Live-cel meting van Odorant Receptor activering met behulp van een Real-time cAMP Assay

* These authors contributed equally
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Karakterisering van de functie van odorant receptoren serveert een onmisbaar onderdeel in het proces van deorphanization. Beschrijven we een methode voor het meten van de activering van odorant receptoren in real time via een kamp assay.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Zhang, Y., Pan, Y., Matsunami, H., Zhuang, H. Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay. J. Vis. Exp. (128), e55831, doi:10.3791/55831 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

De enorme grootte van de zoogdieren odorant receptor (OR) families moeilijkheden te vinden hun cognaat liganden onder talrijke vluchtige stoffen opleveren. Om efficiënt en accuraat deorphanize ORs, combineren we het gebruik van een heteroloog cellijn uitspreken zoogdieren ORs en een plasmide genetisch gemodificeerde biosensor voor het meten van cAMP productie stroomafwaarts van de activering van de OR in real-time. Deze test kan worden gebruikt om scherm odorant tegen ORs en vice versa. Positieve odorant-receptor interacties van de schermen kunnen vervolgens worden bevestigd door testen tegen verschillende concentraties van de geur, het genereren van concentratieresponskrommen. Hier wordt deze methode gebruikt voor het uitvoeren van een high-throughput screening van een geurige samengestelde tegen een menselijke OR bibliotheek uitgedrukt in Hana3A cellen en bevestigd dat de receptor positief reageert de cognaat receptor voor de verbinding van belang. Wij vonden dit high-throughput detectiemethode efficiënt en betrouwbaar bij de beoordeling van de activering van de OR en onze gegevens geven een voorbeeld van het mogelijke gebruik ervan in OR functionele studies.

Introduction

De betekenis van geur speelt een belangrijke rol in dieren overleven als ze op hun olfactorische capaciteiten vertrouwen te verkrijgen van voedsel, vermijden van roofdieren en gevaar onderscheiden soorten en selecteer partner1,2. De realisatie van deze functies is afhankelijk van de odorant receptoren (ORs), die individueel worden uitgedrukt aan de Ciliaire oppervlakte van olfactorische sensorische neuronen (OSNs) gelegen in de olfactorische epitheel (OE). ORs vormen de grootste familie van de superfamilie G-eiwit gekoppelde receptor (GPCR) met ongeveer 400 en 1200 verschillende OR genen in mens en muis, respectievelijk3,4,5. ORs geactiveerd door odorant leiden tot verhoogde intracellulaire cAMP niveaus via de sequentiële activering van olfactorische G-eiwit (Golf) en type III adenylyl cyclase (ACIII). Het resulterende verhoogde niveau van intracellulaire cAMP kon functioneren als een tweede boodschapper, die de nucleotide-gated kanaal op het celoppervlak opent, triggering toestroom van kationen met inbegrip van Ca2 + en actie potentieel, en uiteindelijk initiëren Neuro-potentieel transmissie en de olfactorische waarneming. Het proces voor het opsporen en discrimineren van een groot aantal reukstoffen door ORs wordt beschouwd als de eerste stap van olfactorische waarneming6,7.

Aangezien Buck en Axel8 eerst succesvol gekloond odorant receptoren en het mechanisme van de olfactorische waarneming geïnitieerd door ORs opgehelderd, werd deorphanization van de OR-familie één van de hotspots op dit gebied. Verschillende in vivo, ex vivo en in vitro methoden voor het meten van de activering van de OR zijn gerapporteerde9,10,11,12. Een traditionele methode die gebruikt Ca2 + imaging gevolgd door eencellige RT-PCR op OSNs ingeschakeld de identificatie van verschillende ORs tot en met alifatische odorant13,14,15. Meer recentelijk, de komst van grootschalige transcriptome analyses bevorderd de ontwikkeling van meer high-throughput in vivo methoden. De Kentucky assay geïdentificeerd eugenol - en Muskon-responsieve muis ORs met het gebruik van de S100a5-tauGFP verslaggever muis stam en microarray analyse9. Op basis van de afname van de OR mRNA niveaus na odorant blootstelling, de droom-technologie gebruikt een transcriptomic aanpak om OR activering profielen in beide soorten gewervelde en niet-gewervelde16. Ook, gezien de fosforylatie van S6 in neuronale activeringen, de Matsunami groep gesequenceerd mRNAs van gefosforyleerd ribosoom immunoprecipitations te identificeren responsieve ORs12. Tot slot de Feinstein groep gerapporteerd super sniffer muizen die als een platform om te studeren geur codering in vivo dienen kunnen, bekend als de MouSensor technologie17.

