Precondizionamento ipossico delle cellule progenitori derivate dal midollo osseo come fonte per la generazione di cellule Schwann mature

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Developmental Biology

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Summary

Le cellule stromali del midollo (MSC) con potenziale neurale esistono all'interno del midollo osseo. Il nostro protocollo arricchisce questa popolazione di cellule attraverso precondizionamento ipossico e poi li indirizza a diventare cellule Schwann mature.

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Tsui, Y. P., Mung, A. K., Chan, Y. S., Shum, D. K., Shea, G. K. Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells. J. Vis. Exp. (124), e55794, doi:10.3791/55794 (2017).

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Abstract

Questo manoscritto descrive un mezzo per arricchire i progenitori neurali dalla popolazione delle cellule stromali del midollo (MSC) e quindi di indirizzarli al destino cellulare di Schwann. Abbiamo sottoposto a MSC topi e umani situazioni ipossiche transitorie (ossigeno 1% per 16 h) seguito da espansione come neurosfere su substrato di basso affinamento con fattore di crescita epidermica (EGF) / fattore di crescita fibroblastico base (bFGF). Le neurosfere sono state seminate in plastica di coltura tissutale rivestita con poli-D-lisina e laminina e coltivate in un cocktail gliogenico contenente β-Heregulin, bFGF e fattore di crescita derivato da piastrine (PDGF) per generare cellule simili a cellule Schwann (SCLC). Gli SCLC sono stati indirizzati verso l'impegno di destino mediante cocultura per 2 settimane con neuroni gangliali radici dorsali purificati (DRG) ottenuti da E14-15 ratti incinte Sprague Dawley. Le cellule Schwann mature dimostrano persistenza nell'espressione S100β / p75 e possono formare segmenti di mielina. Le celle generate in questo modo hanno potenziale aPplicazioni nel trapianto di cellule autologhe dopo lesioni del midollo spinale, così come nella modellazione delle malattie.

Introduction

Il trapianto di progenitori neurali e dei loro derivati ​​dimostra la promessa come strategia di trattamento a seguito di lesioni traumatiche 1 e 2 e neurodegenerazione 3 , 4 . Prima dell'applicazione clinica, è essenziale assicurare: i) un metodo per accedere e espandere ad una fonte autologa di cellule staminali / progenitori e ii) un mezzo per indirizzarli a tipi di cellule mature, rilevanti 3 . Il nostro interesse per la terapia cellulare per lesioni del midollo spinale ci ha portato a cercare una fonte di cellule autologhe robuste e robuste di progenitori neurali dai tessuti adulti.

Una sottopopolazione di MSC provengono dalla cresta neurale e sono facilmente accessibili dalla cavità del midollo. Queste cellule sono progenitori neurali che possono generare neuroni e glia 5 . I modelli animali di ischemia cerebrale dimostrano che l'ipossia promuove la prol Iferazione e multipotenza di progenitori neurali all'interno del cervello 6 . Questa è stata la base per l'utilizzo di precondizionamento ipossico come mezzo di espansione su progenitori neurali derivanti dal midollo.

Il trapianto di cellule Schwann nel midollo spinale favorisce la rigenerazione 2 . Le SCLC possono essere generate da MSC mediante l'integrazione con fattori gliogenici (β-Heregulin, bFGF e PDGF-AA) ma dimostrano instabilità fenotipica. Al ritiro dei fattori di crescita, essi ritornano a un fenotipo tipo fibroblasto 7 . L'instabilità fenotipica è indesiderabile nel trapianto cellulare a causa del rischio di differenziazione aberrante e di carcinogenesi. Poiché i precursori di cellule di Schwann sono associati a fasci dell'assone all'interno del nervo periferico embrionale 8 , ci sono stati condotti SCLC di coculture con neuroni embrionali DRG purificati 7 ,Ass = "xref"> 9. Le cellule Schwann mature risultanti sono fate-committed e dimostrano la funzione in vitro 7 , 9 e in vivo 10 .

Il nostro protocollo per l'arricchimento dei progenitori neurali da MSC è semplice ed efficiente e porta ad un aumento del numero di cellule per i successivi dosaggi. La derivazione di cellule Schwann fatte tramite destino attraverso la piattaforma di coculture consente lo studio della differenziazione gliale e la generazione di cellule Schwann stabili e funzionali per una possibile applicazione clinica.

