라이브 셀 측정의 Odorant 수용 체 활성화를 사용 하 여 분석 결과 실시간 캠프

* These authors contributed equally
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Odorant 수용 체의 기능을 특성화 deorphanization 과정에서 필수적인 부분을 제공 합니다. 우리 캠프 분석 결과 사용 하 여 실시간으로에서 odorant 수용 체의 활성화를 측정 하는 방법을 설명 합니다.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Zhang, Y., Pan, Y., Matsunami, H., Zhuang, H. Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay. J. Vis. Exp. (128), e55831, doi:10.3791/55831 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

포유류 odorant 수용 체 (OR) 가족의 거 대 한 크기는 수많은 휘발성 화학 물질 가운데 그들의 동족 ligands를 찾는 데 어려움을 제시. 효율적이 고 정확 하 게 ORs deorphanize, 우리 표현 포유류 ORs와 유전자 변형된 바이오 센서 플라스 미드 실시간으로 또는 활성화의 하류 캠프 생산을 측정 하는 분리 셀 라인의 사용을 결합. 이 분석 결과 ORs와 반대로화면 odorants을 사용할 수 있습니다. 화면에서 긍정적인 odorant 수용 체 상호 작용 이후에 다양 한 악취 농도, 농도-응답 곡선을 생성에 대 한 테스트 하 여 확인할 수 있습니다. 여기 우리는 인간 또는 라이브러리 Hana3A 세포에 표현 하 고 긍정적으로 반응 하는 수용 체의 화합물에 대 한 동족 수용 체 확인 향기로운 화합물의 높은 처리량 검열을 수행 하기 위해이 방법을 사용. 우리 효율적이 고 또는 활성화 평가에 신뢰할 수 있는 것이 높은 처리량 탐지 방법을 발견 하 고 우리의 데이터 또는 기능 연구에 그것의 잠재적인 사용의 예를 제공.

Introduction

냄새의 감각을 음식을 얻기, 육 식 동물 및 위험 방지, 종, 구분 선택 메이 트1,2의 후 각 능력에 의존 하는 그들은 동물의 생존에 중요 한 역할을 재생 합니다. 이러한 기능의 실현 odorant 수용 체 (ORs), 후 각 상피 (OE)에 위치한 후 각 감각 신경 (OSNs)의 속눈썹 표면에 개별적으로 표현 되는에 따라 다릅니다. ORs 구성 최대 약 400와 1200 다양 한 OR 유전자 인간에서 G-단백질 결합 수용 체 (GPCR) superfamily의 가족 및 마우스, 각각3,4,5. ORs odorants에 의해 활성화 후 각 G-단백질 (Golf)의 순차적 활성화를 통해 증가 시킨된 세포내 캠프 수준 이어질 고 III adenylyl 있고 (ACIII)를 입력 합니다. 세포내 캠프의 결과 증가 수준 두 번째 메신저, 세포 표면에 뉴클레오티드 개폐 통로 열어, 트리거링 양이온 등 캘리포니아2 + 활동 전위, 그리고 궁극적으로 시작의 유입으로 작동할 수 있습니다. 신경-잠재적인 전송 그리고 후 각 지 각입니다. 감지 하 고 ORs로 odorants의 많은 수를 감 별 하는 과정은 후 각 지 각6,7의 첫 번째 단계로 간주 된다.

때문에 벅과 악 셀8 먼저 성공적으로 복제 odorant 수용 체 ORs에서 시작 하는 후 각 인식의 메커니즘을 해명, 또는 가족의 deorphanization이이 필드에 핫스팟 중 하나가 되었다. 다양 한 에 비보, ex vivo 생체 외에서 메서드와 OR 활성화를 측정 하는 보고 된9,10,,1112되었습니다. 캘리포니아2 + 영상 단일 셀 RT-PCR OSNs에 다음을 사용 하는 전통적인 방법 지방 족 odorants13,,1415다른 ORs의 식별을 사용할 수 있습니다. 더 최근에, 대규모 transcriptome 분석의 등장 더 많은 비보에 높은 처리량 방법의 개발 추진. 켄터키 분석 결과 eugenol 및 muscone 응답 마우스 ORs S100a5 tauGFP 기자 마우스 긴장과 microarray 분석9를 사용 하 여 식별합니다. Odorant 노출 후 또는 mRNA 수준에서 감소에 따라, 꿈의 기술 고용 모두 척추 및 비 척추 동물16OR 활성화 프로필을 확인 하려면 transcriptomic 접근. Matsunami 신경 활성화에 s 6의 인 산화를 감안할 때, 응답 ORs12식별 phosphorylated 리보솜 immunoprecipitations에서 시퀀스 된 mRNAs를 유사 하 게, 그룹. 마지막으로, 파인 그룹 슈퍼 스니퍼 쥐 냄새에서 vivo에서, MouSensor 기술17로 알려진 코딩을 공부 하는 플랫폼으로 서 역할을 수 있는 보고.

생체 외에서 영역에서 OSNs 경작의 도전은 OR 기능 식에 vivo에서 모방 분리 식 시스템 ORs 향기로운 화학 제품의 대규모 심사를 실시 하 이상적인 솔루션입니다. 그럼에도 불구 하 고, 이후 네이티브 OSNs에서 다 비 후 각 근원의 경작된 셀 라인 또는 단백질 바인딩과 그물에 원형질 막에 트래픽을 수 없습니다 유지 됩니다, 또는 저하 및 수용 체 기능18 의 손실에 결과 , 19.이 문제를 해결 하려면 광범위 한 작품을 만들어왔다 OR 기능 식 분리 세포의 세포 막에 복제. Krautwurst 외. 먼저 연결할 rhodopsin (Rho-태그)의 처음 20 아미노산 또는 단백질의 N 맨끝 그리고이 승진 (HEK) 인간 미 발달 신장 세포20일부 ORs의 세포 표면 표현. 단일 OSNs에서 진 식 (세이 지) 도서관 분석의 직렬 분석을 실시 하 여 사이토 . 먼저 수용 체 수송 단백질 (RTP) 가족 구성원, RTP1, RTP2, 및 수용 체 식 증강 단백질 1 (REEP1) 또는 세포 막에 매매를 촉진 하 고 ORs에서 HEK293T 셀 의 응답 odorant 중재 하는 복제 21. 이러한 결과에 따라, Matsunami 그룹 Hana3A 세포 라인을 설립 성공적으로, 안정적으로 HEK293T에서 RTP1, RTP2, REEP1, 및 Gαolf 와 페 고 뚜렷이 효율적인 또는 기능에 대 한로 태그 ORs와 페 식입니다. 후속 연구 1) 짧은 형태의 RTP1, RTP1S, 홍보 하거나 원래 RTP1 단백질과 2) 유형 3 muscarinic 아 세 틸 콜린 수용 체 (M3R) β-arrestin-2의 억제를 통해 또는 활동을 향상 시킬 수 있는 보다 기능 더 견고 하 게 수 있는 공개 모집, 둘 다 최적화 실험을 분리 표현 시스템에 도입 되었다22,23출력.

여러 가지 검색 방법은 분리 시스템에서 수용 체 활성화를 계량에 사용 되었습니다. 은닉 placental 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (SEAP) 분석 결과 또는 활성화를 평가 하기 위한 매력적인 옵션을 기자 효소 transcriptionally 캠프 응답 요소 (CREs)에 의해 규제로 작동 합니다. 형광은 SEAP 검출 시 약24를 가진 외피 후 문화 매체의 샘플에서 쉽게 감지 된다. 이 메서드를 사용 하 여 아민 관련 수용 체 (TAARs) 되어 OE는 추적 표현 chemosensory 수용 체의 보조 클래스 ORs의 기능25,,2627특징. 또 다른 일반적인 방법은, luciferase 분석 결과, 야영지 응답 성분 (CRE)의 제어에서 반딧불 luciferase 취재 원 유전자를 사용합니다. Luciferase 생산에 의해 생성 된 발광 측정 또는 활성화10,,1128측정의 효율적이 고 강력한 수단을 제공 합니다.

실시간 캠프 분석은 또한 널리 사용 되었습니다 분리 또는 생 GPCRs의 함수를 동적으로 모니터링. 이러한 고급 분석 실험의 한 예로 유전자 인코딩된 바이오 센서 변종, 돌연변이 형태의 luciferase 융합 캠프 바인딩 도메인을 보유 하 고 활용 합니다. 캠프 묶을 때 구조적 변화 luciferase, 있는 발광 다음 화학 리더29,30으로 측정 될 수 있다의 활성화에 지도 한다. 실시간 캠프 기술 드 HEK293 NxG 108CC15 세포에 인간의 odorant 수용 체의 분리에 적합 보고 되었습니다.엉덩이 = "외부 참조" > 31,,3233, 뿐만 아니라 HEK293T에서 파생 된 Hana3A34,35세포로. 또한 Krautwurst 그룹 양방향 대규모 또는 검사 방법32,33에 적합 하도록 실시간 캠프 기술을 자세히 설명 합니다.

여기는 Hana3A 세포에서 실시간 캠프 분석 결과 사용 하 여 또는 활성화를 측정 하기 위한 프로토콜에 설명 합니다. 이 프로토콜에서 미리 equilibrated 라이브 셀의 발광 운동 측정 30 분 다음 특정 휘발성 화합물과 치료, 보다 효율적이 고 정확한 분석에 덜 취약 또는 활성화의 대표 연장 시간과 냄새 유발 세포 독성 세포 환경에서 발생 하는 아티팩트 이 실시간 측정 ORs의 ligands, 대규모 심사로 관심의 특정 또는 ligand 쌍의 수 있습니다. 이 방법을 사용 하 여, 우리가 성공적으로 OR5AN1로 식별 사향 복합 muscone에 대 한 수용 체 379 인간의 ORs에 대 한 심사를 수행 하 고 이후에 긍정적인 심사 결과 확인 하 여.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Culturing 및 유지 보수의 Hana3A 셀

  1. 최소 필수 매체 (MEM)와 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 100의 10 mL에 있는 유지 세포 µ g/mL 페니실린-스, 그리고 1.25 µ g/mL 암포 B 100 m m 5% CO 2와 37 ° C 세포 문화 인큐베이터에서 셀 문화 요리. 모든 다른 통로와 1 µ g/mL puromycin 플라스 (참조 소개)의 안정 되어 있는 transfection를 유지 하기 위해 추가.
    참고: 클래스 II 생물 안전 캐비닛 되도록 무 균 환경에서에서 세포 배양과 관련 된 모든 단계를 수행 하십시오.
  2. 100mm 요리 2-3 일 마다 10-20%의 비율로 subculture.

2. Transfection에 대 한 셀을 도금

  1. 세포 생존 능력을 보장 하 고 합류 추정 단계 대조 현미경 Hana3A 세포 관찰.
  2. 세포 배양 접시에서 모든 매체를 발음.
  3. 접시에 10 mL의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)를 추가 하 고, 접시, 소용돌이, PBS 발음 하 여 세포를 씻어.
  4. 접시에 0.05 %trypsin 에틸렌 diamine tetraacetic 산 (EDTA) 3 mL를 추가합니다. 믹스 1 분 또는 때까지 모든 셀이 해상.
    참고: 필요에 따라 현미경 아래 접시의 하단에서 분리 하는 세포의 진행을 관찰.
  5. 비활성화 trypsin 10 %FBS 피 펫의 덩어리 헤어를 위아래로 MEM의 5 mL을 추가 하 여 셀 미사
    참고: transfection 전에 도금, 사용 매체 없어야 항생제 합니다. 항생제의 추가 transfection 효율 저하 될 수 있습니다.
  6. 페 수에 번호판의 수에 따라 15-mLl 튜브에 세포의 적절 한 금액을 전송. 각 96 잘 접시, 접시 2 x 10 6 셀, 또는 100% confluent 100 mm 접시의 약 1/5, 주는 2 x 10의 세포 수 4 셀 잘 또는 약 15-30% 합류의 밀도 잘 당. 5 분 동안 200 x g에서 튜브 원심 및 셀 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한 발음.
    참고: 셀 overgrowing 또는 자극 전에 셀 undergrowing을 피하기 위해 96 잘 접시에 도금 될 올바른 금액 계산.
  7. 10% FBS 15 mL로 튜브 위쪽 및 아래쪽 플라스틱 셀의 덩어리 헤어 대용량 메모리의 적절 한 금액을 추가 합니다. 각 96 잘 접시 resuspend 10 %MEM 6 mL와 함께 셀 FBS.
    참고: 수 튜브에 공기 방울을 생성 하지 않도록 주의 하십시오.
  8. 는 저수지로 정지 셀을 추가합니다. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여, 96 잘 접시의 각 음에 셀의 50 µ L 플라스틱. 5% CO 2와 37 ° C에서 밤새 품 어.

3. 플라스 미드의 transfection

  1. transfection, 이전 관찰 단계 대조 현미경 잘 당 약 30-50%의 적절 한 합류를 보장 하는 인큐베이터 돌아갑니다 도금된 셀.
  2. 준비 미리로 태그 또는 구성 11 , 21 , , 22 28, 액세서리 요소 구성 (RTP1S 22 , 36과 M3R 23), 바이오 센서 변종 구성 29 , 30 miniprep에 의해. DNA 농도 분 광 광도 계에 의해 측정 하 고 필요에 따라 증류수와 플라스 미드 DNA 농도 (예를 들어, 100 ng / µ L을)을 조정.
  3. Transfection 혼합물의 준비
    1. 표 1에 따라 각 96 잘 접시 MEM의 500 µ L에 플라스 미드 transfection 혼합물 준비.
      참고: 다른 ORs 같은 96 잘 접시에 테스트 하는 경우 transfection 혼합물 및 플라스 미드 DNA 추가 금액의 볼륨 해야 합니다 적응 주어진된 OR와 transfected 우물의 수의 기능에.
    2. 준비 transfection 지질 중재 시 약 MEM.의 500 µ L에서의 18 µ L 튜브에 transfection 혼합물
  4. 아래로 pipetting transfection 혼합물으로 플라스 미드 혼합물을 혼합. 15 분에 대 한 실 온에서 품 어
  5. 10 %MEM 5 mL을 추가 하 여 반응을 중지 FBS.
  6. 셀 문화 후드에서 무 균 종이 타 올의 두꺼운 층에 밖으로 퍼졌다. 인큐베이터에서 셀 96 잘 접시를 가져가 라. 매체는 종이 타월에 의해 완전히 흡수 되도록 부드럽게 하 고 반복적으로 접시 종이 타월의 더미에 거꾸로 누릅니다.
    참고: 않습니다 하지 강제로 또는 갑자기 들어오기 접시 하나의 세포를 잃을 수.
  7. 결합된 transfection 혼합물의 50 µ L 96 잘 접시의 각 음을 하 고 5% CO 2와 37 ℃에서 18-24 h에 대 한 밤새 품 어.
    참고: 시간 관리 transfection 자극 일정 앞에 야 측정 하나 이상의 96 잘 접시는 모든 접시 transfection 동시 자극 노출 시간 후 측정 하기 위해서는 한 실험에서 테스트 했을 때.

4. 자극 및 측정 또는 실시간 캠프 분석 결과 사용 하 여 활동

  1. transfected 세포를 잘 당 50-80%의 적절 한 합류 보장 인큐베이터에 단계 대조 현미경 관찰.
  2. 5 m m 10 mM hydroxyethyl piperazineethanesulfonic 산 (HEPES)를 추가 하 여 행 크에 포도 당 자극 매체를 준비 ' s 균형 소금 솔루션 (HBSS).
  3. 녹여 얼음에 실시간 캠프 분석 결과 기질 시 약 aliquots. PCR 튜브에 기질 시 약 55 µ L 튜브 당에서-80 ° C에 저장 합니다. 접시 당 1 튜브 사용.
  4. 2750 µ L HBSS/HEPES/포도 당 솔루션의 기판 시 약 55 µ L를 혼합 하 여 2% 재래식 솔루션 준비.
  5. 벤치에 종이 타 올의 두꺼운 층에 밖으로 퍼졌다. Transfection 매체는 종이 타월에 의해 완전히 흡수 되도록 부드럽게 하 고 반복적으로 접시 종이 타월에 거꾸로 누릅니다.
  6. 각 잘 HBSS/HEPES/포도 당 솔루션의 pipetting 50 µ L로 세포 세척.
  7. 부드럽게 하 고 반복적으로 96 잘 접시에서 HBSS/HEPES/포도 당 솔루션에 밖으로 두드리는.
  8. 각 2% 재래식 솔루션의 피 펫 25 µ L 고 2 헤 대 한 어둠 속에서 실 온에서 품 어
  9. 준비 사전에 1 M DMSO에-20 ° C까지 사용에서 저장소 odorant 재고 솔루션.
  10. 이전 보육 시간의 끝에 희석 HBSS/HEPES/포도 당 자극 매체에서 작업 농도 odorant 재고 솔루션.
    참고:이 단계에서 준비 odorant 희석 농도 각 잘에서 올바른 최종 농도를 두배로 한다.
  11. 플레이트 리더는 화학을 사용 하 여 및 odorant 추가 하기 전에 잘 34 당 1000 밀리초의 속도에서 2 연속 번 접시의 기저 발광 수준 측정.
  12. 는 플레이트 리더에서 접시를 신속 하 게 제거를 각 잘을 25 µ L odorant 희석을 추가 하 고 즉시 20 사이클에 대 한 모든 우물의 연속 발광 측정을 시작 30 분 이내
    참고: 피 펫 주변 오염 방지 하려면 신중 하 게 우물 같은 접시의 다른 odorants 또는 동일한 odorants의 다른 농도 사용 하 여 때.

5. 데이터 분석

  1. 화학 플레이트 리더 소프트웨어에서 데이터를 내보냅니다.
  2. 계산 수식을 사용 하 여 각 시간 지점에 대 한 응답 또는 정규화
    (발광 N – 발광 기저) / (발광 높은 – 발광 기저)
    어디 N = 특정의 발광 값 잘; 기저 기저 2의 평균 발광 값 = 발광 값; 최고 = 접시의 가장 높은 발광 값 또는 격판덮개의 세트.
    참고: 실험의 목적에 따라 대체 그래픽 표현은 채택 될 수 있다. 심사 분석 ( 그림 1 참조) 예를 들어 고 농도-응답 곡선, 최대값 등 운동 측정 중 원하는 시간에 특정 잘 발광 값을 생성 또는 최종 값을 사용할 수 있습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Muscone 천연 사향에서 주요 향기로운 구성 요소입니다. 최근은 muscone 및 마우스 또는, MOR215-1, 쥐37,38행동에 muscone 응답 glomeruli에서 복제에 상 동에 따라 다른 macrocyclic 사향 화합물에 대 한 인간의 수용 체로 확인 된 OR5AN1을 공부 한다. 또한 인간 또는 레 퍼 토리, 우리의 그룹 및 Touhara 그룹을 심사 하 여 OR5AN1 2 macrocyclic 사향 화합물, cyclopentadecanone 및 muscone, 주요 수용 체로 서 각각 사용 하 여 식별 luciferase 분석 결과 시스템38,39 .

여기 설명 된 캠프 실시간 분석 결과 사용 하 여, 우리는 30 µ M muscone (그림 1)에 대 한 인간의 또는 레 퍼 토리를 상영. 379 인간의 ORs 상영 중 다른 ORs와 부정적인 컨트롤 (아니 냄새 제어 및 빈 벡터 제어) 중요 한 응답을 표시 하지 않았다 하는 동안 OR5AN1 muscone, 저명한 응답으로 나왔다. 긍정적인 통제는 30 µ M 사향 tibetene, OR5AN1에 대 한 리간드에 대 한 OR5AN1를 테스트 (데이터 되지 않은), ORs의 응답 muscone 정상화 하는 데 사용 되었다. 데이터의이 세트의 그래픽 표현에 대 한 우리 시간 포인트를 선택 하는 때 최대 발광 읽기 30 µ M 사향 tibetene에 대 한 OR5AN1에 대 한 달성 했다.

우리는 다음 냄새의 농도-응답 관계 검사-muscone의 3 다른 농도 또는 쌍. Muscone muscone 추가 후 처음 20 분 동안 테스트의 각 농도 대 한 응답 OR5AN1에 의해 점차적으로 증가 하 고 아니 냄새 뿐만 아니라 제어 (0 µ M muscone)에 대 한 추적을 유지 하는 동안 다음 마지막 10 분 (그림 2A)에서 plateaued 상대적으로 평평한. Muscone의 높은 농도 측정을 통해 구별할 수 있는 낮은 사람 보다 강한 또는 응답을 되 살려. 마지막 시간 포인트를 사용 하 여 운동 측정에서 우리 농도 응답 곡선을 생성 하 고 곡선의 극대 효과 (EC50) 값의 50%에 대 한 농도 20.82 µ M (그림 2B) 것으로 추정 된다.

Figure 1
그림 1: 인간의 ORs muscone의에 대 한 검사.
379 독특한 인간의 ORs 30 µ M muscone 실시간 캠프 분석 결과 사용 하 여에 대 한 상영 했다. 컬러 블록 따라는 x-축 다른 인간의 OR 가족을 나타냅니다. 모든 열에 x-축 30 µ M 사향 tibetene (긍정적인 통제), HBSS/HEPES/포도 당 솔루션 (아니 냄새 부정적인 제어), OR5AN1의 응답에 대 한 OR5AN1의 응답은 마지막 세 개의 열을 제외 하 고 단일 또는 형식을 나타냅니다 그리고 왼쪽에서 오른쪽 30 µ M muscone (한 빈 벡터 부정적인 제어), 하로 pCI의 응답. y-축 나타냅니다 odorant 추가 후 30 분에 정규화 된 발광 응답 긍정적인 통제에 대 한 최대에 도달 하는 때 (N = 3). 모든 응답은 긍정적인 통제에 정규화 됩니다. 오차 막대는 평균을 표준 오차 (SEM)을 나타냅니다. 명확성을 위해, 양수 오류 막대만 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: muscone OR5AN1의 응답의 운동 측량.
(다른 농도와 아니 냄새 부정적인 통제 muscone OR5AN1 정품 인증의 A) 실시간 측정 odorant 추가의 30 분 이내 수행 했다. 화살표는 odorant 추가의 시간 포인트를 나타냅니다. (B) 농도-응답 muscone odorant 추가 후 30 분에 대 한 OR5AN1의 곡선. y-축을 나타내는 정규화 된 발광 (N = 3). 모든 응답은 100 µ M muscone에 가장 높은 응답을 정규화 됩니다. 오차 막대를 나타내는 SEM. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

플라스 미드 96 잘 접시 (µ g) 당 금액
로-또는 5
RTP1S 1
M3R 0.5
캠프 바이오 센서 변종 1

표 1: transfection 혼합물의 구성 요소입니다.
96 잘 접시 양의 노 당-또는, RTP1S, M3R, 그리고 실시간 캠프 바이오 센서 변형 플라스 미드.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

특정 odorant에 노출 시 OR의 활성화를 정확 하 게 측정 하는 것은 후 각 정보의 코딩을 해독에 첫걸음 이다. 어떻게 하나의 예로 식별할 수는 생체 외에서 사용 하 여이 연구 대표 OR 식 시스템, 관심 및 이후에 수용 체의 향기가 있는 화학에 대 한 인간의 또는 레 퍼 토리 가운데 응답 ORs 에서처럼 실험 약리학은 화학 물질의 다양 한 농도 사용 하 여입니다. 우리의 결과 muscone에 대 한 진실 fide 수용 체로 OR5AN1를 확인합니다. 이것은 이전 보고서39 와 일치 하 고 수용 체 수가 적은 사향 냄새27,40감지에 관련 된 추측에 대 한 추가 증거를 제공 합니다. 사토-Akuhara 그 외 여러분 luciferase 분석 결과 유사 하거나 분리 식 시스템에 의해 생성 되는에서 심사 데이터와 비교, 검사 결과 약간 더 신호 대 잡음 비율을 했다. 관련 된 다른 기술에 변이 외 출력에 차이가 사실은 우리가 낮은 muscone 농도 (30 µ M 100 µ M)를 사용 수 있습니다. 사토-Akuhara 그 외 여러분 자신의 luciferase 분석 결과 시스템에서 얻은 것과 동일한 크기 순서의에서 muscone 실시간 캠프 분석 결과 통해 얻은 우리에 대 한 OR5AN1의 농도 응답 곡선의 EC50 값은 하는 사실, 다른 검색 방법을 사용 하는 경우는 같은 분리 또는 식 시스템도에 대 한 비교 결과 보여 주고 있습니다. 또 다른 연구에서는, 우리의 그룹 odorants의 작은 수 있었다 유일한 활성 전 아니지만 후자는 실시간 캠프 시스템 평가 OR2T11 수용 체 선택성, luciferase 리포터 유전자 시스템 보다 약간 더 민감한 있을 수 있습니다 발견 시스템35. Geithe 그 외 여러분 에 의해 보고 되는 데이터의 시리즈와 비교 했을 때 (+)에 대 한 OR1A1에 31 -carvone muscone ORs와 사용 하는 odorants의 다른 종류에서 발생할 수 있습니다 직접 고원에 도달 하는 데 필요한 시간에 지연이 보여주었다 OR5AN1에 우리의 데이터. 우리 그룹에서 보고 다른 실시간 캠프 분석 결과 데이터, 우리는 또한 ORs와 odorants,3435에 따라 피크를 다양 한 번 보였다. 또한, ORs를 표현 하는 데 사용 하는 다른 셀 라인, 다른 기판 사용, 다른 실시간 캠프 바이오 센서 변형 플라스 미드, 화학 플레이트 리더, 다른 실험 조건에 변화 등의 다른 감도 실내 온도, 모든 발광 출력의 변화에 기여할 수 있습니다.