In de in vitro rijk maakt de uitdaging van het kweken van OSNs een heteroloog expressie systeem dat OR functionele expressie in vivo bootst een ideale oplossing voor het uitvoeren van grootschalig onderzoek van geurige chemicaliën voor ultraperifere regio's. Niettemin, aangezien gekweekte cellijnen van niet-olfactorische oorsprong van inheemse OSNs verschillen, of eiwitten in het endoplasmatisch reticulum en kunnen verkeer naar het plasmamembraan zijn behouden, resulterend in OR afbraak en verlies van receptor functie18 , 19. om dit probleem oplossen, uitgebreide werken zijn aangebracht om te repliceren de functionele expressie OR op de celmembraan in heterologe cellijnen. Krautwurst et al. eerst de eerste 20 aminozuren van rodopsine (Rho-tag) gekoppeld aan de N-terminal OR eiwit en dit bevorderd de celoppervlak expressie van sommige ultraperifere regio's in menselijke embryonale nier (HEK) cellen20. Door het uitvoeren van een seriële analyse van gen expressie (SALIE) bibliotheek analyse van één OSNs, Saito et al. eerst gekloond receptor-transport eiwit (RTP) familieleden, RTP1 en RTP2 en de receptor expressie enhancer eiwit 1 (REEP1), dat vergemakkelijkt OR mensenhandel aan de celmembraan en verbeterde odorant-gemedieerde reacties van ultraperifere regio's in de cellen van de HEK293T 21. op basis van deze bevindingen, de Matsunami-Fractie gebracht de cellijn van Hana3A, stabiel transfected met RTP1, RTP2, REEP1 en Gαolf in HEK293T en Transient transfected met Rho-gelabeld ORs, voor efficiënte of functionele expressie. Latere studies bleek 1) een korter vorm van RTP1, RTP1S, die meer krachtig kunnen bevorderen of functioneren dan de oorspronkelijke RTP1 eiwitten en 2) het type 3 muscarinerge acetylcholine receptor (M3R) die, OR activiteiten via remming van β-arrestin-2 verhogen kan werving, die beide met het heterologe expressie systeem kennisgemaakt voor het optimaliseren van experimentele output22,23.

Verschillende detectiemethoden zijn gebruikt om het kwantificeren van receptor activering in heterologe systemen. De assay secreted placenta alkalisch fosfatase (SEAP) werkt met een verslaggever enzym transcriptionally geregeld cAMP response-elementen (CREs), waardoor het een aantrekkelijke optie zijn voor de beoordeling van de activering van de OR. De fluorescentie wordt het gemakkelijk ontdekt in een monster van het kweekmedium na de incubatie met SEAP detectie reagens24. Met behulp van deze methode, de functies van de ultraperifere regio's, alsmede een tweede klasse aanwezig receptoren uitgedrukt in de OE-de trace amine-geassocieerde receptoren (TAARs) zijn gekenmerkt25,26,27. Een andere gemeenschappelijke methode, de luciferase assay, gebruikt een firefly luciferase verslaggever gen onder de controle van de cAMP respons-element (CRE). Meten van luminescentie gegenereerd door luciferase productie biedt een efficiënte en robuuste middel OR activering10,11,28te kwantificeren.

Real-time cAMP testen hebben ook wijd gebruikt in dynamisch toezicht op de functie van heterologe of endogene GPCRs. Een voorbeeld van deze geavanceerde gehaltebepalingen maakt gebruik van een genetisch gecodeerde biosensor variant, die beschikt over een cAMP-bindend domein gesmolten tot een gemuteerde vorm van luciferase. Wanneer kamp bindt, leidt de conformationele verandering tot het activeren van luciferase, luminescentie waaruit vervolgens kan worden gemeten met een chemiluminescentie lezer29,30. De real-time cAMP technologie is geschikt voor de-orphaning van menselijke odorant receptoren in de cellen van de HEK293 en NxG 108CC15 gemeldAss = "xref" > 31,32,33, zoals alsook in de Hana3A HEK293T-afgeleide cellen34,35. De Krautwurst-groep ook beschreven in detail de cAMP technologie in real time te geschikt voor grootschalige of screening benaderingen van de bi-directionele32,33.

Hier beschrijven we een protocol voor het meten van de activering van de OR met behulp van een real-time cAMP assay in Hana3A cellen. In dit protocol wordt de luminescentie van levende cellen vooraf zijn geëquilibreerd kinetisch gemeten gedurende 30 minuten na de behandeling met specifieke vluchtige stoffen, die een meer efficiënte en nauwkeurige analyse van de activering van de OR die zijn minder gevoelig voor artefacten die zich in de cellulaire omgeving met langdurig en geur-geïnduceerde cel toxicities voordoen. Deze real-time meting voorziet in een grootschalig onderzoek van zowel de ultraperifere regio's en de liganden, evenals karakterisering van bepaalde OR-ligand paren van belang. Met behulp van deze methode, wij met succes genoemd OR5AN1 de receptor voor de muskus samengestelde Muskon door het uitvoeren van een screening tegen 379 menselijke ORs en vervolgens bevestigt het resultaat positieve screening.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Culturing en onderhoud van de cellen van de Hana3A

  1. behouden cellen in 10 mL van minimale essentiële medium (MEM) met 10% foetale runderserum (FBS), 100 µg/mL penicilline-streptomycine en 1,25 µg/mL amfotericine B in een 100-mm cel cultuur schotel in een 37 ° C cel cultuur incubator met 5% CO 2. Met elke andere passage, voeg 1 µg/mL puromycin te handhaven van stabiele transfectie van plasmiden (Zie Inleiding).
    Opmerking: Voer alle stappen uit met betrekking tot de cultuur van de cel in een klasse II biologische veiligheidskast om steriele omgeving.
  2. Subcultuur in een verhouding van 10-20% in gerechten elke 2-3 dagen van de 100 mm.

2. Plating cellen voor Transfectie

  1. observeren de Hana3A cellen onder een Microscoop fase contrast om de levensvatbaarheid van de cellen en te schatten samenvloeiing.
  2. Alle medium uit de cel cultuur schotel gecombineerd.
  3. Wassen van cellen door het toevoegen van 10 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) op het bord, zwenken van de schotel en de PBS aspirating.
  4. Voeg 3 mL 0,05% trypsine-Dinatriumethyleendiaminetetra-azijnzuuroplossing (NA2EDTA) op het bord. Mix voor 1 min of totdat alle cellen drijven zijn.
    Opmerking: Observeren de voortgang van cellen loskoppelen van de onderkant van de plaat onder de Microscoop desgewenst.
  5. Inactivate trypsine door toevoeging van 5 mL van MEM met 10% FBS en Pipetteer omhoog en omlaag te breken van de brokken van cel mass.
    Opmerking: Voor plating vóór transfectie, het medium gebruikt mogen geen antibiotica. Toevoeging van antibiotica kan afnemen transfectie efficiëntie.
  6. Overbrengen een passend bedrag van cellen in een buis 15-mLl afhankelijk van het aantal platen om te zijn transfected. Voor elke 96-wells-plaat, plaat 2 x 10 6 cellen of ongeveer 1/5 van een 100% confluente 100 mm schotel, geeft een telling van de cel van 2 x 10 4 cellen per well of een dichtheid van ongeveer 15-30% samenvloeiing per putje. Centrifugeer buizen bij 200 x g gedurende 5 min en gecombineerd de bovendrijvende vloeistof zonder verstoring van de cel-pellet.
    Opmerking: Berekening van de juiste hoeveelheid cellen worden verguld op 96-wells-platen om te voorkomen dat de woekerende of undergrowing cellen voorafgaand aan stimulatie.
  7. Toevoegen een passend bedrag van MEM met 10% FBS in de 15-mL tube en Pipetteer omhoog en omlaag te breken brokken van de cel massa. Resuspendeer de cellen met 6 mL MEM met 10% voor elke 96-wells-plaat, FBS.
    Opmerking: Wees voorzichtig niet te genereren van luchtbellen in de buis.
  8. De zwevende cellen toevoegen in een reservoir. Met behulp van een meerkanaalspipet, Pipetteer 50 µL van cellen op elk putje van een 96-wells-plaat. Na een nacht bebroeden bij 37 ° C met 5% CO 2.

3. De transfectie van plasmiden,

  1. vóór transfectie, observeren de vergulde cellen zorgen voor een juiste samenloop van ongeveer 30-50% per putje onder een Microscoop fase contrast en terugkeren naar de incubator.
  2. Voorbereiden op voorhand de Rho-gelabeld OR construct 11 , 21 , 22 , 28, de bijkomende factor construeert (RTP1S 22 , 36 en M3R 23), en de biosensor variant 29 , 30 door miniprep te bouwen. Kwantificeren van de DNA-concentratie door een spectrofotometer en plasmide DNA concentraties (bv naar 100 ng/µL) met gedestilleerd water zonodig aanpassen.
  3. Voorbereiding van de transfectie mengsels
    1. een plasmide transfectie mengsel in 500 µL van MEM voorbereiden op elke 96-wells-plaat volgens tabel 1.
      Opmerking: Wanneer verschillende ORs worden getest op de dezelfde 96-wells-plaat, het volume van het mengsel van de transfectie en het bedrag van de plasmide DNA toegevoegd moet aangepast worden in functie van het aantal transfected putjes met een bepaalde OR.
    2. Voorbereiden een transfectie mengsel in een buis met 18 µL van lipide-gemedieerde transfectiereagens in 500 µL van MEM.
  4. Meng het plasmide mengsel met het mengsel van de transfectie door pipetteren omhoog en omlaag. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten
  5. Zet de reactie stop door toevoeging van 5 mL van MEM met 10% FBS.
  6. Uit een dikke laag van steriele papieren handdoeken in de kap van de cel cultuur verspreid. Neem een 96-wells-plaat met cellen uit de incubator. Zachtjes en herhaaldelijk onttrekt de plaat ondersteboven op de stapel papieren handdoek zodat het medium wordt volledig geabsorbeerd door de keukenrol.
    Opmerking: Doen niet krachtig of abrupt Tik op de plaat als een cellen kon verliezen.
  7. Breng 50 µL van het mengsel van gecombineerde Transfectie aan elk putje van de 96-wells-plaat en na een nacht bebroeden voor 18-24 uur bij 37 ° C met 5% CO 2.
    Opmerking: Een tijd gestuurde transfectie en stimulatie schema moet voorafgaan aan de meting wanneer meer dan één 96-wells-plaat worden getest in één experiment om alle platen gemeten na de transfectie tegelijkertijd en stimulans belichtingstijd.

4. Stimulatie en meten of activiteit met behulp van de Real-Time kamp Assay

  1. observeren transfected cellen onder een Microscoop fase contrast zorgen voor een juiste samenloop van 50-80% per putje en terugkeren naar de incubator.
  2. Bereiden van het medium stimulatie door toevoeging van 10 mM hydroxyethyl piperazineethanesulfonic zuur (HEPES) en 5 mM glucose te Hank ' s evenwichtig zout oplossing (HBSS).
  3. Ontdooi de real-time cAMP assay substraat reagens aliquots op ijs. Bewaar substraat reagens bij-80 ° C bij 55 µL per buis in PCR buizen. Gebruik 1 tube per plaat.
  4. 2% oplossing voor te bereiden door het mengen van 55 µL van het substraat reagens en 2750 µL HBSS/HEPES/glucose oplossing.
  5. Verspreid met een dikke laag keukenpapier op de Bank. Zachtjes en herhaaldelijk onttrekt de plaat ondersteboven op de papieren handdoek zodat het medium van de transfectie is volledig geabsorbeerd door de keukenrol.
  6. Wassen van de cellen door pipetting HBSS/HEPES/glucose oplossing aan elk putje 50 µL.
  7. Voorzichtig en herhaaldelijk onttrekt uit de HBSS/HEPES/glucose-oplossing van de 96-wells-plaat.
  8. Pipetteer 25 µL van 2% oplossing aan elk goed en Incubeer bij kamertemperatuur in donker voor 2 h.
  9. Bereiden op voorhand 1 M odorant voorraadoplossingen in DMSO en opslag bij-20 ° C tot gebruikt.
  10. Voorafgaand aan het eind van de incubatietijd, Verdun de voorraadoplossingen van odorant aan werkende concentraties in HBSS/HEPES/glucose stimulatie middellange.
    Opmerking: De concentraties van de odorant verdunningen bereid in deze stap moeten worden verdubbeld om de opbrengst van de juiste eindconcentraties in elk putje.
  11. Met behulp van een chemiluminescentie plaat lezer en vóór toevoeging van odorant, meten van het niveau van de basale luminescentie van de plaat voor 2 opeenvolgende keer met een snelheid van 1000 ms per goed 34.
  12. Snel de plaat uit de afleesapparaat verwijderen en toevoegen van 25 µL odorant verdunningen aan elk putje en onmiddellijk beginnen met het continu luminescentie meting van alle putjes voor 20 cycli binnen 30 min.
    Opmerking: Pipetteer zorgvuldig om te voorkomen dat besmetting van naburige wells bij het gebruik van verschillende reukstoffen en/of verschillende concentraties van de dezelfde odorant in de dezelfde plaat.

5. Data-analyse

  1. de gegevens exporteren vanuit de software van de lezer van de plaat van Chemoluminescentie.
  2. Berekenen genormaliseerd OR antwoord voor elk punt van de tijd met behulp van de formule
    (luminescentie N – luminescentie basale) / (luminescentie hoogste – luminescentie basale)
    waar N = luminescentie waarde van een bepaalde goed; basale = gemiddelde luminescentie waarde van de twee basale luminescentie waarden; hoogste = de hoogste waarde van de luminescentie van een plaat of een reeks platen.
    Opmerking: Afhankelijk van het doel van het experiment, alternatieve grafische voorstellingen kunnen worden aangenomen. Bijvoorbeeld voor screening tests (Zie Figuur 1) en voor het genereren van de concentratieresponskrommen, de waarde van de luminescentie van een bepaalde bron op een gewenste tijdstip tijdens de kinetische meting, zoals de maximale waarde of de verkoopcommissie, inzetbaar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Muskon is het hoofdbestanddeel van de aromatische van natuurlijke musk. De nieuwste studies geïdentificeerde OR5AN1 als een menselijke receptor voor Muskon en andere macrocyclische muskus-verbindingen op basis van homologie naar de muis of, MOR215-1, gekloond uit Muskon-responsieve glomeruli in muizen37,38gedragen. Door screening van de menselijke OR repertoire, onze fractie en de Fractie van de Touhara ook genoemd OR5AN1 een belangrijke receptor voor twee macrocyclische musk verbindingen, cyclopentadecanone en Muskon, respectievelijk, met behulp van de luciferase assay systeem38,39 .

Gebruik de real-time cAMP assay beschreven hier, we de menselijke OR repertoire tegen 30 µM Muskon (Figuur 1) gescreend. Onder de 379 menselijke ORs gescreend, ontstaan OR5AN1 met een prominente reactie aan Muskon, terwijl de andere ultraperifere regio's en de negatieve controles (de neen-geurcontrole en de lege vectorbestrijding) geen een significante reactie vertonen. De positieve controle wordt OR5AN1 getoetst door 30 µM musk muskustibetine, een ligand voor OR5AN1 (ongepubliceerde gegevens), en werd gebruikt om de ultraperifere regio's reactie op Muskon normaliseren. Voor de grafische weergave van deze gegevens pakte we het punt van de tijd wanneer de maximale luminescentie lezing werd bereikt voor OR5AN1 tegen 30 µM musk muskustibetine.