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Protocol

Tutte le procedure relative agli animali sono state eseguite in stretta conformità con la Guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e approvata dal comitato per l'uso degli animali vivi per l'insegnamento e la ricerca, Li Ka Shing Facoltà di Medicina dell'Università di Hong Kong. I campioni di midollo osseo umano sono stati ottenuti dalla cresta iliaca di donatori sani dopo aver ottenuto il consenso informato. I protocolli sono stati approvati dal consiglio di revisione istituzionale, l'Università di Hong Kong.

1. Preparazione delle Culture MSC di Rat

  1. Raccolta di MSC dal femore
    1. Autoclave tutti gli attrezzi di dissezione ( cioè forbici di dissezione fine , forbici a punta smussate e pinze dentate) a 180 ° C per almeno 2 ore prima dell'uso.
    2. Preparare il mezzo di crescita MSC composto da una minima modifica essenziale di media alfa (αMEM) integrata con 15% di siero fetale fetale (FBS) e penicillina / streptomicina (P / S, 1% v / v).
    3. Sacrifichi giovani ratti maschi Sprague Dawley (200-250 g di peso corporeo) da sovradosaggio di pentobarbitone (240 mg / kg di peso corporeo, intraperitoneale).
      NOTA: I campioni di midollo da diversi ratti devono essere trattati separatamente.
    4. Posizionare gli animali sacrificati in posizione supina. Pulire bene l'addome e gli arti inferiori con il 70% di etanolo.
    5. Togliere la pelle e il tessuto sottocutaneo sulle cosce mediali utilizzando forbici e forbici di dissezione eccellenti. Rimuovere i muscoli della coscia circonferenzialmente fino a quando il femore è esposto. Continuare questo proximally e distally fino a quando le articolazioni del ginocchio e dell'anca sono viste. Disarticolare il femore attraverso l'articolazione dell'anca e del ginocchio mediante forbici a taglio a punta smussata.
      NOTA: non trascinare il femore per esporre la cavità del midollo in questa fase. Trasferire i femori intatti a una cappa di coltura del tessuto a flusso laminare per ulteriori trattamenti.
    6. Utilizzare forbici a taglio tagliente a punta per tracciare le estremità distali e prossime del femore attraverso la metafisi.
    7. Posizionare un filtro cellulare da 70 μm su un tubo conico da 50 ml. Inserire una siringa da 21 g, 10 ml contenente salina fosfata tamponata (PBS, 10 mM Na 2 HPO 4 , pH 7,4) nel canale femorale esposto e sciacquare il contenuto di midollo nel tubo conico ripetutamente.
      NOTA: Circa 20 ml di PBS vengono usati per irrigare ogni femore. Se il colore del contenuto di fiamma rimane macchiato di sangue e torbido, è possibile utilizzare un volume maggiore.
    8. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 480 xg per 5 min. Scartare il surnatante. Resuspendere il pellet di cellule in 10 ml di mezzo di crescita MSC. Piattare le cellule su un piatto da 10 cm di coltura tissutale. Posizionare i piatti di coltura tissutale in un incubatore di cellule (37 ° C, 5% CO 2 ). Registrare il giorno iniziale della placcatura come giorno 0.
      NOTA: In tutti i passaggi che comportano la centrifugazione, impostare il freno per la massima decelerazione.
  2. Costituzione ed espansione delle colonie MSC
    NOTA: Questo protocollo rElie sull'adesione plastica della coltura tissutale come mezzo per selezionare per MSC dall'interno della cavità del midollo 11 . Il contenuto di midollo osseo è permesso di aderire alla plastica della coltura tissutale per 2 giorni.
    1. Il giorno 2, sciacquare le piastre di coltura tre volte con 10 ml di PBS per rimuovere le cellule non aderenti. Sostituire il PBS con 10 ml di mezzo di crescita MSC dopo il risciacquo. Lavare le cellule con PBS e ricostituire con supporto di crescita MSC ogni 3 giorni.
      NOTA: Le colonie MSC devono essere visibili entro il giorno 6-7 ( Figura 2A ).
    2. Passaggio delle cellule entro il giorno 10 rimuovendo il mezzo di crescita e sciacquando le cellule con PBS. Aggiungere 1,5 ml di reagente di dissociazione enzimatica ricombinante e incubare a 37 ° C per 5 min. Aggiungere 3 mL di mezzo di crescita MSC per neutralizzare la reazione. Raccogliere le cellule staccate mediante centrifugazione a 250 xg per 5 min.
    3. Quantificare le cellule all'interno del pellet utilizzando un emocytometro dopo una appropriata diluizione in PBS.
    4. Le cellule sono state passate ad una densità di 40.000 cellule / cm 2 in una piastra di coltura da 10 cm nel mezzo di crescita MSC.
      NOTA: I MSC del gatto dovrebbero raggiungere confluenza del 80-90% entro 2 giorni dal passaggio ( Figura 2B ). Le celle possono essere passate come descritto nel punto 1.2.2 per un massimo di 8 passaggi. Le MSC possono essere caratterizzate da mezzi di immunocitochimica e dalla loro capacità di differenziazione dei trilinei ( Figura 3 ) 12 . Solo le colture MSC tra i passaggi 3 e 8 sono soggette a successivi precondizionamento ipossico e arricchimento dei progenitori neurali. MSC di maggior numero di passaggio adottano una morfologia appiattita ( Figura 2C ) e non producono un numero sufficiente di progenitori neurali. Queste culture devono essere scartate.

2. Preparazione di Culture BMSC umane

  1. Diluire 1 mL di aspirato midollo osseo umano con 9 mL di mezzo di crescita MSC e piastrarloCellule su un piatto da 10 cm di coltura tissutale. Mantenere le colture in un incubatore di cellule (37 ° C, 5% CO 2 ).
  2. Rimuovere il mezzo dopo 2 giorni e sciacquare delicatamente le colture tre volte con 10 ml di PBS per rimuovere le cellule non aderenti. Dopo il risciacquo finale, rimuovere il PBS e sostituirlo con 10 ml di mezzo di crescita MSC. Riempire il mezzo di crescita dopo ogni 3 giorni di coltura dopo il risciacquo di PBS.
    NOTA: Le colonie MSC devono essere visibili entro il giorno 6-7. Il numero di colonie può variare tra i soggetti.
  3. Passaggio delle cellule al giorno 10, come descritto nel passaggio 1.2.2. Quantificare le cellule all'interno del pellet utilizzando un emocytometro dopo una appropriata diluizione in PBS. Seme le cellule passate ad una densità di 40.000 cellule / cm 2 su una piastra di coltura da 10 cm nel mezzo di crescita MSC.
    NOTA: I MSC umani ( Figura 2D ) dimostrano una morfologia simile a MSC del ratto e allo stesso modo dovrebbero raggiungere confluenza 80-90% entro 2 giorni dal passaggio. Dovrebbero essere charaCterizzati mediante immunocitochimica e la loro capacità di differenziazione dei trilinei 12 . Come per i MSC del ratto, MSC umani che sono tra il passaggio 3 e 8 sono soggetti a successivi precondizionamento ipossico e arricchimento dei progenitori neurali.

3. Precondizionamento ipossico

  1. Smontare i componenti della camera di ipossia ( cioè, base, coperchio, vassoi) dopo aver rilasciato il morsetto dell'anello e pulire le singole parti con 70% di etanolo. Posizionare i componenti della camera all'interno di un cappuccio di coltura del tessuto flusso laminare per la sterilizzazione sotto luce UV per 15 minuti.
  2. Prima di precondizionare ipossidi, rimuovere il mezzo e sciacquare le colture di ratto e umano MSC (sezioni 1 e 2) con 10 ml di PBS. Sostituire il PBS con 10 ml di mezzo di crescita MSC integrato con 25 mM HEPES.
    NOTA: I MSC coltivati ​​su piatti da 10 cm dovrebbero avere raggiunto la confluenza del 80-90% prima di essere sottoposti a precondizionamento ipossico.
  3. Posizionare il culAll'interno della camera di ipossia. Riassemblare i componenti della camera e serrare il morsetto dell'anello. Spurgare una miscela di gas del 99% N 2 /1% O 2 nella camera con una portata di 10 L / min per 5 min.
  4. Sigillare le estremità di collegamento della camera di ipossia per assicurarsi che non vi sia perdita di gas. Posizionare la camera all'interno dell'incubatore cellulare (37 ° C, 5% CO 2 ) per 16 h.
  5. Al termine del precondizionamento ipossico, rimuovere le culture dalla camera in preparazione per la successiva cultura arricchita dei progenitori neurali.

4. Cultura arricchimento progenitrice neurale

  1. Preparare un mezzo progenitore neurale costituito da F12 (DMEM / F12) modificato con B27 (2% v / v), fattore di crescita di fibroblasti di base (bFGF, 20 ng / mL), fattore di crescita epidermico (EGF, 20 ng / mL) e P / S (1% v / v).
  2. Staccare i precursori ipossici ratto / umani MSC, come descritto nel punto 1.2.2.Raccogliere le cellule staccate mediante centrifugazione a 250 xg per 5 min. Quantificare le cellule all'interno del pellet usando un emocytometro dopo adeguata diluizione in PBS.
  3. Resuspendere le cellule nel mezzo progenitivo neurale e il seme a bassi attaccamenti, piatti a 6 pozzetti ad una densità di 6.000 cellule / cm 2 . Posizionare la coltura in un incubatore di cellule (37 ° C, 5% CO 2 ) per 12 giorni. Replenish 75% del medium progenitor neurale ogni 3 giorni.
    NOTA: i grandi gruppi cluster non aderenti dovrebbero essere osservati entro il giorno 6-7. Al giorno 10-12 si possono osservare neurosfere con diametro ≥ 100 μm ( Figura 4 ). I MSC precondizionati ipossici dovrebbero produrre più neurosfere rispetto ai MSC coltivati ​​in condizioni normossiche 9 .
  4. Raccogli le neurosfere nel giorno 12 aspirandole in una pipetta da 10 ml e trasferendole in un tubo conico da 15 ml. Centrifugare le neurosfere a 250 xg per 5 min.
    NOTA: le neurosfere possono essereCaratterizzato per il giorno 12 per marcatori progenitrici neurali, come Nestin e GFAP 7 .

5. La generazione di cellule Schwann impegnate nel destino mediante Coculture con i neuroni DRG

  1. Preparazione dei neuroni DRG purificati
    1. Autoclave tutti gli strumenti di dissezione ( cioè forbici di dissezione, pinze, due pinze a microdissezione e forbici a microdissezione) a 180 ° C per almeno 2 ore prima dell'uso.
    2. Pannelli di coltura di tessuti a 6 pozzetti con poli-D-lisina (PDL, 10 μg / mL in PBS) a 4 ° C per una notte. Rimuovere il PDL e risciacquare con 1,5 ml di PBS per pozzetto.
    3. Procedere con il rivestimento delle lastre con laminina (10 μg / mL in PBS) a 37 ° C per 2 ore. Sciacquare le piastre con 1,5 ml di PBS per pozzetto.
    4. Preparare il mezzo di mantenimento del neurone DRG, composto da un mezzo neurobasale integrato con B27 (2% v / v), L-glutamina (1% v / v), fattore di crescita del nervo (NGF, 20 ng / mL) e P / S % V / v).
    5. Preparare il mezzo di purificazione del neurone DRG, composto da un mezzo neurobasale integrato con B27 (2% v / v), L-glutamina (1%), NGF (20 ng / mL), P / S (1%), fluorodeossiridina (FDU, 10 Μg / mL) ed uridine (10 μg / mL).
    6. Ratti in stato di gravidanza durante il giorno di gestazione 14-15 con overdose di pentobarbital (240 mg / kg di peso corporeo, intraperitoneale).
    7. Posizionare gli animali sacrificati in posizione supina. Pulire completamente l'addome con il 70% di etanolo.
    8. Tagliare la parete addominale inferiore dell'animale longitudinalmente usando le forbici e le pinze per disseccare bene. Identificare e rimuovere l'utero utilizzando forbici di dissezione. Tagliare la parete uterina per esporre ed estrarre gli embrioni. Trasferire gli embrioni in un piatto di coltura sterile da 10 cm riempito con PBS. Posizionare il piatto culturale sul ghiaccio.
    9. Trasferire l'embrione destinato alla dissezione in un piatto di coltura sterile da 10 cm riempito con PBS (temperatura ambiente) e posizionarlo sotto un microscopio di dissezione. Avere l'embrione in posizione positiva.
      NONE: Il midollo spinale bianco e le DRG allegate possono essere viste sull'aspetto dorsale dell'embrione, attraverso la sua pelle traslucida.
    10. Inserire le pinze di microdissezione lungo entrambi i lati del midollo spinale e utilizzare una dissezione sbarrata per iniziare a separare il midollo spinale dal tessuto molle circostante. Tagliare il midollo spinale dall'animale usando le pinze di microdissezione lungo l'apertura del collo e la coda della coda. Eseguire ulteriormente la dissezione sbarrata sull'aspetto ventrale del cavo per liberarlo dal tessuto molle circostante.
    11. Utilizzare pinze a microdissezione per rimuovere il tessuto molle residuo sull'aspetto dorsale del midollo spinale liberato.
      NOTA: In questa fase, rimangono solo il midollo spinale, le radici nervose e DRG allegate.
    12. Staccare le DRG individuali dalle loro radici nervose di collegamento utilizzando pinze di microdissezione. Utilizzare una penna pipetta attaccata ad una punta da 1 ml per trasferire le DRG in un tubo centrifugo sterile da 1,5 ml contenente PBS.
      NOTA: Per ogni tubo da 1,5 ml, un massimo diPossono essere alloggiati 100 DRG.
    13. Centrifugare i DRG a 250 xg per 5 min e risospenderli in reattivo ricombinante di dissociazione delle cellule enzimatiche (200 μL per tubo). Incubare (37 ° C, 5% CO 2 ) per 10 min. Centrifugare le DRG a 250 xg per 5 minuti, rimuovere il surnatante e risospendere nel mezzo di manutenzione del neurone DRG. Dissociare il pellet con una triturazione delicata usando una punta di pipetta da 200 μL. Quantificare le cellule all'interno del pellet usando un emocitometro dopo una diluizione appropriata.
    14. Seed le cellule ad una densità di 5.000 cellule / cm 2 in piastre a 6 pozzetti PDL / laminin-rivestite in 1,5 ml di supporto di mantenimento del neurone DRG per pozzetto. Dopo due giorni di coltura, rimuovere il supporto di manutenzione del neurone DRG, risciacquare con PBS e sostituirlo con il mezzo di purificazione dei neuroni DRG.
      NOTA: Per ogni ciclo di purificazione, trattare le colture DRG con il medium di purificazione per 2 giorni, seguita da 1 giorno di incubazione nel supporto di manutenzione. Dopo 3-4 cicli di purificazione, il rimÈ previsto ovale di tutti gli endogeni glia 7 . Ci vogliono circa 14 giorni. Le colture purificate provano positivi per il marcatore neuronale TUJ1 e sono assenti per l'espressione S100β ( Figura 5 ).
  2. Generazione di cellule simili a cellule Schwann
    1. Preparare il mezzo di induzione ialico composto da αMEM integrato con β-Heregulin (100 ng / mL), bFGF (10 ng / ml), fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF-AA, 5 ng / mL), FBS (10%) e P / S (1% v / v).
    2. Piastra le neurosfere preparate nella sezione 4 in piastre a 6 pozzetti PDL / lamina rivestite ad una densità di 5-10 sfere per cm 2 in 1,5 ml di mezzo induttivo gliale per pozzetto. Sostituire il mezzo di induzione degli gliali ogni 2 giorni dopo il risciacquo delle cellule con PBS.
      NOTA: le cellule di neurosfere seminate sono viste a migrare all'esterno al giorno 2. Al giorno 7, le cellule migratorie hanno un aspetto più ridotto e dovrebbero dimostrare l'immunopositività per la cellula SchwannMarcatori p75 neurotrofina recettore (p75) e S100β 7 . Queste cellule sono denominate SCLC.
  3. Cocultura di SCLC con neuroni DRG
    1. Preparare il mezzo di coculture costituito da un mezzo di mantenimento dei neuroni DRG (fase 5.1.4) e da un mezzo di induzione ialico (fase 5.2.1) con un rapporto volume / volume di 1: 1.
    2. Preparare il mezzo di manutenzione della cellula di Schwann composto da DMEM / F12 integrato con FBS (5%), β-Heregulin (10 ng / mL) e P / S (1% v / v).
    3. Rimuovere il mezzo di coltura dal 7 giorno SCLCs, sciacquarli con PBS e incubarli con 0,5 mL / pozzetto di reagente di dissociazione enzimatica ricombinante a 37 ° C per 5 min. Resuspendere gli SCLC in mezzo di coculture.
    4. Quantificare le cellule utilizzando un emocytometro dopo una diluizione appropriata.
    5. Seme le SCLC su colture di neuroni DRG purificate ad una densità di 1.000 cellule / cm 2 . Conservare le coculture per 14 giorni, con sostituzione media ogni 2 giorni.
      NOTA: Durante la coltura, SCLC ha acquisito la morfologia tipo mandrino tipica delle cellule Schwann mature ( Figura 6 ). Queste cellule persistono nel loro fenotipo dopo il ritiro dei fattori di crescita e sono in grado di assoniare mieloni in vitro e in vivo 7 , 10 . La positività dei marcatori cellulari di Schwann ( es., P75 e S100β) deve essere monitorata mediante immunofluorescenza.
    6. Al termine della cocultura, le cellule di Schwann impegnate nel passaggio, come descritto nel passaggio 1.2.2. Utilizzare 0,5 ml di reagente di dissociazione per pozzetto. Quantificare le cellule utilizzando un emocytometro dopo una diluizione appropriata.
    7. Resuspendere le cellule Schwann impegnate nel destino nel mezzo di manutenzione della cella di Schwann ad una densità di 10.000 cellule / cm 2 . Le cellule di semi in PDL / laminin-rivestite piastre a 6 pozzetti per immunofluorescenza.
      NOTA: le coculture contengono inevitabilmente MSC che hanno adottato un fibroblastoDestino cellulare 7 . Queste cellule sono passate insieme a cellule di Schwann fatte a seguito del completamento della cocultura. Le cellule Schwann che si trovano in cima a questo substrato di fibroblasto possono essere facilmente staccate e ulteriormente estese dopo il risciacquo con "getti freddi" di PBS (4 ° C), come è stato descritto altrove 13 . Le cellule di Schwann impegnate nel destino possono essere estese in un mezzo di manutenzione per un mese.

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Representative Results

Una panoramica delle tappe chiave del nostro protocollo è illustrata nella Figura 1 . In sintesi, MSC ratto e umano sono selezionati per aderenza alla plastica della coltura tissutale. I MSC espanditi sono precondizionati con ipossia e sono quindi soggetti a condizioni di formazione della neurosfera. Le neurosfere sono placcate e consentite di differenziarsi in SCLC. Le SCLC vengono coculturate con i neuroni DRG purificati per generare cellule Schwann impegnate nel destino.

La morfologia di ratti coltivati ​​e MSC umani è illustrata in Figura 2 . La loro morfologia congiuntiva è evidenziata in contrasto con l'aspetto quadrangolare di MSC mantenuto per i numeri di passaggio elevato, che hanno perso la loro multipotenza. Le colonie espanse di ratto e umane dovrebbero dimostrare l'espressione di marcatori MSC, un'assenza di marcatori delle cellule staminali ematopoietiche e la capacità di trilineazione difFerentizzazione ( Figura 3 ). MSCs sani tra i passaggi 3 e 8 sono sottoposti a precondizionamento ipossico per 16 ore e successivamente passati su piastre di coltura a bassa aderenza con integrazione EGF / bFGF. I precondizionamenti ipossici portano a un numero maggiore di neurosfere, così come a grandi dimensioni della neurosfera media ( Figura 4 ).

Le neurosfere vengono placcate su piastre di coltura rivestite con PDL / laminina e indotte a diventare SCLC mediante coltura nel mezzo di induzione ialico contenente β-Heregulin, bFGF e PDGF-AA. Le SCLC presentano la caratteristica morfologia conica delle cellule di Schwann e la corrispondente espressione del marcatore, tuttavia sono fenotipicamente instabili e ritornano a un fenotipo di fibroblasto dopo la sospensione dei fattori di crescita

La coagulazione con i neuroni sensoriali è un requisito indispensabile per ottenere una cellula intrinsecaPrurito per destare l'impegno. La creazione di reti DRG purificate viene ottenuta mediante un trattamento pulsato con FDU e uridine per rimuovere glia endogena e deve essere confermata dall'assenza di immunopositività S100β ( Figura 5 ). Il giorno 7 SCLCs sono passati e coculturate con neuroni DRG purificati per 14 giorni ( Figura 6 ). Dopo il completamento della cocultura, dovrebbero emergere mature cellule Schwann impegnate nel destino.

Figura 1
Figura 1: Panoramica del protocollo. Il midollo osseo è ottenuto da femmine di ratto o da aspiranti delia crine umane. MSC da dentro il midollo osseo può attaccare e espandere la plastica della coltura tissutale. Al fine di arricchire per MSCs con potenziale neurale, le cellule sono precondizionate in 1% O 2 per 16 ore e vengono poi passate su colture a bassa adesione plCon supplementazione bFGF / EGF. Ciò determina la formazione di neurosfere che vengono plasmate in plastica di coltura tissutale PDL / laminina e coltivate in mezzo di inibizione ialica per generare SCLC. SCLCs sono passati e coculturate con neuroni DRG purificati per 2 settimane per dirigere alla maturità. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: Costituzione di colonie MSC. Grandi colonie MSC dovrebbero essere visibili 6-7 giorni dopo la placcatura delle cellule del midollo osseo sulla plastica della coltura tissutale. È mostrata un'immagine rappresentativa di una colonia MSC del ratto ( A ), mentre le colonie umane dimostrano un aspetto simile. Le colonie possono essere passate il giorno 10. Visto ad ingrandimento superiore, sia il ratto (B ) e umani ( D ) presentano una caratteristica morfologia simile a fibroblasti dopo il passaggio. MSC che vengono mantenuti per i numeri di passaggio elevato acquista una morfologia quadrata ( C ) appiattita e deve essere scartata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: Caratterizzazione dei MSC. ( A - D ) Immagini rappresentative di MSC umane. Le MSC possono essere caratterizzate dall'espressione di marcatori appropriati, quali CD90 ( A ), CD73 ( B ) e Stro-1 ( C ), e dall'assenza di marcatori delle cellule staminali ematopoietici, come CD45 ( D ). ( E - G ) Rat MGli SC isolati e ampliati come descritti nel protocollo dimostrano la multipotenza nella loro capacità di formare adipociti ( E , depositi di grasso macchiati con Sudan Red), osteoblasti ( F , matrice pericellulare colorate con Alizarin Red) e condrociti ( G , proteoglicani macchiati con Safranin- O) in condizioni di coltura adeguate. Barre scala = 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4: Arricchimento di progenitori neurali da MSC. Entrambi i ratti ( A ) e gli umani ( C ) MSC formano neurosfere quando vengono coltivati ​​in plastica di coltura a tessuto a bassa adesione in mezzo integrato con EGF / bFGF. I numeri e il diametro medio del ratto ( D ) sono migliorate tramite la precondizionazione ipossica di MSC (16 h, 1% O 2 ) prima dell'induzione della sfera. Barre di scala = 200 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5: Creazione di reti DRG purificate DRG. Le reti DRG purificate vengono stabilite dopo un trattamento impulsivo con gli agenti antimitoti FDU e uridine (A). Le reti neurite prive di glia endogena (B) che esprimono S100β sono pronte per la coltura con SCLC. Barre scala = 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.


Figura 6: Generazione di cellule Schwann derivate dal midollo osseo mediante cocultura con i neuroni DRG. Dopo aver completato 2 settimane di cocultura con neuroni DRG purificati e SCLC umani, le cellule di Schwann a forma di mandrino, destinate al destino, emergono da gruppi trattati con normossia e ipossia ( A e D ). Queste cellule esprimono i marker di cellule Schwann p75 (B e E) e S100β (C e F). L'espressione dell'antigene nucleare umano (HuNeu) dimostra che le cellule S100β-positive non stanno contaminando cellule gliali provenienti da DRG del ratto. Barre scala = 100 μm.

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Discussion

È fondamentale preservare la "gamba" dei MSC prima dell'arricchimento dei progenitori neurali attraverso precondizionamento ipossico e cultura della neurosfera. Dalla nostra esperienza, MSC multipotenti possono essere identificati in modo affidabile dalla loro morfologia simile a fibroblasti. Al contrario, i MSC che hanno adottato una morfologia piu 'appiattita e quadrangolare, con fibre di stress sospettose prominenti, non adottano facilmente i destini delle cellule neurali e vanno scartate. In generale, non utilizziamo MSC con numeri di passaggio maggiori di otto. Per preservare la loro stabilità, è fondamentale passare MSC prima di raggiungere la confluenza del 100%. Al contrario, il mantenimento di MSC in una confluenza troppo bassa è indesiderabile. Dalla nostra esperienza, seminare MSC ad una densità di 40.000 cellule / cm 2 , o semplicemente passaggio di cellule che sono 80% confluente ad un rapporto di 1: 2, consente i migliori risultati.

La corretta creazione e manutenzione della rete DRG è un criticoAl determinante del successo di coculture. Il tempo necessario per la raccolta DRG deve essere mantenuto al minimo. I gangli individuali devono essere trattati in modo atraumatico, in particolare durante il distacco dal midollo spinale, quando è meglio gestire solo le radici nervose. In generale, ci proponiamo per un periodo di meno di 2 ore tra il tempo del sacrificio animale e la digestione enzimatica dei DRG raccolti, in quanto un raccolto prolungato porta alla macerazione tissutale e alla perdita di vitalità cellulare. Viene spesso incontrato il distacco dei neuroni DRG dal substrato durante la coltura. Per evitare che questo si verifichi, il rivestimento deve essere preparato e eseguito appena vicino al tempo del raccolto tissutale. In generale, i grossi gruppi di DRG indigeni non si scolano più spesso e non producono successo di coculture. La durata della digestione enzimatica e la quantità di triturazione possono essere regolati, al fine di ottenere una rete con un aspetto simile alla Figura 5 .

Mentre il nostro cocuLa piattaforma completa implica costantemente l'impegno del destino, solo il 20-30% delle colture eseguite in parallelo rendono le cellule Schwann fatte-fatte 7 , 13 . Prepariamo quindi abbastanza DRG e SCLC per eseguire concomitanti coculture in tre o quattro piastre di coltura a 6 pozzetti. Si ipotizza che una combinazione di fattori legati alla rete DRG sottostante, inclusa l'età embrionale, la vitalità cellulare, la densità e la topografia, influenzino il successo della cocultura. Queste variabili sottostanti devono essere ulteriormente studiate e standardizzate. Oltre alle limitazioni della resa cocultura, si dovrebbe ricercare un mezzo per sopprimere l'esigenza dei neuroni DRG e dei prodotti animali. Inoltre, la durata del protocollo dovrebbe essere abbreviata. Come una modifica abbreviata del nostro protocollo, abbiamo avuto successo nel derivare le cellule Schwann mature dalle neurosfere di dieci giorni seminate direttamente sui neuroni DRG purificati, senza la prima generazione di SCLC , 10 .

Le neurosfere arricchite attraverso il nostro metodo servono come una fonte robusta di cellule di linee neuronali e gliali. La nostra piattaforma per dirigere le cellule precursori al destino dell'impegno ha il vantaggio di evitare la manipolazione genetica, con i suoi rischi inerenti e le cellule risultanti sono rilevanti per il trapianto di cellule, la modellizzazione delle malattie e lo studio della differenziazione gliale.

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Disclosures

Tutti gli autori di questo manoscritto non hanno dichiarazioni da dichiarare.

Acknowledgments

Gli autori vorrebbero riconoscere il dottor Nai-Sum Wong per aver fornito l'apparato della camera di ipossia e la signora Alice Lui per il supporto tecnico.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
αMEM Sigmaaldrich M4526
DMEM/F12 Thermofisher scientific 12400-024
Neurobasal medium Thermofisher scientific 21103-049
FBS Biosera FB-1280/500
B27 Thermofisher scientific 17504-001
Epidermal growth factor (EGF) Thermofisher scientific PHG0313
Basic fibroblast growth factor (bFGF)  Peprotech 100-18B/100UG
Nerve growth factor (NGF)  Millipore NC011
Platelet-derived growth factor-AA (PDGF-AA) Peprotech 100-13A
Heregulin beta-3, EGF domain (β-Her) Millipore 01-201
Uridine Sigmaaldrich U3003
5-Fluro-2' - deoxyuridine (FDU) Sigmaaldrich F0503
Poly-D-lysine (PDL) Sigmaaldrich P7886-1G
Laminin Thermofisher scientific 23017015
GlutaMAX Thermofisher scientific 35050061
Penicillin / streptomycin (P/S) Thermofisher Scientific 15140-122
TrypLE Express Thermofisher Scientific 12604-013
10 cm plate for adherent culture TPP 93100 Used for selection of MSCs by tissue culture adherence
6-well plate for adherent culture TPP 92006 Used for expansion of MSCs following passaging
UltraLow 6-well plate for non-adherent culture Corning 3471 Used for neural progenitor enrichment
anti-human CD90(Thy-1) BD Biosciences 555593
anti-human CD73 BD Biosciences 550256
anti-human/rat STRO-1 R&D Systems MAB1038
anti-human nestin R&D Systems MAB1259
anti-human CD45 BD Biosciences 555480
anti-rat CD90(Thy-1) BD Biosciences 554895
anti-rat CD73 BD Biosciences 551123
anti-rat nestin BD Biosciences MAB1259
anti-rat CD45 BD Biosciences 554875
Anti-S100β Dako Z031101
Anti-p75 Millipore MAB5386
Anti-GFAP Sigmaaldrich G3893
Anti-Class III-beta tubulin (Tuj-1) Covance MMS-435P
Anti-Human nuclei Millipore MAB1281
Hypoxia chamber Billups-Rothenberg MIC-101
HEPES buffer Sigmaaldrich H4034-100G

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References

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