단일 시료의 대사 산물, 지질 및 단백질의 종합 분석을위한 간단한 분취 추출 방법

Biochemistry
 

Summary

하나의 샘플을 사용하여 생물학적 조직에서 지질, 대사 산물 및 단백질을 포괄적으로 추출하기위한 프로토콜이 제시됩니다.

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Salem, M., Bernach, M., Bajdzienko, K., Giavalisco, P. A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample. J. Vis. Exp. (124), e55802, doi:10.3791/55802 (2017).

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Abstract

복잡한 생물 시스템에 대한 이해에는 일반적으로 전 사체, 프로테오믹, 대사 체 및 지질 측정에 의해 결정되는 살아있는 세포의 여러 화합물 부류의 측정, 분석 및 통합이 필요합니다. 이 프로토콜에서는 샘플 당 하나의 분액을 사용하여 생물학적 조직에서 대사 산물, 지질 및 단백질을 재현 할 수있는 간단한 방법으로 추출합니다. 추출 방법은 액체 용 메틸 tert- 부틸 에테르 : 메탄올 : 물 시스템을 기반으로합니다 : 소수성 및 극성 대사 산물을 고체 펠렛으로서 단백질 및 기타 거대 분자의 침전과 함께 2 개의 비 혼화 단계로 액체 분배하는 것입니다. 따라서이 방법은 질량 분석기에 결합 된 액체 크로마토 그래피 (LC) 또는 가스 크로마토 그래피 (GC)와 같은 일반적인 높은 처리량 '오믹 (omics)'기술과 완벽하게 호환되는 특정 분자 조성의 세 가지 다른 부분을 제공합니다. 메소드가 init 임에도 불구하고다양한 식물 조직 샘플을 분석하기 위해 개발 된이 제품은 해조류, 곤충 및 포유류 조직 및 세포 배양과 같은 다양한 시스템의 생물학적 시료 추출 및 분석에 완벽하게 호환됩니다.

Introduction

지난 세기 1 중반에 등장하고 게놈 및 transcriptomic 데이터 세트 2 , 3 의 대규모 분석에 의해 발전된 시스템 생물학은 복잡한 생물 시스템 4 , 5 의 분석을위한 새롭고 필수적인 접근 방식으로 발전했습니다. 시스템 생물학의 주요 목표는 생물학적 시스템의 구성 요소 상호 작용과 의존성을 해독하고 유전자형, 그 실현, 분자 변형 및 결과 표현형 사이의 연결 고리를 연결하는 것입니다. 따라서 다양한 대규모 분석 방법, 즉 유전체학, 전이 체학, 대사 체학, 지질학 및 proteomics와 그 계산 분석에 의해 생성 된 포괄적 인 데이터 세트의 통합은 복잡한 생물 시스템의 기술과 이해를위한 전제 조건이되었습니다.

Bas 살아있는 시스템에서 생물학적 구성 요소의 거대한 화학적 다양성과 복잡성에 대해, 크고 포괄적 인 'omics'데이터 세트의 생성은 적용된 추출 방법 9 의 품질에 크게 의존합니다. 추출 방법의 품질 외에도이 방법의 경제성이 중요합니다. 이것은 가능한 한 적은 샘플 입력으로부터 많은 분자 정보를 얻는 것이 바람직하다는 것을 의미한다. 흔히 샘플 양이 제한적일 수 있으므로 추출 방법을 사용하는 것이 바람직합니다. 추출 방법은 주어진 샘플을 한 번 추출 할 때 가능한 많은 분자 클래스를 도출 할 수 있습니다. 이것은 동일한 샘플의 다른 샘플 분취 량으로부터 다른 화합물 종류를 추출하기 위해 여러 가지 특수 추출법을 사용하는 대신, 단일 분취 량의 분자 구성 성분을 다른 분자 분획으로 분별하는 순차 추출 방법을 사용함을 의미합니다.

_content "> 이러한 분획 추출 방법에 사용 된 일반적인 방법은 1957 년에 개발 된 Folch 2 단계 지질 추출 방법에 기반합니다.이 방법은 극성 및 소수성 대사 산물의 클로로포름 : 메탄올 / 물 분배를 기반으로하며 고품질의 지질 분석을위한 시료의 정화 및 해독을 목적으로합니다. 다중 오믹 시스템 생물학의 진화와 함께 Folch 방법은 단백질 및 극성 대사 산물 및 지질의 표본 분배에이를 적용하여 단계적으로 개선되었습니다. 액체 크로마토 그래피에 기초한 프로테오믹스 11,12,13,14 이외에 극성 및 소수성 화합물의 기체 및 액체 크로마토 그래피 기반 대사 체 및 리피도 미믹 (lipidomics )이 있다. 불행히도, 이들 모든 방법은 클로로포름 기반의 추출 방법에 의존하고있다. 원하지 않는 fo극성과 지질 상간의 중간 단계로서 단백질 펠릿의 합성은 녹색 화학 관점에서 바람직하지 않은 용매이다 15 , 16 . 그러나, 용매 메틸 tert- 부틸 에테르 (MTBE)는 전술 한 문제점 모두를 극복하고 클로로포름의 적절한 대체제이다. 이러한 요구 사항을 기반으로 MTBE : 메탄올 : 수성 추출법을 확립하기로 결정했습니다.이 방법은 앞서 언급 한 모든 사양을 충족하므로 포괄적 인 다중 오믹 분석을위한 이상적인 출발점으로 작용합니다 16 .