Vervolgens onderzochten we de concentratie-respons relatie van de geur-OR paar met 3 verschillende concentraties van Muskon. Voor elke concentratie van Muskon getest, tijdens de eerste 20 min na Muskon toevoeging, de reactie van OR5AN1 geleidelijk verhoogd en vervolgens plateaued in de laatste 10 min (figuur 2A), terwijl het spoor voor de toevoeging van neen-geur-controle (0 µM Muskon) bleef relatief vlakke. Hogere concentraties van Muskon opgeroepen sterker OR reacties dan lagere degenen, die is te onderscheiden in de meting. Met behulp van het laatste punt van de tijd van de kinetische meting, we genereerden een concentratie-responscurve en de concentratie voor 50% van maximaal effect (EG50) waarde van de curve wordt geschat op 20.82 µM (figuur 2B).

Figure 1
Figuur 1: Screening voor menselijke ORs van Muskon.
379 unieke menselijke ORs waren gescreend tegen 30 µM Muskon met behulp van de real-time cAMP assay. Gekleurde blokken langs de x-as geven verschillende menselijke OR families. Voor elke kolom op de x-as vertegenwoordigt een enkel type van de OR met uitzondering van de laatste drie kolommen, die de reactie van OR5AN1 op 30 µM musk muskustibetine (een positieve controle), de reactie van OR5AN1 op de HBSS/HEPES/glucose oplossing (een neen-negatieve geurcontrole), en de reactie van Rho-pCI naar de 30 µM Muskon (een lege vector negatieve controle), van links naar rechts. y-as vertegenwoordigt genormaliseerde luminescentie op 30 min na toevoeging van odorant wanneer de respons een maximum voor de positieve controle bereikt (N = 3). Alle reacties zijn genormaliseerd naar de positieve controle. Foutbalken vertegenwoordigen standaardfout gemiddelde (SEM). Voor de duidelijkheid, worden alleen positieve foutbalken weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Kinetische metingen van de reactie van OR5AN1 op Muskon.
(A) real-time metingen van OR5AN1 activering door Muskon van verschillende concentraties en een neen-geur negatieve controle werden uitgevoerd binnen 30 min van odorant toevoeging. Pijl geeft aan dat het punt van de tijd van odorant toevoeging. (B) concentratie-responscurve van OR5AN1 tegen Muskon op 30 min na toevoeging van odorant. y-assen vertegenwoordigen genormaliseerde luminescentie (N = 3). Alle reacties worden genormaliseerd om de hoogste respons op 100 µM Muskon. Foutbalken vertegenwoordigen SEM. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Plasmide Bedrag per 96-wells-plaat (µg)
Rho- of 5
RTP1S 1
M3R 0,5
cAMP biosensor variant 1

Tabel 1: Componenten van het mengsel van de transfectie.
Per 96-wells-plaat bedrag van het Rho-OR, RTP1S, M3R, en de real-time cAMP biosensor variant plasmiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nauwkeurig meten van een OR activering bij blootstelling aan een bepaalde odorant is de eerste stap in het ontcijferen van de codering van de olfactorische informatie. De experimenten aangetoond in deze studie vertegenwoordigen die een voorbeeld van hoe men identificeren kan, met behulp van een in vitro OR expressie systeem, responsieve ORs onder de menselijke OR repertoire voor de geurige chemische stof van belang en vervolgens het karakteriseren van de receptor farmacologie met behulp van verschillende concentraties van de stof. Onze resultaten bevestigen OR5AN1 als een bona fide -receptor voor Muskon. Dit strookt met een eerdere verslag39 en biedt verder bewijs voor de speculatie dat slechts een klein aantal receptoren zijn betrokken bij de muskus geur27,40sensing. Toen vergeleken met de gegevens van de screening van Sato-Akuhara et al. dat wordt gegenereerd door de bepaling van de luciferase op een vergelijkbare of heterologe expressie systeem, onze screening resultaten toonde iets slechter signal-to-noise verhouding. Naast de variaties die inherent zijn aan de verschillende technieken die betrokken zijn zou het verschil in de uitvoer wijten aan het feit dat we een lagere concentratie Muskon (30 µM vs. 100 µM) gebruikt. In feite, is de EC50 -waarde van de concentratie-responscurve van OR5AN1 tegen Muskon die we via de real-time cAMP bepaling verkregen in dezelfde orde van grootte als degene die Sato-Akuhara et al. in hun luciferase assay systeem verkregen, tonen vergelijkbare resultaten voor hetzelfde heterologe OR expressie systeem zelfs wanneer verschillende detectiemethoden worden gebruikt. In een andere studie vond onze fractie dat het real-time cAMP systeem iets gevoeliger dan de luciferase reporter gene systeem bij de beoordeling van de OR2T11 receptor selectiviteit, zijn kan gezien het feit dat een klein aantal odorant alleen actief in de voormalige maar niet in de laatste waren systeem35. In vergelijking met de reeks gegevens gerapporteerd door Geithe et al. 31 op OR1A1 tegen (+)-carvone, onze gegevens op OR5AN1 tegen Muskon toonde een vertraging in de tijd die nodig is om te bereiken plateau, dat zou kunnen rechtstreeks afkomstig is van de verschillende soorten ORs en odorant gebruikt. In andere real-time cAMP assay gegevens gemeld uit onze fractie, toonden we ook verschillende keren om afhankelijk van de ultraperifere regio's en odorant34,35hoogtepunt te bereiken. Bovendien verschillende cellijnen gebruikt om te drukken ORs, verschillende substraat gebruikt, verschillende real-time cAMP biosensor variant plasmiden, verschillende gevoeligheid van de Chemoluminescentie afleesapparaat, en/of verschillende experimentele omstandigheden, zoals variatie in kamertemperatuur, kunnen allemaal bijdragen aan de variaties in luminescentie uitvoer.

De real-time cAMP assay toont verschillende voordelen ten opzichte van andere methoden voor het meten van de activering van de OR. Eerste, vergelijkbaar met de luciferase reporter gene bepaling, de real-time cAMP assay zorgt een extra in vitro van high-throughput identificatie van OR repertoires reageren op odorant. Grootschalige receptor en/of odorant schermen door de real-time cAMP bepaling kunnen bieden een grote hoeveelheid informatie over receptor-geur in paren rangschikken met het gebruik van een klein aantal platen. Wanneer geavanceerde luminometers en pipetting robots zijn beschikbaar, het protocol van de 96-Wells hier beschreven kan eenvoudig worden opgewaardeerd naar een 384-well-indeling, in welke nog minder plasmide DNA en reagentia nodig per eenheid van de output van de gegevens. Ten tweede, de real-time cAMP methode is geschikt voor het meten van veranderingen in de intracellulaire concentratie van kamp in real-time. Terwijl de meeste testen gebruikt om te meten OR activiteit tot nu toe zijn fluorescentie - of Chemoluminescentie-gebaseerde eindpunt detectie vereisen lysis van de cel, het real-time kamp assay isimplemented voorwaarden niet-lytische, live-cel die meer lijken op de endogene situatie en die inschakelen van veranderingen in de cAMP-controle. Ten derde, een relatief korter is vereist voor het uitvoeren van de real-time methode. Een ander high-throughput analysemethode van OR-functie, die op een luciferase verslaggever genexpressie steunt, moet een extra 4 h na de stimulatie van de geur aan het voltooien van een experiment. In sommige gevallen kan een langdurige geur incubatie interval resulteren in potentiële odorant toxiciteit voor cellen, die effectief is verlicht voorbijgaande onderbelichting. In langduriger experimenten, worden daarnaast ook de kans op besmetting van naburige putten door vervluchtiging bij het gebruik van verschillende reukstoffen en/of verschillende concentraties van de dezelfde odorant in de dezelfde plaat verhoogd. Onmiddellijke detectie na toevoeging van de geur maakt de real-time cAMP bepaling een snelle en betrouwbare paradigma.

De beperkingen van het real-time kamp assay voor het meten of activering is als volgt. Ten eerste, onze in vitro -assay is gebaseerd op een HEK293T afkomstige cellijn die vele endogene moleculen van inheemse olfactorische sensoriële neuronen ontbeert. Bovendien, oplosbare eiwitten en enzymatische conversies die zich voordoen in de neus slijm kunnen binden met reukstoffen en/of OR de affiniteit voor odorant beïnvloeden. Activering in het heterologe systeem kan daarom afwijken van de in vivo situatie op het gebied van gevoeligheid en afstemmen van de geur. Ten tweede, de identificatie van ultraperifere regio's voor een bepaalde odorant vereist een hele OR repertoire van ten minste een bepaald soort. Ultraperifere regio's zijn een grote familie van GPCRs en het aantal OR eiwitten in mens en muis zijn zeer grote4,5,41. Veel tijd en inspanning kunnen worden betrokken bij het klonen van elk OR-repertoire van belang. Ten derde, hoewel de OR heterologe expressie systeem bevat OR reeks wijzigingen (zoals het Rho-tag) en een aantal van de belangrijkste of accessoire eiwitten (zoals RTP1S en M3R), we vermoeden dat niet alle ORs functioneel worden uitgedrukt op de celmembraan van de HEK293T-afgeleide cellen. Daarom, het ontbreken van reacties op een bepaalde odorant in vitro noodzakelijkerwijs sluit geen OR reactie in vivo, als gevolg van het feit dat sommige ORs kunnen gewoon slecht uitgedrukt op het celoppervlak en onbekwaam om te erkennen hun liganden. Dus, wanneer mogelijk real-time kamp moet worden gebruikt in combinatie met andere in vitro en in vivo tests om meer overtuigende resultaten te verkrijgen.

Verschillende kritische stappen verdient extra aandacht tijdens de real-time cAMP assay. Eerste plaats voor het uittesten van luminescentie in het algemeen, is temperatuur een belangrijke factor die invloed op het resultaat van het experiment als stijging van de temperatuur basale en geïnduceerde niveaus van lichtopbrengst verlagen en afname van de temperatuur lichtopbrengst verhogen. Daarom, zo vooraf de platen aan de steady-state bedrijfstemperatuur van de GRINT vóór odorant toevoeging is noodzakelijk om te voorkomen dat de invloed op de resultaten veroorzaakt door temperatuurveranderingen. Ten tweede moeten de concentraties van het real-time cAMP assay substraat reagens worden aangepast volgens de werkelijke situatie. Wanneer de basale luminescentie niet tot de laagste drempel van de detectie van de Chemoluminescentie-afleesapparaat, overwegen een toenemende concentraties van het substraat te verhogen van signaal. Ten slotte, ondanks een aanhangend cellijn, Hana3A cellen kunnen loskoppelen tijdens het experiment. Wanneer zuigen of het toevoegen van het medium, kunt de uiteinden van de pipet plaatsen aan de zijkant van de put minimaliseren van verstoring van de cel enkelgelaagde. Het is ook belangrijk aan plaat cellen in een juiste en uniforme dichtheid te vermijden woekerende cellen als dichte vlekken van cellen de neiging om tijdens de verandering van medium afschilferen.

