क्वांटिटेटिकल इमेजिंग तकनीकों का प्रयोग करके हिटरोकेल्लुलर जनसंख्या के भेदभाव और लक्षण वर्णन

Biology
 

Summary

गड़बड़ी के जवाब में हम हेटेरोसेल्यूलर जनसंख्या गतिशीलता के अध्ययन के लिए एक उपन्यास प्रोटोकॉल का विकास किया है। यह पांडुलिपि एक इमेजिंग-आधारित मंच का वर्णन करता है जो एक शक्तिशाली तरीके से हेटेरोसेल्यूलर आबादी के कई सेलुलर फ़िनोटाइप्स के एक साथ लक्षण वर्णन के लिए मात्रात्मक डेटासेट उत्पन्न करता है।

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Garvey, C. M., Gerhart, T. A., Mumenthaler, S. M. Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques. J. Vis. Exp. (124), e55844, doi:10.3791/55844 (2017).

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Abstract

सेलुलर प्रक्रियाएं जटिल हैं और कई सेल प्रकारों और उनके पर्यावरण के बीच परस्पर क्रिया से परिणाम। मौजूदा कोशिका जीव विज्ञान तकनीक अक्सर इस परस्पर क्रिया के सटीक व्याख्या की अनुमति नहीं देते हैं। मात्रात्मक इमेजिंग-आधारित दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, हम पर्यावरण उत्तेजनाओं में परिवर्तन के लिए विषम कोशिका आबादी की गतिशील फेनोटाइपिक प्रतिक्रियाओं ( यानी आकारिकी परिवर्तन, प्रसार, एपोपोसिस) को दर्शाने के लिए उच्च-सामग्री प्रोटोकॉल पेश करते हैं। हम आवेदन के आधार पर प्रतिदीप्ति तीव्रता या निहित आकारिकी विशेषताओं के आधार पर सेल प्रकार के बीच अंतर करने की हमारी क्षमता को हाइलाइट करते हैं। यह मंच परंपरागत कोशिका जीव विज्ञान के एल्स की तुलना में कम समय, अभिकर्मकों की छोटी मात्रा और त्रुटि की कम संभावना का उपयोग करते हुए उप-जनसंपर्क प्रतिक्रिया के अधिक व्यापक लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है। हालांकि, कुछ मामलों में, सेल की आबादी जटिल सेलू के आधार पर पहचान और मात्रा निर्धारित करना मुश्किल हो सकती हैLar सुविधाओं और अतिरिक्त समस्या निवारण की आवश्यकता होगी; हम प्रोटोकॉल में इन परिस्थितियों में से कुछ को उजागर करते हैं। हम कैंसर के मॉडल में दवा के जवाब का उपयोग करते हुए इस आवेदन को प्रदर्शित करते हैं; हालांकि, यह आसानी से अन्य शारीरिक प्रक्रियाओं के लिए अधिक मोटे तौर पर लागू किया जा सकता है यह प्रोटोकॉल किसी को सह-संस्कृति प्रणाली के भीतर उप-जनसांख्यिकी की पहचान करने और बाह्य उत्तेजनाओं के प्रत्येक के विशेष प्रतिक्रिया को चिह्नित करने की अनुमति देता है।

Introduction

सेल-आधारित assays बुनियादी अनुसंधान और दवा विकास सेटिंग्स में एक workhorse किया गया है हालांकि, इन मानक assays की सीमाएं इन विट्रो और नैदानिक ​​डेटा और एफडीए के अनुमोदन प्राप्त करने के लिए सबसे अधिक दवाओं की विफलता के बीच में अंतर के साथ तेजी से स्पष्ट हो गए हैं। यहां, हम प्रासंगिक, सह-उत्पन्न होने वाली पर्यावरणीय उत्तेजनाओं के जवाब में हेटेरोसेल्यूलर फेनोटाइप का विश्लेषण करने के लिए मात्रात्मक इमेजिंग का उपयोग करने के लिए एक उपन्यास विधि प्रस्तुत करते हैं।

पारंपरिक सेल-आधारित एसेज जो कि सेल व्यवहार्यता को मापने के लिए उपयोग किए जाते हैं उनमें शामिल हैं: ट्राइपैप नीली बहिष्कार एशेज, एमटीटी / एमटीएस, और एनेक्सिन वी-एफआईटीसी फ्लो साइटोमेट्री स्टेंसिंग। ट्रिपैन नीले बहिष्कार assays, जबकि सरल और सस्ती, बड़ी संख्या में कोशिकाओं की आवश्यकता होती है, समय लगता है, और अक्सर उपयोगकर्ता पूर्वाग्रह 1 से प्रभावित होता है। एमटीटी और एमटीएस की जांच अप्रत्यक्ष रूप से मिटोकोन्ड्रियल चयापचय दर की माप के माध्यम से सेल व्यवहार्यता को मापते हैं। हालांकि, चयापचय activiटी कोशिकाओं के विभिन्न संस्कृति स्थितियों (जैसे मीडिया या ऑक्सीजन एकाग्रता) से प्रभावित हो सकता है, जो गलत परिणामों की ओर जाता है और सेल प्रकार और शर्तों 2 , 3 में मानकीकरण को रोकता है। इन तकनीकों का एक और बड़ा नुकसान उनकी एकाधिक सेल प्रकारों के बीच अंतर करने में असमर्थता है - सबसे जैविक प्रणालियां हीरोकोसेल्युलर हैं। जबकि प्रवाह साइटमैट्री पद्धति में कई सेल आबादी के बीच अंतर करने की क्षमता होती है, सेल लेबल आवश्यक हैं, गतिशील नमूना चुनौतीपूर्ण है, और अनुयायी कोशिकाओं का उपयोग करते समय, यह अनुप्रयोग समय-उपभोक्ता और त्रुटि प्रवण बन जाता है।

अन्य महत्वपूर्ण सेलुलर फ़िनोटीप्प्स, जिसमें रूपवाचक परिवर्तन शामिल हैं, पर्यावरण उत्तेजनाओं के जवाब में होते हैं लेकिन पारंपरिक सेल-आधारित एसेज़ द्वारा नहीं पकड़े जाते हैं। प्रोफाइलिंग कोशिका के रूप में नमूनों में वर्णनात्मक लक्षण वर्णन और मानचित्रण समानता के माध्यम से एक शक्तिशाली, निष्पक्ष उपकरण हैमूल सेल जीव विज्ञान और दवा की खोज सहित बुनियादी और अनुवादिक अनुसंधान के कई पहलुओं में उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान करने की क्षमता 4 इसके अलावा, ट्यूमर सेल आकारिकी को ट्यूमर उपप्रकार 5 और आक्रामकता 6 के साथ सहसंबंधी होना दिखाया गया है। इसलिए, इन सेलुलर सुविधाओं का अध्ययन करने के लिए और यह कि वे विशिष्ट पर्यावरणीय परिवर्तनों से कैसे संबंधित हैं, यह बहुत रुचि है। इसके अतिरिक्त, एक सह-संस्कृति प्रणालियों में उप-जनसंख्या के बीच भेदभाव करने के लिए, रूपात्मक सुविधाओं में अंतर का उपयोग कर सकता है। फ्लोरोसेंटली लेबलिंग कोशिकाओं में गिरावट होती है ( यानी निहित सेल गुणों को बदलना, समय लेने वाली) और इसलिए सेल प्रकार वर्गीकृत करने के लिए अतिरिक्त तरीके लाभप्रद हैं।

माइक्रोस्कोपी-आधारित इमेजिंग एक मल्टीप्लेक्स, मात्रात्मक और मजबूत तरीके से सेलुलर फ़िनोइटिप्स के प्रोफाइलिंग के लिए एक वैकल्पिक तरीका है। इस पांडुलिपि में, हम विकास को उजागर करने के लिए हमारी मात्रात्मक इमेजिंग पाइपलाइन लागू करते हैंएक ट्यूमर के भीतर विषम सेल आबादी की नारी गतिशीलता। हम गैर-लघु सेल फेफड़े के कैंसर (एनएससीएलसी) कोशिकाओं और कैंसर-संबंधित फाइब्रोब्लास्ट (सीएएफ) के बीच बातचीत पर ध्यान देते हैं, ट्यूमर में पाए जाने वाले सबसे प्रचलित स्ट्रॉम्बल सेल प्रकार। सीएएफ ट्यूमर की दीक्षा, प्रगति और चिकित्सीय प्रतिक्रिया में निहित हैं; इसलिए, सीएएफ की अनुपस्थिति में ट्यूमर कोशिकाओं पर फेनोटाइपिक एनावेस करना 7 , 8 , 9 को गुमराह कर सकता है। विशेष रूप से, हम एरोलेटिनिब के जवाब में ट्यूमर कोशिकाओं पर सीएएफ के प्रभावों का मूल्यांकन करते हैं, एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर (ईजीएफआर) को लक्षित करने वाले एक छोटे अणु जो अक्सर एनएससीएलसी के नैदानिक ​​उपचार में उपयोग किया जाता है। हमने मूल्यांकन के लिए एक उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग प्लेटफ़ॉर्म और इसके साथ में छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग किया; हालांकि, इस पद्धति को अन्य शोधकर्ताओं के लिए सुलभ बनाने के प्रयास में हमने ओपन सोर्स सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके एक तुलनीय डाउनस्ट्रीम प्रोटोकॉल विकसित किया है:सेलफ़ोफर 10 और सेलफ्रॉयलर विश्लेषक 11 अधिकांश छवि-आधारित उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग assays का विश्लेषण एक दिया गया उपकरण मॉडल के लिए विशिष्ट वाणिज्यिककृत सॉफ्टवेयर के साथ किया जाता है। परिणाम दूसरे सॉफ्टवेयर के साथ अन्य प्रयोगशालाओं में दोहराने के लिए मुश्किल होते हैं क्योंकि अंतर्निहित एल्गोरिदम अक्सर मालिकाना होते हैं। औषधि उपचार के प्रति प्रतिक्रिया में प्रतिरक्षा- और आकारिकी-आधारित वर्गीकरण का उपयोग करते हुए, इस चित्र-आधारित पाइप लाइन, कोशिका प्रसार, मृत्यु और हेटोरोसेले्यूलर कल्चर के प्रत्येक उप-जनन का आकृति विज्ञान का उपयोग किया गया था। निम्नलिखित प्रोटोकॉल जटिल सेलुलर प्रक्रियाओं की जांच के लिए एक मजबूत पद्धति प्रदान करता है।

Protocol

1. सेल संस्कृति

नोट: यहां एनजीसीएलसी कोशिकाओं (एच 3255) के फेनोटाइपिक प्रतिक्रियाएं ईजीएफआर-लक्ष्यीकरण एजेंट, एर्लोटिनिब के लिए हैं, जब सह-सुसंस्कृत फेफड़े के फाइब्रोब्लास्ट (सीसीडी -19 एलयू जीएफपी) की जांच की गई। एक ही डेटा सेट के लिए, दो सेल आबादी (एच 3255 और सीसीडी -19 एलयू जीएफपी) की प्रतिदीप्ति-आधारित और आकारिकी-आधारित वर्गीकरण को उनकी अलौकिकता को समझने के लिए किया गया था। हालांकि, केवल एक वर्गीकरण विधि का उपयोग करने की आवश्यकता है और आवेदन के आधार पर चुना जाना चाहिए।

  1. आरपीएमआई -1640 के 500 एमएल का 10% गर्मी निष्क्रिय एफबीएस और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ तैयार करें।
    नोट: विकास माध्यम और पूरक अन्य सेल प्रकार के लिए आवश्यक के रूप में बदला जा सकता है
  2. संस्कृति कोशिकाओं में 10 सेमी 3 की शुद्ध आबादी के रूप में 3% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस और प्रत्येक 3-4 दिनों में उपयुक्त अनुपात पर मार्ग।

2. कोशिकाओं की तैयारी

  1. सेल निलंबन तैयार करने के लिए, सी को हटा दें5 एमएल 1 एक्स फॉस्फेट-बुफ्फ़ेड सलाईन (पीबीएस) के साथ ell मीडिया और वॉश कोशिकाओं।
  2. पीबीएस बंद करना, 0 डिग्री सेल्सियस पर 0.05% ट्रिप्सिन की 1 एमएल को गरम करना और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट (या जब तक कोशिकाओं को प्लेट में नहीं रखा जाता है) के लिए गरम किया जाता है
  3. ट्रिप्सिन को बेअसर करने के लिए, 4 एमएल की आरपीएमआई को एच 3255 और सीसीडीआर -19 एलयू जीएफपी प्लेट्स में जोड़ें और सेल समाधान को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में जोड़ें।
  4. आरटी के 5 मिनट के लिए 150 xg पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं
  5. सीमेंट के लिए तैयार करने के लिए शंक्वाकार ट्यूबों में आरपीएमआई मीडिया के 10 एमएल में सतह पर तैरने वाले और रिज़स्पेंड सेल छल्ले को बंद करना।

3. सेल चढ़ाना

  1. बीजांकन को मानकीकृत करने के लिए कोशिकाओं की गणना करें।
    1. समाधान में कोशिकाओं को मिश्रण करने के लिए ट्यूबों को उलटाएं। प्रत्येक सेल निलंबन के 10 μL को माइक्रोप्रोसेफ्यूज ट्यूब में पिपेट करें और 10 μL ट्रिपन ब्लू जोड़ें।
    2. एक सेल गिनती स्लाइड में इस समाधान के 10 μL पिपेट करें और स्वचालित सेल काउंटर में डालें।
      नोट: सेल गणना की अन्य विधियां ( यानी। हीमोसाइटोमीटर) का उपयोग किया जा सकता है।
    3. सेल गिनती को कम से कम तीन बार दोहराएं, या तब तक प्राप्त की गई संख्याएं लगातार होती हैं।
  2. एक मल्टी-प्लस प्लेट पर बीज कोशिकाएं
    नोट: बीज की प्लेटों की संख्या समय की संख्या पर निर्भर करती है जो इमेजेट की जाएगी। वैकल्पिक रूप से, एक प्लेट को समय के साथ फिर से इमेज किया जा सकता है अगर कोशिकाओं को हिस्टोन -2 बी-जीएफपी (या अन्य स्थिर लेन्टीवियरल परमाणु दागों से पर्याप्त अंतर परमाणु विभाजन प्रदान करने) के साथ ट्रांसडंड किया जाता है।
    1. आरपीएमआई के 100 μL में कुल 1500 कोशिकाओं / अच्छी तरह से बीज। प्लेट तीन सेल आबादी के लिए तीन सेल निलंबन तैयार करें: एच 3255, सीसीडी -19 एलयू जीएफपी, और 50% एच 3255 + 50% सीसीडीडी -19 एलयू जीएफपी। प्रत्येक समय बिंदु के लिए समान प्लेट सेटअप के साथ प्रतिलिपि में प्रत्येक प्रदर्शन करें।
      नोट: प्रारंभिक बोने वाले घनत्व को प्रत्येक सेल लाइन और प्लेट आकार के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।
    2. एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके 3 x 96-अच्छी तरह प्लेट्स में बीज कोशिकाएं 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल ओ / एन को सेते हैं, 5% सीओ 2
    </ Li>

4. ड्रग डोजिंग

  1. डीएमएमएसओ को एर्मोटिनिब पाउडर में जोड़ने के लिए 10 एमएम एकाग्रता का अंतिम एर्लोटिनिब स्टॉक समाधान करें।
    नोट: वांछित के रूप में दवा प्रतिस्थापित किया जा सकता है
  2. सेल संस्कृति के माध्यम से दवा को दो एक्स से अंतिम सूक्ष्मता के साथ 10 माइक्रोन पर उच्चतम एकाग्रता के साथ डालना और 1 9 10 अनुपात में चार बार संतृप्त हो, कुल पांच दवाओं के सांद्रता और कोई नशीली दवाओं के नियंत्रण के लिए।
    नोट: यदि डीएमएसओ की एकाग्रता में उच्चतम दवा की खुराक में 0.1% वी / वी के बराबर या उससे अधिक है, तो डीएमएसओ विषाक्तता के कारण नहीं देखा गया मनाया प्रभाव सुनिश्चित करने के लिए कोई दवा नियंत्रण में डीएमएसओ की समान मात्रा नहीं होनी चाहिए।
  3. मीडिया में पतला 1x के अंतिम दवा एकाग्रता के लिए उचित कूल्हे में 100 μL दवा समाधान का पिपेट।

5. छवि अधिग्रहण

नोट: चित्र 0, 2 और 3 दिनों में हासिल किए गए थे। सेल प्रकार और सेलुलर प्रक्रियाओं के आधार पर अध्ययन किया जा रहा है, ओवांछित समय अंक का अध्ययन किया जा सकता है।

  1. इमेजिंग के लिए तैयार दाग कोशिकाएं
    1. निम्नलिखित अंतिम सांद्रता पर डाई समाधान बनाएं।
      1. प्रतिदीप्ति आधारित वर्गीकरण के लिए, 5 माइक्रोग्राम / एमएल परमाणु दाग ​​और पीबीएस में 5 माइमी मृत कोशिका का दाग तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
      2. आकृति विज्ञान आधारित वर्गीकरण के लिए, 5 माइक्रोग्राम / एमएल परमाणु दाग, 5 सुक्ष्मजीव मृत कोशिका दाग, और पीबीएस में 5 माइक्रोन सेल डालना तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    2. प्रत्येक अच्छी तरह से 20 μL डाई समाधान जोड़ें। प्रकाश से सुरक्षित 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
  2. ऑप्टिमाइज़ करें और चित्र प्राप्त करें
    1. इनक्यूबेटर से अच्छी तरह से थाली निकालें, 70% एटॉएच के साथ प्लेट के नीचे पोंछे और इमेजिंग चैम्बर में प्लेट रखें।
    2. 'सेटअप' टैब में, उपयुक्त चैनल जोड़ने के लिए 'चैनल चयन' के अंतर्गत '+' बटन पर क्लिक करेंछवि ( यानी उज्ज्वलफील्ड, परमाणु दाग, मृत कोशिका दाग, जीएफपी, और आरएफपी संकेत)।
    3. 'लेआउट चयन' पर क्लिक करें और फ़ोकस के विमान की पहचान करने के लिए 0 माइक्रोन से शुरू होने वाले प्रत्येक 2 माइक्रोन और 20 माइक्रोन को समाप्त होने वाले जेड स्टैक्ड टेस्ट छवियों को लें। 'ऊँचाई' के तहत प्रत्येक चैनल के लिए इस दूरी को इनपुट करें
    4. तीव्रता का मूल्यांकन करने और एक्सपोजर के समय का अनुकूलन करने के लिए प्रत्येक चैनल के तहत 'स्नैपशॉट' पर क्लिक करें। आवश्यकता के अनुसार 'समय' के तहत उच्च या निम्न मान दर्ज करें
    5. स्क्रीन के दाईं ओर, थाली योजनाबद्ध पर उचित कुएं (चित्रित करने के लिए) को उजागर करें। कुओं के नीचे योजनाबद्ध, एक समान तरीके से चित्रित करने के लिए पच्चीस फ़ील्ड को हाइलाइट करें
    6. 'रन एक्सपेरिमेंट' के अंतर्गत, बाईं टैब पर 'प्लेट नेम' में प्लेट की पहचान करें और उपर्युक्त चैनलों में ग्रे-स्तरीय TIFF छवियां उत्पन्न करने के लिए 10 एक्स उद्देश्य के साथ छवि अधिग्रहण प्रोटोकॉल चलाने के लिए 'प्रारंभ' बटन (नीचे) पर क्लिक करें।
      नोट: चरण-दर-चरण instइमेजिंग प्रोटोकॉल के लिए खंडन उपकरण के बीच भिन्न हो सकते हैं, लेकिन पैरामीटर मान अब भी अनुकूलित किए जा सकते हैं।
    7. इमेजिंग को दो और तीन दिनों में दोहराएं

6. छवि विश्लेषण

नोट: सभी छवि विश्लेषण मालिकाना सॉफ्टवेयर का उपयोग कर किया गया था हालांकि, क्योंकि यह सार्वजनिक रूप से उपलब्ध नहीं है, तुलनात्मक विश्लेषण भी सेलपरफ़ाइलर 2.2 और सेलप्रोफेलर विश्लेषक 2.0 पर तैयार किए गए थे, नीचे दिए गए एक संक्षिप्त प्रोटोकॉल के साथ और अनुपूरक सामग्री (परीक्षण छवियां पहले से ही कार्यप्रवाह परीक्षण करने के लिए पाइपलाइनों में भरी हुई हैं) के रूप में विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान की गई हैं। इस प्रयोग की छवियों को प्रति अच्छी तरह से आधार पर समूहीकृत किया गया था ताकि प्रत्येक अच्छी तरह से व्यक्तिगत रूप से लोड किया जा सके। नीचे सेलप्रफ़ाइलर पाइपलाइनों में एक नियमित अभिव्यक्ति होती है जो प्रत्येक छवि फ़ाइलनाम से मेटाडेटा जानकारी पार्स करती है और छवियों को चैनल द्वारा और समूहित करने की अनुमति देता है।

  1. ओपन सोर्स सॉफ़्टवेयर को डाउनलोड और इंस्टॉल करें: 'सेलफ्रॉयलर9; और 'सेलफ्रॉयलर विश्लेषक' स्थापना के दौरान सभी डिफ़ॉल्ट विकल्प और ऐड-ऑन स्वीकार करें।
  2. उप-जनसंख्या में हिटरोकेलुलर संस्कृतियों को वर्गीकृत करें
    1. ओपन 'सेलप्रोफाइलर' सॉफ्टवेयर, 'फाइल' पर क्लिक करें | 'आयात पाइपलाइन' | 'फ़ाइल से,' और उपयुक्त फ़ाइल (प्रतिदीप्ति-आधारित वर्गीकरण के लिए "फ्लोरेसेंन्स_लिसीकरण। कोपिप" या मोर्फीलाजी-आधारित वर्गीकरण के लिए "Morphology_Classification.cppipe") का चयन करें।
      नोट: इन फ़ाइलों में बुनियादी छवि प्रसंस्करण और नाभिक / सेल विभाजन के लिए प्रोटोकॉल होते हैं। इन कोशिकाओं में असीम हाईचस्ट दाग मौजूद होने के कारण, नाभिक खंडों में और बढ़े हुए थे, और फिर कम तीव्रता वाले नाभिक के विभाजन के लिए छवि को मुखौटा करने के लिए इस्तेमाल किया जाता था।
      1. प्रतिदीप्ति-आधारित वर्गीकरण पाइपलाइन का चयन करें, कोशिकाओं को एच 3255 या सीसीडी -19 एलयू या तो ईजीएफपी तीव्रता के आधार पर वर्गीकृत करने के लिए, और आकारिकी विशेषताओं की गणना करना।
        नोट: सीसीडी-19 एलयू कोशिकाओं को जीएफपी के साथ ट्रांसडंड किया गया।
      2. आकृति विज्ञान आधारित वर्गीकरण पाइप लाइन को खंड नाभिक और कोशिकाओं के लिए चुनें, और आकारिकी सुविधाओं की गणना करने के लिए।
        नोट: वर्गीकरण के लिए 'सेलफ्रॉयलर विश्लेषक' में आगे डाउनस्ट्रीम विश्लेषण आवश्यक है। मृत कोशिकाओं को प्रतिदीप्ति आधारित वर्गीकरण के माध्यम से वर्गीकृत किया जाता है।
    2. स्क्रीन के नीचे बाईं तरफ 'आउटपुट सेटिंग्स देखें' पर क्लिक करें। विश्लेषण के लिए छवि फ़ाइलों का स्थान ('डिफ़ॉल्ट इनपुट फ़ोल्डर') और निकाले गए डेटा ('डिफ़ॉल्ट आउटपुट फ़ोल्डर') के लिए गंतव्य का चयन करें।
    3. विश्लेषण शुरू करने के लिए 'छवियों का विश्लेषण करें' पर क्लिक करें विश्लेषण पूर्ण होने पर, 'ठीक' पर क्लिक करें और गणना डेटा देखने के लिए 'डिफ़ॉल्ट आउटपुट फ़ोल्डर' पर जाएं।
      नोट: उदाहरण पैरामीटर मान और छवियाँ पूरक फ़ाइल 1-सेलप्रोफ़ाइलर प्रोटोकॉल . pdf में उपलब्ध हैं।
    4. आकृति विज्ञान-आधारित वर्गीकरण (केवल) के लिए निम्नलिखित करें
      1. ओपन 'सेलप्रोफाइलर विश्लेषक' सॉफ्टवेयर, सेलपरफ़ाइलर में जेनरेट की जाने वाली डाटाबेस प्रॉपर्टी फाइल का चयन करें, और 'ओपन' पर क्लिक करें।
      2. स्क्रीन के शीर्ष-बाएं स्क्रीन पर 'क्लासिफायरफ़ायर' टैब पर क्लिक करें। प्रयोग से यादृच्छिक सेल छवियों को कॉल करने के लिए, 'प्राप्त करें' पर क्लिक करें; छवियां अवर्गीकृत विंडो में दिखाई देंगी
    5. सेल को उपयुक्त बिन (चयन फ़ाइल 2-पाइपलाइन पीडीएफ : चित्रा बी ) को चुनकर और खींचकर सकारात्मक रूप से वर्गीकृत करें (एच 3255) या नकारात्मक (सीसीडी -19 एलयू)। प्रत्येक उप-पॉप्युलेशन के अनुसार कम से कम 50 कोशिकाओं को वर्गीकृत करने के बाद, 'ट्रेन क्लासिफायरियर' पर क्लिक करें, और फिर 'प्रगति चेक' पर क्लिक करें
      नोट: सेल को उपयोगकर्ता-पर्यवेक्षित यादृच्छिक वन मशीन सीखने एल्गोरिदम 12 के माध्यम से वर्गीकृत किया जाता है। यदि सटीकता अनुमोदित सीमा (> 90%) से ऊपर नहीं है, तो 'सेलप्रोफाईलर' पर सेल सेगमेंटेशन को वापस जाना और अनुकूल बनाना आवश्यक हो सकता है, या सेल क्लासियों के लिए आदर्श नहीं हो सकता हैआकारिकी द्वारा fying
    6. प्रत्येक उप-जनन के लिए सेल गणना के साथ एक तालिका उत्पन्न करने के लिए 'सभी का स्कोर' पर क्लिक करें।

Representative Results

हमने कुल 4,050 व्यक्तिगत छवियों के लिए 25 पन्नों / अच्छी तरह से एक छवि सेट, 54 कुओं / प्लेट (3 सेल आबादी x 6 दवा सांद्रता x 3 प्रतिकृतियां), तीन प्लेटों में भर दिया। कोशिकाओं ( यानी आकारिकी, प्रतिदीप्ति) के विभिन्न मात्रात्मक गुणों को निकालने के लिए स्वामित्व सॉफ्टवेयर (सामग्री की सारणी देखें) का उपयोग करके प्रयोग के दौरान उत्पन्न छवि सेट का विश्लेषण किया गया था, जिसके बाद सेल उप-पोपों को वर्गीकृत करने के लिए उपयोग किया जा सकता था। हालांकि, क्योंकि उपयोग की जाने वाली व्यावसायिक सॉफ्टवेयर में सीमित पहुंच है, सेलफ्रफ़लर और सेलप्रोफेर विश्लेषक की तुलना में डाउनस्ट्रीम पाइपलाइनों की तुलना की गई।

उप-जनसंख्या में हिटरोसेल्यूलर वर्गीकरण

नाभिक की पहचान की गई और डीएनए धब्बा (यहां Hoechst) के आधार पर विभाजित किया गया और सेल आबादी को या तो प्रतिदीप्ति या मो पर आधारित किया गया।Rphology ( चित्रा 1 )। प्रतिदीप्ति आधारित वर्गीकरण के लिए, फाइब्रोब्लास्ट (सीसीडीआर -19 एलयू) को पहले जीएफपी-लैन्टीवायरस के साथ ट्रांसडॉस्ड किया गया था। जीएफपी तीव्रता के स्तर प्रत्येक नाभिक के लिए मापा गया था, और जिन लोगों को स्वीकार्य सीमा से ऊपर की गणना की गई थी (पृष्ठभूमि संकेत के आधार पर) को सीसीडी -1 9 एलयू के रूप में वर्गीकृत किया गया था, जबकि उन नीचे ट्यूमर कोशिकाओं (एच 3255) के रूप में पहचान की गई थी। आकृति विज्ञान आधारित वर्गीकरण के लिए, कोशिकाओं को पहले गैर विषैले सेलुलर दाग के साथ दाग किया गया था (सामग्री की तालिका देखें) और इसका उपयोग कोशिका द्रव्य को पहचानने और खंडित करने के लिए किया गया था एक मशीन सीखने एल्गोरिदम को प्रत्येक जनसंख्या से ~ 50-100 कोशिकाओं के साथ प्रशिक्षित किया गया था। आकृति विज्ञान की पहचान की गई जो आबादी के बीच काफी अलग थी, जो तब सीसीडीआर -19 एलयू और एच 3255 कोशिकाओं के बीच अंतर करने के लिए एक रैखिक वर्गीकारक को डिजाइन करने के लिए उपयोग किया जाता था। प्रतिदीप्ति और आकारिकी वर्गीकरण प्रोटोकॉल 97.4% (एन = 1403) दो सेल लोकल के बीच भेद पर संयोजक थेअनुपचारित परिस्थितियों में आंदोलन और 9.5% (एन = 9 6) नशीली दवाओं की परिस्थितियों में परिवादात्मक (1 सुक्ष्ममात्र एर्लोटिनिब) ( चित्रा 2 )।

उप-प्रजातियों के फेनोटिपिक विश्लेषण

सेल प्रकारों के बीच भेदभाव करने के अलावा, हमारा लक्ष्य था कि प्रत्येक उप-जननेंद्रिय के फेनोटाइपिक गुणों को चिह्नित करना। मल्टीप्लेक्सिंग एसेल्स समय और अभिकर्मकों को बचाता है, स्थिरता जोड़ता है, और अध्ययन के बारे में अतिरिक्त जानकारी प्रदान करता है। कई संभावित फीनोटाइपिक आउटपुट हैं और उनमें रुचि के प्रश्नों के आधार पर उनका चयन करना चाहिए। यहां, एरलोटिनिब उपचार के जवाब में सेल आकारिकी और व्यवहार्यता स्थिति में परिवर्तन की जांच की गई। तीन दिन की दवा उपचार के बाद, परमाणु क्षेत्र में कमी और एच 3255 कोशिकाओं ( चित्रा 3 ए ) के सेलुलर क्षेत्र में वृद्धि देखी गई थी। परमाणु क्षेत्र में अंतर के बीच अंतर"न दवा" और "औषध" का इलाज करने वाले आबादी को दो तरफा प्रकार -2 (बराबर विचरण) टी- टेस्ट ( पी = 7.92 x 10 -16 ) के माध्यम से सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना गया था। हम इस परिकल्पना करते हैं कि यह अवलोकन औषध उपचार द्वारा लगाए गए तनाव को एक सेलुलर प्रतिक्रिया है।

यह अध्ययन करने के लिए ब्याज भी है कि क्या किसी नशीली दवाओं में साइटोटॉक्सिक ( यानी समय के साथ मृत कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि) या साइटोस्टाटिक ( यानी समय के साथ सेल जन्मों की संख्या में कमी) कोशिकाओं पर प्रभाव है, क्योंकि यह गहरा नैदानिक ​​प्रभाव है। उदाहरण के लिए, एक साइटोस्टैटिक दवा प्रभाव से ग्रस्त गिरफ्तारी उत्पन्न होती है, जो ट्यूमर से कोशिकाओं को खत्म नहीं करती है, इस प्रकार कैंसर कोशिकाओं के लिए कोशिका प्रसार को पुन: संयोजित करने की क्षमता होती है, जब दवा हटा दी जाती है। नशीली दवाओं के प्रभाव अक्सर संदर्भ, एकाग्रता और सेल प्रकार निर्भर हो सकते हैं। हमने पहले एरोटिनिब को एक कोशिका प्रकार में एक साइटोटॉक्सिक प्रतिक्रिया की जानकारी दी थी, जबकि एसी दिखा रहा थाएक और 13 में ytostatic प्रतिक्रिया

परंपरागत व्यवहार्यता का आकलन आउटपुट रिश्तेदार सेल नंबर और इसलिए, वृद्धि गिरफ्तारी और सेल की मृत्यु के बीच भेदभाव नहीं करते। इस प्रकार, मृत कोशिकाओं की पहचान प्रोपिडियम आयोडाइड के दाग ( चित्रा 3 बी ) के आधार पर की गई थी। एच 3255 कोशिकाओं पर एरोटोटिनिब के साइटोटेक्सिक और साइटोस्टैटिक प्रभाव दोनों मौतों की संख्या में वृद्धि और औषध उपचार ( चित्रा -3 सी ) के बाद जन्म की संख्या में कमी के साथ मनाया गया। यह ध्यान देने योग्य है कि सेल की निकासी के कारण मृत कोशिकाओं की संख्या 1 दिन बाद की हो जाती है। सीसीडी -19 एलयू कोशिकाएं दवा से प्रभावित नहीं थीं। इस मंच का एक अतिरिक्त लाभ मात्रात्मक डेटा की पीढ़ी है। उदाहरण के लिए, हमारे सह-संस्कृति प्रयोग में, 1,118 (75.8%) एच 3255 कोशिकाओं की शुरुआती उप-जनसंख्या को 2,817 (87.9%) या 3 9 6 (57.2%) तीन दिन के बिना या एर्मोटिन के साथ मिलाIb उपचार, क्रमशः ( चित्रा 4 )। क्योंकि हम सापेक्ष प्रतिशत के बजाय वास्तविक कोशिका की गणना (प्रवाह cytometry के तरीकों के साथ) उत्पन्न कर सकते हैं, हम निष्कर्ष निकालते हैं कि दवा उपचार के दौरान संरचना में बदलाव एच 3255 कोशिकाओं में कमी और सीसीडी -1 9 एलयू में वृद्धि के कारण नहीं है। यह कुछ भी नहीं है कि सेल की निकासी के कारण मौत की दरों को कम करके आंका जा सकता है, जो प्रयोगात्मक मूल्यांकन करना मुश्किल है और संभवतः सेल प्रकारों में अलग है।

आकृति 1
चित्रा 1: छवि विश्लेषण प्रोटोकॉल का अवलोकन दो संभावित डाउनस्ट्रीम छवि विश्लेषण पाइपलाइनों ने हेरोर्कोल्रल आबादी को वर्गीकृत करने के लिए या तो आकारिकी-आधारित वर्गीकरण या प्रतिदीप्ति-आधारित वर्गीकरण का उपयोग किया। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन कृपया उसे क्लिक करेंई इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए।

चित्र 2
चित्रा 2: आकृति विज्ञान और प्रतिदीप्ति-आधारित वर्गीकरण के बीच एकता। ( ) दो वर्गीकरण प्रोटोकॉल के ओवरलैप को दिखाए गए समानता वाली साजिश समान कोशिकाओं को आकृति विज्ञान- और प्रतिदीप्ति-आधारित वर्गीकरण दोनों का उपयोग करके H3255 के रूप में वर्गीकृत किया गया था। दो प्रोटोकॉल, अनुपचारित कोशिकाओं के 97.4% (एन = 1403) और एरलोटिनिब के साथ इलाज किये गए 92.5% (एन = 9 66) कोशिकाओं के वर्गीकरण के साथ समझौते में थे (ध्यान दें: सफेद क्षेत्र को कल्पना के लिए बहुत छोटा है)। ( बी ) प्रतिदीप्ति-आधारित और आकारिकी-आधारित वर्गीकरण के बीच अच्छे और गरीब संवेदना के उदाहरण दर्शाती 10X छवियां। सफेद तीर उन कोशिकाओं को इंगित करते हैं जो प्लेटफ़ॉर्म के बीच असंगत रूप से वर्गीकृत किए गए थे। इनपुट छवि: नीला - नाभिक (हाईचस्ट); हरा - सीसीडी 1 9 एलयू (जीएफपी) शास्त्रीयFication चित्र: लाल - एच 3255; हरी - सीसीडी -19 एलयू। स्केल बार = 100 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: एक एकल प्रायोगिक सेटअप से मल्टीप्लेक्स फीनोटाइपिक मापन। ( ) morphological सुविधाओं, जैसे नाभिक और सेल क्षेत्र, की उपस्थिति में एक सेल स्तर पर गणना की गई थी और दवा की अनुपस्थिति। नोट: 100 माइक्रोन 2 से छोटे माप वाले सेल क्षेत्रों को मलबे माना जाता था और विश्लेषण से बाहर रखा गया था। बॉक्स की साजिश में पहली और तीसरी चतुर्थ श्रेणी के साथ मध्यवर्ती और 95% आत्मविश्वास अंतराल त्रुटि बार दर्शाए गए हैं। ( बी ) एच 3255 (नीला) और सीसीडी -19 एलयू (हरी) कोशिकाएं सह-सुसंस्कृत थीं और मृत कोशिकाओं की पहचान प्रोपड की तीव्रता के आधार पर की गई थीIum iodide का दाग (लाल) और एक 10x उद्देश्य का उपयोग कर imaged। स्केल बार = 1 मिमी (शीर्ष पैनल); 100 माइक्रोन (नीचे की छवियाँ) ( सी ) जीवित और मृत कोशिकाओं की कुल संख्या तीन दिनों के साथ या नशीली दवाओं के उपचार के बिना गणना की गई, जीवित कोशिकाओं की संख्या में एक स्पष्ट कमी और एरलोटिनिब के अलावा मृत कोशिकाओं में वृद्धि हुई। त्रुटि बार तीन प्रतिकृतियों के आधार पर माध्य के मानक त्रुटि दर्शाती हैं। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4: समय पर उप-गतिशीलता डायनेमिक्स। प्रतिनिधि 0 0 या दिन 3 पर दवाओं के बिना और बिना एच 3255 (नीला) और सीसीडी -19 एलयू (हरित) वाले कुएं की प्रतिनिधि प्रत्येक उप-जननेंद्रिय से संबंधित कोशिकाओं की गणना की गई और आनुपातिक पाई चार्ट को एक दिखाया गयानमूनों में आबादी संरचना में क्रमिक परिवर्तन। स्केल सलाखों = 1 मिमी (मध्यम पैनल, फ़र्श में, सबसे ऊपरी पैनल), 1 मिमी (शीर्ष छवि), 100 माइक्रोन (नीचे की छवियां)। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgements

इस काम को नाना कैंसर इंस्टीट्यूट (एनसीआई) ग्रांट्स यू 54 सीए 1414 9 8 9 और यू 54 सीए 143 9 7 के द्वारा दाना-फार्बर कैंसर संस्थान और दक्षिणी कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय में शारीरिक विज्ञान-ओंकोलॉजी सेंटर (पीएस-ओसी) स्थापित करने के लिए वित्त पोषित किया गया था। एसएम मुममेन्थलर को एक पीएस-ओसी ट्रांसनवर्क पुरस्कार मिला जो इस काम में से कुछ का समर्थन करता था।

हम ओपेरेटा एचसीएस मंच के दान के लिए हमारे परोपकारी समर्थकों, विशेष रूप से स्टीफंसन परिवार, एमेट, टोनी और टेसा को अपनी गहरी आभार व्यक्त करना चाहते हैं। हम मार्गदर्शन के लिए जे फू और आस्था के आणविक चिकित्सा टीम के सदस्यों के लिए धन्यवाद करना चाहेंगे: डी। एगस नैदानिक ​​मार्गदर्शन और सलाह के लिए, के। पात्च्स, प्रायोगिक डिजाइन के साथ सार्थक चर्चाओं के लिए, आर। रावत, छवि विश्लेषण प्रोटोकॉल में सहायता के लिए , जे। कैटज को ओपेरेटा के साथ तकनीकी सहायता के लिए, और पी। मैक्लीन और डी। रुडरमैन उपयोगी चर्चाओं और प्रतिक्रिया के लिए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI-1640 Corning 10-040-CV cell culture medium
Fetal Bovine Serum (FBS) Gemini 100-106 medium supplement
Penicillin/streptomycin Gibco 15-140-122 medium supplement
TC20 Biorad 1450102 cell counter
TC20 slides with trypan blue Biorad 1450003 cell counter slides
96-well plates Corning 3904 clear bottom black plates
Erlotinib LC Laboratories E-4007
DMSO VWR 317275-100ML solution to resuspend drug
Hoechst Invitrogen H21491 nuclear dye
Propidium Iodide (PI) Invitrogen P1304MP dead cell stain
Cell Tracker Orange CMRA Life Technologies C34551 whole cell stain
Operetta high content imaging system Perkin Elmer
CellProfiler Broad Institue version 2.2.0 (rev 9969f42) http://cellprofiler.org/releases/
Cell culture incubator Any cell culture incubator will be suitable - cells were cultured under 37 ºC at 5% CO2.
15 mL Falcon conical tubes Falcon 14-959-53A
10 cm2 cell culture plates TPP 93040

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References

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