이 프로토콜은 일반적으로 관찰되는 문제의 문제 해결을 포함하여 시료 준비의 간단하고 신속하며 재현성있는 워크 플로를 통해 사용자를 단계별로 안내합니다. 또한, 우리는 초 고성능 액체 크로마토 그래피 - 질량 분광법 (UPLC-MS) - 바로부터 모범적 인 분석 데이터를 간략하게 소개 할 것이다식물 조직 샘플에서 추출한 리피드 미생물, 대사 체 및 프로테오믹스 프로파일 링. 비록 주어진 예제가 50mg의 Arabidopsis thaliana 잎 조직 샘플에서 유래 되었지만 ,이 프로토콜은 조류 17 , 18 , 곤충 19 및 포유 동물 세포, 장기 및 조직 20 , 21 , 22 . 제시된 추출 프로토콜의 범위는 사전 추출 시료 처리 및 추출 절차 자체에 대한 명확하고 상세한 설명을 제공하는 것이다. 비록 우리가 분석 응용의 세 가지 간단한 예를 제공한다고해도, 사전 및 사후 분석 데이터 처리에 대한 자세한 정보는 이전의 출판물 16 , 23 , 24 , , 26 .

Protocol

주의 : 추출하는 동안 사용되는 메탄올 (MeOH)과 메틸 tert- 부틸 에테르 (MTBE)는 인화성이며 장기간 노출 및 / 또는 접촉시 호흡기, 눈 또는 피부 자극을 일으킬 수 있습니다. 흄 후드에서 조심스럽게 다루고 추출 중에 적절한 안전 절차 (실험실 코트, 안전 안경, 장갑 )를 사용하십시오. 이 프로토콜의 여러 단계에서 사용되는 액체 질소와 드라이 아이스는 장기간 피부 접촉으로 심각한 화상을 유발할 수 있습니다. 보호 장갑과 안경을 착용하고 조심스럽게 다루십시오. 사용자는 시료 분석을 위해 다른 화학 물질, 시약 또는 내부 표준을 사용할 수 있으며 그 중 일부는 유독 할 수 있습니다. 사용 된 모든 물질에 대한 관련 화학 물질 안전 보건 자료를 검토하십시오.

1. 생물학적 시료 채집 및 채취

  1. 수확 튜브를 준비하십시오.
    참고 : 여기서, 생물학적 샘플을 라벨로 붙인 채로 채취합니다. 2 mL, 둥근 바닥, 안전한 위치k 미세 원심 분리 튜브는 조직 균질 기용으로 2 개의 5 mm 직경의 금속 볼을 포함하고 있습니다.
  2. 채워진 액체 질소 듀어를 준비하십시오.
  3. 생물학적 샘플을 채취하고 조직을 액체 질소로 급히 고정시킵니다. 상처로 인한 신진 대사 변화를 피하려면이 단계를 가능한 한 빨리 수행하십시오.
    참고 : 데모 목적으로 긴 하루 동안 토양에서 자란 30 일 된 야생형 Arabidopsis thaliana (Col-0)의 장미 잎을 사용하십시오.
  4. 수확 된 샘플을 드라이 아이스에 단기간 휴식을 위해 보관하거나 장기간 -80 ° C에 보관하십시오.

2. 연삭 및 조직 파괴

  1. 최소한 10 분 동안 액체 질소로 조직 호 모지 나이저의 튜브 홀더를 사전 냉각하십시오. 조직 균질 기가 없으면 깨끗하고 미리 냉각 된 모르타르와 유봉을 사용하십시오.
  2. 액체 질소, 드라이 아이스 또는 -80 ° C의 냉동고에서 샘플을 꺼내어 미리 냉각시킨 다음튜브 홀더.
  3. 튜브 홀더를 조직 균질기에 신속하게 넣습니다.
  4. 생물학적 물질을 미세하고 균일 한 분말로 분쇄하십시오. 나뭇잎을 위해 20 Hz를 1 분 동안 사용하십시오.
    노트; 균질화 시간과 속도는 조직에 따라 달라질 수 있으므로 샘플이 미세 분말로 균질화되었는지, 그리고이 분말이 균질화의 모든 단계에서 얼게 유지되는지 확인하십시오.
  5. 튜브 홀더에서 생물학적 샘플을 가져 와서 추가 추출까지 냉동 상태로 유지하십시오.

3. 조직의 무게 측정

  1. 필요한 샘플 양에 대해 충분한 정밀도를 가진 분석 저울을 사용하십시오.
  2. 라벨이 부착 된 2 mL 둥근 바닥 안전 잠금 마이크로 원심 분리 관을 준비하십시오.
  3. 튜브와 주걱을 액체 질소로 미리 냉각하십시오.
  4. 나누어 진 분획은 2 mL 안전 잠금 마이크로 원심 분리 관에 조직 분말의 필요한 양을 넣으십시오.
    주의 : w에 걸리는 시간을 최소화하여 식물 재료의 해동을 피하십시오.샘플을 보자.
  5. 액체 질소를 계량 한 직후에 나누어 진 샘플을 돌려 보내십시오.
  6. 정확한 무게를 각 샘플에 기록하십시오. 대부분의 식물 조직에는 10-50 mg ± 10 %를 사용하십시오.
  7. 추가 추출 때까지 -80 ° C에서 aliquoted 샘플을 저장하십시오.

4. 시약 설정

  1. 메틸 tert- 부틸 에테르 (MTBE) / 메탄올 (MeOH)의 추출 혼합물을 사용하십시오.
    1. 100 mL 추출 용매를 제조하기 위해 75 mL의 MTBE를 25 mL의 MeOH에 첨가하여 MTBE : MeOH (3 : 1, vol / vol)의 혼합물을 만든다.
    2. 분석 요구에 따라 사후 분석 정규화를위한 내부 표준을 추가합니다. 일반적으로 UPLC-MS 기반의 지질 분석을위한 내부 표준으로 1,2-diheptadecanoyl- sn -glycero-3-phosphocholine (클로로포름 중 1 mg / mL) 50 μL를 첨가하면서 50 μL의 13 C 소르비톨 ( 1 mg / mL 수용액)을 GC-MS에 기초한 1 차대사 산물. UPLC-MS 기반 대사 산물 분석에 대한 내부 표준은 코르티 코스 테론 (메탄올에서 1 mg / mL) 50 μL와 암피실린 (메탄올에서 1 mg / mL) 25 μL입니다.
    3. 용매를 깨끗한 유리 병에 옮기고 MTBE : MeOH 혼합물로 헹구십시오.
    4. 4 ℃에서 1 주일 동안 추출 혼합물을 보관하십시오.
      참고 : 재현성있는 결과를 유지하기 위해 추출 혼합물을 더 오랫동안 보관하지 마십시오.
  2. 상 분리를 유도하기 위해 물 (H2O) / 메탄올 (MeOH)을 사용하십시오.
    1. 100 mL H 2 O : MeOH의 제조를 위해 H 2 O 75 mL를 MeOH 25 mL에 넣고 H 2 O : MeOH (3 : 1, vol / vol)로 만든다.
    2. H 2 O : MeOH 혼합물로 씻어서 깨끗한 유리 병에 용매를 옮기십시오. 이 용매는 실온에서 몇 주 동안 보관할 수 있습니다.

5. 샘플 추출

  1. 사전 추출 m액체 냉각 시스템 또는 -20 ° C 냉동고를 사용하여 -20 ° C로 냉각시킵니다 (MTBE : MeOH, 3 : 1, vol / vol).
  2. aliquoted 샘플을 하나씩 꺼내어 미리 냉각 된 추출 혼합물 1 mL를 각 샘플 튜브에 첨가하십시오. 주의 : MTBE의 점도가 낮기 때문에이 단계를 빨리 수행하십시오.
  3. 조직이 추출 혼합물 내에서 잘 균질해질 때까지 와동 믹서에서 즉시 혼합한다.
    참고 :이 단계는 단백질을 침전시키고 효소 활성을 비활성화시키기 때문에 매우 중요합니다.
  4. 4 ° C에서 45 분 동안 100 rpm으로 궤도 진탕 기에서 모든 샘플을 배양합니다.
  5. 얼음 냉각 된 초음파 처리 욕조에서 15 분 동안 시료를 초음파 처리하십시오.

6. 상분리에 의한 분별

  1. 각 샘플 튜브에 H 2 O : MeOH (3 : 1, vol / vol) 650 μL를 첨가한다.
  2. 1 분 동안 vortexing하여 잘 혼합한다.
  3. 4 ° C에서 5 분 동안 20,000 x g 의 속도로 시료를 원심 분리하십시오.
    참고 :이 단계가 끝나면 튜브 바닥에 단단한 펠렛이있는 두 개의 혼합 할 수없는 액상이 생깁니다.
    주의 : 두 액상의 혼합을 피하고 침전 된 펠릿을 방해하지 않도록 조심스럽게 튜브를 다루십시오.

7. 극성 및 소수성 분획의 분취

  1. 상단의 지질 함유 상으로부터 1.5 mL의 미세 원심 분리 튜브에 용매 500 μL를 옮긴다.
    참고 : aliquoted 지질 샘플은 즉각적인 UPLC - MS 분석 (단계 8.1)에 직접 집중하거나 -80 ° C에서 몇 주 동안 저장할 수 있습니다.
  2. 500 μL가 샘플에서 제거되면 200 μL 피펫을 사용하여 나머지 지질 상을 제거합니다.
  3. 하위 단계 (극성 및 반 극성 대사 산물)에서 용매의 400 μL를 라벨 1.5 ML microcentrifuge 튜브로 옮기십시오. 분취 된 극성 샘플을 즉시 UPLC-MS 분석을 위해 농축하거나 (8.2 단계), 또는 fo-80 ° C에서 몇 주.
  4. 추가 분석을 수행하기 위해 200 μL를 추가로 취하십시오 (예 : 가스 크로마토 그래피 기반 대사 산물 분석 ) .
  5. 여분의 볼륨을 pipetting하여 수성 단계의 나머지 부분을 제거합니다.
  6. 얻은 단백질, 녹말, 세포벽 펠렛을 500 μL의 메탄올로 씻고 1 분간 완전히 흘려 보냅니다.
  7. 4 ° C에서 5 분 동안 10,000 x g 의 속도로 샘플을 원심 분리하십시오.
  8. 이전에 설명한 바와 같이 단백질 추출 및 소화 (단계 11) 또는 전분 / 세포벽 분석을 수행하십시오.
    참고 : 즉시 활용하지 않으면이 펠릿을 -80 ° C에서 몇 주 동안 보관할 수 있습니다.

8. 분수의 농도와 저장

  1. 가열하지 않고 (1 ~ 2 시간 동안) 진공 농축기에서 용매를 추출하거나 (단계 7.1의) 지질 샘플로부터 용매를 증발 시키거나 바람직하게는 질산염ogen 유동 증발기는 지질의 산화 적 변형을 피한다.
    참고 : 말린 샘플은 즉시 분석해야합니다. 보관을 위해 MTBE 용액에 유리 바이알에 시료를 두십시오 (단계 7.1).
  2. 가열하지 않고 진공 농축기에서 수성 샘플 (단계 7.3 또는 7.4)의 용매를 밤새 증발시킨다. 참고 : 말린 샘플은 분석하기 전에 -80 ° C에서 몇 주 동안 보관할 수 있습니다.

9. UPLC-MS를 이용한 지질 분석 24

  1. 아세토 니트릴 : 2- 프로판올 (7 : 3, vol / vol) 400 μL에서 말린 지질 분획 (단계 8.1로부터)을 재현 탁시킨다.
  2. 유리 병에 충분한 액체를 옮기고 밀폐하십시오.
  3. 유리 바이알을 냉각 된 오토 샘플러 (4 ° C)에 넣으십시오.
  4. 시료 당 2 μL를 주입하고 유속 400 μL / min에서 작동하는 UPLC 시스템을 사용하여 60 ° C에 보관 된 Reversed Phase (RP) C 8 컬럼에서 지질을 분리합니다.
  5. 모바일 사용상을 크로마토 그래피 분리를 위해 표 1 에 기재 하였다.
  6. 150 ~ 1,500 m / z의 질량 범위를 커버하는 적절한 MS 장비를 사용하여 양이온 및 음이온 모드에서 질량 스펙트럼을 얻습니다.

10. UPLC-MS를 이용한 극성 및 반 극성 대사 산물의 분석 25 .

  1. UPLC 등급 메탄올 : 물 (1 : 1, vol / vol) 200 μL에서 극성 단계 (8.2 단계)를 재현 탁합니다.
  2. 유리 병에 충분한 액체를 옮기고 밀폐하십시오.
  3. 유리 바이알을 냉각 된 오토 샘플러 (4 ° C)에 넣으십시오.
  4. 각 샘플에서 2 μL를 주입하고 400 μL / min의 유속으로 작동하는 UPLC 시스템을 사용하여 40 ° C에서 유지되는 RP C 18 컬럼에서 대사 산물을 분리합니다.
  5. 표 2에 주어진 매개 변수로 크로마토 그래피 분리를 위해 이동상을 사용하십시오.
  6. 양이온 및 음이온 모드에서 전체 스캔 질량 스펙트럼 획득질량 범위가 50 ~ 1,500 m / z 인 적절한 질량 분석기를 사용하십시오.

11. 단백질 추출, 분해 및 분석 16

  1. 선택의 단백질 추출 버퍼 200 μL에서 씻어 단백질 / 전분 / 세포 벽 펠렛 (단계 7.8에서)을 다시 일시 중지합니다. 참고 : 우리는 우레아 / thiourea 버퍼 (5 M 우레아, 2 MM thiourea, 15 MM DTT, 2 % CHAPS 및 프로 테아 제 및 포스파타제 억제제) 27을 사용 합니다.
  2. 얼음 냉각 된 음탕에서 10 분 동안 시료를 초음파 처리하십시오.
  3. 실온에서 궤도 진탕 기 (100 rpm)로 30 분 동안 표본을 품어 낸다.
  4. 용해 된 단백질을 10,000 x g 에서 5 분간 원심 분리하십시오.
  5. 새 튜브에 단백질 뜨는을 수집합니다.
  6. 수집 된 상등액 28 에서 단백질 농도를 결정하십시오.
  7. 선택한 프로토콜로 용액 내 50 μg의 단백질을 분해하십시오. 일반적으로 Trypsin / Lys-C mix accordi사용 설명서를 읽으십시오.
  8. 소화 후, C 18 단계 도움말을 사용하여 질량 분광법 전에 펩타이드의 탈염을 수행하고 소화 된 펩티드 29를 용리하십시오.
  9. 가열하지 않고 진공 농축기에서 시료를 거의 건조하게 농축합니다.
  10. 적절한 로딩 버퍼 (예 : 5 % 아세토 니트릴, 0.5 % 포름산)에 샘플을 재현 탁하고 나노 LC 시스템에 연결된 고해상도 질량 분석기를 사용하여 LC-MS / MS로 펩타이드 혼합물을 분석합니다.
    참고 :이 프로토콜에 제시된 예시적인 프로테오믹스 데이터 세트에서 표 3 에 설명 된 바와 같이 그라디언트를 사용했습니다.
  11. 한 번의 전체 스캔 (FS) 다음에 15 개의 데이터 종속 MS / MS 스캔이 이어지는 상위 15 개 전략을 사용하여 질량 분석기를 다음 매개 변수에 설정합니다. FS는 200-2,000m / z 범위의 질량 범위에있었습니다. 3x10 6 이온의 목표 값으로 70,000의 분해능. 상위 엔트리별로 데이터 종속적 인 MS / MS 스캔을 얻는다.rgy 충돌 해리 (HCD). 최대 이온 주입 시간 50ms, 절연 윈도우 4.0m / z, 정규화 된 충돌 에너지 (NCE) 30 % 및 언더필 비율 1 %로 MS / MS의 목표 값을 1e 5 이온으로 설정하십시오. 해상도 17.500에서 MS / MS 이온을 측정하고 역동적 인 배제는 60 초로 설정합니다.

Representative Results

포괄적 인 다중 오믹 데이터 세트는 복잡한 생물 시스템을 이해하는 데 매우 중요합니다. 성공적인 생물학적 실험을위한 전략은 일반적으로 의미있는 실험 설계, 실험 설정 및 성능, 샘플 수집, 추출, 분석 데이터 수집, 원시 데이터 처리, 통계 데이터 분석, 관련 대사 산물 및 생물학적 데이터 해석 경로 매핑 및 시각화를 포함하여 ( 그림 1 ).

여기에 소개 된 추출 프로토콜에서 샘플 수집, 처리 및 추출 단계에 중점을 둡니다 ( 그림 2 의 자세한 워크 플로 개요 참조) . 데모 목적으로, 50 mg의 Arabidopsis 잎 조직을 선택했다. 이 물질을 수확하여 분쇄하고 추출한 후 3표적 지향 및 비 표적화 된 지질, 대사 및 단백질 분석에 활용할 수있는 데이터를 제공하는 대표적인 분석 UPLC-MS 플랫폼입니다. 그림 26 에는 표준 조건에서 추출 용매가 어떻게 보일 것인가에 대한 대표적인 그림이 추가로 포함되어 있습니다. 또한, 과도한 양의 침전 된 거대 분자 (단백질 및 전분)를 함유하는 샘플 및 부적절한 샘플 균질화를 갖는 샘플의 예가 도시되어있다 ( 도 3 ). 이 두 가지 일반적인 문제에 대한 문제 해결은 그림 3 에 간략히 설명되어 있지만 이전 발행물 16 에서도 자세히 설명합니다.

그림 45 는 지질에서 유래 한 세 가지 분석 크로마토 그램의 예를 보여줍니다. polar / semi-polar 대사 산물 및 단백질 분석. 상위 MTBE 단계 ( 그림 2 )에서 추출한 지질을 고해상도 질량 분석기와 결합 된 역상 (RP) C 8 초 고성능 액체 크로마토 그래피로 분석했습니다. 지질은 양성 및 음성 MS 이온화 모드 ( 그림 4 , 상부 창) 16 , 24 를 사용하여 얻을 수 있습니다.

극성 및 반 극성 1 차 및 2 차 대사 산물을 역상 (RP) C 18 UPLC-MS 25 에 의해 극성 (물 / 메탄올) 상 ( 그림 2 )에서 분석했습니다. 역상 크로마토 그래피를 사용하는 예시 된 방법은 반 극성 대사 산물 (즉, 식물 이차 대사 산물의 대사 산물)의 분석에 매우 적합하며, 이는 MS에서 양이온 및 음이온 모드를 사용하여 분석 될 수있다( 그림 4 , 하단 창) 16 . 역 분상 물질에서 우수한 보유력을 나타내지 않는이 분획 (당, 극성 아미노산 등)의보다 친수성 인 대사 산물은 GC-MS 16 또는 친수성 상호 작용 액체 크로마토 그래피 30 과 같은 다른 분석 방법으로 분석 할 수 있습니다.

추출 튜브의 바닥에있는 고체 펠릿 ( 그림 2 )에서 추출 된 단백질은 용액 내에서 소화되었고, 총 (gun) LC-MS를 사용하여 분석되었다 ( 그림 5 ). 반면 전분 및 세포벽 추출 프로토콜 자료는 이전에 출판 된 프로토콜 16 에서 얻을 수 있습니다.

요약하면, 200 개 이상의 지질 종, 50 개의 주석 된 반 극성 대사 산물 및 수천 개의 proteins는 우리 예제에서 사용 된 유형의 샘플로부터 일상적으로 식별 될 수 있습니다. 또한이 방법은 다양한 조직, 기관 및 세포 배양 물질을 사용하여 폭 넓은 적용 가능성을 보였다 ( 그림 6 ).

그림 1
그림 1 : 대규모 비 표적 오믹 분석을위한 일반적인 워크 플로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : 생물학적 시료의 단일 분취 량으로부터의 지질, 대사 물질 및 단백질의 분석을위한 시료 준비 및 추출 워크 플로우.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : 2 상 파티셔닝 추출 프로토콜을 사용하여 일반적으로 관찰 된 문제의 예 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
도표 4 : Arabidopsis thaliana 잎 추출물 에서 지질과 반 극지 대사 산물의 대표적인 크로마토 그램 . 염기 피크 크로마토 그램(상부 창) 및 반 극성 대사 산물 (하부 창)을 양이온 화 모드로 분석 하였다. 각 크로마토 그램의 오른쪽 상단 구석에있는 파이 차트는 서로 다른 화학 등급에 지정된 확인 된 지질과 대사 물의 수를 보여줍니다. Chl, 클로로필; DAG, 디아 실 글리세 라이드; DGDG, 디갈 락토스 디아 실 글리세롤; FA, 지방산; LysoPC, 리소 포스파티딜콜린; MGDG, 모노 갈 락토 실디 알릴 글리세롤; PC, 포스파티딜콜린; PE, 포스파티딜 에탄올 아민; PG, 포스파티딜 글리세롤; PI, 포스파티딜 이노시톨; PS, 포스파티딜 세린; SP, 스핑 고지 질; SQDG, 설 포노보실 디아 릴 글리세롤; TAG, 트리 아실 글리세 라이드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 5 trong> : Arabidopsis thaliana 잎 추출물 의 펩티드의 대표 피크 피크 크로마토 그램 .
오른쪽 상단 모서리에있는 원형 차트는 다른 생물학적 과정에 할당 된 확인 된 단백질의 수를 나타냅니다 16 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6
그림 6 : 야생 형 Arabidopsis thaliana 의 다양한 조직 유형의 대표적인 추출 예
모든 샘플은 표시된 조직으로부터 50 mg의 신선한 무게를 사용하여 추출 하였다.">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

<td> 19.50 내지 19.51 분
시간 (분) 버퍼 A에서 버퍼 B까지
0 ~ 1 분 45 % A 완충액 A : 1 % 1M NH4- 아세테이트, 0.1 % 아세트산, UPLC MS 등급 물
1 ~ 4 분 45 % A에서 25 % A까지의 선형 그래디언트 완충액 B : 아세토 니트릴 / 이소프로판올 7 : 3 중 0.1 % 아세트산, 1 % 1M NH4- 아세테이트, (v : v)
4 ~ 12 분 25 % A에서 11 % A까지의 선형 그래디언트 유속 400 μL / min
12 ~ 15 분 11 % A에서 0 % A까지의 선형 그래디언트 주입량 2 μL
15 ~ 19.5 분 0 % A로 4.5 분 동안 칼럼을 세척한다.
45 % A로 다시 설정
19.51 ~ 24 분 45 % A로 평형을 이룬다.

표 1 : RP-UPLC의 지질 분리를위한 기울기 파라미터. RP, 역상. UPLC, 초 고성능 액체 크로마토 그래피.

시간 (분) 버퍼 A에서 버퍼 B까지
0 ~ 1 분 99 % A 완충액 A : UPLC 등급 물의 0.1 % 포름산
1 분에서 11 분 99 % A에서 60 % A까지의 선형 그래디언트 완충액 B : UPLC 중 아세토 니트릴 중 0.1 % 포름산
11 ~ 13 분 60 % A에서 30 % A까지의 선형 그래디언트 유속 4001; L / 분
13 ~ 15 분 30 % A에서 1 % A까지의 선형 그래디언트 주입량 2 μL
15 ~ 16 분 칼럼을 1 % A
16 ~ 17 분 1 % A에서 99 % A까지의 선형 그래디언트
17 ~ 20 분 99 % A에서 3 분간 평형

표 2 : 극성 및 반 극성 대사 물질의 RP-UPLC 분리를위한 기울기 파라미터. RP, 역상. UPLC, 초 고성능 액체 크로마토 그래피.

시간 (분) 버퍼 B에서 버퍼 A까지 %
0 ~ 5 분 선형 그래디언트 0에서 10 % 완충액 A : UPLC 등급 물의 0.1 % 포름산
5 ~ 80 분 10 %에서 40 %까지의 선형 그래디언트 완충액 B : 60 % UPLC 등급 아세토 니트릴 중 0.1 % 포름산
80 ~ 85 분 40 %에서 60 %까지의 선형 그래디언트 유속 300 nL / min
85 ~ 86 분 60 %에서 95 %까지의 선형 그래디언트 주입량 5 μL
86 ~ 91 분 95 % 칼럼으로 5 분 동안 칼럼을 세척하고,
91 ~ 92 분 95 %에서 0 %까지의 선형 그래디언트
93 ~ 110 분 0 %에서 17 분 동안 컬럼을 평형시킨다.

표 3 : 펩타이드의 나노 -LC 분리를위한 기울기 파라미터. LC, 액체 크로마토 그래피.

Discussion

이 기사에서는 단일 50mg 잎 샘플에서 포괄적 인 지질 대사, 대사 및 단백질 분석을위한 간단하고 고도로 적용 가능한 추출 프로토콜을 설명하고 설명합니다. 이 방법은 여러 연구에서 이미 사용되어 왔으며, 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 그것의 똑 바른 앞으로뿐만 아니라 증명 된워크 플로우 및 높은 적용 성이 강력하고 재현 가능해야합니다.

여기 제공된 응용 프로그램은 복잡한 생물학적 샘플의 초기 스크리닝을위한 몇 가지 일상적인 방법을 보여줍니다. 이러한 설명 된 대용량 대사 체 및 지질 데이터 세트는 분석 된 생물학적 시스템의 신진 대사에서 광범위하거나 특이적인 변화에 대한 포괄적 인 정보를 제공 할 수 있지만 단백질 분석에서 얻은 데이터는 정량적 (풍부 성) 및 정성적인 (수정 ) 세포 기능과 기계를 제어하는 ​​효소, 구조 단백질 또는 전사 인자 (TFs)의 변화. 따라서, 통합 오믹 데이터는 특정 대사 경로 또는 세포 과정과 관련된 다양한 분자의 분자 변화를 밝혀줌으로써 생체 시스템의 유전 적 또는 생물 적 및 / 또는 비 생물 적 섭동에 의해 유도 된 가능한 변화에 대한 초기 정보를 나타낼 잠재 성을 가지고있다.

당연하지장기적으로는 성공적인 시스템 생물학 분석을 위해 분석되고 주석이 달린 분자 실체의 수를 최대화하여 세포 기능과 활동을 가능한 완벽하게 모니터링하는 것이 매우 중요합니다. 이러한 목적으로 얻어진 분획은 추가의 화합물 또는 화합물 군을 표적으로하는 다양한 분석 방법에 추가적으로 적용될 수있다 ( 도 4 ).

이를 말해서, 획득 된 데이터의 글로벌 분석 전략은 두 가지 전략에 따라 수행 될 수있다 : 한편으로, 우리는 알려진 화합물의 정량화에 의한 세포 기능의 해명을 강조하고있다. 다른 한편, 측정 된 대사 산물 및 지질 중 많은 것은 아직 알려지지 않았거나 주석이 달려 있지 않습니다. 아직 주석이 달려 있지 않은 화합물 측정에는 의미있는 정보가 많이 포함되어있어 분류 또는 차별을위한 통계적 방법으로 활용할 수 있습니다. b그룹 또는 치료 사이 20 , 21 , 22 .

여전히 이러한 미지 화합물, 특히 그룹 분류 또는 바이오 마커 역할을하는 화합물은 확인해야합니다. 이 확인 절차는 불행히도 지루하고 추가적인 분석 측정이나 전략 없이는 달성 할 수 없습니다. 그림 4 에서 볼 수 있듯이, 주석이 달린 화합물의 수는 상당히 많습니다 (사실 대다수). 그럼에도 불구하고, 전술 한 바와 같이, 이들 크로마토 그래피 피크는 데이터 분석 내에서 처리 될 수 있으므로, 영향을받는 개체는 설명 될 수 있고 추가 식별 전략의 대상이된다.

요약하면, 우리는 여기서 소개 된 프로토콜이 실험적 시스템 생물학뿐만 아니라 고전적 통계 응용을위한 몇 가지 이점을 제공한다고 결론 지을 수있다ations.

첫째, 모든 분획물이 단일 샘플로부터 추출되기 때문에, 모든 데이터 세트가 동일한 샘플 분취 량으로부터 유도되기 때문에 상이한 실험 데이터 세트 (지질, 대사 물, 단백질) 사이의 편차가 현저하게 감소된다. 이것은 분명히 얻어진 결과의 비교 가능성을 증가시킨다.

둘째,이 방법은 쉽게 확장 가능하며 따라서 작은 샘플에서 많은 샘플까지 호환이 가능합니다. 우리는 일상적으로 조직 샘플 10-100mg을 사용하지만, 성공적으로 지질 연구를 수행 한 결과 Arabidopsis 종자는 20 개 정도로 적습니다. 특히 적은 양의 시료와의 상용 성은 제한된 양의 생물학적 조직이나 시료를 사용할 수있는 경우이 방법을 적용 할 수 있습니다. 여전히 충분한 샘플 물질이 이용 가능하다 할지라도, 여기에 제시된 방법은 u 대신에 많은 수의 실험 복제물에서 이들 샘플을 활용하는 이점을 제공한다다른 추출 절차를 위해 그들을 노래하십시오. 이를 통해 더 우수하고 세련된 통계 데이터 분석이 가능합니다.

셋째,이 방법은 극성 및 비극성 분자의 액체 - 액체 분획 화에 기초하고 있기 때문에, 단순한 단상 추출 방법 ( 예 : 메탄올 추출)과는 대조적으로, 절차에서 상당한 탈 복합체 형성 단계를 제공한다. 이러한 효율적인 샘플 탈 복합체 화는 서로 화학적으로 간섭하는 분자의 분리로 인해 개별 분획물을 부분적으로 정제하게됩니다. 따라서, 화학적 파티셔닝 프로세스는 추출 된 샘플을 상이한 화학적 부류로 체계적으로 등분 할 때 실질적인 이점을 제공 할뿐만 아니라 상이한 분획으로부터 오염 된 화합물을 제거하기 때문에 개별적인 분석적인 측정치를 향상시킨다. 분명히, 우리는 특히 지질 (organic phase)으로 분열되고 지질에 부정적인 영향을 미치는 지질을 관찰 할 수있다.극성 화합물의 크로마토 그래피 분석은 극성 분획으로부터 거의 완전히 제거 될 것이다. 극성 화합물이 고갈되는 소수성 지질의 분석에서도 마찬가지입니다. 극성 및 비극성 화합물을 서로 정화하는 것 외에도 단백질과 전분 및 세포벽 분석에 활용할 수있는 별도의 분획을 제공 할뿐만 아니라 시료에서 단백질 및 기타 거시 분자를 고갈시키고 수집합니다 개별 분획물 내에서보다 깨끗한 시료로 이어진다. 이것은 거대 거대 분자의 존재가 분석 컬럼의 손상 또는 적어도 더 짧은 수명으로 이어지는 것으로 알려져 있기 때문에 특히 적절하다.

마지막으로 중요하지는 않지만 덜 유해하고보다 유리한 클로로포름 대체 용매 15 에 의존하는 기술 된 MTBE 추출 방법은 이미 우리 그룹의 여러 연구에 의해 널리 응용 될 것으로 나타났습니다식물 16 , 조류 17 , 18 , 파리 19 다른 포유류 조직, 장기 또는 세포 20 , 21 , 22 에서 다른 생물 학적 샘플에 대한 적합성.

Disclosures

저자는 아무 것도 공개하지 않는다.

Acknowledgements

MS는 GERLS-DAAD 프로그램의 장학금으로 박사 학위를받습니다. 우리는 Andrew Wiszniewski 박사에게 원고에 대한 독서 및 논평에 감사드립니다. 그들의 도움을 받아 Max-Planck 분자 식물 생리학 연구소 (Golm, Germany)의 Giavalisco 연구소의 모든 구성원에게 매우 감사하고 있습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents and standards
Ampicillin  Sigma Aldrich A9393-5G Internal standard for metabolites
Corticosterone  Sigma Aldrich 27840-500MG Internal standard for metabolites, HPLC grade
13C Sorbitol Sigma Aldrich 605514 Internal standard for metabolites, ISOTEC® Stable Isotopes
1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC)  Avanti Polar Lipids 850360P Internal standard for lipids
Methanol (MeOH)  Biosolve Chemicals 13684102 ULC-MS grade
Water Biosolve Chemicals 23214102 ULC-MS grade
Methyl tert-butyl ether (MTBE)  Biosolve Chemicals 13890602 HPLC grade
Trypsin/Lys-C mix  Promega V5072 Enzymatic digestion of proteins
Equipment
Balance  Sartorius Corporation  14 557 572
Tissue grinding mixer mill  Retsch, Mixer Mill MM 300 20.746.0001
Mortar and pestle  Sigma Aldrich Z247464-1EA
Vortex mixer  Vortex-Genie 2, Model G560 SI-0236
Vacuum concentrator Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators 7.008.500.002
2 mL Safe-lock microcentrifuge tubes  Eppendorf 30120094 Used for sample extarction
1.5 mL Safe-lock microcentrifuge tubes  Eppendorf 30120086 Used for fractions
Shaker Eppendorf Thermomixer 5436 2050-100-05
Sonicator  USC 300 TH 142-0084
Refrigerated microcentrifuge Eppendorf, model 5427R 22620701
UPLC system  Waters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK)
 MS system  Exactive, Orbitrap-type, MS (Exactive, Thermo-Fisher, Bremen, Germany).
Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm × 2.1 mm containing 1.7 μm diameter particles) Waters, Machester, UK 186002878 Analysis of lipids
RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm × 2.1 mm containing 1.8 μm diameter particles)  Waters, Machester, UK 186003539 Analysis of metabolites
Q ExactivePlus high resolution mass spectrometer connected to an EASY-nLC 1000 system  Thermo-Fisher, Bremen, Germany Analysis of peptides

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References

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