Naast het identificeren van OR(s) voor een odorant van belang, de real-time cAMP bepaling kan ook worden gebruikt aan het scherm voor cognaat liganden voor een bepaalde OR wanneer bibliotheken van chemische stoffen beschikbaar zijn. Tot slot, wanneer passende celtypes en transfectie voorwaarden worden gebruikt, kan de bepaling ook voldoende zijn voor de detectie van overexpressie of endogene GPCR activering en concentratie-afhankelijke respons-curven geven voor zowel agonisten en antagonisten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

Het werk werd gesteund door het Chinese National Science Foundation (31070972), de wetenschap en de technologie Commissie van Shanghai gemeente (16ZR1418300), het programma voor innovatieve onderzoek Team van Shanghai gemeentelijk onderwijs Commissie, de oostelijke Shanghai Geleerde programma (J50201), en het programma van de nationale fundamenteel onderzoek van China (2012CB910401).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amphotericin B Sigma A2942
DMSO Sigma D2650
FBS Gibco 10099-141
GloSensor cAMP reagent Promega E1290
pGloSensor-20F cAMP plasmid Promega E1171
Hana3A cells available from authors upon request
HBSS, without calcium or magnesium GIBCO 14175095
HEPES Hyclone SH30237
Lipofectamine2000 Invitrogen 11668-019
M3R plasmid cloned into a mammalian expression vector such as pCI
MEM, with EBSS and L-glutamine Hyclone SH30024
Muscone Santa Cruz sc-200528
Musk tibetene Sigma-Aldrich S359165
OR plasmids cloned with a Rho-tag into a mammalian expression vector such as pCI
PBS, without calcium or magnesium Cellgro 21-040-CV
Penicillin-streptomycin Hyclone SV30010
Plasmid miniprep kit Tiangen DP103-03
Puromycin Sigma P8833
RTP1S plasmid cloned into a mammalian expression vector such as pCI
Trypsin-EDTA Hyclone SH30236
0.2-mL PCR tube Axygen PCR-02-C
1.5-mL Eppendorf tube Eppendorf
15-mL 17 mm x 120 mm conical tube BD Falcon 352096
8-well and/or 12-well multichannel pipetman Eppendorf
96-well flat-bottomed white cell culture plate Greiner 655098
100 mm x 20 mm cell culture dish BD Falcon 353003
Class II biological safety cabinet with laminar flow
Cell culture incubator, with 5% CO2
Centrifuge, with swinging bucket rotor for 15-ml conical tubes
Infinite F200 plate reader Tecan
Phase-contrast microscope with x10 and x20 objectives
Spectrophotometer
Sterile reagent reservoirs for multichannel distribution
Sterile paper towel

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Malakoff, D. Following the scent of avian olfaction. Science. 286, (5440), 704-705 (1999).
  2. Zippel, H. P. The ecology of vertebrate olfaction: D.M. Stoddart. Chapman and Hall, Andover, Great Britain, 1980. £15.00, 234 pp. ISBN 0-412-21820-8. Behav Processes. 7, (2), 198-199 (1982).
  3. Dryer, L., Berghard, A. Odorant receptors: a plethora of G-protein-coupled receptors. Trends Pharmacol Sci. 20, (10), 413-417 (1999).
  4. Zhang, X., Firestein, S. The olfactory receptor gene superfamily of the mouse. Nat Neurosci. 5, (2), 124-133 (2002).
  5. Glusman, G., Yanai, I., Rubin, I., Lancet, D. The complete human olfactory subgenome. Genome Res. 11, (5), 685-702 (2001).
  6. Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat Rev Neurosci. 5, (4), 263-278 (2004).
  7. Reed, R. R. After the holy grail: establishing a molecular basis for Mammalian olfaction. Cell. 116, (2), 329-336 (2004).
  8. Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65, (1), 175-187 (1991).
  9. McClintock, T. S., et al. In vivo identification of eugenol-responsive and muscone-responsive mouse odorant receptors. J Neurosci. 34, (47), 15669-15678 (2014).
  10. Trimmer, C., Snyder, L. L., Mainland, J. D. High-throughput analysis of mammalian olfactory receptors: measurement of receptor activation via luciferase activity. J. Vis. Exp. (88), e51640 (2014).
  11. Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Sci Signal. 2, (60), ra9 (2009).
  12. Jiang, Y., et al. Molecular profiling of activated olfactory neurons identifies odorant receptors for odors in vivo. Nat Neurosci. 18, (10), 1446-1454 (2015).
  13. Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96, (5), 713-723 (1999).
  14. Touhara, K., et al. Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, (7), 4040-4045 (1999).
  15. Kajiya, K., et al. Molecular bases of odor discrimination: Reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants. J Neurosci. 21, (16), 6018-6025 (2001).
  16. von der Weid, B., et al. Large-scale transcriptional profiling of chemosensory neurons identifies receptor-ligand pairs in vivo. Nat Neurosci. 18, (10), 1455-1463 (2015).
  17. D'Hulst, C., et al. MouSensor: A Versatile Genetic Platform to Create Super Sniffer Mice for Studying Human Odor Coding. Cell Rep. 16, (4), 1115-1125 (2016).
  18. Lu, M., Echeverri, F., Moyer, B. D. Endoplasmic reticulum retention, degradation, and aggregation of olfactory G-protein coupled receptors. Traffic. 4, (6), 416-433 (2003).
  19. McClintock, T. S., et al. Functional expression of olfactory-adrenergic receptor chimeras and intracellular retention of heterologously expressed olfactory receptors. Brain Res Mol Brain Res. 48, (2), 270-278 (1997).
  20. Krautwurst, D., Yau, K. W., Reed, R. R. Identification of ligands for olfactory receptors by functional expression of a receptor library. Cell. 95, (7), 917-926 (1998).
  21. Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119, (5), 679-691 (2004).
  22. Zhuang, H., Matsunami, H. Synergism of accessory factors in functional expression of mammalian odorant receptors. J Biol Chem. 282, (20), 15284-15293 (2007).
  23. Li, Y. R., Matsunami, H. Activation state of the M3 muscarinic acetylcholine receptor modulates mammalian odorant receptor signaling. Sci Signal. 4, (155), ra1 (2011).
  24. Durocher, Y., et al. A reporter gene assay for high-throughput screening of G-protein-coupled receptors stably or transiently expressed in HEK293 EBNA cells grown in suspension culture. Anal Biochem. 284, (2), 316-326 (2000).
  25. Liberles, S. D., Buck, L. B. A second class of chemosensory receptors in the olfactory epithelium. Nature. 442, (7103), 645-650 (2006).
  26. Saraiva, L. R., et al. Combinatorial effects of odorants on mouse behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, (23), E3300-E3306 (2016).
  27. Nara, K., Saraiva, L. R., Ye, X., Buck, L. B. A large-scale analysis of odor coding in the olfactory epithelium. J Neurosci. 31, (25), 9179-9191 (2011).
  28. Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nat Protoc. 3, (9), 1402-1413 (2008).
  29. Fan, F., et al. Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase. ACS Chem Biol. 3, (6), 346-351 (2008).
  30. Fan, B. F., Wood, K. V. Live-Cell Luminescent Assays for GPCR Studies: Combination of Sensitive Detection and Real-Time Analysis Expands Applications. Genetic Engineering & Biotechnology News. 29, 30-31 (2009).
  31. Geithe, C., Andersen, G., Malki, A., Krautwurst, D. A Butter Aroma Recombinate Activates Human Class-I Odorant Receptors. J Agric Food Chem. 63, (43), 9410-9420 (2015).
  32. Noe, F., et al. OR2M3: A Highly Specific and Narrowly Tuned Human Odorant Receptor for the Sensitive Detection of Onion Key Food Odorant 3-Mercapto-2-methylpentan-1-ol. Chem Senses. 42, (3), 195-210 (2016).
  33. Geithe, C., Noe, F., Kreissl, J., Krautwurst, D. The broadly tuned odorant receptor OR1A1 is highly selective for 3-methyl-2,4-nonanedione, a key food odorant in aged wines, tea, and other foods. Chem Senses. 42, (3), 181-193 (2016).
  34. Duan, X., et al. Crucial role of copper in detection of metal-coordinating odorants. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (9), 3492-3497 (2012).
  35. Li, S., et al. Smelling Sulfur: Copper and Silver Regulate the Response of Human Odorant Receptor OR2T11 to Low-Molecular-Weight Thiols. J Am Chem Soc. (2016).
  36. Wu, L., Pan, Y., Chen, G. Q., Matsunami, H., Zhuang, H. Receptor-transporting protein 1 short (RTP1S) mediates translocation and activation of odorant receptors by acting through multiple steps. J Biol Chem. 287, (26), 22287-22294 (2012).
  37. Shirasu, M., et al. Olfactory receptor and neural pathway responsible for highly selective sensing of musk odors. Neuron. 81, (1), 165-178 (2014).
  38. Block, E., et al. Implausibility of the vibrational theory of olfaction. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (21), E2766-E2774 (2015).
  39. Sato-Akuhara, N., et al. Ligand Specificity and Evolution of Mammalian Musk Odor Receptors: Effect of Single Receptor Deletion on Odor Detection. J Neurosci. 36, (16), 4482-4491 (2016).
  40. Gane, S., et al. Molecular vibration-sensing component in human olfaction. PLoS One. 8, (1), e55780 (2013).
  41. Young, J. M., et al. Different evolutionary processes shaped the mouse and human olfactory receptor gene families. Hum Mol Genet. 11, (5), 535-546 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics