Среднесрочная подготовка

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Цель этого протокола состоит в том, чтобы обеспечить простой и недорогой подход к сбору эмбрионов дрозофилы в среднем масштабе (0,5-1 г) и приготовлению белковых экстрактов, которые могут быть использованы в протеомических применениях ниже по течению, таких как масс-спектрометрия с аффинной очисткой (AP-MS ).

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Yang, L., Paul, S., DuBois-Coyne, S., Kyriakakis, P., Veraksa, A. Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments. J. Vis. Exp. (123), e55804, doi:10.3791/55804 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Анализ белково-белковых взаимодействий (ИЦП) стал незаменимым подходом к изучению биологических процессов и механизмов, таких как клеточная сигнализация, развитие организма и заболевание. Часто желательно получить информацию PPI, используя материал in vivo , чтобы получить наиболее естественное и непредвзятое представление о сетях взаимодействия. Плодовая мушка Drosophila melanogaster - отличная платформа для изучения ИЦП in vivo и поддается прямым подходам к изоляции материала для биохимических экспериментов. В частности, эмбрионы плодовой мушки представляют собой удобный тип ткани для изучения ИЦП, из-за легкости сбора животных на этой стадии развития и того факта, что большинство белков выражается в эмбриогенезе, тем самым обеспечивая соответствующую среду для выявления большинства ИЦП. Здесь мы представляем протокол для сбора эмбрионов дрозофилы в среднем масштабе (0,5-1 г), что является идеальным количеством для широкого спектраПротеомических приложений, включая анализ ИЦП методом аффинной очистки-масс-спектрометрии (АР-МС). Мы описываем наши конструкции для клеток 1 L и 5 L для коллекций эмбрионов, которые можно легко и недорого настроить в любой лаборатории. Мы также предоставляем общий протокол для сбора эмбрионов и экстракции белка для получения лизатов, которые могут быть непосредственно использованы в нисходящих приложениях, таких как AP-MS. Наша цель - предоставить доступным средствам для всех исследователей для проведения анализа ИЦП in vivo .

Introduction

Генетические экраны, а в последнее время геномные подходы коренным образом изменили изучение биологических функций. Однако важная клеточная информация кодируется в белках и их ансамбле взаимодействующих партнеров. В то время как традиционные экраны генетических модификаторов могут идентифицировать компоненты, ограничивающие скорость, и восстанавливать косвенные взаимодействия, сила протеомических подходов заключается в их способности идентифицировать полные сети немедленного взаимодействия интересующих белков. Таким образом, Proteomics является ценным ортогональным методом для изучения биологических систем и дополняет геномику, транскриптомику и традиционные генетические экраны. Эффективность аффинной очистки-масс-спектрометрии (AP-MS) оказалась мощным подходом к изучению белково-белковых взаимодействий (ИЦП) в их родной среде в клетках и тканях 1 , 2 . Этот метод позволяет идентифицировать прямые или косвенные взаимодействия при конкретном развитииАльфах или тканевых контекстах, и был успешно использован для идентификации нескольких новых ИЦП в различных вариантах развития (рассмотрен в ссылке 1 ). Несмотря на бесспорный успех исследований ИЦП, большинство из них было проведено в культивируемых клетках, в которых представляющие интерес белки «приманки» были сверхэкспрессированы. Существует два вопроса с изучением ИЦП в культуре клеток: во-первых, конкретная клеточная линия не может обеспечить полный набор взаимодействий из-за отсутствия экспрессии определенных белков. Во-вторых, высокая избыточная экспрессия, обычно используемая в таких анализах, может приводить к возникновению артефактов, таких как неправильное распределение белка или идентификация ложноположительных взаимодействий.

Оба этих ограничения можно преодолеть, проанализировав ИЦП in vivo . Ограничивающим этапом в таких экспериментах является доступность исходного материала для очистки белковых комплексов. Drosophila melanogaster уже давно используется в качестве модели для функционального анализаSis, и в последнее время также была продемонстрирована отличная система для изучения ИЦП in vivo . Эмбриогенез дрозофилы представляет собой особенно привлекательный тип ткани для изучения ИЦП, поскольку эмбрионы можно легко собирать в больших количествах, а также потому, что большинство генов (> 88%) экспрессируются в течение эмбриогенеза, тем самым обеспечивая богатую среду in vivo для выявления соответствующих ИЦП 3 .

Традиционно в биохимических исследованиях у мух использовались очень крупномасштабные коллекции эмбрионов (100-150 г), такие как необходимые для очистки функциональных транскрипционных лизатов 4 , 5 . Предыдущие исследования AP-MS у Drosophila также нуждались в большом количестве эмбрионов (5-10 г), поскольку они полагались на двухступенчатый подход к очистке, такой как тандемная аффинная очистка (TAP), с соответствующей потерей материала на каждой стадии 6 . Большой amounTs исходного материала потребовало создания коллекций эмбрионов в больших популяционных клетках, которые могут быть как дорогостоящими (при покупке на коммерческой основе), так и трудоемкими для поддержания и очистки 7 , 8 , 9 .

Недавние достижения в разработке одностадийных аффинно-очистных подходов, а также возрастающая чувствительность масс-спектрометров на порядок уменьшили необходимое количество исходного материала. Используя теги, такие как стрептавидинсвязывающий пептид (SBP) или зеленый флуоресцентный белок (GFP) и начиная с менее 1 г эмбрионов, можно выделить количества белка приманки и взаимодействующих компонентов, которые были бы достаточны для идентификации посредством Масс-спектрометрия 10 , 11 .

Цель представленного здесь протокола - помочь исследователям overcoЯ воспринимаю барьер для биохимического анализа ИЦП in vivo . С этой целью мы предлагаем простую и недорогую процедуру для сбора эмбрионов дрозофилы в среднем масштабе (0,5-1 г) с последующим одностадийным приготовлением цельноклеточных белковых экстрактов, которые пригодны для последующего анализа с помощью AP-MS или других подходов , Наш метод основан на использовании специально изготовленных 1-L или 5-L популяционных клеток, которые могут быть легко получены любой лабораторией. Кроме того, условия экстракции, представленные здесь, были подтверждены в нескольких исследованиях как в культивируемых клетках, так и in vivo 10 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Приготовление 5-литровых мух (для подгонки 15 см)

  1. Получите необходимые материалы: контейнер 5-кварт (4.7-L) с крышкой ( рис. 1А ), нейлоновая сетка и лезвие бритвы.
  2. Отметьте круг диаметром 12 см и вырежьте отверстие в нижней части контейнера с помощью лезвия бритвы ( рисунок 1B ). Отрежьте отверстие диаметром 15 см в крышке ( рис. 1С ).
  3. Вырезать сетку из нейлона в квадраты размером 25 х 25 см.
  4. Поместите сетку поверх верхнего края контейнера и надавите на крышку крышкой ( рис. 1C ). Убедитесь, что сетка плотная, и крышка не наклонена. Клетка готова к заселению мухами (см. Шаг 5.3).

2. Приготовление 1 л мух (для установки 10 см пластин)

  1. Получите необходимые материалы: электрическую дрель, режущий инструмент диаметром 3 дюйма (76 мм) ( рис. 1Е и F1F), односторонняя пластиковая банка емкостью 1 л с крышкой, нейлоновой сеткой, лезвием для бритвы, наждачной бумагой, защитными очками и рабочими перчатками.
  2. Отрежьте 3 дюйма (76 мм) отверстия в нижней части и крышку пластиковой банки ( рис. 1G ), при этом крышка плотно прикручивается к контейнеру во время сверления. Поместите режущий инструмент в центр круга, когда начинаете делать отверстие.
    Внимание: На этом этапе надевайте защитные очки и рабочие перчатки.
  3. Сгладьте края отверстий бритвенным лезвием и наждачной бумагой.
  4. Вырезать сетку из нейлона в квадраты 18 x 18 см.
  5. Поместите сетку поверх верхнего края банки и затяните, завинтив крышку ( рисунок 1G ). Убедитесь, что сетка плотная, и крышка не наклонена. Клетка готова к заселению мухами (см. Шаг 5.3).

