三次元組織配置に発達メカニズムを要約し、神経系の再生を容易にするアストロ サイト ネットワーク

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Bioengineering
 

Summary

縦一直線に並べられたアストロ サイトの突起と新規の生体材料箱詰め内のプロセスの自己組織化、三次元の束の開発を紹介します。これらは「生活足場」、神経発達メカニズムを研究したり、演出の神経細胞移動や軸索再生に関するを促進するテストベッドとしてセンチメートル長さを拡張する可能性がありますまだミクロン径を展示設計草分け。

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Katiyar, K. S., Winter, C. C., Gordián-Vélez, W. J., O'Donnell, J. C., Song, Y. J., Hernandez, N. S., Struzyna, L. A., Cullen, D. K. Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration. J. Vis. Exp. (131), e55848, doi:10.3791/55848 (2018).

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Abstract

頭部外傷、神経変性疾患は、失われた神経細胞を置き換えるし、軸索経路を再生成する中枢神経系 (CNS) の限られた容量のための神経学的な欠損を永続的によくあります。ただし、神経システムの開発、神経細胞移動と軸索の延長中にしばしば「生活の足場」と呼ばれる他の細胞によって形成された経路に沿って発生します。これらのメカニズムをエミュレートするために、中枢神経系の抑制性の環境を回避する戦略の設計を求めて、本稿では提案設計組織を作製するためのプロトコル アストロ ベース「生活足場」。これらの構成要素を作成するには、自己バイポーラ縦揃え突起とプロセスの高密度三次元バンドルにまとめるアストロ サイトを誘導する新規生体材料箱詰め方式を採用しました。最初、中空ゲル マイクロ列が組み立てていた、および内部ルーメンだったコラーゲン細胞外マトリックスでコーティングします。解離の大脳皮質アストロ サイト、マイクロ円柱との重要な内径の内腔に配信された < 350 μ m、自発的に自己整列し、密な束から成る長い繊維のようなケーブルを製造委託するにはアストロ サイトのプロセスおよび測定コラーゲン線維の < 150 μ m の直径はまだいくつかの cm の長さを拡張します。これらは展示の生活の足場を設計 > 97% 生存率を携帯され事実上独占的、中間径フィラメント蛋白質グリア線維性酸性蛋白質 (GFAP), ビメンチンの組み合わせを表現して、ネスチンはアストロ サイトで構成されています。これらはアストロ サイト ネットワーク神経添付の寛容な基板を提供するために発見され、神経突起の伸展を整列配置されます。さらに、これらの構成要素は、整合性とハイドロゲルの箱詰めは、中枢神経系の注入に適してから抽出されるときの配置を維持します。これらの前もって形成された構造は構造的に自然発生するキー細胞要素をエミュレート グリア ベース「足場を生きている」 in vivo。など、これらの設計された生活の足場は、神経発達機構研究生体外でまたは神経移行および/または中枢神経系変性体内に続く軸索経路の指示により容易に再生に関するテスト ベッドとして可能性があります。.

Introduction

中枢神経系 (CNS)、限られた容量の損失および/またはニューロンと外傷性脳損傷 (TBI) などの条件を伴う軸索経路の機能不全を打ち消すために脳卒中、脊髄損傷 (SCI) と神経変性疾患1 ,2,3,4,5。中枢神経系における神経新生は、失われたニューロン67の復元を妨げる、脳内領域の限られた数に制限されます。さらに、失われた中枢神経系軸索経路の再生は十分な監督指導の欠如、伸長阻害剤および神経組織2,8への損傷、次反応性アストロ サイトの増生の存在により 9,10。アストロ サイトは通常、イオン恒常性、神経伝達物質のクリアランス、シナプス形成、神経血管11を結合ニューロンの支援に多様な機能を持っています。それにもかかわらず、次の神経組織にも軽度の損傷、アストロ サイト変わることがあります分子・構造・機能肥大状態11に移行していくようです。重症頭部外傷に対しては、これらの変更は移行反応性アストロ サイトと破裂血液脳関門 (BBB)、ミクログリアから流出した白血球を含む病変コアを含む半影と傷跡の形成の結果します。オリゴデンドロ サイト、および線維芽細胞11,12,13。これらの反応性アストロ サイトは糸状、解体プロセスの形態を達成して中間径フィラメント蛋白質および神経再生12を妨げるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン (CSPGs) の発現の増加を展示します。にもかかわらず、グリア瘢痕最初 BBB の整合性を復元し、周囲の健康な組織に炎症性応答の送信を避けることができます、それは軸索再生12,14 に対して物理・生化学的バリアとして機能します。 ,,1516。例えば、グリア瘢痕が発生する軸索は球根の栄養障害による成長円錐を表示し、発育成長12。さらに、星状膠細胞の傷害の後の解体は、再生軸索17の拡張を妨げます。これらの抑制特性の結果、TBI、科学を含む重度の頭部外傷後の患者は苦しむ多くの場合永久的な物理的および神経学的な障害で明らかに

外因性課題中枢神経系機能の再生、関係なく軸索が再生する本質的な能力を所有する示されています。例えば、グリア瘢痕と接触して栄養障害による成長円錐の動的な性質は、これらの終末が12を拡張するための能力を保持することを示唆します。したがって、受傷後の中枢神経系のグリア瘢痕・傷跡再生橋になる提供を減らすことでより寛容な環境を提供する抑制性の環境を軸索再成長への主な障害にはいわれています。有利であります。確かに、以前の研究は中枢神経系ニューロンが軸索軸索再生12,18のより好ましい環境を現在のブリッジとして末梢神経移植を使用して病変を拡張することができることを実証しています。 19。他のいくつかの戦略は、この痕跡の再生能力を悪用する追求されています。たとえば、さまざまな傷害モデルにおける細胞成長シグナル伝達経路の操作は、軸索再生とグリア瘢痕削減10,20,21になりました。さらに、研究はコンドロイチナーゼ ABC は、CSPGs の糖鎖の大半を裂く、治療が反応性アストロ サイト22から分泌される CSPGs の抑制効果を減少することを示しています。結果の奨励にもかかわらず、これらのアプローチは監督の迷入再生12、ことがあります、またニューロンの損失を考慮しない成長円錐ガイダンスを提供しています。セル ベースのアプローチは、グリア瘢痕の与える影響を克服するため、失われた細胞、特に神経細胞を補充するための試みで利用されています。いくつかのグループが脱分化型反応性アストロ サイトのニューロンに損傷領域を再作成し、軸索再生23,24,を促進する中枢神経系病変に神経前駆細胞を移植したが他の中25します。 ただし、幹細胞移植だけでは生存率が低、統合が不完全と損傷した組織5ささやかな保有期間によって制限されます。さらに、これらのセルに基づく戦略は、制御された方法で特に長距離軸索路を復元に失敗します。したがって、他のアプローチとの組み合わせで生体材料は、様々 な神経の配送車として検討されています、前駆細胞と成長因子26。生体材料ベースのアプローチの高度な特定の物理的な haptotaxic を模した構造を生成する設計制御機能し、ターゲット ホスト組織27の三次元 (3 D) の微小環境に存在する chemotaxic キュー 28,29,30,31,32,33,34。これらの環境の信号の再現は、ネイティブのような形態、増殖、移行、および他の神経生物学特性29の間で、シグナリングを提示する移植細胞の最も重要です。これらの有利な性質にもかかわらずシード従来の携帯バイオマテリアル足場を超えて進歩は同時に監督の長距離軸索再生を促進し、失われた神経細胞を置き換える必要です。

ネイティブ神経解剖学をエミュレートする前もって形成された細胞構築と神経細胞の存在のため他のセル ベースのアプローチとは異なる「生活の足場」、有望な代替手法は、神経ティッシュ エンジニア リングおよび/または対象となる交換、再建そして神経回路4,35の再生を容易にする機構。生活の足場の設計に関する考慮事項は、表現型、機械・物理プロパティと同様に、神経細胞の源および生化学的なシグナルは任意の付随のバイオマテリアル35の組成によって決まります。生体外作製後、これらの生活の足場注入体内細胞接着分子と走化性、神経信号を神経細胞移動と軸索伸長の状態に応じて積極的に調整して再生の進行は、35を処理します。グリア細胞は、これらの細胞は、生体内のさまざまな発達のメカニズム仲介以来生活の足場の設計研究のための基礎として使用できます。脳の発達中に新しい神経細胞は、基底プロセスの指示移行36,37の生活の足場として発展途上の骨皮質骨板に向けた心室ゾーンから放射状グリア細胞による拡張に依存します。さらに、グリア済みパターンに沿って拡張することによって正しいターゲットに到達する示唆、錐体は、グリア道標細胞によって誘発される魅力的で撥の信号を感知して自体の向きを示すといわゆる「先駆的な「軸索成長の拡張骨格の35,38,39。したがって、グリア細胞は軸索、後に軸索ベースを提供する先駆的な指導のために必要な「生活足場」「追従」の軸索投射を指示します。また、グリア細胞を介した成長機構が神経芽細胞下帯 (SVZ) 成体脳における神経新生のいくつかの残りの部分のいずれかから移動する (RMS) 吻側渡り鳥ストリームに従ってください、後天的、保持するために示されている、嗅球 (OB)40。直接細胞接着斑での縦揃えのアストロ プロセスは構成され、可溶性因子37,をローカライズ グリア管 (図 1 a-1) 内に RMS でこれらの神経を移行します。41します。 最後に、哺乳類の原因で傷ついた中断するアストロ サイト プロセス配置軸索再生17を物理的に阻害するグリア瘢痕形成と、多くの非哺乳類システムを欠いている有害なグリア瘢痕の形成。むしろ、非哺乳類種のグリア細胞維持組織、負傷した領域17,42,43をガイドとして使用されるパターンを配置しました。例えば、非哺乳類科学モデル、軸索の軸索の再生と機能回復 (促進する基板としてグリア足場の組織の重要な役割を示唆している病変のグリア橋と密接な関係に成長する表示されます。図 1A-2)42,44,45反復の神経解剖学的機能と上述の発達/再生機構が未熟な神経細胞移動をドライブすることができます同時に設計されたグリア ベースの生活の足場の新しいクラスをもたらす可能性があります、軸索。そうでなければ寛容な環境では、神経の影響を軽減させる可能性がありますを草分けと中枢神経系の損傷や疾患に関連付けられている軸索路変性。