실시간 캠프 분석 결과 또는 활성화를 측정 하기 위한 다른 방법에 비해 몇 가지 장점을 보여줍니다. 첫째, 비슷한 luciferase 취재 원 유전자 분석 결과, 실시간 캠프 분석 결과 odorants에 응답 하는 또는 레파토리의 높은 처리량 id의 추가적인 생체 외에서 수단을 제공 합니다. 대규모 수용 체 또는 odorant 화면 실시간 캠프 분석 결과 의해 많은 양의 수용 체-냄새 접시의 작은 수를 사용 하 여 연결에 대 한 정보를 제공할 수 있습니다. 때 luminometers와 pipetting 로봇 사용할 수 있습니다, 여기에 설명 된 96 잘 프로토콜은 덜 플라스 미드 DNA에서에서 384-잘 형식으로 쉽게 업그레이드할 수 있습니다 및 시 약은 데이터 출력의 단위 당 필요. 둘째, 실시간 캠프 방법은 실시간으로 캠프의 세포내 농도 변화를 측정입니다. 실시간 캠프는 내 생에 더 유사한 비 용균성, 라이브 셀 조건 하에서 isimplemented 시험 날짜 또는 활동을 측정 하는 데 사용 하는 대부분 분석 실험은 형광 또는 화학 기반 끝점 감지 필요한 세포 세포의 용 해, 상황과 캠프 수준에 변화의 모니터링 활성화. 셋째, 상대적으로 짧은 시간 실시간 방법을 수행 해야 합니다. Luciferase 리포터 유전자 발현에 의존, 또는 기능의 또 다른 높은 처리량 분석 방법은 실험을 완료 하는 데 냄새 자극 후 추가 4 h 필요 합니다. 경우에 따라 장시간된 냄새 외피 간격 과도 노출 완화 효과적으로 셀에 잠재적인 odorant 독성 발생할 수 있습니다. 또한, 긴-지속적인 실험에서 동일한 격판덮개에 다른 odorants 또는 동일한 odorant의 다른 농도 사용 하 여 때 휘 발 하 여 이웃 우물의 오염 가능성 또한 증가 된다. 냄새 또한 다음 즉시 감지 실시간 캠프 분석 결과 신속 하 고 신뢰할 수 있는 패러다임을 만든다.

실시간 캠프의 한계를 측정 하기 위한 시험 또는 활성화는 다음과 같습니다. 첫째, 분석 결과 생체 외에서 우리의 부족 네이티브 후 각 감각 신경의 많은 생 분자 HEK293T 파생 셀 라인에 기반. 또한, 수용 성 단백질 및 효소 전환 비 강 점액에서 발생 하는 odorants에 바인딩하려면 및 있습니다 또는 odorants에 대 한 선호도 영향을 미칠. 따라서, 분리 시스템에서 활성화 및 냄새 튜닝 vivo에서 상황에서 달라질 수 있습니다. 둘째, 주어진된 odorant ORs의 식별 적어도 주어진 종의 전체 또는 레 퍼 토리를 필요합니다. ORs GPCRs의 큰 가족과 또는 단백질 인간에서의 숫자 이며 마우스는 매우 큰4,,541. 상당한 시간과 노력이 각 OR 레 퍼 토리의 복제에 관련 될 수 있습니다. 셋째, 비록 OR 분리 식 시스템 (예: Rho-태그) 또는 시퀀스 수정 및 일부 (예: RTP1S 및 M3R) 키 또는 액세서리 단백질 포함, 우리 용의자 모든 ORs의 세포 막에 기능적으로 표현 되는 HEK293T에서 파생 된 셀입니다. 따라서, 응답은 특정 odorant에서 생체 외에서 의 부재 또는 응답에서 vivo에서, 일부 ORs 저조한 세포 표면에 표현 하 고 그들의 ligands를 인식할 수 없습니다에 그냥 있을 수 있습니다 사실 결과로 반드시 배제 하지 않습니다. 따라서, 언제 든 지 가능한 실시간 캠프 해야 사용할 수 함께 다른 생체 외에서 그리고 vivo에서 분석 실험에에서 더 설득력 있는 결과를 얻을.

몇 가지 중요 한 단계는 실시간 캠프 분석 결과 중 여분의 관심을 부여 되어야 합니다. 첫째, 발광을 일반적으로 포함 하는 실험에 대 한 온도 온도 증가 감소 광 출력의 기저 및 유도 수준 및 온도 감소 증가 광 출력으로 실험의 결과 영향을 미치는 핵심 요소 이다. 따라서, 사전에 instrume의 정상 온도에 번호판 평형nt odorant 추가 전에 온도 변화에 의해 발생 하는 결과에 영향을 피하기 위해 필요 합니다. 둘째, 실제 상황에 따라 실시간 캠프 분석 결과 기질 시 약의 농도 조정 한다. 기저 발광 화학 플레이트 리더의 최저 검출 임계값에 도달에 실패 하면 하나를 신호 증가 기질 농도 증가 하는 것이 좋습니다. 마지막으로, 부착 셀 라인 되 고, 불구 Hana3A 세포 실험 기간 동안 분리 수 있습니다. 발음 또는 추가 매체, 우물의 측에 피 펫 팁을 배치 셀 단층의 파괴를 최소화할 수 있습니다. 또한 셀을 셀의 짙은 반점으로 세포를 overgrowing 피하기 위해 적절 한 하 고 균일 한 밀도에 매체의 변화 하는 동안 껍질을 하는 경향이 접시에 중요 하다.

식별 이외에 대 한 관심, 실시간 캠프 분석 결과 odorant OR(s)를 사용할 수 있습니다 주어진된 OR에 대 한 동족 ligands에 대 한 화면을 때 화학 물질의 라이브러리를 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 적절 한 세포 종류와 transfection 조건 사용 하는 분석 결과 고 수 있습니다 또한 overexpressed 또는 내 생 적인 GPCR 활성화의 검출에 대 한 허용 농도 의존 응답 곡선 주 작동 근 그리고 길 항 근에 대 한 제공.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgements

작품은 중국 국립 과학 재단 (31070972), 과학 및 기술 위원회의 상하이 시 (16ZR1418300), 혁신적인 연구 팀의 상하이 시 교육 위원회, 상하이 동부에 대 한 프로그램에 의해 지원 되었다 학술 프로그램 (J50201), 그리고 중국 (2012CB910401)의 국가 기본 연구 프로그램.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amphotericin B Sigma A2942
DMSO Sigma D2650
FBS Gibco 10099-141
GloSensor cAMP reagent Promega E1290
pGloSensor-20F cAMP plasmid Promega E1171
Hana3A cells available from authors upon request
HBSS, without calcium or magnesium GIBCO 14175095
HEPES Hyclone SH30237
Lipofectamine2000 Invitrogen 11668-019
M3R plasmid cloned into a mammalian expression vector such as pCI
MEM, with EBSS and L-glutamine Hyclone SH30024
Muscone Santa Cruz sc-200528
Musk tibetene Sigma-Aldrich S359165
OR plasmids cloned with a Rho-tag into a mammalian expression vector such as pCI
PBS, without calcium or magnesium Cellgro 21-040-CV
Penicillin-streptomycin Hyclone SV30010
Plasmid miniprep kit Tiangen DP103-03
Puromycin Sigma P8833
RTP1S plasmid cloned into a mammalian expression vector such as pCI
Trypsin-EDTA Hyclone SH30236
0.2-mL PCR tube Axygen PCR-02-C
1.5-mL Eppendorf tube Eppendorf
15-mL 17 mm x 120 mm conical tube BD Falcon 352096
8-well and/or 12-well multichannel pipetman Eppendorf
96-well flat-bottomed white cell culture plate Greiner 655098
100 mm x 20 mm cell culture dish BD Falcon 353003
Class II biological safety cabinet with laminar flow
Cell culture incubator, with 5% CO2
Centrifuge, with swinging bucket rotor for 15-ml conical tubes
Infinite F200 plate reader Tecan
Phase-contrast microscope with x10 and x20 objectives
Spectrophotometer
Sterile reagent reservoirs for multichannel distribution
Sterile paper towel

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Malakoff, D. Following the scent of avian olfaction. Science. 286, (5440), 704-705 (1999).
  2. Zippel, H. P. The ecology of vertebrate olfaction: D.M. Stoddart. Chapman and Hall, Andover, Great Britain, 1980. £15.00, 234 pp. ISBN 0-412-21820-8. Behav Processes. 7, (2), 198-199 (1982).
  3. Dryer, L., Berghard, A. Odorant receptors: a plethora of G-protein-coupled receptors. Trends Pharmacol Sci. 20, (10), 413-417 (1999).
  4. Zhang, X., Firestein, S. The olfactory receptor gene superfamily of the mouse. Nat Neurosci. 5, (2), 124-133 (2002).
  5. Glusman, G., Yanai, I., Rubin, I., Lancet, D. The complete human olfactory subgenome. Genome Res. 11, (5), 685-702 (2001).
  6. Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat Rev Neurosci. 5, (4), 263-278 (2004).
  7. Reed, R. R. After the holy grail: establishing a molecular basis for Mammalian olfaction. Cell. 116, (2), 329-336 (2004).
  8. Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65, (1), 175-187 (1991).
  9. McClintock, T. S., et al. In vivo identification of eugenol-responsive and muscone-responsive mouse odorant receptors. J Neurosci. 34, (47), 15669-15678 (2014).
  10. Trimmer, C., Snyder, L. L., Mainland, J. D. High-throughput analysis of mammalian olfactory receptors: measurement of receptor activation via luciferase activity. J. Vis. Exp. (88), e51640 (2014).
  11. Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Sci Signal. 2, (60), ra9 (2009).
  12. Jiang, Y., et al. Molecular profiling of activated olfactory neurons identifies odorant receptors for odors in vivo. Nat Neurosci. 18, (10), 1446-1454 (2015).
  13. Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96, (5), 713-723 (1999).
  14. Touhara, K., et al. Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, (7), 4040-4045 (1999).
  15. Kajiya, K., et al. Molecular bases of odor discrimination: Reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants. J Neurosci. 21, (16), 6018-6025 (2001).
  16. von der Weid, B., et al. Large-scale transcriptional profiling of chemosensory neurons identifies receptor-ligand pairs in vivo. Nat Neurosci. 18, (10), 1455-1463 (2015).
  17. D'Hulst, C., et al. MouSensor: A Versatile Genetic Platform to Create Super Sniffer Mice for Studying Human Odor Coding. Cell Rep. 16, (4), 1115-1125 (2016).
  18. Lu, M., Echeverri, F., Moyer, B. D. Endoplasmic reticulum retention, degradation, and aggregation of olfactory G-protein coupled receptors. Traffic. 4, (6), 416-433 (2003).
  19. McClintock, T. S., et al. Functional expression of olfactory-adrenergic receptor chimeras and intracellular retention of heterologously expressed olfactory receptors. Brain Res Mol Brain Res. 48, (2), 270-278 (1997).
  20. Krautwurst, D., Yau, K. W., Reed, R. R. Identification of ligands for olfactory receptors by functional expression of a receptor library. Cell. 95, (7), 917-926 (1998).
  21. Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119, (5), 679-691 (2004).
  22. Zhuang, H., Matsunami, H. Synergism of accessory factors in functional expression of mammalian odorant receptors. J Biol Chem. 282, (20), 15284-15293 (2007).
  23. Li, Y. R., Matsunami, H. Activation state of the M3 muscarinic acetylcholine receptor modulates mammalian odorant receptor signaling. Sci Signal. 4, (155), ra1 (2011).
  24. Durocher, Y., et al. A reporter gene assay for high-throughput screening of G-protein-coupled receptors stably or transiently expressed in HEK293 EBNA cells grown in suspension culture. Anal Biochem. 284, (2), 316-326 (2000).
  25. Liberles, S. D., Buck, L. B. A second class of chemosensory receptors in the olfactory epithelium. Nature. 442, (7103), 645-650 (2006).
  26. Saraiva, L. R., et al. Combinatorial effects of odorants on mouse behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, (23), E3300-E3306 (2016).
  27. Nara, K., Saraiva, L. R., Ye, X., Buck, L. B. A large-scale analysis of odor coding in the olfactory epithelium. J Neurosci. 31, (25), 9179-9191 (2011).
  28. Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nat Protoc. 3, (9), 1402-1413 (2008).
  29. Fan, F., et al. Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase. ACS Chem Biol. 3, (6), 346-351 (2008).
  30. Fan, B. F., Wood, K. V. Live-Cell Luminescent Assays for GPCR Studies: Combination of Sensitive Detection and Real-Time Analysis Expands Applications. Genetic Engineering & Biotechnology News. 29, 30-31 (2009).
  31. Geithe, C., Andersen, G., Malki, A., Krautwurst, D. A Butter Aroma Recombinate Activates Human Class-I Odorant Receptors. J Agric Food Chem. 63, (43), 9410-9420 (2015).
  32. Noe, F., et al. OR2M3: A Highly Specific and Narrowly Tuned Human Odorant Receptor for the Sensitive Detection of Onion Key Food Odorant 3-Mercapto-2-methylpentan-1-ol. Chem Senses. 42, (3), 195-210 (2016).
  33. Geithe, C., Noe, F., Kreissl, J., Krautwurst, D. The broadly tuned odorant receptor OR1A1 is highly selective for 3-methyl-2,4-nonanedione, a key food odorant in aged wines, tea, and other foods. Chem Senses. 42, (3), 181-193 (2016).
  34. Duan, X., et al. Crucial role of copper in detection of metal-coordinating odorants. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (9), 3492-3497 (2012).
  35. Li, S., et al. Smelling Sulfur: Copper and Silver Regulate the Response of Human Odorant Receptor OR2T11 to Low-Molecular-Weight Thiols. J Am Chem Soc. (2016).
  36. Wu, L., Pan, Y., Chen, G. Q., Matsunami, H., Zhuang, H. Receptor-transporting protein 1 short (RTP1S) mediates translocation and activation of odorant receptors by acting through multiple steps. J Biol Chem. 287, (26), 22287-22294 (2012).
  37. Shirasu, M., et al. Olfactory receptor and neural pathway responsible for highly selective sensing of musk odors. Neuron. 81, (1), 165-178 (2014).
  38. Block, E., et al. Implausibility of the vibrational theory of olfaction. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (21), E2766-E2774 (2015).
  39. Sato-Akuhara, N., et al. Ligand Specificity and Evolution of Mammalian Musk Odor Receptors: Effect of Single Receptor Deletion on Odor Detection. J Neurosci. 36, (16), 4482-4491 (2016).
  40. Gane, S., et al. Molecular vibration-sensing component in human olfaction. PLoS One. 8, (1), e55780 (2013).
  41. Young, J. M., et al. Different evolutionary processes shaped the mouse and human olfactory receptor gene families. Hum Mol Genet. 11, (5), 535-546 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics