC avec des neurones DRG
    1. Préparer un milieu de coculture composé de milieu de maintenance des neurones DRG (étape 5.1.4) et du milieu d'induction glial (étape 5.2.1) à un rapport volume / volume 1: 1.
    2. Préparer le milieu de maintenance cellulaire de Schwann composé de DMEM / F12 complété par FBS (5%), β-Heregulin (10 ng / mL) et P / S (1% v / v).
    3. Enlever le milieu de culture des SCLC du jour 7, les rincer avec du PBS et les incuber avec 0,5 mL / puits de réactif de dissociation des cellules enzymatiques recombinantes à 37 ° C pendant 5 min. Resuspendre les SCLC en milieu coculture.
    4. Quantifier les cellules en utilisant un hémocytomètre après une dilution appropriée.
    5. Graisser les SCLC sur des cultures de neurones DRG purifiés à une densité de 1000 cellules / cm 2 . Maintenir les coculures pendant 14 jours, avec un remplacement moyen tous les 2 jours.
      NOTE: Pendant la coculture, les SCLC ont acquis la morphologie de type fusible typique des cellules Schwann matures ( Figure 6 ). Ces cellules persistent dans leur phénotype après le retrait des facteurs de croissance et sont capables de myéliniser les axones in vitro et in vivo 7 , 10 . La positivité des marqueurs de cellules de Schwann (p75 et S100β) doit être surveillée par immunofluorescence.
    6. À la fin de la coculture, les cellules de Schwann commises par le destin du passage, comme décrit à l'étape 1.2.2. Utiliser 0,5 ml de réactif de dissociation par puits. Quantifier les cellules en utilisant un hémocytomètre après une dilution appropriée.
    7. Réanimer les cellules Schwann engagées dans le milieu de maintenance cellulaire de Schwann à une densité de 10 000 cellules / cm 2 . Cellules de graines dans des plaques de 6 puits revêtues de PDL / laminine pour immunofluorescence.
      NOTE: Les cultures contiennent inévitablement des MSC qui ont adopté un fibroblasteDestin de la cellule 7 . Ces cellules sont passées ensemble avec des cellules Schwann engagées par le destin à la fin de la coculture. Les cellules de Schwann situées au-dessus de ce substrat de fibroblastes peuvent être facilement détachées et expansées suite au rinçage avec des «jets froids» de PBS (4 ° C), comme cela a été décrit ailleurs 13 . Les cellules Schwann engagées par le destin peuvent être développées en milieu de maintenance pendant 1 mois.

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Representative Results

Un aperçu des étapes clés de notre protocole est illustré à la figure 1 . En résumé, les MSC de rat et humains sont sélectionnés par adhérence au plastique de culture tissulaire. Les MSC élargis sont préconditionnés avec une hypoxie et sont ensuite soumis à des conditions de formation de la neurosphère. Les neuro-sphères sont plaquées et autorisées à se différencier en SCLC. Les SCLC sont cultivés avec des neurones DRG purifiés pour générer des cellules Schwann engagées dans le devenir.

La morphologie des MSC cultivés et des MSC humains est illustrée à la figure 2 . Leur morphologie effilée et saine est montrée contrairement à l'aspect quadrangulaire des MSC maintenus pour les nombres de passage élevés, qui ont perdu leur multipotence. Les colonies élargies de rat et humaines devraient démontrer l'expression des marqueurs MSC, une absence de marqueurs de cellules souches hématopoïétiques et la capacité de trilineage difFerentiation ( figure 3 ). Les MSC sains entre les passages 3 et 8 sont soumis à un préconditionnement hypoxique pendant 16 h et sont ensuite passés sur des plaques de culture à faible adhérence avec une supplémentation EGF / bFGF. Le préconditionnement hypoxique entraîne un plus grand nombre de neurosphères, ainsi que des tailles moyennes de neurosphères ( figure 4 ).

Les neuro-sphères sont plaquées sur des plaques de culture revêtues de PDL / laminine et induites à devenir SCLC par culture dans un milieu d'induction glial contenant de la β-Hereguline, du bFGF et du PDGF-AA. Les SCLC présentent la morphologie conique caractéristique des cellules de Schwann et l'expression du marqueur correspondante, mais elles sont phénotypiquement instables et reviennent à un phénotype de fibroblastes lors de l'arrêt des facteurs de croissance

La coculture avec les neurones sensoriels est une condition préalable à la création d'une cellule-intrinsèqueDémangeaison pour s'engager. L'établissement de réseaux DRG purifiés est réalisé grâce à un traitement pulsé avec FDU et uridine pour éliminer la glie endogène et devrait être confirmé par l'absence d'immunopostivité S100β ( figure 5 ). Le jour 7, les SCLC sont passés et cultivés avec des neurones DRG purifiés pendant 14 jours ( Figure 6 ). À la fin de la coculture, des cellules Schwann mature et destinées au sort devraient émerger.

Figure 1
Figure 1: Vue d'ensemble du protocole. La moelle osseuse est obtenue à partir de fémurs de rat ou d'aspirats de crête iliaque humaine. Les MSC provenant de la moelle osseuse peuvent s'attacher et se développer sur le plastique de culture tissulaire. Afin d'enrichir les MSC avec potentiel neuronal, les cellules sont préconditionnées dans 1% O 2 pendant 16 h et sont ensuite passées sur une culture à faible adhérence pAvec la supplémentation bFGF / EGF. Il en résulte la formation de neurosphères, qui sont plaquées sur du plastique de culture de tissu revêtu de PDL / laminine et cultivées dans un milieu d'induction glial pour générer des SCLC. Les SCLC sont passés et cultivés avec des neurones DRG purifiés pendant 2 semaines afin de les diriger vers la maturité. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2: Établissement de colonies MSC. Les colonies MSC importantes devraient être visibles 6-7 jours après le placage des cellules de la moelle osseuse sur du plastique de culture de tissu. Une image représentative d'une colonie MSC de rat est montrée ( A ), alors que les colonies humaines démontrent une apparence similaire. Les colonies peuvent être passées le jour 10. Vu à un grossissement plus élevé, les deux rat (B ) et les MSC humains ( D ) présentent une morphologie caractéristique fibroblaste caractéristique après le passage. Les MSC qui sont maintenus pour les nombres de passage élevé acquièrent une morphologie quadrangulaire aplatie ( C ) et doivent être jetés. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

figure 3
Figure 3: Caractérisation des MSC. ( A - D ) Images représentatives des MSC humains. Les MSC peuvent être caractérisés par l'expression de marqueurs appropriés, tels que CD90 ( A ), CD73 ( B ) et Stro-1 ( C ), et par l'absence de marqueurs de cellules souches hématopoïétiques, tels que CD45 ( D ). ( E - G ) Rat MLes SC isolés et expansés, comme décrit dans le protocole, démontrent une multiplicité de leur capacité à former des adipocytes ( E , des dépôts de graisse colorés au Soudan Rouge), des ostéoblastes ( F , une matrice pericellulaire colorée avec Alizarine Rouge) et des chondrocytes ( G , des protéoglycans colorés au Safranine- O) dans des conditions de culture appropriées. Barres d'échelle = 100 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4: Enrichissement des progéniteurs neuronaux des MSC. Les MSC de rat ( A ) et humaines ( C ) forment des neurosphères lorsqu'elles sont cultivées sur un plastique de culture de tissu à faible adhérence en milieu supplémenté avec EGF / bFGF. Le nombre et le diamètre moyen du rat ( D ) est améliorée par le préconditionnement hypoxique des MSC (16 h, 1% O 2 ) avant l'induction de la sphère. Barres d'échelle = 200 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5: Établissement de réseaux DRG de rat purifiés. Les réseaux DRG purifiés sont établis après traitement pulsé avec les agents antimitotiques FDU et uridine (A). Les réseaux de neurones dépourvus de glande endogène exprimant S100β (B) sont prêts pour la coculture avec SCLC. Barres d'échelle = 100 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.


Figure 6: Génération de cellules Schwann dérivées de la moelle osseuse par coculture avec des neurones DRG. Après avoir complété 2 semaines de coculture avec des neurones DRG purifiés et des SCLC humains, des cellules Schwann engagées par un fouet et un sort ont émergé des groupes traités par la normoxie et l'hypoxie ( A et D ). Ces cellules expriment les marqueurs de cellules Schwann p75 (B et E) et S100β (C et F). L'expression de l'antigène des noyaux humains (HuNeu) démontre que les cellules positives pour S100β ne contaminent pas les cellules gliales issues des DRG de rat. Barres d'échelle = 100 μm.

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Discussion

Il est essentiel de préserver la «tige» des MSC avant l'enrichissement des progéniteurs neuronaux par un préconditionnement hypoxique et une culture de la neurosphère. De notre expérience, les MSC multipotents peuvent être identifiés de manière fiable par leur morphologie allongée de type fibroblaste. En revanche, les MSC qui ont adopté une morphologie quadrangulaire plus aplatie, avec des fibres de stress cytosquelettiques proéminentes, n'admettent pas facilement le devenir des cellules neurales et devraient être jetées. En général, nous n'utilisons pas de MSC avec des numéros de passage supérieurs à huit. Pour conserver leur tige, il est essentiel de passer rapidement les CSM avant qu'ils atteignent 100% de confluence. À l'inverse, le maintien de MSC à une confluence trop faible est indésirable. De notre expérience, l'obtention de MSC à une densité de 40 000 cellules / cm 2 , ou simplement des cellules passantes qui sont 80% confluent à un ratio 1: 2, permet les meilleurs résultats.

L'établissement et la maintenance appropriés du réseau DRG est un critiqueTout déterminant de la réussite de la coculture. Le temps requis pour la récolte DRG devrait être réduit au minimum. Les ganglions individuels doivent être manipulés de manière atraumatique, en particulier lors du détachement de la moelle épinière, lorsqu'il est préférable de manipuler uniquement les racines nerveuses. En général, nous visons une période de moins de 2 h entre le moment du sacrifice des animaux et la digestion enzymatique des DRG récoltés, car une récolte prolongée entraîne une macération des tissus et une perte de viabilité cellulaire. Le détachement de neurones DRG du substrat pendant la culture est souvent rencontré. Pour éviter que cela ne se produise, le revêtement doit être préparé à nouveau et pratiqué près du moment de la récolte des tissus. En général, les clusters DRG grands et non digestifs se détachent plus souvent et ne produisent pas de succès de coculture. La durée de la digestion enzymatique et la quantité de trituration peuvent être ajustées, dans le but de réaliser un réseau ayant une apparence ressemblant à la Figure 5 .

Alors que notre cocuLa plate-forme de lancement induit systématiquement l'engagement du destin, seulement 20 à 30% des cultures exécutées dans des cellules Schwann 7 , 13 . Nous préparons donc suffisamment de DRG et SCLC pour réaliser simultanément des cocultures dans trois ou quatre plaques de culture à 6 puits. Nous faisons l'hypothèse qu'une combinaison de facteurs liés au réseau DRG sous-jacent, y compris leur âge embryonnaire, leur viabilité cellulaire, leur densité et leur topographie, ont une incidence sur la réussite de la coculture. Ces variables sous-jacentes doivent encore être étudiées et standardisées. Outre les limites du rendement en coculture, il faut rechercher un moyen de remplacer l'exigence de neurones DRG dérivés de rats et de produits animaux. En outre, la durée du protocole devrait être raccourcie. En tant que modification abrégée de notre protocole, nous avons eu du succès dans la dérivation de cellules Schwann matures à partir des 10 jours de neurosphères semées directement sur des neurones DRG purifiés, sans la génération précédente de SCLC , 10 .

Les neurosphères enrichies par notre méthode constituent une source robuste de cellules de lignées neuronales et gliales. Notre plate-forme pour diriger les cellules précurseurs à l'engagement du destin a l'avantage d'éviter la manipulation génétique, avec ses risques inhérents, et les cellules résultantes sont pertinentes pour la transplantation cellulaire, la modélisation de la maladie et l'étude de la différenciation gliale.

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Disclosures

Tous les auteurs de ce manuscrit n'ont aucune divulgation à déclarer.

Acknowledgments

Les auteurs souhaitent remercier le Dr Nai-Sum Wong d'avoir fourni l'appareil de chambre hypoxique et Mme Alice Lui pour le soutien technique.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
αMEM Sigmaaldrich M4526
DMEM/F12 Thermofisher scientific 12400-024
Neurobasal medium Thermofisher scientific 21103-049
FBS Biosera FB-1280/500
B27 Thermofisher scientific 17504-001
Epidermal growth factor (EGF) Thermofisher scientific PHG0313
Basic fibroblast growth factor (bFGF)  Peprotech 100-18B/100UG
Nerve growth factor (NGF)  Millipore NC011
Platelet-derived growth factor-AA (PDGF-AA) Peprotech 100-13A
Heregulin beta-3, EGF domain (β-Her) Millipore 01-201
Uridine Sigmaaldrich U3003
5-Fluro-2' - deoxyuridine (FDU) Sigmaaldrich F0503
Poly-D-lysine (PDL) Sigmaaldrich P7886-1G
Laminin Thermofisher scientific 23017015
GlutaMAX Thermofisher scientific 35050061
Penicillin / streptomycin (P/S) Thermofisher Scientific 15140-122
TrypLE Express Thermofisher Scientific 12604-013
10 cm plate for adherent culture TPP 93100 Used for selection of MSCs by tissue culture adherence
6-well plate for adherent culture TPP 92006 Used for expansion of MSCs following passaging
UltraLow 6-well plate for non-adherent culture Corning 3471 Used for neural progenitor enrichment
anti-human CD90(Thy-1) BD Biosciences 555593
anti-human CD73 BD Biosciences 550256
anti-human/rat STRO-1 R&D Systems MAB1038
anti-human nestin R&D Systems MAB1259
anti-human CD45 BD Biosciences 555480
anti-rat CD90(Thy-1) BD Biosciences 554895
anti-rat CD73 BD Biosciences 551123
anti-rat nestin BD Biosciences MAB1259
anti-rat CD45 BD Biosciences 554875
Anti-S100β Dako Z031101
Anti-p75 Millipore MAB5386
Anti-GFAP Sigmaaldrich G3893
Anti-Class III-beta tubulin (Tuj-1) Covance MMS-435P
Anti-Human nuclei Millipore MAB1281
Hypoxia chamber Billups-Rothenberg MIC-101
HEPES buffer Sigmaaldrich H4034-100G

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References

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