我々 の研究グループは複数の種類の生活復興のため足場を設計して以前とマイクロ組織を介して末梢神経系 (PNS)、中枢神経系の軸索路の再生設計ニューラル ネットワーク (マイクロ TENNs) と組織神経移植 (TENGs)、それぞれ27,46,47,48を設計されています。両方の戦略は、バイオミミ クリーに本質的に基づいています。マイクロ TENNs は、解剖学的に触発された構造の構造的、機能的脳の異なる神経細胞の集団を接続する軸索路を置き換えるために設計です。TENGs 軸索促進の軸索の再生をターゲット ホスト軸索再生35,46,48を達成するために、「パイオニア」の軸索に沿って"追従"の軸索成長に代表される発達のメカニズムを利用します。我々 は最近、生活足場の汎用性を資本金法マイクロ TENNs として箱詰め、同様のスキームを使用して、グリア細胞ベースのメカニズムからのインスピレーションを求めて開発全体を通して提示します。ここでは、ハイドロゲル マイクロ列49の膠原線維の内腔にまたがる整列アストロ サイトの束から成る構造を開発しました。これらのアストロ サイト生活の足場が開発の直径に対応する外径 (OD) と内径 (ID) 中空円筒状のゲルを作成する液体の agarose が付いてキャピラリー チューブ鍼針アセンブリを記入、管、針、それぞれ。Agarose のゲル化とキャピラリー チューブからゲル マイクロ列の抽出、中空のインテリアはタイプ私アストロ接着のために寛容な環境を供給するコラーゲンをコーティングし、束形成 (図 1 bを揃え-1)。その後、内腔は生後仔 (1 b を図-2) から分離された大脳皮質アストロ サイトとシードします。二次元 (2 D) 配置手法 (ECM) タンパク質パターンニング、電界、マイクロパターニングゲル溝と細胞外マトリックスのアプリケーションに依存している生活の足場でアストロ配置に反する手法では, 自己組織化基板曲率 (ID 列)、細胞密度、コラーゲン濃度50,51,52などの制御可能な変数に基づいています。アストロ サイトは契約し、コラーゲンをフルモデル チェンジし、バイポーラ、縦配置の形態観察生体内で(図 1 b-3) 自然な足場に似ていますを取得します。確かに、進めてこれらのケーブルのような構造の使用特に破損した CNS の不利な環境による軸索再生を促進することと同様、未熟な神経細胞の移行の対象となる指導のため物理的な基質として哺乳類グリア瘢痕 (図 1)。この記事はアストロ サイトのマイクロ列の詳細な製作方法を提示する、位相コントラスト蛍光イメージの予想される細胞構築と現在の制限に関する包括的な議論と今後の方向性、技術。

Figure 1
図 1: インスピレーション、作製プロトコル、および整列のアストロ サイト ネットワークの提案されたアプリケーション。(A) 神経生物学のインスピレーション: (1) 神経芽細胞由来神経因性脳室下帯 (SVZ) を利用 (OB); 嗅球に向かって指示の移行で吻側の渡り鳥ストリーム (RMS) に縦一直線に並べられたグリア チューブ(2) 両生類や魚など非哺乳類神経組織の一部病変 (例えば切断脊髄) の両端を接続しの指導のための足場としてグリア橋の形成に起因する損傷後の再生を耐えることができます。軸索の再生。(B) 製造の概要: ミクロン サイズの中空ゲル マイクロ段 ECM、被覆ルーメンの構築 (1) (2) ラットの子犬で、縦型の (3) 自己組織から分離された主な皮質アストロ サイトの播種文化、将来移植研究のための生体材料箱詰めからバンドルの (4) の抽出のバンドル。(C)体内のアプリケーション: (1) これらの生活の足場はニューロン欠損領域を再作成する神経因性センターから指示されたニューロン移行のため設計されたグリア チューブとして可能性があります(2) の軸索ガイダンスを先駆的な発達のメカニズムと再生機構非哺乳類におけるグリア橋の反復可能性があります非寛容で軸索の再生を指示する容量を持つこれらのアストロの足場を授ける哺乳類のグリア瘢痕の環境。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Protocol

すべてのプロシージャ機関動物ケアとペンシルバニア大学で、マイケル ・ j ・ Crescenz 退役軍人医療センター利用委員会によって承認され、慈悲深いの NIH 公衆衛生サービス ポリシーのガイドラインを遵守ケアと動物実験 (2015 年)。

1. Agarose のゲル マイクロ列の開発

  1. 寒天 3 g を計量してダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) 100 mL を含む滅菌ビーカーに移し agarose 3% 重量/体積 (w/v) ソリューションを行います。ビーカーに滅菌磁気棒を加えてホット プレート ・ スターラーの表面の上に置きます。次の手順でその内容の蒸発を防ぐために覆われたビーカーを維持します。
  2. アガロースと DPBS 100 ° C の温度で熱を 60 120 rpm でかき混ぜる。必要に応じて、これらの設定を調整して、ソリューションに変更当初から不透明な agarose が完全に解散したことを示す明確な外観と溶解過程の進行を常に監視します。
    注意: ホット ビーカーとソリューションは、高温!
  3. アガロース溶液は加熱し攪拌、4 空 10 cm シャーレを取得し、それらの 2 つに DPBS の 20 の mL を追加します。鍼を置く (直径: 300 μ m、長さ: 40 mm)、1 マイクロリットル キャピラリー チューブをガラス (直径: 701.04 μ m、長さ: 65 mm、容量: 25.0 μ L)、およびバイオ セーフティ キャビネット内部電球ディスペンサー。液体アガロース溶液を消して、定数の約 50 ° C で加熱と agarose のゲル化を避けるために攪拌を維持します。
  4. 電球ディスペンサーの下部開口部に鍼針を紹介します。キャピラリー チューブを外気に針を挿入します。キャピラリー チューブを固定するには、電球ディスペンサー シリンダーのゴム部分にそれの一部を入力します。
  5. 空のシャーレの表面に液体のアガロース マイクロ ピペットで 1 mL を転送し、ながら内側に電球ディスペンサーのゴム製のキャップが挟まる、アガロース、接触 (挿入針) と垂直キャピラリー チューブの一方の端を配置します。ゆっくりとキャピラリー チューブにアガロースを描画する電球ディスペンサー キャップの圧力を解放します。
    注: キャピラリー チューブに液体 agarose の転送を急速に実行する必要があります。液体 agarose が残っている場合ペトリ皿表面で冷却し、十分な時間を (約 60 秒)、キャピラリー チューブに沿って agarose の適切な吸引を防止する、ゲル化開始。
  6. 針を残して 5 分は、ゴム栓を手でキャピラリー チューブを慎重に引いて、電球ディスペンサー シリンダー内のキャピラリー チューブ内のゲルの無料ペトリ皿と聞かせて agarose の各電球チューブ針アセンブリの場所を固めると、チューブ内に agarose のゲル。
  7. ゆっくりと引き出してキャピラリー チューブ; から、鍼針を手動で抽出します。新しく凝固 agarose シリンダーはまだ針を取り巻くこの手順でチューブからもスライドします。終わりに移動する滅菌鉗子の先端で鍼に沿ってマイクロ列を少しずつ動かして。オープン、DPBS 含むペトリ皿の上針を置き、鉗子でマイクロ列に、DPBS 押し込みます。
    注: アガロース マイクロ鍼針の除去時にガラス キャピラリー チューブ内で残っている場合ゆっくりとキャピラリー チューブからアガロース マイクロ段 25 mm ゲージの針とプッシュ DPBS と皿にします。
  8. Microscalpels やホット ビーズ滅菌器を使用して鉗子を滅菌します。4% の w/v agarose を作る、寒天 4 g を計量し、DPBS 100 mL に転送します。熱し、ステップ 1.2 クリア 4% 液体アガロース溶液を取得するで説明したようにかき混ぜます。加熱と次の手順でソリューションの攪拌を維持します。
  9. 郭清フードにマイクロ列シャーレを転送し、微細鉗子でマイクロ列を空のシャーレに移動します。視覚的なガイダンスの万国実体写真とマイクロ列を希望の長さにカットする microscalpel を利用します。ECM とセル追加マイクロ列の処理を容易にするために水平から 45o角度で傾斜形両端に両端をトリミングします。
  10. 以前同じシャーレのマイクロ-列を 3 つのステップし、の分離と並行して 4 つの構成要素を繰り返す < 各シリンダーの間 3 mm。マイクロ ピペットと 4% アガロース溶液 50 μ L をロードし、液体のストリーク/ラインを接続、4 つのグループに構造をバンドル マイクロ列配列に注ぐ (来世は「マイクロ列ボート」と呼ばれる)。構成要素間の距離を最小限に抑え、細い線ですばやく agarose を追加することによって、内部を詰まらせることがマイクロ柱の両端に 4% の agarose の動きを避けてください。
    注: は、アストロ サイトの足場を作製する必要はありません「ボート」に 4 つのマイクロ-列のグループを配置します。それにもかかわらず、船は作製プロセスを早めるためと移動し、後の手順でマイクロ列を処理するより安全な方法を提供するを提供します。
  11. 追加の 4% の agarose のゲル化を許可するように 1-2 分のマイクロ列ボートを冷ます。接続の 4% の agarose によって微細鉗子でマイクロ列ボートをピックアップし、他 DPBS 含むペトリ皿 1.1.3 の手順で準備するマイクロ列を移動します。必要に応じて残りのマイクロ列とより多くのボートを作製します。
  12. シャーレ マイクロ列やバイオ セーフティ キャビネットへのボートを移動し、30 分の紫外 (紫外線) ライトへの露出で消毒します。
    注意: は、紫外線への露出を防ぐために適切な保護具を着用します。
  13. ECM 加算およびセルめっきがすぐに発生しない場合は 4 ° c、DPBS にマイクロ列ボート料理を格納後、1 週間まで。構造はこの期間内に使用しない場合は、マイクロ列作製手順を繰り返します。

2. 一次電池文化および分離

  1. ラットから皮質アストロ サイト分離
    1. 次の手順の準備として、ハンクの 20 mL 平衡塩類溶液 (HBSS) 切り裂かれたティッシュのための貯蔵所として機能する 4 つの 10 cm のシャーレを追加します。氷の上のすべての料理を保つため。きれいな外科はさみ、鉗子、マイクロ-ヘラ、ホット ビーズ滅菌器でマイクロ メスを殺菌します。
    2. Prewarm 1 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) と 0.15 mg/mL デオキシリボヌクレアーゼ (DNase) 0.25% トリプシンで 37 ° C で HBSSさらに、prewarm のダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) ハムの F-12 栄養混合物と 10% 牛胎児血清 (FBS) から成る 37 ° C でアストロ培。
    3. 低体温の状態にそれらを公開することで生後 0 または 1 日目 Sprague-dawley ラット仔の麻酔し、斬首で安楽死させます。ピン頭 19 mm を使用してステージにゲージの針が鼻、目の前方に配置されます。
    4. 目のすぐ後ろに、首の付け根からの前方、後方真ん中にメスで切開を行います。直接 T 字を形成、目の後ろから横に行く別の切開を行います。微細鉗子を使用して、頭蓋の皮膚/スカルを路肩側にします。
    5. 鉗子の 1 つのピンを配置することによって (上向き) 鼻で動物と外側の表面上の他の口の中に頭を保持します。滅菌マイクロ ヘラで脳を取り出し、冷蔵 HBSS でシャーレのいずれかに置きます。場所このシャーレ氷の上すぐにその後、すべては、使用時に除く回します。
    6. 以前解離フード内部万国実体写真下-20 ° C で保存花崗岩ブロックを移動します。解剖手順の間に、低温を維持する花崗岩ブロックの表面に脳組織でシャーレを配置します。次の手順で視覚的なガイダンスとして、万国実体写真を使用します。
    7. 嗅球は、そのまま残ります、鉗子または microscalpels でそれらを抽出切り出して。さらに、小脳を削除し、2 つの大脳半球を分ける正中切開、microscalpel を使用します。鉗子で半球を含む生鮮・冷蔵 HBSS ペトリ皿に転送します。
    8. 分離皮質のみを取得する microscalpel と半球の内側から中脳の構造を解剖します。皮質の組織から髄膜、シート状の構造物を剥離し、冷たい HBSS で新しいシャーレに分離皮質を転送する微細鉗子を使用します。次の手順でトリプシンの表面積を高めるために、組織をミンチに、microscalpel を使用します。
    9. Prewarmed トリプシン-EDTA (各管内 8 野) の 4 つの mL を含む 15 mL 遠心管に、野を転送するのにパスツール ピペットを使用します。37 ° C で 5-7 分のトリプシン-EDTA に大脳皮質組織を公開します。
    10. パスツール ピペットで慎重にトリプシン-EDTA を削除し、0.15 mg/mL DNAse の 400 μ l を追加私遠心管にソリューション。すべての組織に分離される液体の残りの組織部分がなくなるまで管または渦流を振りま します。組織を完全に解消できない場合は、パスツール ピペットの先端で残りのフラグメントを削除します。
    11. 遠心分離機管 200 x g で 3 分間の解離細胞のソリューションが含まれているセルを妨げないでパスツール ピペットで上澄みを削除します。マイクロ ピペット管にアストロ培 (2.1.2 のステップで定義されている) の 1 つの mL を追加し、再懸濁します、均一溶液を作成する揺り動かしなさい。
    12. T-75 フラスコにアストロ培地と血清ピペット 10 mL を転送します。マイクロ ピペットの 1 mL セル溶液 (2.1.11 の手順で準備) の 250 μ l をプレートにフラスコあたりのセルの価値がある 1 つの子犬脳フラスコに追加します。均等に排出された細胞液を培養培地に, 均一な配分を促進するフラスコを振といます。
    13. 37 ° C、5% CO2で加湿のインキュベーターでメッキのフラスコの文化.24、72 h 文化に達すると、機械的に非付着細胞の種類、ニューロン、オリゴデンドロ サイトなどをデタッチするフラスコを揺り動かしなさい。
    14. その後、これらの縦長の各で、メディアの変更を実行します。培地付着細胞をカバーしていない、フラスコの底にあるので、フラスコを垂直に保持します。セルの抽出を避けるために、フラスコの底角に対してピペットの先端を押してパスツール ピペットで培を吸い出しなさい。元の水平位置にフラスコを置き、優しく血清ピペットで細胞をアストロ培地 10 mL を追加します。
    15. 各メディア変更後、フラスコをインキュベーターに返します。90% の confluency が達成された後は、機械的に任意の残りの非付着細胞を除去するもう一度フラスコを振りま します。
    16. 真空とパスツール ピペットで培を取り出すことでアストロ サイトを通路します。付着細胞上の 0.25% トリプシン-EDTA 血清ピペットで 5 mL を追加します。振とうフラスコ、トリプシンをカバーするすべてのセルを確認して 37 ° C および 5% CO2で 5-7 分のフラスコを孵化させなさい。
    17. 血清ピペットで細胞にアストロ サイトの中の 1 つの mL を追加してトリプシンを癒します。血清ピペットでフラスコから細胞液を抽出し、滅菌 15 mL 遠心管にそれを転送します。3 分間 200 x g でチューブを遠心します。
    18. 血清ピペットで上澄みを除去し、アストロ サイト培養液 1 mL でそれを再懸濁します。同種細胞ソリューションにチューブを揺り動かしなさい。診断またはセルの自動カウンターにソリューション内のセルの数をカウントします。
      注: 90% 合流は、フラスコ約 300 万アストロ サイトが生成されます。
    19. T-75 フラスコにアストロ培地 10 mL を追加します。1:4 希釈を実行するには、培地を既に含む T-75 フラスコにピペットで細胞液 (ステップ 2.1.18) の 250 μ l を転送します。振とうフラスコのサーフェス全体で均質な細胞の分布を確認します。
    20. セルを通過する 90% の confluency を達成するたびに 2.1.16-2.1.19 の手順を繰り返します。
  2. ラット胎仔の大脳皮質ニューロン分離
    1. 2.1.1 と 2.1.2 の手順 prewarmed のメディアが共同培地、Neurobasal 培地 (ニューロン) のための 2 %b-27 サプリメント + 1 %g-5 無血清サプリメント (アストロ) + 0.25% から成る例外として同じような準備に従う L-グルタミン。
    2. 二酸化炭素の窒息とタイミング妊娠 18 日ラットを安楽死させるし、斬首で死を確認します。
    3. ラット胎仔を抽出し、視覚的なガイダンスと滅菌はさみ、microscalpel、鉗子53に堅実を使用して冷蔵花崗岩ブロックの表面にシャーレ HBSS で脳組織の残りの部分から皮質の解剖.頭や脳、大脳半球皮質の連続郭清後新しい HBSS いっぱいシャーレに各組織を転送します。
    4. トリプシンの表面積を高めるための小さな断片に大脳皮質組織をミンチします。転送、パスツールと 4-6 野 5 ml prewarmed トリプシン-EDTA の管にピペットし、組織を分離する 37 ° C で維持します。5-7 分で手動でミックスして組織の凝集を防ぐため管を揺り動かしなさい。
    5. 10 分後に、37 ° C からチューブを削除します。手順 2.1 で前述したように、トリプシン-EDTA を抽出し、0.15 mg/mL DNAse 液 1.8 mL で代用します。その後、渦ソリューションまで組織が表示されます同質、液体に浮かんでない組織片。
    6. 3 分間 200 x g で解離組織ソリューションを遠心します。上清を除去した後は、共同培養培地 2 mL に再懸濁します。診断またはセルの自動カウンターでこのソリューション内のセルの数をカウントします。
      注: 通常の利回りは、106セル/大脳皮質半球 x 3.0 5.0 です。
    7. 2.0-4.0 x 105セル/mL 上で定義した培養メディアの密度を持つ新しい携帯ソリューションを準備します。

3. マイクロ列内部アストロ サイトのケーブルの開発

  1. ECM コア製造
    注: ECM、ハイドロゲル マイクロ柱の内部に実行するが細胞を同じ日に追加します。
    1. バイオ セーフティ キャビネット、内部準備 1 mg/mL 滅菌遠心チューブの共同培養培地における I 型コラーゲン ラットの尾のソリューション。使用している場合を除いてすべての回で氷の ECM ソリューションと遠心チューブを維持します。
    2. その pH を推定するリトマス試験紙のストリップにピペットで ECM ソリューションの 1-2 μ L を転送します。1 N 水酸化ナトリウム (NaOH) の ECM ソリューションの pH をそれぞれ増減するマイクロ ピペットと塩酸 (HCl) 1 μ L を追加し、ピペットの上下を均質化します。リトマス試験紙のストリップと新しい pH を確認し、pH が 7.2 7.4 範囲で安定するまで、必要に応じてより多くの酸またはベースを追加します。
    3. ステップ 1.2 から郭清フードにペトリ皿を移動し、空、滅菌 35 または 60 mm シャーレに滅菌微細鉗子で 4-5 マイクロ列またはボートを転送します。株分け業を使用すると、指導のため、各マイクロ列と空の DPBS と空気の泡の内腔に吸引の一方の端でピペットの 10 μ L チップを移動します。次の手順で追加した ECM が内腔の間で自由にやり取りできるように万国実体写真と気泡の有無を確認します。
    4. ECM ソリューション、10 μ L ハイドロゲル マイクロ列の一方の端に対してヒントし、ルーメン (約 3-5 μ L)、万国実体写真と ECM のエントリを観察に合わせて十分なソリューションを提供できる場所で P10 マイクロ ピペットを充電します。マイクロ列の両端に ECM ソリューションの小さな貯水池 (2-4 μ L) のピペットします。
      注: は常に 4-5 マイクロ列を管理または防ぐために一度に 1 つのボート長期言語構造には、乾燥のマイクロ列構造のくしゃくしゃがありますので。完全に乾燥させたマイクロ列に細胞の利用を防止する、ペトリ皿の面にしっかりと取り付けます。これは後述の潜伏期間中に流出する ECM を引き起こす可能性がありますので、(として水和) 共同文化メディアの過剰な量をマイクロ列に追加できません。
    5. 列の潜伏中に完全に乾くことを防ぐために湿度のシンクを提供するシャーレの周りのリングでピペットの共培養メディア。神経細胞やアストロ サイトを追加する前にコラーゲンの重合を促進する 1 時間の 37 ° C および 5% の CO2で ECM を含むマイクロ列を含むペトリ皿を孵化させなさい。
      注: はインテリアを含む固体 ECM のコアは、どちらも観察できる、万国実体写真を使用してなく ECM は中空の内腔の内面をコーティング層を形成する必要があります。ECM は、コアを形成する層だけが残っているまでに潜伏期間を続行します。この層を形成とアストロ サイト細胞液はメッキの手順でマイクロ列の内部を埋めることができます。
    6. 潜伏期間中に (後述)、アストロ サイト細胞液を準備します。
  2. グリアとニューロン シード マイクロの列
    1. 手順 2.1.16-2.1.19 で説明したように (の間に第 4 そして第 12 道) メッキ アストロ サイトを通路します。フラスコ内のセルの数をカウント後、細胞培養液中に浮遊 9.0 12.0 × 105セル/mL の溶液の密度で細胞液を準備します。
    2. 堅実を使用して、マイクロ-列の一方の端に P10 マイクロ ピペットの先端を置き、完全にそれを埋めるための内腔に十分な電池ソリューション (~ 5 μ L) を転送します。上記、ECM で行われ、各マイクロ列の両端に携帯ソリューションの小さい貯蔵所を追加します。
    3. ECM にアストロ サイトの添付ファイルを促進する 1 時間の 37 ° C および 5% の CO2でペトリ皿上メッキ マイクロ列を孵化させなさい。ニューロンは、マイクロ列には追加されない場合、3.2.5 をステップに進みます。
    4. 初期潜伏期 1-2 μ L での株分け業を観察しながらピペット、マイクロ柱の両端に 2.2.7 手順で取得した大脳皮質ニューロン ソリューションの追加します。十分なメディアが、乾燥を避けるため、再び神経細胞の接着のため許可する CO2を 37 ° C、5% で 40 分間インキュベートし料理の存在を確認します。
      注: 大脳皮質ニューロンのソリューションも追加できます慎重にマイクロ ピペットをシャーレから培地を除去した後の手順 3.2.4 束形成後 1 〜 2 日。
    5. 孵化後期間、慎重には、それぞれ 3 または 6 ml の 35 または 60 mm のペトリ皿、共同文化メディアのメッキ マイクロ列を含むペトリ皿を入力します。文化を促進する CO2を 37 ° C、5% でメッキ マイクロ列を維持、6-10 時間後バンドルされており、ケーブルのような構造を形成する必要があります整列のアストロ バンドルの自己集合。
  3. アストロ サイト ケーブル アーキテクチャの安定化
    注: バンドル構成要素、養殖の約 6-12 時間の形成後、アストロ サイトの足場の配置構造の崩壊を防ぐために以下の手順を実行します。
    1. 滅菌遠心管では 3 mg/mL ラット尾コラーゲンを準備私共培養メディア ソリューション。7.2 7.4 3.1.2 のステップで説明する手順を次に溶液の pH を調整します。使用しないときは、氷の上コラーゲン株式と共培養メディアを管理し、すべての回で氷の上準備されたコラーゲン溶液を配置します。
    2. マイクロ ピペット、マイクロ列の水和により湿度シンクを作成する皿の両側にいくつかのメディアを残してとアストロ サイトの足場シャーレからメディアを削除します。可視化を支援する万国実体写真の下皿を配置します。
    3. マイクロ ピペット、マイクロ列、株分け業を用いた視覚誘導の各終わりにコラーゲン溶液と放電の 2-3 μ L を取る。この料理は、皿の周囲湿度シンクとして機能する側面のまわりの十分なメディアであることを確認します。新しく追加されたコラーゲンのゲル化を促進するために加湿のインキュベーターで CO2を 5% と 37 ° C で 30 分間マイクロ列とペトリ皿を孵化させなさい。
    4. ゆっくりと共培養メディアの 3 または 6 mL を追加 (35、60 mm ペトリ料理、それぞれ)、ペトリネット、ピペットと料理や文化を 37 oC と 5% CO2で加湿のインキュベーターで料理。

4. ゲル内部からアストロ サイトの束の抽出

  1. ガラス coverslips オートクレーブで滅菌します。無菌細胞培養グレード水ポリ-L-リジン (PLL) の 20 μ g/mL の溶液を準備します。
  2. バイオ セーフティ キャビネット、内部手動で滅菌 10 cm シャーレに滅菌ガラス coverslips を転送し、coverslips をカバーする十分な PLL のソリューションを追加します。
  3. 表面をコートする 37 ° C で 30 分間、PLL ソリューションで覆われて、coverslips を孵化させなさい。Coverslip に細胞培養グレードの水を追加し、Pasteur のピペットを使用する 3 回 30 分すすぎ後パスツール ピペット PLL ソリューションを削除します。
  4. 整列のグリア束の形成後滅菌微細鉗子を滅菌シャーレに繊細なマイクロ列を転送し、脱水を防ぎバンドル健康を維持するマイクロ ピペットと共培養メディアの 10 μ L の小さなプールを追加します。堅実を用いた視覚的なガイダンス、滅菌手術用鉗子を端から端まで注意深く引いてハイドロゲル マイクロ列からアストロ サイトのバンドルを抽出します。
  5. 鉗子でアストロ サイトのバンドルを保持、PLL コート coverslip でそれをマウントします。修正し、以下のプロトコルで染色します。

5. 研究の in Vitro免疫細胞化学

注: この研究の一次抗体がウサギ抗グリア酸性線維性蛋白 (GFAP) (1: 500)、抗 β-チューブリン III (1: 500) をマウス、ウサギの抗コラーゲン I (1: 500), マウス抗ネスチン (レバレッジ) とウサギ抗ビメンチン (1: 100)。ロバ抗マウス 568、ロバ抗家兎 568、ロバ反うさぎ 488、ロバ抗マウス 568 (すべての 1: 500) され、二次抗体。すべてのインスタンスで完全マイクロ列をカバーする各ソリューションの十分な量を追加します。

  1. 化学の発煙のフードの中 1 x DPBS で 4% (v/v)/ボリューム ホルムアルデヒド溶液を準備します。
    注意: ホルムアルデヒドは、毒性化合物には発癌性、知られている別の容器で処分する必要があります。常にこの化合物化学の発煙のフード内を操作し、白衣、安全メガネと手袋などの個人保護用具 (PPE) を利用します。
  2. マイクロ-列の場合ハイドロゲル シリンダーを誤って吸引せずパスツール ピペットの構造体を含むシャーレから文化メディアを破棄します。マイクロ列または (どちらのまま、ペトリ皿上に) マウントされた coverslips をカバーする十分なホルムアルデヒド溶液を追加し、18-24 ° c. で 35 分間インキュベート
  3. 固定マイクロ列または血清ピペットと coverslips から 4.0% ホルムアルデヒド溶液を抽出します。すぐに追加し PBS を 2 回削除、それから 10 分 3 分の 1 の時間に浸ることによって 3 回 PBS で固定マイクロ列をすすいでください。
  4. 濃度 4 %v/v の濃度 0.3 %v/v NHS 溶液を溶媒として用いた非イオン性洗剤を使用してソリューションの準備のため PBS で通常の馬血清 (NHS) を溶解します。
  5. マイクロ列またはピペットと coverslips シャーレから PBS を削除します。セルを permeabilize 18-24 ° C で 60 分のマイクロ-列/coverslips をカバーする十分な 0.3% 中性洗剤溶液を追加します。
  6. 取り、洗剤とリンスを 2 回すばやく PBS で 3 回 5 分 4 %nhs の必要な量と一次抗体の各計算を浸すことによって目的とする抗体の濃度の溶液を調製します。
  7. ペトリ皿から PBS を削除し、十分な一次抗体を追加 (4% で希釈した NHS DPBS) マイクロ列または抽出されたアストロ サイトの束をカバーするソリューション。孵化 4 ° C で一晩 (12-16 h)
  8. 第一抗体溶解液を取り出して、5 分間浸漬による PBS で、3 回に 2 回をすぐに洗います。各抗体希釈 1: 500 で 4.0 %nhs ソリューションに存在して、暗闇の中、二次抗体溶液を準備します。
  9. 18-24 ° C で 2 時間二次抗体溶液を細胞を孵化させなさいインキュベーションの全体の時間、光への暴露を避けるためにアルミ箔のマイクロ列シャーレをカバーします。
  10. 二次抗体溶液を削除し、核を染色する 18-24 ° C で 10 分間のヘキスト ・ ソリューション (1:10, 000) を追加します。
    注意: ヘキストは知られている変異原性発癌物質として扱う必要があります。したがって、別の容器に処分する必要があり、PPE を使用する必要がありますすべての回でこのエージェントを操作するとき。
  11. 5 回、その後 5-10 分のたびに PBS で洗い、PBS とアルミ箔でカバーの 4 ° C で汚されたマイクロ列を格納します。マウントされたアストロ バンドルの場合水土台媒体のドロップをバンドルに追加固定バンドル上別のガラス基板に配置、長期的なストレージおよびその後画像処理用マニキュアで両方 coverslips をシールします。

6. Live 死んだ (カルセイン AM/エチジウム ホモ) 生存率アッセイ染色

  1. 試薬溶液を準備するには、1 x DPBS 10 mL に 5 μ l カルセイン AM (無水ジメチルスルホキシド (DMSO) 4 mM) と 20 μ l エチジウム ホモ-1 (EthD-1) (DMSO/H2O 1:4 v/v 2 mM) を追加します。アルミ箔とソリューションをカバーしたり、光から保護するために暗闇の中で保存します。
  2. パスツール ピペット メッキ マイクロ列を含むシャーレからメディアを吸引し、(上記準備) 構造をカバーする十分なソリューションを追加します。37 ° C、5% CO2、光からソリューションを保護するために覆われてペトリ皿で 30 分間インキュベートします。
  3. マイクロ ピペットやパスツール ピペットとソリューションを削除します。ステップ 5.3 で説明したように、DPBS で 2-3 回を洗い流してください。皿のサイズに従って DPBS とペトリ皿の洪水します。イメージ セルすぐにその後または使用して落射蛍光顕微鏡を用いたイメージング。
    注: 変換膜透過性のカルセイン AM カルセインを代謝活性の高い細胞のカルセインの蛍光グリーンが得られます。死んだ細胞は、EthD 1 のセルと核酸、赤い蛍光性の原因とそのバインディングへの参入を可能にする膜侵害セルとしてマークされます。

Representative Results

当初は、位相差顕微鏡は、アストロ サイトの接着とバンドル形成の進行と時間の関数として、細胞構築全体の安定性を監視する使用されました。めっき後 1 h で、球状形態 (図 2 a) マイクロ柱のルーメンを通してアストロ サイトが見つかりました。5 h で、アストロ サイト始めプロセスを拡張する、契約、8 h で中細胞展示完了プロセス入り形態マイクロ列 (図 2 a) の長手方向の軸に沿ったケーブルのような構造を形成します。特に、マイクロ列にわたって細胞の分散最初の存在と比較して、アストロ サイトの内部に沿って密な束のネットワークを形成するために契約している登場(図 2 b)。初期セルの配置は、しばしば、縦軸に沿ってまとめアストロ サイト ネットワークの後のジッパーを閉じて、マイクロ列 (図 2) の中心部に密なバンドルを形成するために似ています。このバンドルされたアーキテクチャの形成された自己組織化プロセスのため、一部マイクロ列 ID とセル密度の選択によって決まります。アストロ サイトは整列し、(図 3 b、トップとミドル、そして3 D 3F) 350 μ m 未満の ID を持つマイクロ列のシードとバイポーラ形態を取得49。1 mm の ID が利用されたときに、これらの細胞がランダムな方向性を実証するどころか、(図 3 b下) 外観に似ている血清無料公開される 2D アストロ サイト文化の共同培養液 (図 3 a右)。さらに、アストロ サイトが配置を低の播種密度 (105セル/mL x 2.0 3.0 または 2.0 から 3.0 × 10 の2セル/mm3) でまだ表示にもかかわらず (図 3)、高密度 (9.0 12.0 でのみ高密度のネットワークが形成されます。x 105セル/mL または 9.0 12.0 × 102セル/mm3) と同様の寸法の円筒形マイクロ列内 (図 3 bに見られる、トップ)、49プロトコルの提案。蛍光を発する蛍光グリーン (カルセイン AM) と赤 (EthD-1) セルの総面積に対する緑 (カルセイン AM) 細胞の面積の比として生きる/デッド試金を使用してアストロ サイトの束で生存率が定量化されました。アストロ サイトのバンドルの生存率は 97.4%、2 D アストロ サイト文化コントロール (図 4 a4 b) の 98.2% 生存率に似ているマイクロ列内の環境はアストロ サイトの活力 (に適しているを証明します。図 4E)。アストロ サイトの足場のライブと死んでいるセルの 3 D 再構成はまた構造 (図 4-4 D) 内全体のセルの配置を示します。さらに、超長いアストロ マイクロ列は実質的な長さとアストロ サイトのバンドルの安定性を調査するため開発されました。3.5 cm の異常な距離でも、整列、密で、契約のアストロ バンドルの細胞構築がはっきりのズームの領域に見られる (図 5 a)、マイクロ-列の長さを通して一貫して持続された、マイクロ-列 (図 5 b5 C)。

構成、バンドルされた固定し、GFAP などのグリア細胞の特徴的な中間フィラメント蛋白質の免疫細胞化学法による染色、ネスチンとビメンチン。共焦点画像では、アストロ サイトのプロセス軸受形態およびプロセス (図 6および図 7) の縦方向の配置を確認してください。中間フィラメント蛋白質の表現はマイクロ列 (図 6図 7 b7 D) 内でアストロ サイトの束だけでなく、2 D のアストロ サイト文化 (図 7 a) で見ることができます。さらに、コラーゲンの染色態度マイクロ列でこの ECM タンパク質の存在を確証しました。アストロ サイトはコラーゲン (図 8 a)、2 D 環境で培養した場合に連続した構造を形作らないアストロ サイト登場に準拠し、できるようにマイクロ列で培養したときのルーメン内のコラーゲンを改造するのに対し細胞収縮とバンドル形成 (図 8 b)。GFAP およびコラーゲンのチャンネルのオーバーレイは、アストロ サイト ケーブル (図 8 b) 縦コラーゲン線維と密接に関連付けられてプロセスから成っていることを示した。したがって、アンカレッジを提供しから離れてコラーゲン線維も提供している収縮後密な束を形成するアストロ サイトの方向に関する指示追加。アストロ サイト コラーゲンの収縮保持、いくつかのケースでに一直線に並べられたバンドル (図 9 a) 形成後 12-24 時間以上の崩壊の結果として得られるもの。ハイドロゲル マイクロ列内のケーブルのようなアストロ サイト アーキテクチャを安定させるために追加のコラーゲン マトリックスは完全に形成されたバンドルには、さらに収縮を阻害し、崩壊の端に追加されました。これは安定性の長いウィンドウ (図 9 b) を予想する補強土工法は、少なくとも 4 日間希望のケーブル アーキテクチャの生存のため許可されています。また、代表のアストロ バンドルされたハイドロゲル マイクロ列から抽出した、マウントと張力と外部の環境にさらされたとき安定性を評価するためにガラス coverslips に 4% ホルムアルデヒドと固定します。強調表示、抽出およびさまざまな形状 (図 10 a10 b) に物理的な操作、アストロ サイトの突起と配置、維持プロセスはマイクロ スケールの形態 (図 10) をバンドルした後でも、一度形成されたハイドロゲル マイクロ列の構造サポートが存在しない場合でも、自己整合アストロ足場の弾力性。

一次皮質ニューロンも共同培養アストロ サイトのバンドルされた神経細胞の接着と神経突起伸長を扇動できるかどうかを探索するマイクロ列内のアストロ サイトで。GFAP および微小管タンパク質 β-チューブリン III がそれぞれ、ニューロンとアストロ サイトの特定のマーカーとして使用します。図 11 aは、プロセスを展示し、一直線に並べられたバンドルを形成できるがまた共同皮質ニューロンとシード アストロ サイトを示しています。ニューロンは、GFAP (図 11 b-11 Cのオーバーレイ) と共局在すべて肯定的な β-チューブリン III 染色から、アストロ サイトのバンドルに優先的が付いて登場。ハイドロゲル マイクロ列内でメッキされた皮質ニューロン (図 12 b) アストロ サイト構造の再生特性を示すためには、2 日後にアストロ サイトがメッキ (図 12 a)。ニューロンは、アストロ バンドルに、アストロ サイトの管に沿って直接神経突起を拡張します。更なる検査解体方法 (図 12) の成長するアストロ サイト管が存在しない地域で突起が見られたに対し神経突起伸長アストロ サイトのケーブルの方向を示した。これらの観察は、ニューロンの接着や神経突起の伸長を促進埋込型生活経路として機能する可能性がある、実行可能なそして堅牢なのアストロ サイト ネットワークのプロトコルが結果を示します。

Figure 2
図 2: 明視野顕微鏡が時間をかけてアストロ サイト内の束ハイドロゲル マイクロ列形成を示しています。(A) めっき後時間の関数としてのアストロ サイト形態: (1 h) アストロ サイトは球状で、構成体全体で分散しました。(5 h) アストロ サイト開始プロセスの拡張・収縮;(8 h) アストロ サイトが整列し、契約します。スケール バー = 100 μ m (B) 束追加代表的な足場に時間をかけて形成: (1 h) 最初にアストロ サイトは球状、はプロセスは発生しません。(24 h) 星状膠細胞の密な束が形成されます。スケール バー = 300 μ m (左) と 500 μ m (右)。(C) 完全に形成されたアストロ バンドル 24 h めっき後, 内腔の壁の明瞭な端にケーブルの両端を接続する場所「zippering」効果を示します。スケール バー = 1000 μ m。

Figure 3
図 3: 微小カラム内径と細胞密度の影響、バイポーラ アストロ サイトの一直線に並べられたバンドルの自己集合。(左) 血清を含むメディアおよび無血清培養メディア (右) と (A) 2 D アストロ サイト文化非プロセスおよびマルチ プロセス軸受形態をそれぞれ表示します。スケール バー 180 と 350 μ m フォーム配置バンドル ID が複数、アストロ サイトの 1 ミリメートルの結果の間の長手方向軸を基準にしての ID を持つマイクロ列で 100 μ m (B) アストロ (9.0 12.0 × 105セル/mL) の高密度で播種を =。内腔の直径全体のアライメントされていないプロセス。スケール バー = 100 μ m (上、中) および 150 μ m (下)。低密度 (2.0-4.0 x 105セル/mL) で 350 μ m の ID マイクロ-列のシード (C) アストロ サイトは整列がバンドルされていません。スケール バー 100 μ m。 (D) = バイポーラ形態低または中程度の細胞密度で 350 μ m の ID マイクロ-列のメッキ、ときアストロ サイトを獲得。スケール バー = 300 μ m. (E) Dハイドロゲル マイクロ列の内側を形成するバイポーラ アストロ サイトのチェーンのズーム表示ボックスします。スケールバー = 300 μ m. (F) 個々 のバイポーラ アストロ サイトの例。スケールバー = 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: バンドル形成ハイドロゲル マイクロ列内後アストロ サイトは存続します。(AB)、(CD) それぞれ、カルセイン AM/エチジウム ホモ染色 (グリーン ライブの平面文化と一直線に並べられたアストロ バンドル中の細胞の生存率を示す 3 D 共焦点再構成細胞;赤死細胞)。ライブとデッドの細胞の (E) 定量の結果、マイクロ コラム ライブ/デッド アストロ サイトの 2D サーフェス上で培養したときのパーセンテージがほとんど同じで。エラーバーは標準偏差を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5: 代表的な超長い整列アストロ バンドル ハイドロゲル マイクロ列内の位相コントラスト イメージ。(A) 3.5 cm のマイクロ列の全体の長さで形成をバンドルします。スケール バー = 1,000 μ m. (BC) 高倍率ズーム イン表示アストロ配置全体に沿って様々 な地域でAのボックスに対応する構成要素の。スケール バー = 500 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 6
図 6: アストロ サイトの足場の反応は星状膠細胞の縦方向の配置を示します。(A) (右) GFAP (赤; 左) と核 (ヘキスト; 中間) および両方のチャネルのオーバーレイの染色を示すアストロ バンドルの共焦点の復興。(B) 高倍率ズームのAで箱入りの地域のアストロのバンドルのマイクロ列内でアストロ サイトの細胞構築の可視化を許可します。スケール バー = 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 7
図 7: 免疫細胞化学を通じて代表的なアストロ バンドルのキャラクタリゼーション。(A B)2D サーフェス上で培養アストロ サイトとハイドロゲルでシード マイクロ列表現と同様のアストロ サイトのマーカー GFAP (赤) とビメンチン (緑)。(A) 独立した、結合されたチャンネルを示す 2D 平面アストロ サイト文化の共焦点の復興。スケールバー = 100 μ m。 (B) 共焦点画像アストロ バンドル、マーカーの発現を確認すると、アストロ サイトの配置を紹介します。スケールバー = 50 μ m. (C D) アストロ マイクロ列内培養もエクスプレス中間フィラメント蛋白質ネスチン (赤) とビメンチン (緑)。(C) アストロ バンドルのコンフォーカル画像。スケール バー 100 μ m (D) 高倍率ズーム-でc=。スケールバー = 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 8
図 8: 配置バンドルのアストロ サイトは密接に契約、縦コラーゲン マトリックス、二次元文化のコラーゲンの不規則な配置ではなくやり取りします。セルは、カルビンディン抗体がアストロ サイト (GFAP; 赤)、核 (ヘキスト; 青)、コラーゲン (緑) を観察されました。(A) 2 D アストロ サイト文化 1 mg/mL でコラーゲンたっぷり示し不整列アストロ サイト ランダム コラーゲン。スケール バー = 250 μ m の範囲 (B) コラーゲン マイクロ列内腔の壁から引っ張ってし、アストロ サイトのバンドルの一部である配置のマトリックスを形成する契約です。スケール バー = 150 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 9
図 9: 追加コラーゲンはアストロ サイトのケーブルの構造を安定させるために使用できます。(A) バンドルがアストロ サイト コラーゲン被覆ハイドロゲル マイクロ列内をめっき後約 6 h を形成します。バンドルは形作られたより高い濃度 (3 mg/mL) コラーゲンはアストロ サイトのケーブルの収縮を阻害するマイクロ列の端に追加されます。追加コラーゲンの安定していない構成要素でアストロ サイト コラーゲンの束が 18 h で契約を始めていたし、アストロ サイトのケーブルは 24 h で完全に崩壊していた。バンドルが 3 mg/mL コラーゲン強化されたときこの収縮は観察されなかった。スケール バー = 1,000 μ m。(B) ズームでの折りたたまれたアストロ バンドル 3 mg/mL コラーゲンで補強しないの。スケール バー = 500 μ m。(C) ズームでのコラーゲン強化マイクロ列からの領域。アストロ バンドル形態は、マイクロ列の全体を通して維持されました。スケール バー = 500 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 10
図 10: マイクロ列およびポリ L リジン コーティング ガラス Coverslips にマウントからアストロ サイトの束の抽出手法のロバスト性を証拠。(A) 位相のいくつかのイメージを抽出「ペン」、単語のスペルに操作、アストロ サイトのバンドル。(B) 同一の共焦点の復興は抽出アストロ サイトのマーカー GFAP (赤) と (ヘキスト; 青) の細胞の核の染色のバンドルです。スケールバー = 100 μ m。 b箱入り地域の (C) 倍率維持を示しています、、不規則な形に操作時にもアストロ サイトの足場的バンドル並びに一直線に並べられた、バイポーラの形態。スケール バー = 200 μ m. 相と共焦点画像間の構造的な違いは可能性が高い免疫細胞化学プロシージャの間に洗浄によりシフト構造の人工物であることに注意。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 11
図 11: ニューロンに準拠し、ニューロン ・ グリア共培養足場で一直線に並べられたアストロ束に沿って神経突起を拡張します。(A) 位相差像ニューロン シード アストロ バンドル。スケールバー = 300 μ m (B) ・ (C) ニューロンがアストロ サイトのバンドルに準拠し、ケーブル (ヘキスト-青の方向に沿って神経突起を拡張するみ。GFAP 緑;Β-チューブリン III-赤)。スケール バーそれぞれ 200 と 100 μ m を =。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 12
図 12: 監督神経突起伸長のための生活の足場としてアストロ サイト ケーブル。ニューロンから成るマイクロ-列の領域を示す共焦点の再構成はシード束形成後約 2 日間です。(A) GFAP 陽性グリア バンドル, (B) β-チューブリン III 陽性ニューロン, とヘキスト染色核 (青) を含む、すべてのチャンネルの (C) マージ。注意ニューロン展示突起配置整列アストロ サイトのプロセス (矢印) と地域へ付着したとき、ランダムに展示するアストロ サイトが登場したニューロン遵守していないに一直線に並べられたに対し (すなわち多方向) 神経突起伸展 (矢印)。(D) ズームイン領域の神経突起伸展の方向性を示しています。スケール バー = 100 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Discussion

PNS のより協力的な環境と比較して、中枢神経系特に頭部外傷、神経変性の有害な結果の処理に制限されます。哺乳類の中枢神経系への深刻な侮辱、グリア瘢痕が形成されると、軸索の伸長を阻害するプロテオグリカン14を分泌する無秩序の反応性アストロ サイトの密な網目に囲まれた線維化と炎症性細胞の核心から成る。この傷跡は、軸索終末12の再生に対して物理的および生化学的な妨害として機能します。なお、成人の哺乳類の中枢神経系は神経因性センターは下帯、海馬歯状回および可能性のある他の通常非アクティブに制限されますので外傷や神経変性の後で失われた細胞を復元する新しい神経細胞の限られた資源を所有しています。エリア54。理想的な戦略は、現在のアプローチは、アドレスに失敗する中枢神経系の再生能力に限界の両方の側面を回避でしょう。など、我々 の研究グループは、神経欠損領域と再生軸索成長円錐のガイド付きの拡張に向けて神経移行経路の生活を提示を目的としたアストロ ベースの足場を開発しました。アガロース マイクロ柱の内部にコラーゲン含まれている整列のアストロのバンドルは、これらアストロ サイト生活の足場を構成します。かなり区別から従来細胞と生体材料に基づく中枢神経系の修復と再生のための戦略は、これらの構成要素の研究は完全に生体内でいくつかをシミュレートする体外を前もって形成しました。グリア細胞ベースの指導と足場のアーキテクチャ。例えば、萌芽期の開発中に放射状グリア細胞経路行動として大脳新皮質とグリア細胞への移行新しい神経細胞の足場の生活パターン基板や道標細胞35 を装った軸索を先駆的な対象となる拡張子を仲介します。 ,,3839。脳室下帯で放射状グリア細胞胚はまたを神経移行後天的下帯からチェーン-形成 OB41縦整列のグリア チューブを形成しているアストロ サイトを生成します。さらに、それで実証されているいくつか非-哺乳類、次の中枢神経系の損傷は、再生の大きい程度は組織化、整列のアストロ配置44の形成のために可能。たとえば、ゼブラフィッシュ、病巣、バイポーラの形態と橋の病変は、パスを形成するグリア細胞プロセスの伸びへの分化への未熟なグリア細胞の移動、次の脊髄を再生することができること再生軸索45に指示します。整列アストロ バンドルの設計された構造物は、これらのメカニズムの概説およびグリア細胞を介した神経細胞移動と軸索再生35の必要な不溶性及び可溶性信号を表現することができる可能性があります。さらに、生きているアストロ サイトの包含のためこれらの構成要素は、ホストからのフィードバックに基づいて必要な環境手がかりを積極的に提示できます。

当社は技術でアストロ配置が自己組織化プロセスの物理的な手がかりとマイクロ カラム内径、コラーゲンの濃度、および播種密度によって促進される細胞間相互作用に依存します。このメソッドのもう一つの魅力的な機能は、ミクロン スケールのサイズについては、低侵襲被災地域の中枢神経系のことです。さらに、本稿で示された結果を示すプロトコルで得られた構造が高い生存率を持っているし、中間径フィラメント蛋白質 GFAP、ネスチンやアストロ サイト年齢通路番号で定義されているに関係なく, ビメンチンを表現.GFAP およびビメンチンは未熟果と成熟のアストロ サイトで表されます、ネスチンは未分化または未熟な細胞、グリア骨折 GFAP の発現とネスチン45,の減少生産を成熟に主に制限されました。55。 前研究示されているそのアストロ サイト年齢による変更の動作しかし、通路番号 (通路 4 12)56の範囲にわたって同様のバンドル中間フィラメント蛋白質の一貫性のある表現が見られました。アストロ サイトの足場も超長い達成するために示されていたセンチ スケール長生体外で、この手法は異なる傷害の長さに適応とジオメトリは、生体内で発生を示唆しています。さらに、一直線に並べられたアストロ バンドル展示顕著な構造の健全性と安定性、マイクロ列から抽出にさらされた後でも、ケーブルのような細胞構築を維持。アストロ ベースの生活は骨格も監督ニューロンの移行と軸索の拡張機能中枢神経系の修復を促進するためにこの技術の可能性を補強サポート ニューロン接着や神経突起伸長です。

整列のアストロのバンドルは、膠原線維の内部に保護鋼管ハイドロゲル箱詰めの含まれています。アストロ サイトの足場の作製開始マイクロ柱鍼針のキャピラリー チューブを挿入し、それに液体アガロースを吸引します。アガロースのせい、不活性プロパティ、生体適合性、および容易に制御機械、物理的で、および生化学的特性49選択した生体材料。ゲルの Agarose の集中が (例えば剛性) は基板から機械的刺激を感覚細胞以来重要な変数であるし、細胞内変化57で応答します。これらのマイクロ-柱の設計条件に十分な大量輸送ですが小さいのため横方向プロセスの副産物; を禁止する十分な気孔のサイズを許可する十分に高い気孔率が含まれていますナノスケール開放気孔率によってこれらの条件を満たしているこのプロトコルで使われる濃度で agarose の存在。このプロトコルの agarose の集中もその安定性、処理、および脳環境58の機械的性質の類似性の容易さのために選ばれました。注目すべき考察はキャピラリー チューブ内の針の中心的な配置であります。多くの場合、針があります若干斜めまたは避難過程で、チューブから agarose のゲル化とマイクロ列の除去の後外側の壁にあるオフセンター相対する内腔を引き起こしています。これを避けるために、針はまっすぐでなければなりません、アガロース中心軸に沿って針を保持する描画されている間プランジャー チューブ針アセンブリ垂直位置に置く必要があります。内腔の正確な集中保護 agarose の壁の間の整列のアストロ サイト内腔はシリンダーの外側の縁の近位にある場合は破裂しやすいです。さらに、内腔と外側の壁の間に十分な距離があります保護の利点中および移植後 (ただし、インプラントするマイクロ列前からアストロ サイトの構成要素は削除されません)。アストロ足場製造の初期段階は、ニードル径の選択は適切なアストロ相馬/プロセス配置とケーブルの重要な自己組織として、技術の成功のため重要です。アストロ配置が逆セルの配置と堅牢なアストロ バンドルされて 180 に 350 μ m (図 3) の形成に最適な ID の範囲と、マイクロ列 ID に依存していたことがわかった。同様に、それは以前ニューロン直接5960、曲げ処理を軽減するために最小の基板曲率方向に伸長し、同様のメカニズムが職場でアストロ サイトに影響を与える可能性が示されました。私たちシステム49で配置。アストロ サイトの配置に影響を与えず、曲率だけでなく分かった 350 μ m ID 範囲取得、バイポーラ形態49, 1 mm のまたはの培養アストロ サイト ID で観測された星状、多極のフォルムに反してアストロ サイトの結果に 1802 D (図 3)。それは同様に彼らの生理学的特性をバイポーラ アストロ サイトの形態にこれらの深遠な形態学的変化に変更可能性があります。例えば、これらのアストロ サイトは代替 secretable 要因またはセル表面のマーカー再生のために有利かもしれないことを述べることができるが、これはさらに特性を保証します。全体的にみて、私達の調査結果を示す表面の曲率などの物理的な手がかりの適切な選択、アストロ サイト生活の足場でネイティブの細胞構築をエミュレートすることが不可欠。

アストロ サイトの足場の建設は、マイクロ-柱の内部に空洞をシーケンシャル含めるコラーゲン ECM ソリューションと皮質アストロ サイトを続行します。マイクロ列の内部ルーメンは、アストロ サイトの生存、添付ファイル、および agarose の神経突起伸長61を個別にサポートすることができないのため、配置バンドルの形成をサポートするコラーゲンでコーティングされています。1 mg/mL のコラーゲン濃度は、低次及び高濃度が接着剤の不足、ECM、それぞれ49の不安定性の結果を先行研究が決定されるために選ばれました。したがって、期待どおりに、コラーゲン濃度はこの手法の有効性に劇的な影響をいます。さらに、ECM ソリューションで構成されていますのみタイプ私コラーゲン。ラミニンと 2D アストロ文化のマトリゲル コーティング基板に比較すると、アストロ サイト メッキ タイプ私コラーゲンを示した最適な密着性とネットワーク形成62。コラーゲンの細胞播種前に重合用培養時間もプロトコルの重要なステップです。以前わかったニューロンは、アガロース マイクロ列に未重合 ECM と付随して配信された減らされた神経突起伸展と軸索の脱力が見られる47とこれらの調査結果がアストロ サイトを延長することが可能です。同様に。コラーゲンはアストロ サイトの接着とバンドルの形成に必要なため、構築中 ECM の存在と空気の泡や空のポケットがない場合必要があります可視化し、顕微鏡を用いて確認しました。

プロトコルは、アストロ サイトのメッキ、コラーゲン、短期文化ターゲット細胞構築の形成のために細胞接着を確保するため潜伏期間で終わります。アストロ サイト通過数 4-12 の間は、彼らは堅牢なアストロ バンドル、コラーゲンな改革を展示として使用されました。これらのアストロ サイトはまた成る成熟した表現型を提示 > 95% 純粋培養63,64神経汚染なしには少し。血清含有培地 (左図 3 a, ) を採用してください、普通のアストロ サイトの文化と対照をなして本手法はプロセス軸受形態 (図 3 a,右を採用するアストロ サイトを許可する無血清培地を利用してください。)と一直線に並べられた突起とマイクロ列62,65,66内のプロセスの束を形成します。350 μ m という ID を持つ 9.0 12.0 × 105セル/mL の範囲で高濃度結果の伴うコラーゲンを改造、アストロ サイトが分散している間堅く詰められたバンドルの形成面での細胞播種濃度、、しかしまだ揃え、低濃度を利用していた場合 (図 3)。したがって、播種濃度細胞間相互作用に及ぼすアストロ配置や観測ケーブルのような構造の形成の程度に影響します。内腔細胞液の注入は、連続束形成にとって重要であるマイクロ列の長さにわたって同種の配信を確保するため堅実を用いて可視化する一般に。播種後文化メディアで氾濫する前に予備的なインキュベーション時間は ECM にアストロ サイトの定着を確保するため不可欠です。構造が十分に乾燥を防止するため加湿される期間をアストロ サイトは、構造から脱出する場合に修正されるかもしれません。8 h、整列のアストロ サイトの束のネットワークが形成される過程でことを示した時間の関数としてのアストロの足場の位相差像。さらに、構造がコラーゲンと GFAP図 8に示すように、ラベル付けされたとき管腔壁、その後の収縮および細胞と契約のコラーゲンの緊密な関連から ECM の剥離が認められました。この現象はフレキシブル基板とマトリックス改造を歪める力を生成するグリア細胞の線維芽細胞のような容量の事前報告書に基づいて、壁からコラーゲンをデタッチ アストロ サイトの収縮力の結果である可能性があります。アストロだけにおけるアストロ サイトの機能し、ニューロン ・ グリア共培養28,49,,6768。具体的には、アストロ サイトの運動性とコラーゲン線維とインテグリンを介した相互作用の結果の一つは線維17,69を契約するための十分な力の世代です。全体的にみて、説明プロトコルの実装は物理基板中枢神経系の開発の複数の段階で存在を要約密、整列のアストロ サイト ケーブルのような構造の自己組織化ネットワークから成る生活の足場を生成します。

プロトコルを通して生じる個々 の問題に加えてアストロ足場技術は、中枢神経系を修復する能力に影響を与える可能性がありますその他の支障を所有しています。例えば、この技術の究極の成功は神経系の可塑性と機能統合ホスト回路とアストロ サイトの足場の次第であります。アストロ サイトのバンドルのプロ再生属性をカウンター可能性があります炎症性の応答の可能性があるこれらの足場の注入に関連。すべての移植技術は、血液脳関門を破壊し、神経細胞と組織47の毛細血管との間の近さのための炎症性細胞の浸潤を引き起こす能力を持っています。この場合、ハイドロゲルのマイクロ列または足場のアストロ サイト別箱詰めパターンは、炎症反応を軽減する抗炎症因子放出制御車として利用されるかもしれない。当初、セルの配置を強いる力として整列アストロ バンドルはマイクロ列内安定していない、最終的に目的の細胞構築の 1-2 日間の培養後の崩壊につながった行列を改造します。ただし、追加の収縮とバンドルの崩壊場所でバンドルを保持するために高濃度のコラーゲンを追加してマイクロ列の両端にバンドルの追加補強を提供することにより邪魔をされました。追加戦術は、セカンダリのカプセル化、という新しいゲルのコーティングはマイクロ列から彼らが引き出されます整列アストロ バンドルに適用を採用することです。脳への一直線に並べられたアストロ サイト ネットワークの配信のために全体の長さに沿ってホストと構成細胞間の細胞間接着構造を安定させるとも可能性ですが、これは今後の研究で直接テストする必要があります。

したがって、今後の取り組みが安定化とアストロ サイトの束の中に体内の神経細胞の移動を可能にするために出産後保護修復を保証する効果的な移植法の開発を目的とされると負傷した中枢神経系の再生。我々 は以前のホストと生存率と構造の統合の結果を神経細胞・軸索ベースとする「マイクロ TENNs 視床の経路で、アストロ サイトの構成要素の箱詰めスキームを共有留置成功に示している組織 1 ヶ月46,47まで。したがって、マイクロ列から抽出後ケーブルの堅牢性を悪用できます。この場合、自己組織を誘導する初期文化ベッドとして役立つであろう agarose のゲルとアストロ サイトのケーブルが、箱詰めから削除され、薄肉針を使用して脳に直接注入するし。ハイドロゲル マイクロ列から抽出中に機械力によるアストロ サイトの変形はみられていないといいます。アストロ サイトの反応性に関する力学的変形の効果を勉強の前の仕事は、任意の結果の変形が適用されないことを急速に十分なアストロサイトーシスまたはプロセスの伸長62,70を誘導するために示唆しています。脳組織および可能な炎症性応答への損傷を最小限に抑えるために開発以前マイクロ TENNs 針レス技術を使用して、ハイドロゲル内でバンドルを埋め込むことが。この方法論で、ハイドロゲルは、ニードルレス注入47の破壊と炎症性のフット プリントを損なう可能性があります脳参入は、カルボキシメチル セルロースの薄い層でコーティングされています。その後、移植研究は、生き残るためにホスト組織と統合これらの足場の能力を評価するために行うことができる、神経移行と軸索ガイダンスを促進します。これらの構成要素が神経幹細胞の分裂直接擬態の可能性のあるドライブに、RMS と傷害のサイトに接続されているもう一方の端でそのプールにアクセスする SVZ など神経因性領域から発せられる一端植え付けられる特に、神経移行と従量制のファッションの領域を再設定します。

移植プロトコル最適化後、他の分野で技術を向上できます。未熟なアストロ サイト (例えば放射状グリア、RMS 型セル) と具体的に製作されるマイクロ列またはこれらの構成体の49の再生誘導能力を強化するために脱分化型は、後半に成熟した表現型。グリア瘢痕の生体外モデル、成熟したアストロ サイトには軸索伸長71の経路を形成する能力がなかった。対照的に、未熟なアストロ サイトは、神経突起伸長の in vitroと軸索再生体内コンドロイチナーゼ ABC グリア瘢痕71 CSPGs の高レベルに対処するために付随して移植を促進するために示されています。,72。 個別化医療の出現と合わせて自家アストロ マイクロ列をソースなど誘導多能性幹細胞 (Ips) とひと神経幹細胞 (hNSCs) からの幹細胞を播くことによって開発可能性があります。この変更は、これらの個別のコンジットとして機能する足場と特定経路修復と再生が許可されます。これらの細胞の源の使用が可能なを回避可能性がありますさらに、免疫応答、アストロ サイトの注入が原因します。これらの細胞が理論的に回避か iPSC 由来臓器後有害な応答の不在によって提案されるように、移植時の免疫反応を減少していることができるにもかかわらず、免疫原性は、iPSC 細胞によって異なります、マウス73,74で注入。さらに、自家 hNSCs 及びそのアストロ サイトの誘導体は、同種免疫の75を抑制します。したがって、これらを製造、自家幹細胞ネットワークが重要な未来の臨床設定でより容易に適用可能なこの手法を作るステップありますアストロ サイトが配置されます。

中枢神経系の修復と再生のための導管としてアプリケーションから離れてアストロ サイト生活足場の in vitroテスト ベッド、特定テスト パラダイムの目標に基づいてハイドロゲル箱詰めの有無として使えます。これらアストロ サイトの構成要素を使用して神経生理現象のモデルとして制御可能なプロパティと生活の足場の 3 D 環境を悪用するアストロ サイトを介したニューロンの移行と神経突起拡張機能などを調査可能性があります例えば、生体内での条件。本稿で説明したプロトコルでは、自己組織化ハイドロゲルのマイクロ列内コラーゲン マトリックス整列アストロ サイト束の作製を詳しく説明します。脳神経解剖学、発達・再生メカニズム、およびバッタの移行経路の機能の概説、によってこれらの埋込型アストロ サイト足場向神経移行と軸索支持の経路を提供する可能性があります。損傷した中枢神経系の抑制以外の環境での指導。

Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

財政支援と定められた国立衛生研究 [U01 NS094340 (カレン) ・ F31 NS090746 (Katiyar)]、マイケル ・ j ・ フォックス財団 [治療パイプライン プログラム #9998 (カレン)]、Penn 医学神経科学センター パイロット賞 (カレン)国立科学財団 [大学院研究奨学金 DGE-1321851 (Struzyna)]、復員部 [RR & D メリット レビュー #B1097-私 (カレン)]、陸軍衛生研究と資材コマンド [#W81XWH-13-207004 (カレン) &W81XWH-15-1-0466 (カレン)]。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acupuncture needle (300 µm diameter) Lhasa Medical HS.30x40 The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dish Fisher 08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) Invitrogen 14200075
Polystyrene disposable serological pipet Fisher 13-678-11D
Agarose Sigma A9539-50G
Microliter glass capillary tube (701 µm) Fisher 21-170J The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Microcap bulb dispenser Fisher 21-170J Bulb comes with the microcap tubes.
Hot plate Fisher SP88857200
Magnetic bar Fisher 1451352
Micropipette Sigma Z683884-1EA
25 mm gauge needle Fisher 14-826-49
Microscalpel Roboz Surgical RS-6270
Scissors Fine Science Tools 14081-09
Forceps World Precision Instruments 501985
Hot bead sterilizer Sigma Z378550-1EA
Stereoscope Nikon SMZ800N
Micro-spatula Fisher S50821
Rat tail type I collagen Corning 354236 Maintain at 4 ºC and remove only when needed. Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tube Fisher 02-681-256
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher SS2661
Hydrochloric acid (HCl) Fisher SA48-1
Litmus paper Fisher 09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS) Invitrogen 14170112 Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA Invitrogen 25200056 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (Dnase) I Sigma 10104159001 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with Ham's F-12 Nutrient Mixture Gibco 11330-032 Store at 4 ºC.
Fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals S11195 Store at -20ºC.
Postnatal day 0 or day 1 Sprague Dawley rat pups Charles River Strain 001
Neurobasal embryonic neuron basal medium Invitrogen 21103049 Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 serum free supplement Invitrogen 12587010 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamine Invitrogen 35050061 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
G5 astrocytic supplement Invitrogen 17503012
Sprague Dawley embryonic day 18 rats Charles River Strain 001
Pasteur pipette Fisher 22-042816
15 mL centrifuge tube EMESCO 1194-352099
Vortex Fisher 02-215-414
Centrifuge Fisher 05-413-115
Hemocytometer Fisher 02-671-6
Incubator Fisher 13 998 076
Formaldehyde 40% Fisher F77P-4 Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.
Glass cover slip Fisher 12-548-5M
Nail polish Electron Microscopy Sciences (EMS) 72180
Fluoromont mounting medium Southern Biotech 0100-01
Poly-L-lysine Sigma P4707
Phosphate buffered saline Fisher BP3994
Triton X-100 Sigma T8787
Normal horse serum Gibco 16050-122
Rabbit anti-glial acidic fibrillary protein (GFAP) primary antibody Millipore AB5804 Store at -20ºC.
Mouse anti-beta-tubulin III primary antibody Sigma T8578 Store at -20ºC.
Rabbit anti-collagen I primary antibody Abcam ab34710 Store at -20ºC.
Rabbit anti-vimentin Millipore AB3400 Store at -20ºC.
Mouse anti-nestin Millipore AB5326 Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody Invitrogen A10037 Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 568 secondary antibody Invitrogen A10042 Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody Invitrogen A21206 Store at 4ºC.
Hoechst 33342, Trihydrochloride Invitrogen H3570 Store at 4ºC. Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen. Therefore, it must be disposed of in a separate container.
Calcein AM Sigma C1359 4 mM in anhydrous DMSO
Ethidium homodimer-1 Life Technologies E1169 2 mM in DMSO/H2O 1:4 (v/v)
Dimethyl sulfoxane (DMSO) Sigma 276855
A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope Nikon Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S Microscope Nikon Used for taking the phase-contrast images. With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).

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