3. Подготовка планшета Apple Juice (AJ)

  1. Добавить 19 г агара и 1 л воды 18,2 МОм · см в колбу объемом 2 л.Добавьте мешалку и слегка смешайте.
  2. Автоклав в течение 30 мин. Между тем, 100% яблочный сок оттаивают из замороженного материала и готовят 10 мл 10% (вес / объем) метил-4-гидроксибензоата в этаноле.
  3. После автоклавирования начните смешивать агар на мешалке и добавьте 80 мл 100% концентрата яблочного сока и 10 мл 10% (вес / объем) раствора метил-4-гидроксибензоата в колбу. Дайте остыть при комнатной температуре с постоянным перемешиванием.
  4. Налейте 15 см чашки Петри (для клеток 5 л) или 10 см чашки Петри (для 1 л клеток), чтобы уровень агара в каждом блюде составлял приблизительно 5 мм. Дайте застыть при комнатной температуре и оберните полиэтиленовые пакеты. Пластины AJ можно хранить при 4 ° C в течение двух недель.
    Примечание: чашки Петри можно мыть и использовать повторно.
  5. Подготовьте влажную дрожжевую пасту: залейте некоторые активные сухие дрожжи в контейнер объемом 100 мл с крышкой, которая позволит легко перемешать, и добавьте воду в небольших количествах при перемешивании, чтобы получить толстую, но тщательно смешаннуювставить. Хранить при температуре 4 ° C в течение 2 недель.

4. Получение реагентов лизиса

  1. Приготовить 5х лизисный буфер: 250 мМ Трис, pH 7,5, 25% глицерина, 1% октилфеноксиполи (этиленокси) этанола (IGEPAL CA-630), 7,5 мМ MgCl 2 , 625 мМ NaCl, 125 мМ NaF, 5 мМ Na 3 VO 4 .
    1. Сделать 200 мл: полностью растворить 1 г порошка NaF и 184 мг Na 3 VO 4 порошка в 71 мл воды с постоянным перемешиванием. Добавить 50 мл 1 М Tris pH 7,5, 2 мл 100% IGEPAL, 1,5 мл 1 M MgCl 2 и 25 мл 5 М NaCl. Затем добавьте 50 мл глицерина (добавьте последний) и продолжайте перемешивание в течение 1 часа.
    2. Стерилизацию фильтром с использованием фильтров на 250 мл. Этот шаг может быть медленным, но фильтрация раствора важна для удаления нерастворимых частиц. Аликвоту по 10 мл в 50 мл пробирках и хранить при -80 ° С.
  2. Подготовьте раствор 1 M дитиотреитола (DTT) в воде. Хранить при -20 ° C в аликвотах по 1 мл.
  3. Получите протеинТаблеток для коктейлей с ингибиторами ангиотензина, с этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА). Хранить при температуре 4 ° C.
  4. Получите 10 мл шприцев и шприцевых фильтров: диаметр 26 мм, мембрану ацетата целлюлозы без поверхностно-активного вещества (SFCA), размер пор 0,45 мкм.

5. Коллекция летающих эмбрионов

  1. Усильте трансгенные линии мух, несущих меченый белок, который интересует бутылки (приблизительно 100 мух на бутылку), и переносите бутылки каждые 2 дня, пока не будет накоплено 25-30 бутылок для каждой линии мух. Упростите контрольный запас ( например , линию yw ) аналогичным образом.
  2. Теплая плита AJ до комнатной температуры (около 1-2 ч, может быть выполнена в течение ночи). Используя перчаточный палец, разложите влажную дрожжевую пасту в центре пластин AJ, чтобы сделать ок. 6-сантиметровый круг для 15-сантиметровой пластины и круг 4 см для пластины диаметром 10 см.
  3. Анестезируйте мух с потоком двуокиси углерода, используя стандартную установку стадии Drosophila , и переведите в(Около 15 хорошо выращенных бутылок мух на клетку 5 л, 5 бутылок на 1 л клетку).
    1. Покройте нижнюю часть клетки подготовленными планшетами AJ с этапа 5.2 и наклейте пластину AJ на клетку двумя полосками ленты ( рис. 1D и 1H ). Полезно сгибать кончики ленты, которые проходят через пластину для легкого пилинга при замене тарелок.
    2. После того, как мухи оправятся от анестезии, держите клетки с пластинами внизу и сеткой сверху.
      Примечание. Важно подождать, пока мухи полностью не восстановятся, поскольку в противном случае они будут придерживаться пластины AJ и дрожжевой пасты.
    3. В конце эксперимента, чтобы подготовить клетку для очистки, поместите клетку в морозильник в течение нескольких часов. Замачивание сетки в воде в течение нескольких часов облегчит очистку.
  4. Инкубируйте клетки с мухами при комнатной температуре в течение 2-3 дней и меняйте пластины AJ два раза в день. Чтобы изменить пластины, поверните клетку вверх дном,Отделите ленту от тарелки, но приложите тарелку к клетке, аккуратно постучите по всей клетке на скамейку и быстро поменяйте старую пластину на новую, стараясь не позволить мухам бежать.
    Примечание: мухи должны приспосабливаться к клетке и лучше всего начинать с 3-го дня. Они будут продолжать укладываться на пиковый уровень в течение примерно 4-5 дней. Два 5-литровых клетки при максимальной укладке могут производить до 1 г эмбрионов в ночной коллекции. Используйте 1 L клетки для экспериментов меньшего масштаба.
  5. Позвольте мухам закладывать эмбрионы на свежие пластины AJ в течение ночи (около 16 часов) или в течение любого другого желаемого периода времени.
  6. На следующее утро отметьте и взвешивайте контейнеры с ячейками для сбора эмбрионов, по одному на каждую используемую линию мух.
  7. Подготовьте 1x лизисный буфер, используя реагенты из раздела 4 (Примечание: готовый к использованию 1x лизисный буфер должен быть приготовлен непосредственно перед экстракцией): добавить 40 мл воды в 10 мл 5-кратного концентрированного буфера для лизиса (хранится при -80 ° C) В трубке объемом 50 мл.
    1. Добавить 50 мкл 1 MDTT до конечной концентрации 1 мМ, хорошо перемешать и разделить на две пробирки объемом 50 мл по 25 мл в каждой. В одну из пробирок добавьте одну таблетку ингибитора протеазы и вращайте ее при 4 ° С в течение 30 мин. Пока таблетка растворяется, собирает и дехлорирует эмбрионы (шаги с 5.8 по 6.6). Убедитесь, что планшет полностью растворен, и держите буфер на льду.
      Примечание. Вторая трубка 1x буфера с DTT может храниться при -80 ° C и требует только добавления планшета перед следующим экспериментом. 25 мл буфера для лизиса достаточны для до 2 образцов с учетом последующих промывок на этапах очистки белков.
  8. Отметьте пластины AJ на клетках генотипами используемых линий мух и замените пластины на свежие.
    Примечание. Избыток дрожжевой пасты можно очистить от пластины на этом этапе. Эмбрионы можно выдерживать на планшетах при температуре 25 ° C или комнатной температуре, чтобы получить желаемое окно времени развития.
  9. Добавьте достаточное количество воды tO накройте каждую пластину AJ. Аккуратно выньте эмбрионы из пластины мягкой кистью (плоская головка шириной около 10 мм хорошо подходит для больших пластин). Вылейте эмбрионы в предварительно взвешенный и помеченный контейнер для ячеек и слейте лишнюю воду.
    1. При необходимости выполните второе полоскание и чистку пластины, чтобы удалить все эмбрионы. Объедините эмбрионы из дополнительной пластины (ов) для той же линии мух в один и тот же сетчатый контейнер.
  10. Кратко промокните сетку на бумажных полотенцах, чтобы удалить лишнюю воду.

6. Дехрионация эмбрионов

  1. Пополняйте чашку Петри 6 см с 50% -ным отбеливателем (объемный раствор в воде).
    Примечание. См. Важный комментарий о марке отбеливателя в Таблице материалов и реактивов.
    Осторожно: надевайте перчатки и избегайте отбеливания на одежде.
  2. Приготовьте 2 больших чашки Петри с водой.
  3. Погрузите сетчатый контейнер эмбрионами в 50% отбеливатель на 90 с. Плотно коснитесь сетки во время incuНесколько раз, чтобы приостановить эмбрионы в растворе отбеливателя.
  4. В конце 90-х годов инкубации промыть сетчатый контейнер в каждой из 2 блюд водой в течение примерно 10 с.
  5. Промойте сетчатый контейнер тщательно водой 18,2 МОм · см, используя бутылку для шприца. Кроме того, вымыть боковые стороны и снаружи сетчатого контейнера.
    Примечание: после тщательной мойки не следует обнаруживать запах отбеливателя.
  6. Помещают сетчатый контейнер на бумажные полотенца. Взвесьте сетчатый контейнер с эмбрионами и вычтите вес пустого контейнера, полученного на этапе 5.6. Запишите полученный вес эмбрионов. Хорошее количество эмбрионов для достижения составляет 0,5-1 г.

7. Получение экстракта эмбрионов

  1. Добавьте 1 мл буфера для лизиса ингибиторами протеазы (с шага 5.7) в гомогенизатор стеклянного стекла и держите его на льду. Перенесите эмбрионы из сетчатого контейнера в гомогенизатор.
    Примечание: Эмбрионы можно взять с плоским концом oFa металлический шпатель или кисть и передается непосредственно в буфер. Выполните все шаги в этом разделе на льду.
  2. Вымойте оставшиеся эмбрионы на сетке дополнительным 1 мл лизирующим буфером и добавьте материал в гомогенизатор. Пусть эмбрионы оседают на дно гомогенизатора и тщательно аспирируют супернатант.
  3. Добавьте буфер для лизиса с ингибиторами протеазы (из стадии 5.7) в гомогенизатор, нацелив на 5-6 мл буфера для лизиса на грамм эмбрионов.
  4. Гомогенизируйте эмбрионы на 4-6 ударов с помощью хомута.
    Примечание: во время первых ударов будет больше сопротивления. Старайтесь перемещать пестик в непрерывном движении, чтобы избежать разбрызгивания раствора.
  5. Гомогенизируйте эмбрионы на 8-10 ударов с помощью крепкого пестика.
  6. Инкубируйте гомогенат на льду в течение 20 мин.
  7. Перенесите гомогенат в микроцентрифужные пробирки и центрифугируйте при 4 ° C в течение 15 минут с максимальной скоростью (около 13000 xg).
  8. AvoidiГранулы и самый верхний липидный слой, переносят супернатанты в свежие микроцентрифужные пробирки и центрифугируют при 4 ° С в течение 15 мин с максимальной скоростью (около 13000 × г).
  9. Осторожно аспирируйте супернатанты с 1 мл наконечника и загрузите в охлажденные 10 мл шприцы с прикрепленными фильтрами 0,45 мкм (объедините аликвоты одного и того же образца в один шприц). Вставьте весь раствор в промаркированную пробирку объемом 15 мл на льду. Экстракт можно немедленно использовать для последующих экспериментов по очистке белков или замораживать в жидком азоте и выдерживать при -80 ° C для будущего использования.
    Примечание. Лучше замораживать экстракты, а не эмбрионы, потому что во время последующего таяния эмбрионов протеазы могут активироваться и приводить к деградации белка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Чтобы проиллюстрировать использование этого протокола в эксперименте по очистке белкового комплекса, мы создали гомозиготную жизнеспособную линию мух, arm-EGFP-ERK , экспрессирующую EGFP-меченную внеклеточную сигнальную киназу Drosophila (ERK, кодируемую прокатанным геном) под контролем Вездесуще выраженного промотора армадильо ( рука ) 18 , 19 . Промотор руки активен на большинстве стадий эмбриогенеза дрозофилы 19 . Лизаты получали с использованием описанного протокола, и экспрессия белка из трансгена GE EG -ERK была подтверждена вестерн-блоттингом для общего белка ERK для одновременного определения уровней эндогенного и трансгенного EGFP-ERK, мигрирующего при 42 кДа и 69 кДа , Соответственно ( рис. 2А ). Одна полоса, соответствующая немаркированному эндогенному ER K (42 кДа) был обнаружен в контрольной линии yw . Этот результат подтверждает успешное извлечение ERK и EGFP-ERK из эмбрионов.

Чтобы проверить, подходит ли наш протокол экстракции для последующей очистки меченого белка, экстракты мух yw и arm-EGFP-ERK подвергали аффинной очистке с использованием гранул GFP-агарозы в соответствии с установленными протоколами 10 , 11 . Серебристое окрашивание образцов, протекающих на градиенте SDS-PAGE, продемонстрировало успешную очистку белка приманки EGFP-ERK ( рисунок 2B ). Помимо EGFP-ERK, экспериментальная полоса содержала дополнительные полосы, которые не наблюдались в контрольном образце yw , что указывает на то, что процедура очистки восстанавливает потенциальные ERK-взаимодействующие белки.

"Src =" / files / ftp_upload / 55804 / 55804fig1.jpg "/>
Рисунок 1 : Подготовка клеток населения. ( A - D ) 5-L клетка из пластикового контейнера. ( A ) Стартовый контейнер. ( B ) Вид снизу клетки 5 L. ( C ) Вид сверху 5-литровой клетки с прикрепленной сеткой. ( D ) Собранная клетка 5 L с пластиной яблочного сока 15 см, вид снизу. ( E и F) 3-дюймовый (76 мм) сверло, используемое для сверления отверстий в контейнере емкостью 1 л. ( G , H ) A 1 L клетка. ( G ) Вид сверху 1-литровой клетки с прикрепленной сеткой. ( H ) Собранная клетка 1 L с прикрепленной пластиной яблочного сока 10 см, вид снизу. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2 : Экстракция и очистка EGFP-ERK от эмбрионов. ( А ) Вестерн-блоттинг, демонстрирующий экспрессию EGFP-ERK и эндогенной ERK в экстракте, полученном из трансгенной линии arm-EGFP-ERK . Линия yw использовалась в качестве контроля. Зеленый, общее ERK-антитело; Красный, маркер молекулярного веса. ( B ) Серебряный окрашенный гель, показывающий очищенный EGFP-ERK и связанные с ним белки. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Протокол, представленный здесь, представляет собой простую и общую процедуру для создания популяционных клеток дрозофилы в среднем масштабе и получения экстрактов белков цельной клетки из эмбрионов. Полученные экстракты могут быть использованы во множестве последующих приложений, таких как очистка белковых комплексов на аффинных смолах. Крайне важно выполнить стадии экстракции на льду и использовать сильное ингибирование протеазы, чтобы минимизировать деградацию белка. Как описано, протокол подходит для выделения большинства цитоплазматических и некоторых мембранных и растворимых ядерных белков 6 , 10 , 12 , 15 . Его можно легко адаптировать для более целенаправленной очистки белков из других отсеков, таких как выделение менее растворимых ядерных белков с использованием высокой экстракции соли 5 . Как указано на этапе 5.8, время сбора и периоды старения эмбрионов могут бытьУстанавливаются точными интервалами для получения различных этапов развития.

Часто желательно удостовериться, что меченый белок, представляющий интерес, экспрессируется на уровнях, близких к эндогенным уровням экспрессии, как мы показали, используя анти-общее ERK-антитело ( фиг. 2A ). Если антитело против эндогенного белка недоступно, функциональность конструкций может быть проверена другими анализами, например, в генетическом эксперименте по спасению. Однако в большинстве случаев мягкая избыточная экспрессия меченого белка должна по-прежнему приводить к изоляции значимых белковых комплексов и может фактически способствовать экстракции и очистке «сложных» белков.

Основным преимуществом этого протокола является его простота и возможность настроить всю процедуру с умеренной стоимостью. Дополнительным преимуществом использования меньших клеток является то, что множественные трансгенные линии могут быть установлены и проанализированы в паралеЛ, что может оказаться невозможным при использовании больших клеток. Мы можем описать здесь летающие клетки, которые можно легко очистить и использовать повторно. Вместо того, чтобы создавать 1-L клетки из банки Nalgene, как описано, можно использовать другие доступные контейнеры, такие как меньшая версия контейнера 5 л.

Мы успешно использовали этот протокол (или его вариации с небольшими модификациями) для очистки комплексов, содержащих различные сигнальные белки и связанные с ними компоненты, с последующим анализом с помощью масс-спектрометрии 6 , 10 , 15 . Эти подходы привели к выявлению новых ИЦП, которые были дополнительно подтверждены в функциональных исследованиях 10 , 15 . Вариации представленного здесь протокола ранее использовались для анализа фосфопротема в эмбриогенезе Дрозофилы 20 и изучения ландшафтаUbiquitination в нейронном развитии 21 , 22 . Таким образом, эта процедура представляет собой удобный шлюз для анализа ИЦП in vivo и может использоваться для других приложений протеомики.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

Авторы благодарят членов лаборатории Veraksa за полезные комментарии к рукописи и предложения по совершенствованию протокола. AV был поддержан грантами NIH GM105813 и NS096402. LY был поддержан Университетом штата Массачусетс Бостон Sanofi Genzyme Докторантура.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Container (Pack of 3) Home Depot 209330 For making 5-L cages.
Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Lid (Pack of 3) Home Depot 209320 Diameter 8.37 in. Lids for 5-L cages.
Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 100 x 15 mm Fisher Scientific FB0875712 Material: Polystyrene. To be used with 1-L cages.
Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 150 x 15 mm Fisher Scientific FB0875714 Material: Polystyrene. To be used with 5-L cages.
Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 60 x 15 mm Fisher Scientific FB0875713A Material: Polystyrene. Used during embryo dechorionation.
Sefar NITEX nylon mesh Sefar 03-180/44 180 micron, 44% open area, used for fly cages.
Milwaukee 3 in. Hole Dozer Hole Saw with Arbor Home Depot 49-56-9670 3 inch cutting tool for making 1-L cages.
Nalgene Wide-Mouth Straight-Sided PMP Jars with White Polypropylene Screw Closure Fisher Scientific 11-823-33 For making 1-L cages. Thermo Scientific cat # 21171000. Alternative 1-L containers can be used.
Red Star Active Dry Yeast, 2 pound pouch Red Star  can be purchased from Amazon.com or other suppliers.
Frozen 100% Apple Juice Concentrate  can be purchased from a grocery store. Has to say "100% apple juice" on the can.
Methyl 4-hydroxybenzoate Acros Organics AC126965000 also known as methylparaben or Tegosept. Used as a preservative in AJ plates.
IGEPAL CA-630 for molecular biology, 100 ml Sigma I8896 used for preparing lysis buffer.
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with CN Membrane  Fisher Scientific 09-740-2A 0.2 μm pore size. Used for filtering 5x lysis buffer. Thermo Scientific cat # 1260020.
CO-RO ROCHE cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Sigma 11697498001 Vial of 20 tablets. Used for protease inhibition in lysis buffer.
Corning SFCA syringe filters  Fisher Scientific 09-754-21 SFCA membrane, diameter 26 mm, pore size 0.45 μm. Used for filtering final extract samples.
BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles Fisher Scientific 14-823-2A for filtering final extract samples. BD cat # 309604.
Bleach Clorox used for embryo dechorionation at 50% (vol/vol) in water, can be purchased at any supermarket. It is important to use the Clorox brand, as other brands may result in incomplete dechorionation or may be toxic for embryos.
Corning Costar Netwell Plates Fisher Scientific 07-200-213 mesh containers for embryo collections. 74 μm mesh size, 6-well.
Wheaton Dounce Tissue Grinders, capacity 15 ml Fisher Scientific 06-435B homogenizer for embryos, with loose and tight pestles. Wheaton cat # 357544.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Veraksa, A. Regulation of developmental processes: insights from mass spectrometry-based proteomics. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, (5), 723-734 (2013).
  2. Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches. Curr Opin Biotechnol. 22, (1), 42-49 (2011).
  3. Arbeitman, M. N., et al. Gene expression during the life cycle of Drosophila melanogaster. Science. 297, (5590), 2270-2275 (2002).
  4. Soeller, W. C., Poole, S. J., Kornberg, T. In vitro transcription of the Drosophila engrailed gene. Genes Dev. 2, (1), 68-81 (1988).
  5. Kamakaka, R. T., Kadonaga, J. T. The soluble nuclear fraction, a highly efficient transcription extract from Drosophila embryos. Methods Cell Biol. 44, 225-235 (1994).
  6. Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. Tandem affinity purification in Drosophila: The advantages of the GS-TAP system. Fly (Austin). 2, (4), 229-235 (2008).
  7. Shaffer, C. D., Wuller, J. M., Elgin, S. C. Raising large quantities of Drosophila for biochemical experiments. Methods Cell Biol. 44, 99-108 (1994).
  8. Sisson, J. C. Culturing large populations of Drosophila for protein biochemistry. CSH Protoc. 2007, (2007).
  9. Caravaca, J. M., Lei, E. P. Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage. J Vis Exp. (109), (2016).
  10. Yang, L., et al. Minibrain and Wings apart control organ growth and tissue patterning through down-regulation of Capicua. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, (38), 10583-10588 (2016).
  11. Neumuller, R. A., et al. Stringent analysis of gene function and protein-protein interactions using fluorescently tagged genes. Genetics. 190, (3), 931-940 (2012).
  12. Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev Dyn. 232, (3), 827-834 (2005).
  13. Mukherjee, A., et al. Regulation of Notch signalling by non-visual beta-arrestin. Nat Cell Biol. 7, (12), 1191-1201 (2005).
  14. Gilbert, M. M., Tipping, M., Veraksa, A., Moberg, K. H. A Screen for Conditional Growth Suppressor Genes Identifies the Drosophila Homolog of HD-PTP as a Regulator of the Oncoprotein Yorkie. Dev Cell. 20, (5), 700-712 (2011).
  15. Anjum, S. G., et al. Regulation of Toll Signaling and Inflammation by beta-Arrestin and the SUMO Protease Ulp1. Genetics. 195, (4), 1307-1317 (2013).
  16. Degoutin, J. L., et al. Riquiqui and minibrain are regulators of the hippo pathway downstream of Dachsous. Nat Cell Biol. 15, (10), 1176-1185 (2013).
  17. Zhang, C., et al. The ecdysone receptor coactivator Taiman links Yorkie to transcriptional control of germline stem cell factors in somatic tissue. Dev Cell. 34, (2), 168-180 (2015).
  18. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141, (7), 1117-1134 (2010).
  19. Vincent, J. P., Girdham, C. H., O'Farrell, P. H. A cell-autonomous, ubiquitous marker for the analysis of Drosophila genetic mosaics. Dev Biol. 164, (1), 328-331 (1994).
  20. Zhai, B., Villen, J., Beausoleil, S. A., Mintseris, J., Gygi, S. P. Phosphoproteome analysis of Drosophila melanogaster embryos. J Proteome Res. 7, (4), 1675-1682 (2008).
  21. Franco, M., Seyfried, N. T., Brand, A. H., Peng, J., Mayor, U. A novel strategy to isolate ubiquitin conjugates reveals wide role for ubiquitination during neural development. Mol Cell Proteomics. 10, (5), (2011).
  22. Ramirez, J., et al. Proteomic Analysis of the Ubiquitin Landscape in the Drosophila Embryonic Nervous System and the Adult Photoreceptor Cells. PLoS One. 10, (10), 0139083 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics