लाइव-एक वास्तविक समय शिविर परख का उपयोग कर गंध रिसेप्टर सक्रियण के सेल माप

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Neuroscience

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Summary

निस्र्पक रिसेप्टर्स के समारोह deorphanization प्रक्रिया में एक अपरिहार्य हिस्सा कार्य करता है. हम एक शिविर परख का उपयोग कर वास्तविक समय में सुगंधित रिसेप्टर्स के सक्रियकरण को मापने के लिए एक विधि का वर्णन ।

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Zhang, Y., Pan, Y., Matsunami, H., Zhuang, H. Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay. J. Vis. Exp. (128), e55831, doi:10.3791/55831 (2017).

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Abstract

स्तनधारी सुगंधित रिसेप्टर के विशाल आकार (या) परिवारों को कई अस्थिर रसायनों के बीच अपने cognate लाइगैंडों खोजने के लिए उपस्थित कठिनाइयों । करने के लिए कुशलतापूर्वक और सही deorphanize ओआरएस, हम एक heterologous सेल लाइन का उपयोग करने के लिए स्तनधारी ओआरएस एक्सप्रेस और एक आनुवंशिक रूप से संशोधित प्लाज्मिड के शिविर उत्पादन बहाव को मापने के लिए और वास्तविक समय में सक्रियण । इस परख के लिए ओआरएस और इसके विपरीतodorants स्क्रीन इस्तेमाल किया जा सकता है । स्क्रीन से सकारात्मक गंध रिसेप्टर बातचीत बाद में विभिन्न गंध सांद्रता के खिलाफ परीक्षण द्वारा पुष्टि की जा सकती है, पैदा एकाग्रता प्रतिक्रिया घटता. यहां हम इस विधि का इस्तेमाल किया एक मानव या Hana3A कोशिकाओं में व्यक्त पुस्तकालय के खिलाफ एक गंध यौगिक का एक उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग प्रदर्शन और पुष्टि की है कि सकारात्मक प्रतिक्रिया रिसेप्टर ब्याज की यौगिक के लिए cognate रिसेप्टर है । हमने पाया है इस उच्च प्रवाह का पता लगाने के लिए विधि का आकलन या सक्रियण और हमारे डेटा में कुशल और विश्वसनीय होने के लिए या कार्यात्मक अध्ययन में अपने संभावित उपयोग का एक उदाहरण प्रदान करते हैं ।

Introduction

गंध की भावना जानवरों के अस्तित्व में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है के रूप में वे भोजन प्राप्त करने के लिए अपने घ्राण क्षमताओं पर भरोसा करते हैं, शिकारियों और खतरे से बचने, प्रजातियों भेद, और चुनें मेट1,2. इन कार्यों की प्राप्ति गंध रिसेप्टर्स (ओआरएस), जो व्यक्तिगत रूप से घ्राण संवेदी न्यूरॉन्स (OSNs) घ्राण उपकला (ँ) में स्थित की सिलिअरी सतह पर व्यक्त कर रहे हैं पर निर्भर करता है । ओआरएस जी के सबसे बड़े परिवार का गठन-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर (GPCR) superfamily के साथ लगभग ४०० और १२०० विविध या मानव और माउस में जीन, क्रमशः3,4,5. घ्राण जी प्रोटीन (golf) और प्रकार III adenylyl cyclase (ACIII) के अनुक्रमिक सक्रियण के माध्यम से वृद्धि हुई intracellular शिविर के स्तर को odorants नेतृत्व द्वारा सक्रिय ओआरएस । intracellular शिविर के परिणामस्वरूप वृद्धि का स्तर एक दूसरा दूत है, जो सेल की सतह पर न्यूक्लियोटाइड-gated चैनल खोलता है के रूप में कार्य कर सकता है, सीए सहित cations की आमद को ट्रिगर2 + और कार्रवाई की क्षमता है, और अंततः की शुरुआत न्यूरो-संभाव्य पारेषण और घ्राण बोध । ओआरएस द्वारा odorants की एक बड़ी संख्या का पता लगाने और भेदभाव करने की प्रक्रिया को घ्राण बोध6,7के पहले चरण के रूप में माना जाता है ।

के बाद से बक और एक्सल8 पहले सफलतापूर्वक सुगंधित रिसेप्टर्स क्लोन और घ्राण द्वारा शुरू की धारणा के तंत्र का आविर्भाव, deorphanization या परिवार के इस क्षेत्र में आकर्षण के हॉटस्पॉट में से एक बन गया । vivo मेंविभिन्न, पूर्व विवो और इन विट्रो तरीकों को मापने या सक्रियण के लिए9,10,11,12रिपोर्ट की गई है । OSNs पर एकल-कक्ष RT-पीसीआर द्वारा फ़ॉलो किए गए Ca2 + इमेजिंग का उपयोग करने वाली एक पारंपरिक विधि aliphatic odorants13,14,15को विभिंन ओआरएस की पहचान सक्षम करती है । हाल ही में, बड़े पैमाने पर transcriptome विश्लेषण के आगमन और अधिक उच्च vivo तरीकों में प्रवाह के विकास को बढ़ावा दिया । केंटुकी परख eugenol की पहचान-और muscone-उत्तरदाई माउस S100a5-tauGFP रिपोर्टर माउस तनाव और microarray विश्लेषण के उपयोग के साथ ओआरएस9। गंध जोखिम के बाद में या mRNA के स्तर में कमी के आधार पर, ड्रीम प्रौद्योगिकी निर्धारित करने के लिए एक transcriptomic दृष्टिकोण कार्यरत है या सक्रियकरण प्रोफाइल दोनों हड्डीवाला और गैर हड्डीवाला प्रजातियों में16। इसी तरह, न्यूरॉन सक्रियणों में S6 के फास्फारिलीकरण को देखते हुए, Matsunami समूह अनुक्रम mRNAs से phosphorylated ribosome immunoprecipitations के लिए उत्तरदायी ओआरएस की पहचान करने के लिए12. अंत में, Feinstein समूह सुपर सूंघा चूहों कि vivo मेंगंध कोडिंग, MouSensor प्रौद्योगिकी17के रूप में जाना जाता अध्ययन करने के लिए एक मंच के रूप में सेवा सकता है की सूचना दी ।

इन विट्रो दायरे में, संवर्धन OSNs की चुनौती एक heterologous अभिव्यक्ति प्रणाली है कि नकल या vivo में कार्यात्मक अभिव्यक्ति एक आदर्श समाधान के लिए ओआरएस के लिए सुगंधित रसायनों की बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग आचरण बनाता है । फिर भी, के बाद से गैर घ्राण मूल के प्रसंस्कृत सेल लाइनों देशी OSNs से अलग है, या प्रोटीन endoplasmic जालिका में बनाए रखा और प्लाज्मा झिल्ली के लिए यातायात में असमर्थ हैं, जिसके परिणामस्वरूप या क्षरण और रिसेप्टर समारोह के नुकसान18 , 19. इस समस्या को हल करने के लिए, heterologous कक्ष रेखाओं में सेल झिल्ली पर प्रतिकृति या कार्यात्मक अभिव्यक्ति के लिए व्यापक कार्य किए गए हैं । Krautwurst एट अल. पहले rhodopsin के पहले 20 एमिनो एसिड (Rho-टैग) के एन-टर्मिनल या प्रोटीन के लिए संलग्न है और यह सेल-मानव भ्रूण गुर्दे (HEK) कोशिकाओं में कुछ ओआरएस की सतह अभिव्यक्ति को बढ़ावा20। एकल OSNs, साइतो एट अलसे जीन अभिव्यक्ति (ऋषि) पुस्तकालय विश्लेषण का एक धारावाहिक विश्लेषण आयोजित करके । पहले रिसेप्टर-परिवहन प्रोटीन (RTP) परिवार के सदस्यों, RTP1 और RTP2, और रिसेप्टर एक्सप्रेशन बढ़ाने प्रोटीन 1 (REEP1) कि सुविधा या सेल झिल्ली के लिए तस्करी और बढ़ाया गंध-HEK293T कोशिकाओं में ओआरएस के मध्यस्थता प्रतिक्रियाओं का 21. इन निष्कर्षों के आधार पर, Matsunami समूह सफलतापूर्वक Hana3A सेल लाइन की स्थापना की, RTP2 में RTP1, REEP1, Gα, और olfHEK293T के साथ छुरा transfected, और क्षणिक transfected के साथ Rho-टैग ओआरएस, कुशल या कार्यात्मक के लिए अभिव्यक्ति. बाद के अध्ययनों से पता चला 1) RTP1, RTP1S के एक छोटे फार्म, कि अधिक मजबूती से बढ़ावा देने या मूल RTP1 प्रोटीन और 2) प्रकार 3 मस्करीनिक acetylcholine रिसेप्टर (M3R) है कि बढ़ाने या गतिविधि के निषेध के माध्यम से हो सकता है समारोह में β-arrestin-2 भर्ती, दोनों जिनमें से heterologous अभिव्यक्ति प्रणाली के लिए प्रायोगिक उत्पादन22,23अनुकूलित करने के लिए पेश किया गया ।

कई तरीकों का पता लगाने के लिए heterologous प्रणालियों में रिसेप्टर सक्रियकरण मात्रा का इस्तेमाल किया गया है । गुप्त अपरा alkaline फॉस्फेट (SEAP) परख एक रिपोर्टर एंजाइम शिविर प्रतिक्रिया तत्वों (CREs) द्वारा विनियमित transcriptionally के साथ काम करता है, यह आकलन या सक्रियण के लिए एक आकर्षक विकल्प बना । प्रतिदीप्ति आसानी से SEAP डिटेक्शन रिएजेंट24के साथ मशीन के बाद संस्कृति माध्यम का एक नमूना में पाया जाता है । इस विधि का प्रयोग, ओआरएस के कार्य के साथ-साथ chemosensory रिसेप्टर्स के एक माध्यमिक वर्ग ँ-स्ट्रेस अमीन-संबद्ध रिसेप्टर्स (TAARs) में व्यक्त किया गया है25,26,27की विशेषता है । एक अंय आम विधि, luciferase परख, शिविर प्रतिक्रिया तत्व (CRE) के नियंत्रण में एक जुगनू luciferase रिपोर्टर जीन का उपयोग करता है । luciferase उत्पादन द्वारा उत्पंन luminescence को मापने के एक कुशल और मजबूत साधन बढ़ाता है या सक्रियण के10,11,28प्रदान करता है ।

वास्तविक समय शिविर परख भी व्यापक रूप से गतिशील heterologous या अंतर्जात GPCRs के समारोह की निगरानी में इस्तेमाल किया गया है । इस तरह के उंनत परख का एक उदाहरण के एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग संवेदी संस्करण है, जो एक शिविर-बाध्यकारी luciferase के एक उत्परिवर्ती फार्म से जुड़े डोमेन के पास का लाभ लेता है । जब शिविर बांध, गठन परिवर्तन luciferase, luminescence, जिसमें से तो एक chemiluminescence रीडर29,30के साथ मापा जा सकता है सक्रियण की ओर जाता है । वास्तविक समय शिविर प्रौद्योगिकी HEK293 और NxG 108CC15 कोशिकाओं में मानव गंध रिसेप्टर्स के de-अनाथ के लिए उपयुक्त बताया गया है= xref > 31,३२,३३, साथ ही HEK293T-व्युत्पन्न Hana3A कोशिकाओं में३४,३५. Krautwurst समूह भी विस्तार से वास्तविक समय शिविर प्रौद्योगिकी द्वि-दिशात्मक बड़े पैमाने पर या स्क्रीनिंग दृष्टिकोण३२,३३के लिए उपयुक्त होना बताया ।

यहां हम मापने या सक्रियण Hana3A कोशिकाओं में एक वास्तविक समय शिविर परख का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । इस प्रोटोकॉल में, पूर्व equilibrated लाइव कोशिकाओं के luminescence के लिए विशेष वाष्पशील यौगिकों के साथ 30 मिनट के बाद उपचार के लिए काइनेटिक मापा जाता है, का एक अधिक कुशल और सटीक विश्लेषण का प्रतिनिधित्व या सक्रियण कि कम करने के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं कलाकृतियों है कि लंबे समय तक और गंध प्रेरित सेल विषाक्तता के साथ सेलुलर वातावरण में होते हैं । इस वास्तविक समय माप दोनों ओआरएस और लाइगैंडों, साथ ही ब्याज की विशिष्ट या-ligand जोड़ों के लक्षण वर्णन के एक बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देता है । इस विधि का प्रयोग, हम सफलतापूर्वक कस्तूरी यौगिक muscone के लिए रिसेप्टर के रूप में OR5AN1 की पहचान की ३७९ मानव ओआरएस के खिलाफ एक स्क्रीनिंग प्रदर्शन और बाद में सकारात्मक स्क्रीनिंग परिणाम की पुष्टि ।

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Protocol

< p class = "jove_title" > 1. संवर्धन और Hana3A कोशिकाओं के रखरखाव

  1. न्यूनतम आवश्यक माध्यम के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं को बनाए रखने (मेम) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), १०० & #181; g/ml पेनिसिलिन-streptomycin, और १.२५ & #181; g/ml amphotericin B में १००-mm सेल एक ३७ में संस्कृति डिश & #176; ग सेल संस्कृति मशीन के साथ 5% सह 2 । हर दूसरे बीतने के साथ, plasmids के स्थिर अभिकर्मक को बनाए रखने के लिए 1 & #181; g/mL puromycin (देखें परिचय ).
    नोट: बाँझ वातावरण सुनिश्चित करने के लिए एक वर्ग द्वितीय जैविक सुरक्षा कैबिनेट में सेल संस्कृति को शामिल सभी कदम प्रदर्शन.
  2. १००-mm व्यंजन में 10-20% के अनुपात में
  3. उपसंस्कृति हर 2-3 दिन ।
< p class = "jove_title" > 2. अभिकर्मक के लिए चढ़ाना कोशिकाओं

  1. कोशिका व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए और संगम का अनुमान लगाने के लिए एक चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप के तहत Hana3A कोशिकाओं का निरीक्षण ।
  2. महाप्राण सेल कल्चर डिश से सभी मीडियम.
  3. प्लेट पर फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) के 10 मिलीलीटर जोड़कर, पकवान घूमता है, और aspirating पंजाबियों को धो कोशिकाओं ।
  4. प्लेट पर ०.०५% trypsin-ईथीलीन डायमाइन tetraacetic एसिड (EDTA) के 3 मिलीलीटर जोड़ें । 1 मिनट के लिए या जब तक सभी कोशिकाओं को बचाए है मिश्रण ।
    नोट: आवश्यक के रूप में माइक्रोस्कोप के तहत थाली के नीचे से अलग कोशिकाओं की प्रगति का निरीक्षण.
  5. को सूचनाको trypsin को जोड़ कर 10% FBS के साथ मेम के 5 मिलीलीटर और पिपेट ऊपर और नीचे कोशिका द्रव्यमान का हिस्सा तोड़ने के लिए ।
    नोट: अभिकर्मक से पहले चढ़ाना के लिए, इस्तेमाल किया मध्यम एंटीबायोटिक दवाओं को शामिल नहीं करना चाहिए । एंटीबायोटिक दवाओं के अलावा अभिकर्मक क्षमता कम हो सकती है ।
  6. प्लेटों की संख्या के आधार पर एक 15-mLl ट्यूब के लिए एक उचित मात्रा में स्थानांतरण transfected किया जा करने के लिए । प्रत्येक ९६ के लिए अच्छी तरह से प्लेट, प्लेट 2 x 10 6 कोशिकाओं, या लगभग 1/5 एक १००% धाराप्रवाह १०० mm डिश, के एक सेल गिनती दे 2 x 10 4 कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से या एक घनत्व के प्रति अच्छी तरह से लगभग 15-30% संगम । 5 मिनट के लिए २०० x g पर ट्यूबों केंद्रापसारक और सेल गोली परेशान बिना supernatant महाप्राण ।
    नोट: कोशिकाओं की सही मात्रा की गणना ९६ पर चढ़ाया जा करने के लिए अच्छी तरह से प्लेटें बढ़ने से बचने के लिए या उत्तेजना से पहले की कोशिकाओं में तबदील हो जाना ।
  7. 15 मिलीलीटर ट्यूब में 10% FBS के साथ मेम का एक उचित मात्रा में जोड़ें और ऊपर और नीचे कोशिका द्रव्यमान का हिस्सा तोड़ने के लिए पिपेट । प्रत्येक ९६-well प्लेट के लिए, 10% FBS के साथ मेम के 6 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं reसस्पेंड.
    नोट: ट्यूब में हवा के बुलबुले उत्पन्न करने के लिए नहीं सावधान रहें.
  8. एक जलाशय में निलंबित कोशिकाओं को जोड़ें । एक मल्टीचैनल पिपेट का प्रयोग, पिपेट ५० & #181; एक ९६-खैर प्लेट के प्रत्येक कुआं पर कोशिकाओं के एल. गर्मी में रात भर ३७ & #176; ग के साथ 5% कं 2 .
< p class = "jove_title" > 3. Plasmids

  1. के अभिकर्मक अभिकर्मक से पहले, मढ़वाया कोशिकाओं का निरीक्षण करने के लिए लगभग 30-50% प्रति एक चरण के तहत अच्छी तरह से एक उचित संगम-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप और मशीन को वापस सुनिश्चित करते हैं ।
  2. तैयार अग्रिम में Rho-टैग या निर्माण < सुप वर्ग = "xref" > ११ , < सुप class = "xref" > 21 , < सुप class = "xref" > 22 , < सुप क्लास = "xref" > 28 , एक्सेसरी फैक्टर construction (RTP1S < सुप वर्ग = "xref" > २२ , < सुप क्लास = "xref" > 36 और M3R < सुप क्लास = "xref" > 23 ), और जो कि ' xref "> 29 , < सुप क्लास =" xref "> 30 बाय miniprep. एक spectrophotometer द्वारा डीएनए एकाग्रता को बढ़ाता है और आवश्यक के रूप में आसुत जल के साथ प्लाज्मिड डीएनए सांद्रता ( जैसे , १०० एनजी/& #181; L) को समायोजित करें ।
  3. अभिकर्मक मिश्रण की तैयारी
    1. एक प्लाज्मिड अभिकर्मक मिश्रण को ५०० & #181 में तैयार करें; प्रत्येक के लिए मेम की ९६-वेल प्लेट के अनुसार टेबल 1 .
      नोट: जब एक ही ९६-well प्लेट पर अलग ओआरएस का परीक्षण कर रहे हैं, अभिकर्मक मिश्रण की मात्रा और प्लाज्मिड डीएनए की मात्रा एक दिया या.
    2. के साथ transfected कुओं की संख्या के समारोह में अनुकूलित किया जाना चाहिए जोड़ा
    3. एक ट्यूब में अभिकर्मक मिश्रण तैयार करते हैं जिसमें 18 & #181; l की लिपिड-मध्यस्थता अभिकर्मक रिएजेंट में ५०० & #181; मेम.
    4. के एल.
  4. को अभिकर्मक मिश्रण के साथ प्लाज्मिड मिश्रण को ऊपर से ऊपर और नीचे करके मिला दीजिये. 15 min.
  5. के लिए कमरे के तापमान पर मशीन
  6. 10% FBS के साथ मेम की 5 मिलीलीटर जोड़कर रिएक्शन बंद कर दें ।
  7. बाहर कोशिका संस्कृति हूड में बाँझ कागज तौलिए की एक मोटी परत फैल गया । एक ९६-मशीन से कोशिकाओं के साथ अच्छी तरह से थाली ले लो । धीरे से और फिर बार से प्लेट उल्टा कागज तौलिया के ढेर पर नीचे इतना है कि मध्यम पूरी तरह से कागज तौलिया द्वारा अवशोषित कर लेता है नल ।
    नोट: नहीं जबरदस्ती या अचानक प्लेट नल के रूप में एक कोशिकाओं को खो सकता है.
  8. Transfer ५० & #181; संयुक्त अभिकर्मक मिश्रण के एल ९६ के प्रत्येक कुआं के लिए अच्छी तरह से थाली और गर्मी रात भर 18-24 एच के लिए ३७ & #176; ग के साथ 5% कं 2 .
    नोट: एक समय प्रबंधित अभिकर्मक और उत्तेजना अनुसूची माप से पहले जब १ ९६ से अधिक अच्छी तरह से प्लेट एक प्रयोग में परीक्षण कर रहे है क्रम में सभी एक ही अभिकर्मक समय और उत्तेजना जोखिम समय के बाद मापा प्लेटें हैं ।
< p class = "jove_title" > 4. उत्तेजना और मापने या गतिविधि का उपयोग कर वास्तविक समय शिविर परख

  1. एक चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप के तहत transfected कोशिकाओं का पालन करने के लिए अच्छी तरह से प्रति 50-80% की एक उचित संगम और मशीन को वापस सुनिश्चित करते हैं ।
  2. 10 एमएम hydroxyethyl piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES) और 5 एमएम ग्लूकोज को हांक & #39; एस बैलेंस्ड साल्ट सॉल्यूशन (HBSS) जोड़कर उत्तेजना मध्यम तैयार करें.
  3. गल वास्तविक समय शिविर परख सब्सट्रेट रिएजेंट बर्फ पर aliquots । स्टोर सब्सट्रेट रिएजेंट पर-८० & #176; C at ५५ & #181; एल प्रति ट्यूब पीसीआर ट्यूबों में । थाली प्रति 1 ट्यूब का उपयोग करें.
  4. मिश्रण से 2% equilibration हल तैयार करें ५५ & #181; l सब्सट्रेट रिएजेंट और २७५० & #181; l HBSS/HEPES/ग्लूकोज सॉल्यूशन.
  5. पीठ पर कागज के तौलिए की एक मोटी परत फैल गई । धीरे और बार प्लेट उल्टा कागज तौलिया पर इतना है कि अभिकर्मक माध्यम पूरी तरह से कागज तौलिया द्वारा अवशोषित कर लेता है ।
  6. धोने से कोशिकाओं को pipetting ५० & #181; L के HBSS/HEPES/ग्लूकोज समाधान के लिए एक अच्छी तरह से.
  7. धीरे और बार से बाहर HBSS/HEPES/ग्लूकोज समाधान ९६-well थाली से नल ।
  8. पिपेट 25 & #181; L 2% equilibration के लिए एक अच्छी तरह से समाधान और 2 ज.
  9. के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर मशीन
  10. अग्रिम में तैयार DMSO में 1 मीटर की गंध स्टॉक समाधान और स्टोर पर-20 & #176; ग जब तक इस्तेमाल किया.
  11. मशीन समय के अंत से पहले, HBSS/HEPES/ग्लूकोज उत्तेजना माध्यम में काम कर रहे सांद्रता के लिए गंध स्टॉक समाधान पतला ।
    ध्यान दें: इस चरण में तैयार की गई गंध वाले कमजोर पड़ने की सांद्रता को प्रत्येक कुआं में सही अंतिम सांद्रता प्राप्त करने के लिए दोगुना किया जाना चाहिए ।
  12. एक chemiluminescence प्लेट रीडर का उपयोग कर और इससे पहले कि गंध इसके अलावा, माप की थाली के बेसल luminescence स्तर पर लगातार 2 बार की दर से १००० ms प्रति well < सुप वर्ग = "xref" > ३४ .
  13. जल्दी प्लेट रीडर से थाली निकालें और जोड़ें 25 & #181; एल गंध एक अच्छी तरह से कमजोर पड़ने और तुरंत 20 चक्र के लिए सभी कुओं की सतत luminescence माप शुरू 30 min.
    के भीतर नोट: पिपेट ध्यान से जब एक ही प्लेट में अलग odorants और/या एक ही odorants के विभिंन सांद्रता का उपयोग कर पड़ोसी कुओं दूषित से बचने के लिए ।
< p class = "jove_title" > 5. डेटा विश्लेषण

  1. chemiluminescence प्लेट रीडर सॉफ्टवेयर से डेटा निर्यात.
  2. सूत्र का उपयोग कर प्रत्येक समय बिंदु के लिए सामान्यीकृत या प्रतिक्रिया की गणना करें
    (luminescence n & #8211; luminescence बसाल )/(luminescence उंच & #8211; luminescence बेसल )
    जहां N = luminescence मान एक निश्चित वेल; बेसल = औसत luminescence मान दो बेसल luminescence मान; उच्चतम = एक प्लेट या प्लेटों का एक सेट के उच्चतम luminescence मूल्य ।
    नोट: प्रयोग के प्रयोजन के आधार पर, वैकल्पिक चित्रमय अभ्यावेदन अपनाया जा सकता है । उदाहरण के लिए, स्क्रीनिंग की परख के लिए (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 1 ) और एकाग्रता-प्रतिक्रिया घटता पैदा करने के लिए, काइनेटिक मापन के दौरान एक निश्चित समय बिंदु पर एक खास कुआं का luminescence मूल्य, जैसे अधिकतम मूल्य या अंतिम मूल्य, इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Representative Results

Muscone प्राकृतिक खरबूज से मुख्य सुगन्धित घटक है. हाल के अध्ययनों से माउस को समरूपता पर आधारित muscone और अन्य macrocyclic खरबूज यौगिकों के लिए एक मानव रिसेप्टर के रूप में OR5AN1 की पहचान की है या, MOR215-1, चूहों बर्ताव करने में muscone उत्तरदायी glomeruli से क्लोन३७,३८. द्वारा मानव या प्रदर्शनों की जांच, हमारे समूह और Touhara समूह भी दो macrocyclic खरबूज यौगिकों, cyclopentadecanone और muscone, क्रमशः के लिए एक प्रमुख रिसेप्टर के रूप में OR5AN1 की पहचान की, luciferase परख प्रणाली का उपयोग कर३८,३९ .

वास्तविक समय शिविर का उपयोग परख यहां वर्णित है, हम 30 µ एम muscone (चित्रा 1) के खिलाफ मानव या प्रदर्शनों की जांचें दिखलाई) । ३७९ मानव ओआरएस की जांच के अलावा, OR5AN1 muscone के लिए एक प्रमुख प्रतिक्रिया के साथ उभरा है, जबकि अंय ओआरएस और नकारात्मक नियंत्रण (कोई गंध नियंत्रण और खाली वेक्टर नियंत्रण) एक महत्वपूर्ण प्रतिक्रिया नहीं दिखा था । सकारात्मक नियंत्रण 30 µ एम खरबूज tibetene, OR5AN1 (अप्रकाशित डेटा) के लिए एक ligand के खिलाफ OR5AN1 का परीक्षण किया, और muscone के लिए ' ओआरएस की प्रतिक्रिया को सामान्य करने के लिए इस्तेमाल हुआ था. डेटा के इस सेट की चित्रमय प्रतिनिधित्व के लिए, हम समय बिंदु उठाया, जब अधिकतम luminescence पढ़ने 30 µ एम खरबूज tibetene के खिलाफ OR5AN1 के लिए प्राप्त किया गया था ।

हम अगले एकाग्रता-गंध की प्रतिक्रिया संबंध-या muscone के 3 अलग सांद्रता के साथ जोड़ी की जांच की । muscone के प्रत्येक एकाग्रता के लिए परीक्षण किया, muscone अलावा के बाद पहले 20 मिनट के दौरान, OR5AN1 द्वारा प्रतिक्रिया धीरे-धीरे वृद्धि हुई है और फिर पिछले 10 मिनट (चित्रा 2a) में पठारित जबकि कोई गंध इसके अलावा नियंत्रण के लिए ट्रेस (0 µ एम muscone) रह अपेक्षाकृत सपाट है । muscone के उच्च सांद्रता कम लोगों की तुलना में मजबूत या प्रतिक्रियाओं पैदा की, कि माप भर में अलग है । काइनेटिक माप से अंतिम समय बिंदु का उपयोग करते हुए, हम एक एकाग्रता प्रतिक्रिया वक्र और अधिक से अधिक प्रभाव के ५०% के लिए एकाग्रता उत्पन्न (ईसी५०) वक्र के मूल्य २०.८२ µ एम (चित्रा बी) होने का अनुमान है ।

Figure 1
चित्रा 1: muscone के मानव ओआरएस के लिए स्क्रीनिंग ।
३७९ अद्वितीय मानव ओआरएस 30 µ मीटर muscone के खिलाफ वास्तविक समय शिविर परख का उपयोग कर जांच की गई । x-अक्ष के साथ रंगीन ब्लॉक्स विभिंन मानव या परिवारों को इंगित करते हैं । x-अक्ष पर प्रत्येक स्तंभ अंतिम तीन स्तंभों को छोड़कर किसी एकल या प्रकार का प्रतिनिधित्व करता है, जो OR5AN1 30 µ एम खरबूज tibetene (एक सकारात्मक नियंत्रण), HBSS/HEPES/ग्लूकोज समाधान (एक कोई गंध नकारात्मक नियंत्रण) को OR5AN1 की प्रतिक्रिया के लिए प्रतिक्रिया कर रहे हैं, और Rho की प्रतिक्रिया-pCI के लिए 30 µ m muscone (एक खाली वेक्टर नकारात्मक नियंत्रण), बाएं से दाएं । yअक्ष के बाद जब प्रतिक्रिया धनात्मक नियंत्रण (N = 3) के लिए एक अधिकतम तक पहुंच गई, तो इसके अतिरिक्त के बाद 30 मिनट में सामान्यीकृत luminescence का प्रतिनिधित्व करता है । सभी प्रतिक्रियाओं को सकारात्मक नियंत्रण के लिए सामान्यीकृत हैं । त्रुटि पट्टियां मानक त्रुटि माध्य (SEM) का प्रतिनिधित्व करती हैं । स्पष्टता के लिए, केवल धनात्मक त्रुटि पट्टियां दिखाई जाती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: muscone करने के लिए OR5AN1 की प्रतिक्रिया के काइनेटिक माप.
(क) OR5AN1 सक्रियकरण के विभिंन सांद्रता और एक नहीं, गंध नकारात्मक नियंत्रण के muscone द्वारा वास्तविक समय माप गंध इसके अलावा के 30 मिनट के भीतर प्रदर्शन किया गया । तीर गंध इसके अलावा के समय बिंदु को इंगित करता है । (ख) एकाग्रता-muscone के खिलाफ OR5AN1 की प्रतिक्रिया वक्र के बाद 30 मिनट में गंध इसके अलावा । y-अक्षों का प्रतिनिधित्व सामान्यीकृत luminescence (N = 3) । सभी प्रतिक्रियाओं १०० µ एम muscone के लिए उच्चतम प्रतिक्रिया करने के लिए सामान्यीकृत हैं । त्रुटि पट्टियों का प्रतिनिधित्व SEM. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

प्लाज्मिड ९६-well प्लेट (µ g) प्रति राशि
Rho-या 5
RTP1S 1
M3R ०.५
शिविर-संवेदी संस्करण 1

तालिका 1: अभिकर्मक मिश्रण के घटक ।
प्रति ९६-Rho की अच्छी तरह से प्लेट राशि-या, RTP1S, M3R, और वास्तविक समय शिविर में एक प्रकार का संवेदी संस्करण plasmids ।

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Discussion

सही एक निश्चित गंध को जोखिम पर एक या सक्रियण मापने घ्राण जानकारी के कोडिंग का गूढ़ रहस्य में पहला कदम है । इस अध्ययन में दिखाया प्रयोगों के एक उदाहरण का प्रतिनिधित्व कैसे एक की पहचान कर सकते हैं, एक में इन विट्रो या अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग कर, मानव के बीच उत्तरदायी ओआरएस और ब्याज की गंध रसायन के लिए और बाद में निस्र्पक रिसेप्टर रसायन के विभिंन सांद्रता का उपयोग कर औषध विज्ञान । हमारे परिणाम muscone के लिए एक सदाशई के रूप में OR5AN1 की पुष्टि रिसेप्टर । यह एक पिछले रिपोर्ट३९ के अनुरूप है और अटकलें है कि केवल रिसेप्टर्स की एक छोटी संख्या कस्तूरी गंध27,४०संवेदन में शामिल है के लिए और अधिक सबूत प्रदान करता है । जब सातो से स्क्रीनिंग डेटा के साथ तुलना-Akuhara एट अल. कि एक समान या heterologous अभिव्यक्ति प्रणाली पर luciferase परख द्वारा उत्पंन होता है, हमारे स्क्रीनिंग परिणाम थोड़ा बदतर संकेत से पता चला-शोर अनुपात । विभिंन तकनीकों शामिल करने के लिए निहित रूपांतरों के अलावा, उत्पादन में अंतर तथ्य यह है कि हम एक कम muscone एकाग्रता (30 µ एम बनाम १०० µ एम) का इस्तेमाल करने के लिए कारण हो सकता है । वास्तव में, चुनाव आयोग एकाग्रता का५० मूल्य-muscone के खिलाफ OR5AN1 की प्रतिक्रिया वक्र हम वास्तविक समय शिविर परख के माध्यम से प्राप्त की परिमाण के एक ही क्रम में एक के रूप में है कि सातो-Akuhara एट अल अपने luciferase परख प्रणाली में प्राप्त की, एक ही heterologous या अभिव्यक्ति प्रणाली के लिए तुलनीय परिणामों का प्रदर्शन भी जब अलग पहचान तरीकों का इस्तेमाल कर रहे हैं । एक और अध्ययन में, हमारे समूह ने पाया कि वास्तविक समय शिविर प्रणाली थोड़ा OR2T11 रिसेप्टर selectivity का आकलन करने में luciferase रिपोर्टर जीन प्रणाली की तुलना में अधिक संवेदनशील हो सकता है, यह देखते हुए कि odorants की एक छोटी संख्या में पूर्व में ही सक्रिय नहीं थे, बाद में सिस्टम३५। जब Geithe एट अल द्वारा रिपोर्ट डेटा की श्रृंखला के साथ तुलना में । 31 OR1A1 के खिलाफ (+)-कार्वोन, muscone के खिलाफ OR5AN1 पर हमारे डेटा पठार तक पहुंचने की जरूरत समय में देरी से पता चला है, जो सीधे ओआरएस और इस्तेमाल odorants के विभिंन प्रकार से परिणाम हो सकता है । अंय वास्तविक समय शिविर परख हमारे समूह से सूचना डेटा में, हम भी अलग बार दिखाया को ओआरएस और odorants३४,३५के आधार पर चोटी । इसके अलावा, विभिंन सेल लाइनों के लिए इस्तेमाल किया ओआरएस एक्सप्रेस, विभिंन सब्सट्रेट इस्तेमाल किया, विभिंन वास्तविक समय शिविर plasmids, chemiluminescence प्लेट रीडर के विभिंन संवेदनशीलता, और/या विभिंन प्रयोगात्मक परिस्थितियों में भिंनता के रूप में, कमरे के तापमान, सभी luminescence उत्पादन में बदलाव के लिए योगदान कर सकता है ।

वास्तविक समय शिविर परख मापने या सक्रियण के लिए अंय तरीकों पर कई लाभ से पता चलता है । सबसे पहले, luciferase रिपोर्टर जीन परख के समान, वास्तविक समय शिविर परख प्रदान करता है एक अतिरिक्त इन विट्रो के उच्च प्रवाह की पहचान के साधन या प्रदर्शनों odorants का जवाब । बड़े पैमाने पर रिसेप्टर और/या वास्तविक समय शिविर परख द्वारा स्क्रीन की एक बड़ी राशि की पेशकश कर सकते है रिसेप्टर-गंध प्लेटों की एक छोटी संख्या के उपयोग के साथ बाँधना । जब उंनत luminometers और pipetting रोबोटों उपलब्ध हैं, ९६ अच्छी तरह से यहां वर्णित प्रोटोकॉल को आसानी से एक ३८४-अच्छी तरह से प्रारूप है, जिसमें भी कम प्लाज्मिड डीएनए और एजेंट डेटा उत्पादन की इकाई प्रति आवश्यक है उंनत किया जा सकता है । दूसरा, वास्तविक समय शिविर विधि वास्तविक समय में शिविर के intracellular एकाग्रता में परिवर्तन को मापने में सक्षम है । जबकि अधिकांश परख करने के लिए माप या गतिविधि की तारीख करने के लिए उपयोग किया जाता है प्रतिदीप्ति-या chemiluminescence-आधारित समापन बिंदु का पता लगाने की आवश्यकता सेल lysis, वास्तविक समय शिविर परख isimplemented के तहत गैर lytic, रहते सेल शर्तों है कि अधिक अंतर्जात के समान है स्थिति और है कि शिविर के स्तर में परिवर्तन की निगरानी सक्षम करें । तीसरा, एक अपेक्षाकृत कम समय के लिए वास्तविक समय विधि प्रदर्शन की आवश्यकता है । एक और उच्च प्रवाह विश्लेषण या समारोह है, जो एक luciferase रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति पर निर्भर करता है विधि, गंध उत्तेजना के बाद एक अतिरिक्त 4 एच की जरूरत है एक प्रयोग पूरा । कुछ मामलों में, एक लंबे समय तक गंध मशीन अंतराल संभावित गंध विषाक्तता कोशिकाओं में परिणाम है, जो प्रभावी रूप से क्षणिक जोखिम के तहत समाप्त हो सकता है । इसके अलावा, अब स्थाई प्रयोगों में, लीचिंग द्वारा पड़ोसी कुओं के संदूषण की संभावना जब अलग odorants और/या एक ही प्लेट में एक ही गंध के विभिंन सांद्रता का उपयोग भी बढ़ रहे हैं । तत्काल का पता लगाने के बाद गंध इसके अलावा वास्तविक समय शिविर परख एक तेजी से और विश्वसनीय प्रतिमान बनाता है ।

मापने या सक्रियण के लिए वास्तविक समय शिविर परख की सीमाएं इस प्रकार है । सबसे पहले, हमारे इन विट्रो परख एक HEK293T पर आधारित है सेल लाइन व्युत्पंन जो देशी घ्राण संवेदी ंयूरॉंस के कई अंतर्जात अणुओं की कमी है । इसके अलावा, घुलनशील प्रोटीन और एंजाइमी नाक बलगम में होने वाले रूपांतरण odorants और/या प्रभाव या odorants के लिए समानता के साथ बाइंड कर सकते हैं । इसलिए, heterologous प्रणाली में सक्रियण संवेदनशीलता और गंध ट्यूनिंग के मामले में vivo स्थिति में से अलग हो सकता है । दूसरा, एक दिया गंध के लिए ओआरएस की पहचान के लिए एक पूरी या प्रदर्शनों की कम ओआरएस GPCRs का एक बड़ा परिवार है और मानव और चूहे में प्रोटीन की संख्या बहुत बड़ी है4,5,४१। काफी समय और प्रयास एक या ब्याज की प्रदर्शनियों की अनुकृति की क्लोनिंग में शामिल किया जा सकता है । तीसरा, यद्यपि या heterologous अभिव्यक्ति प्रणाली शामिल है या अनुक्रम संशोधन (जैसे Rho-टैग) और कुछ महत्वपूर्ण या गौण प्रोटीन (जैसे RTP1S और M3R), हमें संदेह है कि नहीं सभी ओआरएस कार्यात्मक की कोशिका झिल्ली पर व्यक्त कर रहे है HEK293T-व्युत्पन्न कोशिकाओं. इसलिए, इन विट्रो में एक निश्चित गंध के लिए प्रतिक्रियाओं के अभाव जरूरी बाधा या प्रतिक्रिया vivo मेंनहीं है, तथ्य यह है कि कुछ ओआरएस बस खराब हो सकता है की एक परिणाम के रूप में सेल की सतह पर व्यक्त की और उनके लाइगैंडों पहचान करने में असमर्थ । इस प्रकार, जब भी संभव वास्तविक समय शिविर अन्य विट्रो में और विवो में अन्य के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए और अधिक समझाने परिणाम प्राप्त करने के लिए.

कई महत्वपूर्ण कदम वास्तविक समय शिविर परख के दौरान अतिरिक्त ध्यान दिया जाना चाहिए । पहले, सामांय में luminescence को शामिल प्रयोगों के लिए, तापमान एक महत्वपूर्ण कारक है कि प्रयोग के परिणाम को प्रभावित करता है के रूप में तापमान में वृद्धि बेसल और प्रेरित स्तर प्रकाश उत्पादन की कमी और तापमान में वृद्धि प्रकाश उत्पादन में कम हो जाती है । इसलिए, instrume के स्थिर-राज्य ऑपरेटिंग तापमान के लिए प्लेटें pre-equilibratingnt इससे पहले कि गंध के अलावा तापमान परिवर्तन की वजह से परिणामों पर प्रभाव से बचने के लिए आवश्यक है । दूसरा, वास्तविक समय शिविर परख सब्सट्रेट एजेंट की सांद्रता वास्तविक स्थिति के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए । जब बेसल luminescence chemiluminescence प्लेट रीडर का सबसे कम पता लगाने की दहलीज तक पहुँचने में विफल रहता है, एक संकेत बढ़ाने के लिए सब्सट्रेट सांद्रता बढ़ाने पर विचार करना चाहिए. अंत में, एक अनुयाई सेल लाइन होने के बावजूद, Hana3A कोशिकाओं प्रयोग के दौरान अलग कर सकते हैं । जब aspirating या मीडियम को जोड़कर, पिपेट टिप्स को अच्छी तरह से साइड पर रखकर सेल monolayer के व्यवधान को कम कर सकते हैं. यह भी एक उपयुक्त और समान घनत्व में प्लेट कोशिकाओं के लिए महत्वपूर्ण है कोशिकाओं के घने धब्बे के रूप में बढ़ती कोशिकाओं से बचने के लिए माध्यम के परिवर्तन के दौरान बंद छील करते हैं ।

की पहचान या (ओं) के लिए ब्याज की एक गंध के अलावा, वास्तविक समय शिविर परख भी एक दिया या जब रसायनों की पुस्तकालयों उपलब्ध है के लिए cognate लाइगैंडों के लिए स्क्रीन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । अंत में, जब उचित कोशिका प्रकार और अभिकर्मक शर्तों का इस्तेमाल कर रहे हैं, परख भी व्यक्त या अंतर्जात GPCR सक्रियण का पता लगाने के लिए अनुमति दे सकते है और एकाग्रता पर निर्भर प्रतिक्रिया दोनों एगोनिस्ट और विरोधी के लिए घटता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgements

काम चीनी राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (३१०७०९७२), शंघाई नगर पालिका (16ZR1418300) के विज्ञान और प्रौद्योगिकी आयोग, शंघाई नगर शिक्षा आयोग, शंघाई पूर्वी के अभिनव अनुसंधान टीम के लिए कार्यक्रम के द्वारा समर्थित किया गया विद्वान कार्यक्रम (J50201), और चीन के राष्ट्रीय बुनियादी अनुसंधान कार्यक्रम (2012CB910401) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amphotericin B Sigma A2942
DMSO Sigma D2650
FBS Gibco 10099-141
GloSensor cAMP reagent Promega E1290
pGloSensor-20F cAMP plasmid Promega E1171
Hana3A cells available from authors upon request
HBSS, without calcium or magnesium GIBCO 14175095
HEPES Hyclone SH30237
Lipofectamine2000 Invitrogen 11668-019
M3R plasmid cloned into a mammalian expression vector such as pCI
MEM, with EBSS and L-glutamine Hyclone SH30024
Muscone Santa Cruz sc-200528
Musk tibetene Sigma-Aldrich S359165
OR plasmids cloned with a Rho-tag into a mammalian expression vector such as pCI
PBS, without calcium or magnesium Cellgro 21-040-CV
Penicillin-streptomycin Hyclone SV30010
Plasmid miniprep kit Tiangen DP103-03
Puromycin Sigma P8833
RTP1S plasmid cloned into a mammalian expression vector such as pCI
Trypsin-EDTA Hyclone SH30236
0.2-mL PCR tube Axygen PCR-02-C
1.5-mL Eppendorf tube Eppendorf
15-mL 17 mm x 120 mm conical tube BD Falcon 352096
8-well and/or 12-well multichannel pipetman Eppendorf
96-well flat-bottomed white cell culture plate Greiner 655098
100 mm x 20 mm cell culture dish BD Falcon 353003
Class II biological safety cabinet with laminar flow
Cell culture incubator, with 5% CO2
Centrifuge, with swinging bucket rotor for 15-ml conical tubes
Infinite F200 plate reader Tecan
Phase-contrast microscope with x10 and x20 objectives
Spectrophotometer
Sterile reagent reservoirs for multichannel distribution
Sterile paper towel

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References

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