Tessutale tridimensionale allineato Astrocyte reti per ricapitolare i meccanismi dello sviluppo e facilitare la rigenerazione del sistema nervoso

* These authors contributed equally
Bioengineering
 

Summary

Presenteremo lo sviluppo di auto-assemblati, tridimensionale fasci di somata astrocytic allineati longitudinalmente e processi all'interno di un encasement romanzo biomateriale. Questi ingegnerizzato "ponteggi vivente", che esibiscono micron-scala diametro ancora estendere centimetri di lunghezza, può servire come banchi di prova per lo studio dei meccanismi dello sviluppo neurologico o facilitare la neurorigenerazione di regia della migrazione neuronale e/o assonale path-finding.

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Katiyar, K. S., Winter, C. C., Gordián-Vélez, W. J., O'Donnell, J. C., Song, Y. J., Hernandez, N. S., Struzyna, L. A., Cullen, D. K. Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration. J. Vis. Exp. (131), e55848, doi:10.3791/55848 (2018).

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Abstract

Malattia di neurodegenerative e neurotrauma provocare spesso durevole deficit neurologici a causa della limitata capacità del sistema nervoso centrale (CNS) per sostituire i neuroni persi e rigenerare le vie axonal. Tuttavia, durante lo sviluppo del sistema nervoso, della migrazione neuronale ed assonale estensione spesso si verificano lungo le vie formate da altre cellule, indicato come "vita ponteggi". Cercando di emulare questi meccanismi e per progettare una strategia che elude l'ambiente inibitorio del SNC, questo manoscritto presenta un protocollo per fabbricare tessuti ingegnerizzati basati su astrociti "vivente ponteggi". Per creare questi costrutti, abbiamo impiegato uno schema di encasement del romanzo biomateriale per indurre gli astrociti di auto-assemblarsi in tridimensionale densi fasci di bipolare somata allineati longitudinalmente e processi. Idrogel in primo luogo, cavo micro-colonne erano riunite, e il lume interno è stato rivestito con collagene-matrice extracellulare. Astrocytes corticali cerebrali dissociato quindi sono state consegnate nel lumen della micro-colonna cilindrica e, a un diametro interno critico di < 350 µm, spontaneamente auto-allineati e contratta per produrre fibra come lunghi cavi composto densi fasci dei processi di astrociti e fibrille di collagene misura < 150 µm in diametro ancora estendere diversi centimetri di lunghezza. Questi ingegnerizzato ponteggi vivente ha esibiti > 97% vitalità cellulare e sono stati quasi esclusivamente composta da astrociti esprimendo una combinazione del filamento intermedio proteine glial-proteina silicea fibrillare (GFAP), vimentina e nestina. Questi stati allineati Astrocita reti sono state trovate per fornire un substrato permissivo per il fissaggio di un neurone e allineato del neurite estensione. Inoltre, questi costrutti mantengono l'integrità e l'allineamento quando estratti dal encasement di idrogel, che li rende adatti per l'impianto di CNS. Questi costrutti preformati strutturalmente emulano gli elementi chiave cytoarchitectural di biofiltri glial-based "vivere impalcature" in vivo. Come tale, queste impalcature derivati dal vivente possono servire come banchi di prova per studiare neurodevelopmental meccanismi in vitro o facilitare la neurorigenerazione dirigendo la migrazione neuronale e/o pathfinding axonal seguendo la degenerazione di CNS in vivo .

Introduction

Il sistema nervoso centrale (SNC) ha una capacità limitata per contrastare la perdita e/o disfunzione dei neuroni e vie axonal che accompagnano condizioni come la ferita di cervello traumatica (TBI), ictus, malattia di ferita (SCI) e neurodegenerative del midollo spinale1 ,2,3,4,5. Neurogenesi nel SNC è limitata a un numero limitato di aree del cervello, che ostacolano il restauro di neuroni persi6,7. Inoltre, la rigenerazione delle vie axonal perse nello SNC è insufficiente a causa della mancanza di orientamento diretto, la presenza di inibitori di conseguenza e astrogliosi reattiva dopo danno di tessuto neurale2,8, 9,10. Astrociti in genere hanno diverse funzioni nell'assistere i neuroni con omeostasi ionica, neurotrasmettitore gioco, formazione della sinapsi e neurovascular attacco11. Tuttavia, in seguito anche lievi danni al tessuto neurale, astrocytes possono subire variazioni molecolari, strutturali e funzionali come la transizione a un stato ipertrofico11. In risposta a grave neurotrauma, questi cambiamenti provocano la formazione di una cicatrice con una penombra contenente la migrazione astrociti reattivi e un nucleo di lesione che include leucociti trapelati dalla rottura emato - encefalica (BBB), microglia, oligodendrociti e fibroblasti11,12,13. Questi astrociti reattivi raggiungono una morfologia dei processi filamentosi, disorganizzati ed esibiscono l'espressione aumentata di proteine dei filamenti intermedi e proteoglicani Condroitin solfato (CSPG), che ostacolano la rigenerazione neurale12. Anche se inizialmente la cicatrice gliale aiuta a ripristinare l'integrità BBB ed evitare la trasmissione della risposta infiammatoria al tessuto sano circostante, serve come una barriera fisica e biochimica contro assone rigenerazione12,14 ,15,16. Per esempio, gli assoni che incontrano la cicatrice gliale visualizzare dei coni di crescita distrofica bulboso e stentata crescita12. Inoltre, la disorganizzazione dei processi astrocitari dopo lesione impedisce l'estensione della rigenerazione di assoni17. Il risultato di queste caratteristiche inibitorie si manifesta spesso permanenti menomazioni fisiche e neurologiche che pazienti soffrono dopo neurotrauma grave, tra cui TBI e SCI.

Indipendentemente dalle sfide estrinseche funzionale rigenerazione nel SNC, assoni hanno dimostrati di possedere un'intrinseca capacità di rigenerarsi. Per esempio, la natura dinamica dei coni di crescita distrofico a contatto con la cicatrice gliale suggerisce che queste terminazioni mantengono la loro capacità di estendere12. Di conseguenza, si ritiene che un ostacolo principale alla ricrescita assonale è l'ambiente inibitorio del SNC di alberino-ferito e che fornendo un ambiente più permissivo via la riduzione di cicatrici e/o fornendo rigenerative ponti attraverso la cicatrice sarebbe glial vantaggioso. Infatti, studi precedenti hanno dimostrato che i neuroni CNS erano capaci di estendere gli assoni attraverso una lesione usando gli innesti di nervi periferici come ponti, che presentano un ambiente più favorevole per assone rigenerazione12,18, 19. Parecchie altre strategie sono state perseguite per sfruttare questa capacità rigenerativa vestigiale. Ad esempio, manipolazione delle vie di segnalazione cellulare crescita in vari modelli di lesione ha provocato la rigenerazione assonale e cicatrice gliale riduzione10,20,21. Inoltre, gli studi hanno indicato che il trattamento con chondroitinase ABC, che scinde la maggior parte delle catene dello zucchero in CSPG, diminuisce l'effetto inibitorio di CSPG secernuto da astrociti reattivi22. Nonostante incoraggianti i risultati, questi approcci non forniscono diretto orientamento dei coni di crescita, che può potenzialmente causare rigenerazione aberrante12e inoltre non tengono conto della perdita di neuroni. Approcci basati su cellule sono stati utilizzati nei tentativi per superare gli effetti della cicatrice gliale e per ricostituire le cellule perse, in particolare i neuroni. Alcuni gruppi hanno dedifferenziate di astrociti reattivi nei neuroni, mentre gli altri sono trapiantate cellule progenitrici neurali in lesioni dello SNC di ripopolare la zona ferita e promuovere assone rigenerazione23,24, 25. Tuttavia, trapianto di cellule staminali è limitato dalla bassa sopravvivenza, scarsa integrazione e conservazione modesta nel tessuto danneggiato5. Inoltre, queste strategie basate sulle cellule non riescono a ripristinare a distanza axonal tratti, soprattutto in un modo controllato. Di conseguenza, biomateriali in combinazione con altri approcci stanno esplorande come veicoli di consegna per vari neurale e fattori di crescita e cellule progenitrici26. Approcci basati su biomateriali presentano un elevato grado di controllo di progettazione per la produzione di costrutti che imitano le specifiche fisiche, haptotaxic, e chemotaxic spunti presentano nel microambiente tridimensionale (3D) di destinazione host tessuto27, 28,29,30,31,32,33,34. Riproduzione di questi segnali ambientali è preminente per cellule trapiantate a presentare nativo-come la morfologia, la proliferazione, migrazione e segnalazione, tra le altre caratteristiche neurobiologiche29. Nonostante queste proprietà vantaggiose, avanzamento oltre tradizionale delle cellule seminate biomateriale ponteggi è necessaria per promuovere la rigenerazione assonale interurbano diretta e sostituire i neuroni persi contemporaneamente.

Un promettente approccio alternativo si basa su tessuto neurale ingegnerizzato "ponteggi vivente", che sono distinti da altri approcci basati su cellule a causa della presenza di cellule neurali viventi con un cytoarchitecture preformato che emula neuroanatomia nativo e/o meccanismi per facilitare la sostituzione mirata, la ricostruzione e la rinascita di circuiti neurali4,35. Considerazioni per la progettazione di ponteggi viventi includono i fenotipi e le fonti di cellule neurali, come pure le proprietà fisiche e meccaniche e i segnali biochimici dettata dalla composizione di qualsiasi accompagnamento di biomateriali35. Dopo il montaggio in vitro, queste impalcature vivente possono essere impiantato in vivo di molecole di adesione cellulare presente e chemiotattica e neurotrophic segnali per regolare attivamente la migrazione delle cellule neurali e crescita assonale a seconda dello stato e progressione dei processi rigenerativi35. Le cellule gliali possono servire come base per i derivati dal cytoarchitecture di vita ponteggi poiché queste cellule mediano vari meccanismi in vivo. Durante lo sviluppo cerebrale, nuovi neuroni si basano su processi basali esteso da glia radiale dalla zona ventricolare verso la piastra corticale in via di sviluppo come vivente impalcature per migrazione diretto36,37. Inoltre, estendendo la crescita coni sono mostrato a orientarsi rilevando segnali attraenti e repellenti suscitati dalle cellule gliali guidepost e cosiddetto "pionieristico" assoni sono consigliati per raggiungere gli obiettivi corretti estendendo lungo pre-modellato glial ponteggi di35,38,39. Così, le cellule gliali sono necessari per la Guida di avanguardia di assoni, che più tardi servono come assone-based "ponteggi vivente" per dirigere la proiezione degli assoni "seguace". Inoltre, meccanismi di crescita mediata da cellule gliali sono stati indicati a persistere dopo la nascita, come neuroblasti seguono migratori rostrale (RMS) per spostarsi dalla zona subventricolare (SVZ), una delle poche regioni di neurogenesi nel cervello adulto, per il bulbo olfattivo (OB)40. Questi neuroblasti nel RMS migrano all'interno del tubo glial (Figura 1A-1), che è costituito da processi astrocitari allineati longitudinalmente, tramite le adesioni cellula-cellula diretto e localizzato fattori solubili37, 41. Infine, mentre danno dello SNC in cause di mammiferi perturbato disposizione astrocytic processo formando una cicatrice gliale che fisicamente impedisce la rigenerazione assonale17, molti sistemi di mammiferi mancano la formazione di una cicatrice gliale dannosa. Piuttosto, le cellule gliali di specie di mammiferi mantengono più organizzato, allineato modelli che vengono utilizzati come guide attraverso la regione feriti17,42,43. Per esempio, nei modelli SCI non derivanti da mammiferi, assoni sono mostrati a crescere in stretta associazione con glial ponti che attraversano la lesione, suggerendo un ruolo importante per ponteggi glial organizzati come substrati facilitando la rigenerazione assonale e recupero funzionale ( Figura 1A -2) 42 , 44 , 45. ricapitolazione delle caratteristiche neuroanatomiche e i meccanismi dello sviluppo/rigenerativo descritti sopra può produrre una nuova classe di derivati dal vivere glial basato su impalcature che contemporaneamente possono guidare immatura migrazione neuronale ed assonale path-finding attraverso ambienti altrimenti non permissivi, quindi potenzialmente mitigare gli effetti di un neurone e la degenerazione del tratto dell'assone associato con lesione dello SNC e malattia.

Il nostro gruppo di ricerca ha già progettato più tipi di ponteggi vivente per la ricostruzione e rigenerazione di axonal tratti nel sistema nervoso centrale e sistema nervoso periferico (PNS) tramite micro-tessuto ingegnerizzato reti neurali (micro-teen) e tessuto innesti ingegnerizzati del nervo (TENGs), rispettivamente27,46,47,48. Entrambe le strategie dipendono intrinsecamente biomimetica. Micro-teen sono strutture anatomicamente ispirato alla strutturalmente e funzionalmente sostituire axonal tratti collegamento distinte popolazioni neuronali del cervello. TENGs sfruttare il meccanismo inerente allo sviluppo di assone-facilitato la rigenerazione assonale, esemplificato dalla crescita assonale "seguace" lungo gli assoni "pioniere", per raggiungere la destinazione host la rigenerazione assonale35,46,48. Abbiamo recentemente sfruttato la versatilità dello scaffold vivente tecnica mediante uno schema simile di encasement come micro-teen e in cerca di ispirazione dai meccanismi basati su cellule gliali presenti nel corso dello sviluppo. Qui, abbiamo sviluppato costrutti costituito da fasci astrocytic allineati che abbracciano il lume collageno di un idrogel micro-colonna49. Queste impalcature astrocytic viventi sono state sviluppate da primo riempimento un gruppo di ago di agopuntura-tubo capillare con agarosio liquido per creare un idrogel cavo cilindrico con un diametro esterno (OD) e il diametro interno (ID) corrispondenti ai diametri della tubo ed ago, rispettivamente. A seguito dell'agarosi gelificazione ed estrazione di idrogel micro-colonna dal tubo capillare, interno cavo è rivestito con tipo I collagene per fornire un ambiente permissivo per adesione di astrociti e allineato bundle formazione (Figura 1B -1). In seguito, il lumen è seminato con i astrocytes corticali cerebrali isolati da cuccioli del ratto postnatale (Figura 1B-2). Contrariamente alle tecniche bidimensionali (2D) allineamento che si basano sull'applicazione di campi elettrici, bioerodibili scanalature e matrice extracellulare della proteina (ECM) patterning, allineamento di astrociti nell'impalcatura di vita tecnica si basa sulla auto-assemblaggio secondo variabili controllabili come substrato curvatura (ID di colonna), la densità delle cellule e collagene concentrazione50,51,52. Gli astrociti contraggono e rimodellano il collagene e di acquisiscono una morfologia bipolare, allineati longitudinalmente analoga per i ponteggi naturali osservati in vivo (Figura 1B-3). Infatti, stiamo attivamente perseguendo l'uso di questi cavo-come le strutture come substrati fisici per un orientamento mirato di migrazione neuroni immaturi, nonché facilitare la rigenerazione assonale attraverso l'ambiente sfavorevole del danneggiato snc, in particolare la cicatrice gliale mammiferi (Figura 1). Questo articolo verrà presentare il metodo di fabbricazione dettagliato per le micro-colonne astrocytic, contrasto e immunofluorescenza immagini della citoarchitettura previsto e per una discussione esaustiva sulle limitazioni attuali e future direzioni di fase i tecnica.

Figure 1
Figura 1: ispirazione, protocollo di fabbricazione e applicazioni proposte per le reti di Astrocytic allineate. Ispirazione neurobiologica (A): (1) neuroblasti provenienti dalla zona subventricular neurogena (SVZ) utilizzano il tubo glial allineato longitudinalmente in rostrale migratori (RMS) per la migrazione diretto verso il bulbo olfattivo (OB); (2) Non-mammiferi come anfibi e pesci possono sostenere la rigenerazione dopo tessuto neurale in parte i danni dovuti alla formazione di un ponte glial che collega le estremità di una lesione (ad es. transected del midollo spinale) e serve come impalcatura per la Guida di assoni di rigenerazione. (B) Panoramica di fabbricazione: (1) costruzione di un'idrogel micron di dimensioni medie, cavo micro-colonna con il lume rivestito con ECM, (2) semina di astrociti corticali primari isolati da cuccioli del ratto postnatale, (3) auto-assemblaggio di longitudinalmente orientati verso il fasci di cultura ed estrazione (4) del fascio dal encasement del biomateriale per gli studi futuri dell'impianto. (C) applicazioni In vivo : (1) Queste impalcature vivente possono servire come tubi gliali ingegnerizzati per migrazione neuronale diretto da neurogene centri per ripopolare le regioni del neurone-carenti; (2) ricapitolazione del meccanismo dello sviluppo di avanguardia di orientamento dell'assone e il meccanismo rigenerativo di glial ponti in non-mammiferi può dotare queste impalcature astrocitari con la capacità di dirigere la rigenerazione assonale attraverso il non permissivi ambiente della cicatrice gliale dei mammiferi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

Tutte le procedure sono state approvate dalle commissioni di utilizzo presso la University of Pennsylvania e la Michael J. Crescenz Veterans Affairs Medical Center e istituzionali Animal Care e rispettate le linee guida stabilite nei criteri del servizio di sanità pubblica di NIH su Humane Cura e uso degli animali da laboratorio (2015).

1. sviluppo di agarosio Hydrogel Micro-colonne

  1. Fare una soluzione di agarosio 3% peso/volume (p/v) di peso 3 g di agarosio e trasferirlo in un recipiente sterile contenente 100 mL di soluzione fisiologica tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS). Aggiungere una barra magnetica sterile Becher e posizionarlo sulla superficie di una piastra calda/agitatore. Tenere a riposo il becher coperto per evitare l'evaporazione del suo contenuto nel passaggio successivo.
  2. Riscaldare l'agarosio e DPBS ad una temperatura di 100 ° C e mescolare a 60-120 giri/min. Regolare queste impostazioni come necessario e monitorare costantemente la progressione del processo di dissoluzione, come la soluzione inizialmente cambia da opaco a un aspetto chiaro che significa che l'agarosio è stato sciolto completamente.
    Attenzione: Il bicchiere caldo e la soluzione sono calde!
  3. Come la soluzione di agarosio è riscaldata e mescolata, recuperare quattro capsule di Petri vuota 10cm e aggiungere 20 mL di DPBS a due di loro. Posizionare gli aghi di agopuntura (diametro: 300 µm, lunghezza: 40 mm), microliter tubi capillari di vetro (diametro: 701,04 µm, lunghezza: 65 mm, capacità: 25,0 µ l) e un dispenser di lampadina all'interno della cappa di biosicurezza. Quando la soluzione di agarosio liquido Cancella, mantenere costante riscaldamento a circa 50 ° C e mescolando per evitare la gelificazione di agarosio.
  4. Introdurre un ago di agopuntura nell'apertura inferiore di un distributore di lampadina. Inserire un tubo capillare sopra l'ago esposta all'esterno. Fissare il tubo capillare inserendo parte di esso nella sezione di gomma del cilindro erogatore lampadina.
  5. Trasferire 1 mL di liquido dell'agarosi con una micropipetta alla superficie di una piastra di Petri vuota e inserire un'estremità del capillare verticalmente (con l'ago inserito) a contatto con agarosio, mentre il tappo di gomma del dispenser lampadina è vengano schiacciato verso l'interno. Rilasciare lentamente la pressione sul tappo erogatore lampadina disegnare agarosio nel tubo capillare.
    Nota: Il trasferimento di agarosio liquido nel tubo capillare deve essere eseguito rapidamente. Se l'agarosio liquido viene lasciato raffreddare sulla superficie di Petri per un tempo sufficiente (circa 60 s), inizia a gel, prevenire l'aspirazione adatto di agarosio lungo il tubo capillare.
  6. Posto che ogni gruppo di lampadina-tubo-ago in un libero di Petri e lasciare che l'agarosio gel all'interno dei tubi capillari solidificare per 5 min. Estrarre con cautela il tubo capillare con le mani fuori il tappo di gomma nel cilindro erogatore lampadina, lasciando l'ago e la gel di agarosio al posto all'interno del tubo.
  7. Estrarre manualmente l'ago di agopuntura estraendolo lentamente il tubo capillare; il cilindro di agarosio appena solidificato anche scivola fuori dal tubo in questa procedura, che ancora circondano l'ago. Spingere delicatamente la micro-colonna lungo l'ago di agopuntura con la punta delle pinze sterili per spostarlo alla fine. Posizionare l'ago sopra un aperto, capsula di Petri contenenti DPBS e spingere la micro-colonna nella DPBS con il forcipe.
    Nota: Se la micro-colonna di agarosio rimane all'interno del tubo capillare di vetro alla rimozione dell'ago di agopuntura, e spingere lentamente la micro-colonna di agarosio fuori il tubo capillare con un ago calibro 25 mm e nel piatto con DPBS.
  8. Sterilizzare microscalpels o forcipe usando uno sterilizzatore caldo perlina. Fare 4% w/v agarosio pesando 4 g di agarosio e trasferirlo a 100 mL di DPBS. Riscaldare e mescolare come spiegato nel passaggio 1.2 per ottenere una soluzione di agarosio liquido trasparente di 4%. Mantenere il riscaldamento e l'agitazione della soluzione durante la procedura seguente.
  9. Trasferire le capsule di Petri contenente le micro-colonne da un cappuccio di dissezione e spostare una micro-colonna con una pinzetta in una capsula di Petri vuota. Utilizzare lo stereoscopio per la guida ottica e un microscalpel per tagliare le micro-colonne fino alla lunghezza desiderata. Tagliare entrambe le estremità all'estremità di forma smussata agli angoli di 45o dalla posizione orizzontale per facilitare la movimentazione delle micro-colonne durante l'aggiunta di ECM e cella.
  10. Ripetere la precedente passo per tre ulteriori micro-colonne nello stesso piatto Petri e allineare i quattro costrutti in parallelo con una separazione di < 3 mm tra ognuno dei cilindri. Caricare 50 µ l di soluzione di agarosio 4% con una micropipetta e versare una striscia/linea di liquido sopra la matrice di micro-colonna per connettersi e aggregare i costrutti in gruppi di quattro persone (di seguito denominati "micro-colonna barche"). Evitare movimenti di 4% di agarosio fino ai confini della micro-colonne, che possono intasare l'interno, riducendo al minimo la distanza tra i costrutti e aggiungendo l'agarosio rapidamente in una linea sottile.
    Nota: Organizzare gruppi di quattro micro-colonne in "barche" non è necessaria per fabbricare i ponteggi astrocytic. Tuttavia, le barche servono per accelerare il processo di fabbricazione e di offrire un modo più sicuro per spostare e gestire micro-colonne nei passaggi successivi.
  11. Lasciare raffreddare la barca di micro-colonna per 1-2 min consentire di gelificazione di agarosio 4% aggiunto. Prendere la barca di micro-colonna con una pinzetta di collegamento 4% agarosio e spostare la micro-colonne di altri contenenti DPBS Petri preparata al punto 1.1.3. Fabbricare altre imbarcazioni con le micro-colonne rimanenti come desiderato.
  12. Spostare le piastre Petri contenenti micro-colonne e/o barche per una cappa di biosicurezza e sterilizzare con l'esposizione ai raggi ultravioletti (UV) per 30 min.
    Attenzione: Indossare una protezione adeguata per evitare l'esposizione ai raggi UV.
  13. Conservare i piatti con le barche di micro-colonna in DPBS a 4 ° C, se aggiunta di ECM e placcatura di cella non verrà eseguita immediatamente in seguito, fino a 1 settimana. Ripetere i passaggi di fabbricazione di micro-colonna se i costrutti non sono utilizzati durante questo lasso di tempo.

2. isolamento e coltura primaria delle cellule

  1. Isolamento di astrociti corticali da cuccioli del ratto
    1. In preparazione per la procedura seguente, aggiungere 20 mL di Hank soluzione salina (HBSS) a quattro Petri da 10 cm che servirà come serbatoi per i tessuti dissecati equilibrata. Tenere tutti i piatti sul ghiaccio. Sterilizzare pulito forbici, pinze, micro-spatola e micro-bisturi in uno sterilizzatore a caldo della perla.
    2. Preriscaldare il 0,25% tripsina con 1 millimetro di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e desossiribonucleasi (DNasi) di 0,15 mg/mL in HBSS a 37 ° C. Inoltre, preriscaldare il terreno di coltura di astrociti a 37 ° C, che consiste di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) con miscela di nutrienti F-12 di prosciutto e 10% siero bovino fetale (FBS).
    3. Anestetizzare postnatale giorno 0 o cuccioli del ratto Sprague-Dawley di giorno 1 di esporli a condizioni ipotermiche ed eutanasia per decapitazione. Perno la testa in un palcoscenico con una 19 mm calibro ago inserito nel muso davanti agli occhi.
    4. Fare un'incisione con un bisturi nel mezzo posteriore a anteriore, dalla base del collo fino al proprio dietro gli occhi. Eseguire un'altra incisione andando lateralmente da direttamente dietro gli occhi verso il basso, formando una forma a T. Utilizzare una pinzetta per tirare il pelle/cranio cranico fuori al lato.
    5. Tenere la testa per il muso (rivolto verso l'alto) inserendo un polo delle pinze nella bocca dell'animale e l'altro sulla superficie esterna. Rimuovere il cervello con una micro-spatola sterile e inserirlo in uno dei piatti Petri riempito con HBSS refrigerati. Posto questa capsula di Petri sul ghiaccio immediatamente in seguito e a tutte le volte tranne quando è in uso.
    6. Situare un blocco di granito precedentemente conservato a-20 ° C sotto uno stereoscopio all'interno di una cappa di dissezione. Collocare la capsula di Petri con il tessuto cerebrale sulla superficie del blocco di granito per preservare la sua bassa temperatura durante la procedura di dissezione. Utilizzare lo stereoscopio come guida visiva durante la procedura seguente.
    7. Se bulbi olfattivi rimangono intatti, estrarli da taglio con forcipe o microscalpels. Inoltre, utilizzare un microscalpel per rimuovere il cervelletto e fare un'incisione mediana che separa i due emisferi cerebrali. Trasferire gli emisferi con il forcipe per una piastra Petri contenente HBSS fresco, refrigerato.
    8. Sezionare le strutture del midbrain dall'interno degli emisferi con un microscalpel per ottenere solo le cortecce separate. Utilizzare una pinzetta per staccare le meningi, una foglio-come la struttura, dal tessuto corticale e trasferire le cortecce isolate per una nuova capsula Petri con HBSS freddo. Utilizzare il microscalpel per tritare il tessuto al fine di aumentare la superficie per azione della tripsina nel passaggio successivo.
    9. Utilizzare una pipetta Pasteur per trasferire le cortecce una provetta da centrifuga da 15 mL contenente 4 mL di tripsina-EDTA preriscaldata (8 cortecce in ogni tubo). Esporre il tessuto corticale di tripsina-EDTA per 5-7 min a 37 ° C.
    10. Con una pipetta Pasteur, rimuovere la tripsina-EDTA con cautela e aggiungere 400 µ l di 0,15 mg/mL dnasi I soluzione per la provetta da centrifuga. Agitare il tubo o vortice fino a tutto il tessuto è dissociato e non ci sono nessun pezzi di tessuto rimanente nel liquido. Se non è possibile sciogliere completamente il tessuto, rimuovere i frammenti rimasti con la punta di una pipetta di Pasteur.
    11. Centrifugare la provetta contenente la soluzione delle cellule dissociate a 200 x g per 3 minuti rimuovere il surnatante con una pipetta Pasteur senza disturbare le cellule. Aggiungere 1 mL di terreno di coltura di astrociti (definito al punto 2.1.2) al tubo con una micropipetta e agitare per risospendere e creare una soluzione omogenea.
    12. Trasferire 10 mL di terreno di coltura di astrociti con una pipetta sierologica in un pallone di T-75. Aggiungere 250 µ l di soluzione di cella 1 mL (preparata al punto 2.1.11) con una micropipetta al pallone a piastra un cervello pup vale la pena di cellule per fiaschetta. Distribuire uniformemente la soluzione scaricata cella il terreno di coltura e agitare delicatamente il pallone per promuovere ulteriormente una distribuzione uniforme.
    13. Coltura le beute placcate in un incubatore a 37 ° C e 5% CO2. Dopo aver raggiunto 24 e 72 h nella cultura, meccanicamente agitare la beuta per staccare i tipi di cellule non-aderenti, quali i neuroni ed oligodendrociti.
    14. In seguito, ciascuno di questi punti temporali, è possibile eseguire una modifica di media. Tenere la beuta verticalmente così i terreni di coltura si trova sul fondo del matraccio, non coprendo le cellule aderite. Aspirare il terreno di coltura con una pipetta Pasteur, premendo la punta della pipetta contro l'angolo inferiore del pallone per evitare l'estrazione delle cellule. Mettere il pallone in posizione orizzontale originale e delicatamente aggiungere 10 mL di medium di astrociti sopra le cellule con una pipetta sierologica.
    15. Riporre le beute nell'incubatore dopo ogni cambiamento di media. Dopo aver acquisito il 90% confluency, Agitare meccanicamente il pallone una volta di più per rimuovere tutte le cellule rimanenti non aderenti.
    16. Passaggio i astrocytes prendendo fuori il terreno di coltura con un vuoto e una pipetta Pasteur. Aggiungere 5 mL di tripsina-EDTA 0.25% con una pipetta sierologica sopra le cellule aderite. Agitare delicatamente il pallone per assicurare che la tripsina copre tutte le celle e incubare la beuta per 5-7 min a 37 ° C e 5% CO2.
    17. Placare la tripsina aggiungendo 1 mL di terreno di astrociti alle cellule con una pipetta sierologica. Estrarre la soluzione di cella dal pallone con una pipetta sierologica e trasferirlo in una provetta da centrifuga sterili da 15 mL. Centrifugare la provetta a 200 x g per 3 min.
    18. Rimuovere il surnatante con una pipetta sierologica e risospendere le in 1 mL di terreno di coltura di astrociti. Agitare il tubo per garantire che la soluzione di cella è omogenea. Contare il numero di celle nella soluzione con un contatore automatico delle cellule o un emocitometro.
      Nota: Un pallone che è 90% confluenti in genere produce circa 3 milioni gli astrociti.
    19. Aggiungere 10 mL di terreno di coltura di astrociti in un pallone da T-75. Eseguire una diluizione di 1:4 trasferendo 250 µ l della soluzione delle cellule (passo 2.1.18) con una micropipetta il matraccio di T-75 già contenente terreno di coltura. Agitare delicatamente per garantire una distribuzione omogenea delle cellule su tutta la superficie del pallone.
    20. Ripetere passaggi 2.1.16-2.1.19 ogni volta confluency di 90% avviene per le cellule del passaggio.
  2. Isolamento di neurone corticale da feti di ratto
    1. Seguire preparazioni simili come punti 2.1.1 e 2.1.2, con l'eccezione che i media preriscaldati è co-coltura, composto da Neurobasal medium + supplemento di B-27 del 2% (per i neuroni) + 1% G-5 privo di siero supplemento (astrociti) + 0,25% L-glutammina.
    2. Eutanasia ratti Sprague-Dawley temporizzato-gravidanza giorno embrionale 18 con anidride carbonica asfissia e confermare la morte per decapitazione.
    3. Estrarre i feti di ratto e sezionare le cortecce dal resto del tessuto cerebrale in capsule di Petri contenente HBSS sulla superficie del blocco di granito refrigerati, utilizzando uno stereoscopio per guida visiva e forbici sterilizzate, microscalpel e forcipe53 . Dopo la dissezione successiva delle teste, cervello, emisferi cerebrali e cortecce, trasferire ogni tessuto per una nuova scatola di Petri HBSS-riempito.
    4. Tritare il tessuto corticale in frammenti più piccoli per aumentare l'area per la tripsina. Trasferimento nelle cortecce di 4-6 con un Pasteur pipettare in una provetta con 5 mL di tripsina-EDTA preriscaldato e mantengono a 37 ° C per dissociare il tessuto. A 5-7 min agitare manualmente il tubo per mescolare ed evitare l'agglutinamento del tessuto.
    5. Rimuovere il tubo da 37 ° C dopo 10 min. Come spiegato in precedenza nel passaggio 2.1, estrarre la tripsina-EDTA e sostituire con 1,8 mL di 0,15 mg/mL soluzione dnasi. In seguito, vortice il tessuto fino a quando la soluzione appare omogeneo, con nessun frammenti di tessuto galleggiante nel liquido.
    6. Centrifugare la soluzione dissociata tessuto a 200 x g per 3 min. Dopo aver rimosso il sovranatante, risospendere in 2 mL di mezzo di co-coltura. Contare il numero di cellule in questa soluzione con un contatore automatico delle cellule o un emocitometro.
      Nota: La resa di solito è 3.0-5.0 x 106 cellule/corticale emisfero.
    7. Preparare una nuova soluzione di cella con una densità di 2.0-4.0 x 105 cellule/mL in co-coltura sopra definito.

3. sviluppo dei cavi Astrocytic all'interno delle Micro-colonne

  1. Montaggio centro ECM
    Nota: L'ECM dovrà essere aggiunto all'interno dell'idrogel micro-colonne nello stesso giorno in cui semina cellulare verrà eseguita.
    1. All'interno di una cappa di biosicurezza, preparare un 1 mg/mL soluzione di coda di topo collagene di i tipo mezzo di co-coltura in una provetta da microcentrifuga sterile. Mantenere il tubo del microcentrifuge con la soluzione di ECM su ghiaccio sempre eccetto quando in uso.
    2. Trasferire 1-2 µ l della soluzione ECM con una micropipetta su una striscia di cartina al tornasole per valutare il suo pH. Aggiungere 1 µ l di 1 N di idrossido di sodio (NaOH) o acido cloridrico (HCl) con una micropipetta per aumentare o diminuire il pH della soluzione ECM, rispettivamente e pipettare su e giù per omogeneizzare. Verificare il pH di nuovo con una striscia di carta di tornasole e aggiungere più acido o base, se necessario, fino a quando il pH è stabile nell'intervallo di 7,2-7,4.
    3. Spostare le piastre di Petri da passo 1.2 un cappuccio di dissezione e trasferimento di 4-5 micro-colonne o una barca con una pinzetta sterile un vuoto, sterile 35 o 60 mm di Petri. Usando lo stereoscopio come guida, situare la punta di 10 µ l di una micropipetta a un'estremità di ogni micro-colonna e aspirazione per svuotare il lume delle bolle di aria e DPBS. Verificare l'assenza di bolle d'aria con lo stereoscopio per garantire che l'ECM aggiunto nel passaggio successivo può fluire liberamente attraverso il lume.
    4. Caricare una micropipetta P10 con soluzione di ECM, posto il 10 µ l punta contro un'estremità di idrogel micro-colonne e fornire una soluzione abbastanza per riempire il lume (circa 3-5 µ l), osservando la voce di ECM con lo stereoscopio. Pipettare un piccolo serbatoio (2-4 µ l) di soluzione di ECM su entrambe le estremità della micro-colonna.
      Nota: Il gestore sempre 4-5 micro-colonne o una barca alla volta per evitare prolungata essiccazione dei costrutti, come questo può provocare la sgualcendo della struttura micro-colonna. Micro-colonne completamente asciutto applicare saldamente alla superficie delle capsule di Petri, che impedisce il loro utilizzo per la semina delle cellule. Una quantità eccessiva di co-coltura (come una misura di idratazione) non è possibile aggiungere alle micro-colonne, perché ciò potrebbe causare l'ECM di fuoriuscire durante il periodo di incubazione descritto di seguito.
    5. Pipetta di co-coltura in un anello intorno alla capsula di Petri per fornire un sink di umidità per evitare che le colonne secchino durante l'incubazione. Incubare la capsula di Petri contenente le micro-colonne contenenti ECM a 37 ° C e 5% di CO2 per 1 h promuovere la polimerizzazione di collagene prima di aggiungere i neuroni e/o astrociti.
      Nota: L'ECM dovrebbe formare uno strato di rivestimento della superficie interna del lume cavo, piuttosto che un nucleo solido di ECM che comprende l'interno, entrambi i quali possono essere osservati utilizzando lo stereoscopio. Se l'ECM costituisce un nucleo, continuare il periodo di incubazione fino a quando non viene lasciato solo il livello. Con questo strato formato, la soluzione delle cellule astrocitarie possa riempire l'interno della micro-colonna nei passaggi placcatura.
    6. Durante il periodo di incubazione, è necessario preparare la soluzione di cella di astrociti (come descritto di seguito).
  2. Astrociti e neuroni semina nelle Micro-colonne
    1. Come spiegato nella procedura 2.1.16-2.1.19 del passaggio gli astrociti placcati (tra il quarto e dodicesimo passaggio). Dopo il conteggio del numero di cellule nel pallone, preparare la soluzione di cella ad una densità di 9.0-12.0 x 105 cellule/mL soluzione sospesa nei mezzi di coltura cellulare.
    2. Con uno stereoscopio, posizionare la punta di una micropipetta P10 a un'estremità della micro-colonne e trasferire sufficiente soluzione di cella (~ 5 µ l) nel lumen per riempirlo completamente. Come fatto in precedenza con la ECM, aggiungere piccoli invasi di soluzione di cella a entrambe le estremità di ogni micro-colonna.
    3. Incubare il placcato micro-colonne sui piatti Petri a 37 ° C e 5% di CO2 per 1 h a promuovere l'attaccamento dei astrocytes alla ECM. Se i neuroni non verranno aggiunti al micro-colonne, passare al punto 3.2.5.
    4. Dopo il periodo di incubazione iniziale, aggiungere 1-2 µ l di soluzione neurone corticale ottenuta al passaggio 2.2.7 in entrambe le estremità delle micro-colonne con una micropipetta, osservando sotto lo stereoscopio. Assicurare che i media sufficienti è presenti nei piatti per evitare la disidratazione e incubare nuovamente per 40 min a 37 ° C e 5% di CO2 per consentire l'adesione dei neuroni.
      Nota: Soluzione di neurone corticale può essere aggiunto anche 1-2 giorni dopo la formazione di bundle, esecuzione passo 3.2.4 dopo aver accuratamente tolto terreni di coltura di Petri con una micropipetta.
    5. Dopo l'incubazione periodo, attentamente riempire le capsule di Petri contenente il placcato micro-colonne con 3 o 6 mL di co-coltura per 35 o 60 mm di Petri, rispettivamente. Mantenere la micro-colonne placcate in coltura a 37 ° C e 5% di CO2 per promuovere l'auto-assemblaggio dei fasci astrocytic allineati, che dovrebbero formare una struttura in dotazione, cavo-come dopo 6-10 h.
  3. Stabilizzazione del Astrocyte cavo architettura
    Nota: Dopo la formazione di fasci, circa 6-12 h di coltura i costrutti, procedere come segue per evitare il collasso della struttura allineata la chiodatura astrocytic.
    1. In una microcentrifuga sterile, preparare un collagene di coda di ratto 3mg/mL ho soluzione in co-coltura. Regolare il pH della soluzione a 7.2-7.4 seguendo la procedura descritta al punto 3.1.2. Mantenere il collagene Stock in co-coltura e mezzi su ghiaccio quando non in uso e mettere la soluzione di collagene preparati sul ghiaccio in ogni momento.
    2. Rimuovere il supporto dai piatti Petri contenente i ponteggi astrocitari con una micropipetta, lasciando alcuni supporti ai lati del piatto per creare un sink di umidità che assicura l'idratazione delle micro-colonne. Mettere il recipiente sotto uno stereoscopio per facilitare la visualizzazione.
    3. Con una micropipetta, prendere 2-3 µ l di soluzione di collagene e scarico a ciascuna estremità delle micro-colonne, utilizzando lo stereoscopio per la guida ottica. Assicurarsi che il piatto ha sufficienti media intorno ai lati di agire come un lavandino di umidità intorno ai bordi del piatto. Incubare le piastre di Petri con micro-colonne per 30 min a 37 ° C e 5% di CO2 in un incubatore per promuovere la gelificazione del collagene appena aggiunto.
    4. Aggiungere lentamente 3 o 6 mL di co-coltura (per 35 o 60 mm piastre di Petri, rispettivamente) per il Petri piatti con una pipetta e cultura i piatti in un incubatore a 37 oC e 5% CO2.

4. estrazione dei fasci Astrocytic dall'interno dell'idrogelo

  1. Sterilizzare i vetrini coprioggetti in autoclave. Preparare una soluzione di 20 µ g/mL di poli-L-lisina (PLL) in acqua di grado di cultura cellulare sterile.
  2. All'interno di una cappa di biosicurezza, manualmente trasferire i coprioggetti di vetro sterilizzati un sterile 10cm di Petri e aggiungere soluzione di PLL sufficiente per coprire i vetrini coprioggetti.
  3. Incubare i vetrini coprioggetti, coperti con la soluzione PLL, per 30 min a 37 ° C per rivestire la superficie. Rimuovere la soluzione PLL con una pipetta Pasteur dopo 30 min. Sciacquare tre volte aggiungendo acqua di grado di cultura cellulare il vetrino coprioggetto e rimuoverlo con una pipetta Pasteur.
  4. Dopo la formazione del fascio glial allineato, trasferire la micro-colonna delicatamente una capsula di Petri sterile con una pinzetta sterile e aggiungere una piccola piscina di 10 µ l di co-coltura con una micropipetta per prevenire la disidratazione e garantire salute bundle. Estrarre il pacchetto astrocytic dalla micro-colonna idrogel tirando delicatamente da un lato con il forcipe chirurgico sterile, utilizzando uno stereoscopio per la guida ottica.
  5. Tenendo il bundle astrocitario con forcipe, montarlo su un vetrino coprioggetti rivestite con PLL. Difficoltà e macchia con il protocollo sottostante.

5. immunocitochimica per studi In Vitro

Nota: Per questo studio, gli anticorpi primari erano la proteina fibrillare acida anti-glial coniglio (GFAP) (1: 500), topo anti-β-tubulina III (1: 500), rabbit anti-collagene ho (1: 500), mouse anti-nestina (1: 200) e coniglio anti-vimentin (1: 100). Gli anticorpi secondari erano asino anti-topo 568, asino 568 anti-coniglio, anti-coniglio di asino 488 e asino anti-mouse 568 (1: 500 per tutti). In tutti i casi, aggiungere un volume sufficiente di ogni soluzione per coprire interamente il micro-colonne.

  1. Preparare una soluzione di formaldeide 4% volume/volume (v/v) in 1 x DPBS all'interno di una cappa chimica.
    Attenzione: formaldeide è un composto tossico, noto per essere cancerogeni e dovrà essere smaltiti in un contenitore separato. Sempre questo composto all'interno di una cappa chimica di manipolare e utilizzare dispositivi di protezione individuale (PPE) ad esempio un camice da laboratorio, occhiali protettivi e guanti.
  2. Nel caso di micro-colonne, scartare i terreni di coltura dai piatti Petri contenente i costrutti con una pipetta Pasteur senza accidentalmente l'aspirazione dei cilindri di idrogel. Aggiungere la soluzione di formaldeide sufficiente per coprire le micro-colonne o lamelle montate (entrambi dei quali rimangono sui piatti Petri) e incubare per 35 min a 18-24 ° C.
  3. Estrarre la soluzione di formaldeide 4,0% da micro-colonne fisse o lamelle con una pipetta sierologica. Sciacquare il micro-colonne fisse tre volte con PBS rapidamente aggiungendo e rimuovendo PBS due volte e poi lasciarli ammollo per 10 min la terza volta.
  4. Sciogliere di siero equino normale (NHS) in PBS per una concentrazione del 4% v / v. preparare una soluzione con un detergente non ionico ad una concentrazione di 0,3% v/v utilizzando la soluzione di NHS come solvente.
  5. Rimuovere il PBS dalle capsule di Petri contenente le micro-colonne o lamelle con una pipetta. Aggiungere sufficiente soluzione detergente 0,3% per coprire le micro-colonne/coprioggetti per 60 min a 18-24 ° C per permeabilize le cellule.
  6. Estrarre la soluzione detergente e sciacquare rapidamente due volte con PBS e tre volte da ammollo per 5 min, calcolare il volume richiesto di 4% NHS e ciascuno degli anticorpi primari per preparare una soluzione con le concentrazioni nell'anticorpo desiderato.
  7. Rimuovere il PBS dalle capsule di Petri e aggiungere abbastanza anticorpo primario (diluito in 4% NHS-DPBS) soluzione per coprire il micro-colonne o i pacchetti estratti astrocytic. Incubare per una notte (12-16 h) a 4 ° C.
  8. Togliere la soluzione di anticorpo primario e sciacquare rapidamente due volte con PBS e tre volte da ammollo per 5 minuti ciascuno. Preparare la soluzione di anticorpo secondario, al buio, con ogni anticorpo presente ad una diluizione di 1: 500 in soluzione di NHS 4,0%.
  9. Incubare le cellule con la soluzione di anticorpo secondario per 2 h 18-24 ° c. Durante l'intero periodo di incubazione, coprire le capsule di Petri contenente le micro-colonne con carta stagnola per evitare l'esposizione alla luce.
  10. Rimuovere la soluzione di anticorpo secondario ed aggiungere la soluzione di Hoechst (01:10, 000) per 10 min a 18-24 ° C a macchiare i nuclei.
    Attenzione: Hoechst è un noto agente mutageno che deve essere trattato come un agente cancerogeno. Pertanto, esso deve essere smaltito in un contenitore separato e PPE deve essere utilizzato in qualsiasi momento durante la manipolazione di questo agente.
  11. Risciacquare con PBS cinque volte, ogni volta per 5-10 min. in seguito, memorizzare il macchiato micro-colonne a 4 ° C in PBS e coprire con carta stagnola. Nel caso i fasci astrocytic montati, aggiungere una goccia di mezzo di montaggio acquoso all'aggregazione, posizionare un altro vetrino coprioggetti sopra il fascio fisso e sigillare entrambe le lamelle con smalto per immagazzinaggio a lungo termine e la formazione immagine successiva.

6. analisi di attuabilità con Live-morti (calceina-AM/etidio omodimero) colorazione

  1. Preparare la soluzione di reagente aggiungendo 5 μl calceina (4 mM in anidro dimetilsolfossido (DMSO)) e 20 μl omodimero di etidio-1 (EthD-1) (2 mM in DMSO/H2O 1:4 v/v) a 10 mL di 1 x DPBS. Coprire la soluzione con carta stagnola o conservare al buio per proteggerlo dalla luce.
  2. Aspirare la media dalla capsula di Petri contenente le micro-colonne placcate con una pipetta Pasteur e aggiungere soluzione abbastanza (preparata in precedenza) per coprire i costrutti. Incubare per 30 min a 37 ° C e 5% CO2, mantenendo la piastra di Petri coperto per proteggere la soluzione dalla luce.
  3. Rimuovere la soluzione con una micropipetta o pipetta Pasteur. Sciacquare 2 - 3 volte con DPBS come spiegato al punto 5.3. Inondare le capsule di Petri con DPBS secondo la dimensione del piatto. Celle di immagine immediatamente in seguito con epifluorescenza o imaging confocale.
    Nota: Conversione della membrana permeabile calceina a calceina di cellule metabolicamente attive produce la fluorescenza verde della calceina. Le cellule morte vengono contrassegnate come cellule membrana-compromessi, che permettono l'entrata di EthD-1 nella cella e il suo legame con gli acidi nucleici, causando la fluorescenza rossa.

Representative Results

Inizialmente, a contrasto di fase microscopia è stata usata per monitorare la progressione della formazione di adesione e bundle di astrociti e la stabilità generale della citoarchitettura come funzione del tempo. A 1 h dopo il placcaggio, gli astrociti sono stati trovati in tutto il lume delle micro-colonne con una morfologia sferica (Figura 2A). A 5 h, astrociti iniziato estendendo i processi e contraenti, mentre da 8 h cellule hanno esibito una morfologia di processo-cuscinetto completa e formano cavo-come le strutture orientate lungo l'asse longitudinale della micro-colonna (Figura 2A). In particolare, rispetto alla presenza di cellule inizialmente dispersa attraverso la micro-colonne, gli astrociti sono comparso di avere contratto per formare una rete di fasci dense lungo l'interno (Figura 2B). Dopo l'allineamento della cella iniziale, le reti di astrociti spesso tirate insieme lungo l'asse longitudinale, che assomiglia ad una cerniera di chiusura, per formare un fascio denso al centro della micro-colonna (Figura 2). La formazione di questa architettura in dotazione era dovuta a un processo di auto-assemblaggio, in parte dettata dalla scelta di densità di micro-colonna ID e cella. Gli astrociti allineato e acquisito una morfologia bipolare quando seminati in micro-colonne con un ID a meno di 350 µm (Figura 3B, superiore e centrale e 3D-3F)49. Al contrario, queste cellule hanno dimostrato la direzionalità casuale quando è stato utilizzato un ID di 1 mm (Figura 3B, in basso), che è simile all'aspetto delle culture 2D Astrocita esposte per il privo di siero, co-cultura medio (Figura 3A, destra). Inoltre, anche se gli astrociti ancora visualizzare l'allineamento alle basse densità di semina (2.0-3.0 x 105 cellule/mL o 2.0-3.0 x 102 cellule/mm3) (Figura 3), fitte reti sono formate solo presso le alte densità (9.0-12.0 x 105 cellule/mL o 9.0-12.0 x 102 cellule/mm3) all'interno di micro-colonne cilindriche di dimensioni simili (visto in Figura 3B, in alto), come suggerito nel protocollo49. Vitalità nei fasci astrocytic è stato quantificato, usando l'analisi live/dead, come il rapporto tra l'area delle cellule che reagiscono verde (calceina) rispetto all'area totale delle cellule che reagiscono verde (calceina) e rosso (EthD-1). La vitalità dei fasci astrocytic è stato 97,4%, che è simile all'attuabilità di 98,2% dei controlli di cultura Astrocita 2D (fig. 4A-4B), dimostrando che l'ambiente all'interno delle micro-colonne è adatto per la vitalità di astrociti ( Figura 4E). Le ricostruzioni 3D delle cellule vivi e morte in impalcature astrocytic dimostrano anche l'allineamento globale delle cellule all'interno di costrutti (Figura 4-4D). Inoltre, ultra-lunghe astrocytic micro-colonne sono state sviluppate per analizzare la stabilità dei pacchi del astrocyte con notevole lunghezza. Anche alla straordinaria distanza di 3,5 cm, cytoarchitecture dei pacchi astrocytic allineati, densi e contratte è stato sostenuto costantemente per tutta la lunghezza della micro-colonna (Figura 5A), come chiaramente vista nelle regioni zoomare la micro-colonne (figura 5B-5C).

Una volta formati, i fasci erano fissi e macchiati mediante tecniche di immunocitochimica per proteine dei filamenti intermedi caratteristici delle cellule gliali, come GFAP, nestina e il vimentin. Le immagini confocale confermano la morfologia di processo-cuscinetto di astrociti e allineamento longitudinale dei processi (Figura 6 e Figura 7). Espressione di proteine dei filamenti intermedi può essere visto in entrambe le culture Astrocita 2D (figura 7A) così come i fasci di Astrocita all'interno della micro-colonna (Figura 6, figura 7B-7D). Inoltre, macchiatura di collagene ha confermato la presenza di questa proteina di ECM in micro-colonne. Gli astrociti non formavano una struttura continua con il collagene quando coltivate in un ambiente 2D (Figura 8A), considerando che gli astrociti sono comparso ad aderire e rimodellare il collagene presente all'interno del lume quando coltivate in micro-colonne, consentendo di per formazione di contrazione e bundle delle cellule (Figura 8B). Sovrapposizione dei canali GFAP e collagene ha dimostrato che i cavi del astrocyte consistevano di processi strettamente associati con le fibre di collagene longitudinale (Figura 8B). Pertanto, oltre ad offrire ancoraggio, fibrille di collagene possono avere anche fornito ulteriori spunti direzionali per gli astrociti formare densi fasci dopo la contrazione. In alcuni casi, persistente contrazione Astrocita-collagene, risultante in un crollo del bundle allineato oltre il 12-24 h dopo la formazione (Figura 9A). Al fine di stabilizzare l'architettura di cavo-come Astrocita all'interno delle micro-colonne di idrogel, matrice di collagene supplementare è stato aggiunto fino ai confini di un pacco completamente formato per inibire ulteriore contrazione e crollo. Questo rinforzo tecnica ha permesso per la sopravvivenza dell'architettura cavo desiderata per almeno 4 giorni, con una finestra più lungo di stabilità previsto (figura 9B). Inoltre, rappresentante astrocytic fasci erano estratte dalla micro-colonna idrogel, montati e fissati con formaldeide 4% su vetrini coprioggetti per valutare la loro robustezza quando esposti a forze di tensione e all'ambiente esterno. Anche dopo l'estrazione e manipolazione fisica in forme diverse (Figura 10A, 10B), i somata astrocytic e processi mantenuti un allineato, in bundle Microscala morfologia (Figura 10), evidenziando il resilienza dell'impalcatura astrocytic Self-aligned, una volta formata, anche se il supporto strutturale della micro-colonna idrogel è assente.

Neuroni corticali primari sono state anche co-coltivati con i astrocytes all'interno delle micro-colonne di esplorare se i fasci di astrociti erano capaci di fomentare adesione neuronale e neuriti. GFAP e la proteina microtubule β-tubulina III sono stati usati come indicatori specifici per gli astrociti e i neuroni, rispettivamente. Figura 11A Mostra che gli astrociti co-seminati con neuroni corticali erano anche in grado di esibizione processi e formando fasci allineati. I neuroni sono sembrato hanno aderito preferenzialmente i fasci di astrociti, poiché tutti i positivo β-tubulina III macchiatura co-localizzati con GFAP (sovrapposizioni nella Figura 11B-11C). Per dimostrare le proprietà rigenerative dei costrutti di astrociti, neuroni corticali (figura 12B) erano placcati all'interno della micro-colonna di idrogel 2 giorni dopo erano astrocytes placcato (Figura 12A). Neuroni connessi il bundle di astrociti ed esteso neurites direttamente lungo i tratti astrocytic. Nuova visita di controllo ha mostrato neuriti orientata nella direzione del cavo astrocytic, mentre nelle regioni dove il tratto di astrociti non era presente, neuriti sono stati visti crescere in un modo disorganizzato (Figura 12). Queste osservazioni dimostrano che il protocollo risultati in reti astrocytic allineate, praticabile e robuste che hanno il potenziale di agire come vivente impiantabili vie promuovendo la conseguenza del neurite e di adesione neurone.

Figure 2
Figura 2: microscopia in campo chiaro Mostra la formazione di fasci di Astrocita all'interno di idrogel Micro-colonne nel corso del tempo. (A) morfologia Astrocyte come funzione del tempo dopo il placcaggio: gli astrociti (1 h) sono di forma sferica e disperse in tutto il costrutto; gli astrociti (5h) avviare il processo di estensione e contrazione; gli astrociti (8 h) hanno allineato e contratta. Scala bar = 100 µm. (B) Bundle formazione nel tempo in un'impalcatura rappresentanza aggiuntiva: (1 h) inizialmente gli astrociti sono sferici e non presentano processi; (24 h) un denso fascio di processi astrocitari è formata. Scala bar = 300 µm (a sinistra) e 500 µm (a destra). (C) completamente formate astrocytic bundle 24 h dopo il placcaggio, mostrando un effetto di "zippering", dove le estremità del cavo di applicare alle estremità distinte delle pareti del lume. Barra della scala = 1000 µm.

Figure 3
Figura 3: diametro interno Micro-colonna e cella densità influenza l'auto-assemblaggio di fasci allineati di astrociti bipolari. (A) colture di astrociti 2D con supporti contenenti siero (a sinistra) e privo di siero co-coltura (a destra) mostrano una morfologia di cuscinetto non-processo e multi-processo, rispettivamente. Scala bar = 100 µm. (B) gli astrociti seminati ad alta densità (9.0-12.0 x 105 cellule/mL) in micro-colonne con un ID di 180 e 350 µm fasci di forma allineato rispetto all'asse longitudinale, mentre un ID di risultati di 1mm in astrocytes visualizzano più, processi non allineati in tutto il diametro del lume. Scala bar = 100 µm (alto, medio) e 150 µm (in basso). (C) astrociti seminati in una micro-colonna di ID a 350 µm a bassa densità (2.0-4.0 x 105 cellule/mL) sono allineati, ma non in bundle. Barra della scala = 100 µm. (D) quando placcato in una micro-colonna di ID a 350 µm a densità bassa o media delle cellule, gli astrociti acquisiscono una morfologia bipolare. Scala bar = 300 µm. (E) casella D mostrando uno zoom-in delle catene dei astrocytes bipolare che formano all'interno delle micro-colonne di idrogel. Barra della scala = 300 µm. (F) esempio di un Astrocita bipolare individuo. Barra della scala = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: astrociti rimangono vitali dopo formazione Bundle all'interno della Micro-colonna Hydrogel. (A-B), (C-D) ricostruzioni 3D confocale, mostrando la vitalità delle cellule in tutta culture planare e pacchi astrocytic allineati, rispettivamente, come analizzato con calceina-AM/etidio omodimero colorazione (verde-live cellule; rosso-morti cellule). (E) quantificazione delle cellule vivi e morte ha provocato in una percentuale simile di astrociti live/dead quando coltivate sulle superfici 2D e le micro-colonne. Barre di errore rappresentano la deviazione standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: immagine di contrasto di fase di un Bundle Astrocytic allineato lungo Ultra rappresentanza all'interno dell'idrogelo Micro-colonna. (A) Bundle formazione tutta la lunghezza di una micro-colonna di 3,5 cm. Barra della scala = 1.000 µm. (B-C) più alto ingrandimento zoom aggiuntivi visualizzando Astrocita allineamento in varie regioni lungo la totalità del costrutto, corrispondente alle scatole in A. Scala bar = 500 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Immunolabeling di impalcature Astrocytic dimostra l'allineamento longitudinale dei processi astrocitari. (A) ricostruzione Confocal di un bundle astrocytic risultati di macchiatura per GFAP (rosso; sinistra) e nuclei (Hoechst; medio) e una sovrapposizione di entrambi i canali (a destra). (B) più alto ingrandimento zoom-del bundle astrocytic nella regione boxed in A consente di visualizzare la citoarchitettura degli astrociti all'interno di micro-colonne. Scala bar = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: caratterizzazione di fasci rappresentante Astrocytic tramite immunocitochimica. (A-B) Astrocytes coltivati su superfici 2D e seminato in idrogel micro-colonne esprimono simili marcatori astrocitari GFAP (rosso) e il vimentin (verde). (A) confocale ricostruzione di una cultura 2D planari Astrocita mostrando i canali separati e Uniti. Barra della scala = 100 µm. (B) immagini Confocal di un bundle astrocytic, confermando l'espressione dei marcatori e una vetrina di allineamento di astrociti. Barra della scala = 50 µm. (C-D) Astrocytes coltivati all'interno di micro-colonne anche esprimere le proteine dei filamenti intermedi nestina (rosso) e il vimentin (verde). (C) immagine confocale di un bundle astrocytic. Barra della scala = 100 µm. (D) più alto ingrandimento zoom-in c. Barra della scala = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8: astrociti nei fasci allineati interagiscono intimamente con una matrice di collagene contratta, longitudinale, in contrasto con la disposizione irregolare di collagene nelle culture 2D. Le cellule immunolabeled per osservare gli astrociti (GFAP; rosso), i nuclei (Hoechst; blu) e collagene (verde). (A) colture di astrociti 2D con collagene a 1mg/mL Visualizza astrociti non allineati e distribuite casualmente collagene. Barra della scala = 250 µm. (B) collagene viene tirata fuori dalle mura del lumen micro-colonna e si contrae per formare una matrice allineata che è parte del bundle astrocytic. Barra della scala = 150 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 9
Figura 9: collagene aggiuntive può essere utilizzata per stabilizzare la struttura dei cavi Astrocytic. (A) fasci formano circa 6 h dopo il placcaggio astrociti all'interno di micro colonne rivestite con collagene idrogel. Una volta che i fasci sono stati formati, collagene più elevate di concentrazione (3 mg/mL) è stato aggiunto fino agli estremi confini della micro-colonna di inibire la contrazione dei cavi astrocytic. Nei costrutti non stabilizzati con ulteriore collagene, i fasci di collagene astrocytic avevano cominciato a contrarsi di 18 h, e i cavi di astrociti erano completamente crollato da 24 h. Questa contrazione non è stata osservata quando i pacchi sono stati rinforzati con collagene 3 mg/mL. Barra della scala = 1.000 μm. Zoom-in (B) di bundle astrocytic compresso non rinforzato con collagene 3 mg/mL. Barra della scala = 500 μm. Zoom-in (C) delle regioni da collagene-rinforzato micro-colonne. Morfologia del astrocyte è stata mantenuta durante la totalità della micro-colonna. Scala bar = 500 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 10
Figura 10: estrazione dei fasci Astrocytic dalla Micro-colonna e montaggio sulle lamelle di vetro rivestito di poli-L-lisina evidenzia la robustezza della tecnica. (A) fase-contrasto immagine di diversi estratti astrocytic pacchi, manipolati in ortografia della parola "Penn". (B) ricostruzione confocale dello stesso estratto fasci colorati per il marcatore astrociti GFAP (rosso) e nuclei delle cellule (Hoechst; blu). Barra della scala = 100 µm. (C) ingrandimento della regione boxed in B Mostra che, anche quando manipolate in forme irregolari, i ponteggi astrocytic mantengono una morfologia allineata, bipolare e un cytoarchitecture in bundle. Barra della scala = 200 µm. nota che eventuali differenze strutturali tra la fase e immagini confocal probabilmente è un artefatto di costrutti spostando a causa di risciacquo durante la procedura di immunocitochimica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 11
Figura 11: neuroni aderire ed estendere i Neurites lungo i fasci allineati Astrocyte in ponteggi co-colture di neuroni-astrociti. (A) immagine di contrasto di fase di un bundle astrocytic neurone-seminato. Barra della scala = 300 µm. (B)-(C) i neuroni sono stati osservati ad aderire i fasci astrocytic ed estendere i neurites lungo la direzione del cavo (Hoechst-blu; GFAP-verde; Β-tubulina III-rosso). Scala bar = 200 e 100 µm, rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 12
Figura 12: Astrocyte cavi fungono da un'impalcatura di vivere per diretta conseguenza del Neurite. Confocale ricostruzioni mostrando una regione di una micro-colonna costituito da neuroni seminato circa 2 giorni dopo la formazione del bundle. (A) fasci di astrociti GFAP-positive, neuroni di III-positivi β-tubulina (B) e (C) Unione di tutti i canali, tra cui HOECHST-ha macchiato i nuclei (blu). Si noti che i neuroni hanno esibito del neurite allineamento quando aderito alle regioni con processi astrociti allineati (frecce), considerando che i neuroni non abbia aderito a allineati gli astrociti apparve ad esporre casuale (cioè multi-direzionale) neuriti (frecce). Zoom-in (D) della regione Mostra la direzionalità dei neuriti. Scala bar = 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Rispetto per l'ambiente più favorevole del PNS, il CNS è notevolmente ridotto a gestire le conseguenze pregiudizievoli di neurotrauma e neurodegenerazione. Dopo un grave insulto al sistema nervoso centrale dei mammiferi, si forma una cicatrice gliale, costituito un nucleo di cellule infiammatorie e fibrotiche circondata da un denso reticolo di astrociti reattivi disorganizzati che secernono assone escrescenza-inibizione proteoglicani14. Questa cicatrice agisce come un'ostruzione fisica e biochimica contro la rigenerazione dell'assone terminazioni12. Inoltre, snc mammifero adulto possiede fonti limitate di nuovi neuroni per ripristinare le cellule perse dopo trauma o neurodegenerazione, poiché neurogene centri sono limitate a SVZ, giro dentato dell'ippocampo e potenzialmente altri solitamente inattivo zone54. Una strategia ideale sarebbe evitare entrambi gli aspetti delle funzionalità limitate con recupero dello SNC, quali approcci attuali non riescono a indirizzo. Come tale, il nostro gruppo di ricerca ha sviluppato basato su astrociti ponteggi finalizzate alla presentazione vivente vie neurali migrazione verso aree del neurone-carenti e guidate estensione della rigenerazione dei coni di crescita dell'assone. Allineati astrocytic pacchetti contenuti all'interno del collagene di una micro-colonna di agarosio costituiscono queste impalcature astrocytic vivente. Una distinzione notevole da convenzionale e biomateriale-basati su cellule strategie utilizzate per la rigenerazione e riparazione CNS è che la citoarchitettura di questi costrutti è completamente preformate in vitro per simulare diversi in vivo architetture di ponteggi e orientamento basato su cellule gliali. Per esempio, durante lo sviluppo embrionale, vie di glia radiale fungono da impalcature vivente per nuovi neuroni migrazione alla neocorteccia e cellule gliali mediano l'estensione mirata di avanguardia di assoni in posa come substrati e/o cellule guidepost35 ,38,39. Glia radiale embrionale nella zona subventricolare anche produrre astrociti che formano tubi gliali allineati longitudinalmente, sopra cui neuroblasti migrano dopo la nascita in una formazione incatenato dalla SVZ al OB41. Inoltre, è stato dimostrato in alcuni non-mammiferi che, a seguito di CNS danno, un maggior grado di rigenerazione è possibile a causa della formazione di un arrangiamento astrocytic organizzato, allineati44. Ad esempio, sono in grado di rigenerare la loro midolli spinali dopo la migrazione delle cellule gliale acerbe al sito di lesione, differenziazione in una morfologia bipolare e l'allungamento dei processi gliali per colmare la lesione, formando un percorso di zebrafish adulto che dirige rigenerante assoni45. Costrutti ingegnerizzati di fasci astrocytic allineati possono essere capace di ricapitolare questi meccanismi e di presentare i necessari segnali strutturali e solubili per migrazione neuronale mediata da cellule gliali e di rigenerazione dell'assone35. Inoltre, a causa dell'inclusione dei astrocytes vivente, questi costrutti possono presentare attivamente gli stimoli ambientali richiesti basati sul feedback dall'host.

Nella nostra tecnica, Astrocita allineamento è un processo auto-assemblaggio contingente sulla fisiche spunti e interazioni cellula-cellula promossi dal diametro interno micro-colonna, la concentrazione di collagene e la densità di semina. Un'altra caratteristica interessante di questo metodo è la sua dimensione di micron-scala, che può consentire per l'impianto mini-invasiva nelle aree danneggiate del SNC. Inoltre, i risultati presentati in questo manoscritto dimostrano che i costrutti ottenuti con il protocollo possiedono alta attuabilità ed esprimono le proteine dei filamenti intermedi GFAP, nestina e il vimentin, indipendentemente dall'età del astrocyte come definito dal numero di passaggio . Mentre GFAP e il vimentin sono espressi negli astrociti immaturi e maturi, la nestina è principalmente limitata alle cellule indifferenziate o immature, con maturazione glia upregulating l'espressione di GFAP e produzione diminuente della nestina45, 55. precedenti studi hanno dimostrato che Astrocita cambiamenti di comportamento con l'età, tuttavia coerente espressione di proteine dei filamenti intermedi, anche impacchettato è stato visto in una gamma di passaggio numeri (passaggi 4-12)56. I ponteggi astrocytic inoltre sono stati indicati per raggiungere ultra-lungo, centimetro-scala lunghezze in vitro, che suggerisce che questa tecnica è adattabile alle lunghezze distinte lesioni e geometrie incontrate in vivo. Inoltre, i fasci allineati astrocytic presentano notevole integrità strutturale e stabilità, come loro citoarchitettura cavo-come viene mantenuta anche dopo essere stato sottoposto a estrazione da micro-colonne. Basato su astrociti vivente ponteggi anche supporto neurone del neurite e adesione escrescenza, rafforzare il potenziale di questa tecnica per promuovere neurone diretto migrazione e axon estensione per la riparazione di CNS.

I fasci astrocytic allineati sono contenuti all'interno di un encasement idrogel tubolare protettivo collagena. Fabbricazione di impalcature astrocytic inizia con micro-colonna assembly inserendo un ago di agopuntura in un tubo capillare ed aspirazione liquido agarosio in esso. Agarosi era il biomateriale selezionato a causa della sua proprietà inerte, biocompatibilità e facilmente controllabile meccanica, proprietà fisiche e biochimiche49. Concentrazione di agarosio nell'idrogel può essere una variabile importante poiché le cellule stimoli meccanici senso dal loro substrato (ad es. rigidità) e rispondere con cambiamenti intracellulari57. Criteri di progettazione per questi micro-colonne include una porosità sufficientemente alta per consentire adeguato trasporto di massa, ma un piccolo abbastanza formato del poro di vietare escrescenza processo laterale; questi criteri sono soddisfatti dal nano-scala aperta-porosità presenti in agarosio alla concentrazione utilizzata nel presente protocollo. La concentrazione di agarosio in questo protocollo è stato anche scelto per la sua stabilità, maneggevolezza, e somiglianza nelle proprietà meccaniche per il cervello ambiente58. Una considerazione degno di nota è il posizionamento centrale dell'ago all'interno del tubo capillare. Spesso, l'ago può essere leggermente inclinato o spostato durante il processo, causando il lume sia situato fuori centro parente per le pareti esterne dopo la rimozione di gelificazione e micro-colonna di agarosio dal tubo. Per evitare questo, l'ago deve essere dritto, e il gruppo pistone-tubo-ago dovrebbe essere mantenuto in posizione verticale mentre agarosio viene disegnata a mantenere l'ago lungo l'asse centrale. Centralizzazione precisa del lume salvaguarda gli astrociti allineati fra le pareti di agarosio; il lume è più incline alla rottura se trova prossimale al bordo esterno del cilindro. Inoltre, una distanza sufficiente tra il lume e la parete esterna può offrire i benefici protettivi durante e dopo il trapianto (purché i costrutti astrocytic non sono rimossi dal micro-colonna prima dell'impianto). Questa fase iniziale di montaggio astrocitari impalcatura è fondamentale per il successo della tecnica, come la selezione del diametro dell'ago è cruciale per il cavo e l'allineamento corretto del astrocyte soma/processo self-assembly. Abbiamo trovato che l'allineamento del astrocyte era inversamente dipendente da micro-colonna ID, con un intervallo ottimo di ID per l'allineamento delle cellule e la formazione di fasci di astrociti robusto da 180 a 350 µm (Figura 3). Allo stesso modo, è stato dimostrato in precedenza che neuroni diretto loro escrescenza lungo la direzione di curvatura minima del substrato per diminuire il processo di piegatura59,60, e meccanismi simili sono probabili al lavoro per influenzare Astrocita allineamento nel nostro sistema49. Oltre alla curvatura colpisce Astrocita allineamento, che abbiamo trovato un 180 a 350 µm intervallo di ID ha provocato l'acquisizione di una morfologia bipolare49, al contrario alla forma stellare, multi-polare osservata con un ID di 1 mm o quando gli astrociti sono stati coltivati astrocytes 2D (Figura 3). È probabile che queste profonde modificazioni morfologiche di una morfologia bipolare Astrocita alterano le loro caratteristiche fisiologiche pure; per esempio, questi astrociti possono esprimere fattori secretable alternativi o indicatori di superficie delle cellule che possono essere vantaggiosi per la rigenerazione, ma questo autorizza ulteriore caratterizzazione. Nel complesso, i nostri risultati dimostrano che adatta selezione di segnali fisici, ad esempio di curvatura della superficie, sono indispensabili per emulare cytoarchitecture nativo in astrocytic vivente impalcature.

Costruzione di impalcature astrocytic procede all'inserimento sequenza della soluzione ECM di collagene e astrociti corticali nell'interno cavo delle micro-colonne. Il lume interno della micro-colonna è ricoperta di collagene per sostenere la sopravvivenza di astrociti, attaccamento e formazione bundle allineati, a causa dell'incapacità di agarosio per supportare in modo indipendente del neurite escrescenza61. Una concentrazione di collagene di 1 mg/mL è stato scelto perché gli studi precedenti hanno determinato che concentrazioni inferiori e superiori ha provocato una mancanza di aderenza e l'instabilità della ECM, rispettivamente49. Così, come previsto, la concentrazione di collagene ha effetti drammatici sull'efficacia di questa tecnica. Inoltre, la soluzione ECM consiste solo di tipo I del collagene. Rispetto alla laminina e substrati Matrigel-rivestite per culture astrocytic 2D, astrociti placcato il tipo I collagene ha dimostrato un'aderenza ottimale e rete formazione62. Il tempo di incubazione utilizzato per polimerizzazione di collagene prima della semina cellulare è anche un passo essenziale nel protocollo. Precedentemente abbiamo trovato che quando i neuroni sono stati consegnati in concomitanza con ECM non polimerizzate per l'agarosio micro-colonne, neuriti ridotta e fascicolazione axonal erano visto47, ed è possibile che questi risultati si estenderebbero ai astrocytes pure. Poiché il collagene è richiesto per la formazione di adesione e bundle di astrociti, la presenza di ECM in tutto il costrutto e l'assenza di vuoti o bolle d'aria dovrebbe essere visualizzate e confermate con tecniche microscopiche.

Il protocollo si conclude con Astrocita placcatura, un periodo di incubazione per garantire adesione delle cellule del collagene, e la coltura di breve durata per la formazione della citoarchitettura destinazione. Gli astrociti tra numero di passaggio 4-12 sono stati utilizzati, come hanno esibito robusto astrocytic riforma impacchettato e collagene. Questi astrociti ha presentato anche un fenotipo maturo composto da > 95% colture pure63,64 con poca o nessuna contaminazione neuronale. A differenza di culture ordinaria astrocitarie, che impiegano contenenti siero medio (Figura 3A, a sinistra), la nostra tecnica utilizza medium senza siero per consentire gli astrociti di adottare una morfologia di processo-cuscinetto (a destranella figura 3A, ) e formare fasci di somata allineati e processi all'interno della micro-colonne62,65,66. In termini di semina concentrazione cellulare, le più alte concentrazioni nella gamma di 9.0-12.0 x 105 cellule/mL, con un ID di 350 µm, ha provocato la formazione di fasci strettamente imballate con accompagnamento di rimodellamento del collagene, mentre gli astrociti sono stati più dispersi , ma ancora allineati, quando sono state utilizzate concentrazioni più basse (Figura 3). Così, l'effetto di concentrazione su interazioni cellula-cellula di semina influenza il grado di allineamento di astrociti e la formazione delle strutture cavo-come osservate. L'iniezione della soluzione delle cellule nel lumen è generalmente visualizzato usando uno stereoscopio per garantire la consegna omogenea su tutta la lunghezza di micro-colonna, che è cruciale per la formazione continua bundle. Dopo la semina, il tempo di incubazione preliminare prima dell'inondazione con cultura media è indispensabile per garantire l'ancoraggio dei astrocytes alla ECM. La durata può essere modificata se astrociti sfuggire i costrutti, purché i costrutti sono sufficientemente umidificati per precludere l'essiccazione. Immagini di contrasto di fase di impalcature astrocytic in funzione del tempo ha mostrato che di 8 h, una rete di fasci astrocytic allineati era in via di costituzione. Inoltre, il distacco di ECM da parete lumen, sua conseguente contrazione e la stretta associazione tra cellule e il collagene contratto è stato osservato quando costrutti sono stati etichettati per collagene e GFAP come mostrato in Figura 8. Questo fenomeno è probabilmente una conseguenza delle forze contrattile astrocytic staccando il collagene dalle pareti, basato su rapporti anteriori della capacità di generare forze che distorcono i substrati flessibili e il rimodellamento della matrice fibroblasto-come delle cellule gliali capacità di astrociti in sola astrociti e neuroni-astrociti co-culture di28,49,67,68. In particolare, una delle conseguenze del astrocyte motilità e l'interazione integrina-mediata con fibrille del collageno è la generazione di forze sufficienti per contratto le fibrille17,69. Nel complesso, implementazione del protocollo descritto produrrà ponteggi vivente composto da reti auto-assemblati di dense, allineate astrocytic cavo-come le strutture che ricapitolano substrati fisici presenti in parecchie fasi di sviluppo del SNC.

Oltre alle singole questioni che potrebbero sorgere in tutto il protocollo, la tecnica di impalcatura astrocytic possiede altri ostacoli che possono influire sulla sua capacità di riparare il sistema nervoso centrale. Per esempio, il successo finale di questa tecnica è contingente sulla plasticità del sistema nervoso e integrazione funzionale dell'impalcatura astrocitario con i circuiti di host. Relative all'impianto di queste impalcature è la possibilità di una risposta infiammatoria che può contrastare gli attributi pro-rigenerativa dei fasci astrocytic. Tutte le tecniche di trapianto hanno la capacità di rottura della barriera emato - encefalica e causare l'infiltrazione delle cellule infiammatorie, a causa della vicinanza tra neuroni e capillari nel tessuto47. In questo caso, la micro-colonna di idrogel o un altro schema di encasement per i ponteggi astrocytic può essere utilizzato come un veicolo per il rilascio controllato di fattori anti-infiammatori per ridurre la risposta infiammatoria. Inizialmente, il bundle astrocytic allineato non era stabile all'interno della micro-colonna, come le forze che spingono l'allineamento di cella e rimodellamento della matrice infine ha condotto ad un crollo della citoarchitettura desiderato dopo 1-2 giorni nella cultura. Tuttavia, ulteriore crollo di contrazione e bundle è stato ostacolato fornendo ulteriore rinforzo dei pacchetti alle estremità della micro-colonna aggiungendo maggiore collagene di concentrazione al fine di tenere il bundle in posizione. Una tattica aggiuntiva potrebbe essere di impiegare un incapsulamento secondario, per cui un nuovo rivestimento di idrogel viene applicato per i fasci astrocytic allineati come essi sono tirati da micro-colonne. È probabile che la consegna delle reti allineati astrociti nel cervello sarebbe anche stabilizzare i costrutti a causa di adesioni cellula-cellula fra host e costrutto cellule lungo tutta la lunghezza, anche se questo avrà bisogno di essere testati direttamente negli studi futuri.

Di conseguenza, gli sforzi futuri saranno volto a sviluppare un metodo di trapianto efficace che assicura la stabilizzazione e la protezione del bundle astrocytic durante e dopo la consegna in vivo al fine di consentire la migrazione neuronale, riparazione, e rigenerazione nel SNC feriti. Precedentemente abbiamo dimostrato riuscito impianto di micro-teen neuronale/axonal-basato, che condividono lo schema encasement dei costrutti astrocytic, nelle vie di corticothalamic, con conseguente integrazione strutturale e di sopravvivenza con l'host tessuto al almeno fino a 1 mese46,47. Così, la robustezza dei cavi dopo l'estrazione dalle micro-colonne può essere sfruttata. In questo caso, l'idrogel di agarosio sarebbe servita come il letto di coltura iniziale per indurre auto-assemblaggio e poi il cavo astrocytic sarebbe rimosso dal encasement e direttamente iniettato nel cervello usando un ago sottile. Deformazione di astrociti a causa di forze meccaniche durante l'estrazione dalla idrogel micro-colonna non è stata osservata e non è previsto. Precedente lavoro studiando gli effetti di deformazione meccanica sulla reattività Astrocita suggerisce che qualsiasi deformazione risultante non verrà applicato abbastanza rapidamente per indurre astrocytosis o processo di allungamento62,70. Per ridurre al minimo i danni al tessuto cerebrale e la risposta infiammatoria, i pacchi entro l'idrogel potrebbero essere impiantati utilizzando la tecnologia di ago-meno sviluppato in precedenza per micro-teen. In questa metodologia, l'idrogel è rivestito con un sottile strato di carbossimetilcellulosa che permette per ago-meno voce nel cervello che può diminuire l'impronta dirompente e infiammatoria dell'impianto47. In seguito, studi di trapianto possono essere effettuati per valutare la capacità di queste impalcature per sopravvivere, si integrano con il tessuto ospite e promuovono la migrazione neuronale e la guida dell'assone. In particolare, questi costrutti possono essere impiantati con un'estremità che emana da una regione neurogena come SVZ per accedere il proprio pool di cellule staminali neurali e neuroblasti, in diretta mimicry di RMS e l'altra estremità collegata a un sito di lesione potenzialmente guidare migrazione neuronale e ripopolare la zona in modo misurato.

A seguito di ottimizzazione dei protocolli di trapianto, la tecnica può essere migliorata in altri settori. Il micro-colonne possono essere fabbricate specificamente con gli astrociti immaturi (ad es. glia radiale, RMS-tipo cellule) o fenotipi maturi che vengono poi dedifferenziate per aumentare la capacità rigenerativa-induzione di questi costrutti49. In modelli in vitro della cicatrice gliale, astrociti maturi non hanno avuto la capacità di formare le vie per assone escrescenza71. Al contrario, gli astrociti immaturi hanno dimostrati di promuovere la conseguenza del neurite in vitro e la rigenerazione assonale in vivo quando trapiantate in concomitanza con chondroitinase ABC per affrontare gli alti livelli di CSPG nella cicatrice gliale71 , 72. in concomitanza con l'avvento della medicina personalizzata, autologhe astrocytic micro-colonne possono essere sviluppate da semina di cellule staminali da fonti come indotti le cellule staminali pluripotenti (iPSCs) e cellule staminali neurali (hNSCs). Questa modifica permetterà queste impalcature per funzionare come condotti per individualizzato e la via specifica riparazione e la rigenerazione. Inoltre, uso di queste fonti cellulari può eludere la possibile risposta immunogenica che l'impianto di astrociti potrebbe causare. Anche se l'immunogenicità differisce secondo linee cellulari iPSC, queste cellule sono teoricamente in grado di evitare o diminuire le risposte immunitarie dopo trapianto, come suggerito dall'assenza di risposte deleteri dopo organo iPSC-derivato impianto in topi73,74. Inoltre, hNSCs autologo e loro derivati astrocytic reprimono le risposte immunitarie allogeniche75. Di conseguenza, fabbricando queste allineato Astrocita reti con cellule staminali autologhe possono essere un futuro critico passo nel rendere questa tecnica più facilmente applicabile in ambito clinico.

Oltre all'applicazione come condotti per la CNS riparazione e rigenerazione, impalcature astrocytic vivente è utilizzabile come in vitro test-letti, con o senza la carenatura di idrogel in base agli obiettivi di un paradigma di prova particolare. Per esempio, tali costrutti astrocytic possono essere utilizzati per studiare fenomeni neurobiologici come estensione del neurite e migrazione di neurone mediata da astrociti, sfruttando le proprietà controllabile e l'ambiente 3D di ponteggi vivente come modelli di condizioni in vivo . Il protocollo descritto in questo manoscritto dettagliato la fabbricazione di pacchi astrocytic allineati auto-assemblate in una matrice collagena all'interno di una micro-colonna di idrogel. Di ricapitolare le caratteristiche di neuroanatomia del cervello, i meccanismi dello sviluppo/rigenerativo e percorsi di migrazione neuroblasto, queste impalcature astrocytic impiantabili hanno il potenziale per offrire percorsi di sostegno per la regia dell'assone e migrazione neuronale orientamento nell'ambiente altrimenti inibitorio del sistema nervoso danneggiato.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Il sostegno finanziario è stato fornito dal National Institutes of Health [U01-NS094340 (Cullen) & F31-NS090746 (Katiyar)], Michael J. Fox Foundation [terapeutico Pipeline programma #9998 (Cullen)], Penn medicina Neuroscience Center Pilot Award (Cullen), National Science Foundation [Graduate Research Fellowships DGE-1321851 (Struzyna)], Department of Veterans Affairs [RR & D merito recensione B1097 #-ho (Cullen)] e l'US Army Medical Research e Materiel Command [n #W81XWH-13-207004 (Cullen) & W81XWH-15-1-0466 (Cullen)].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acupuncture needle (300 µm diameter) Lhasa Medical HS.30x40 The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dish Fisher 08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) Invitrogen 14200075
Polystyrene disposable serological pipet Fisher 13-678-11D
Agarose Sigma A9539-50G
Microliter glass capillary tube (701 µm) Fisher 21-170J The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Microcap bulb dispenser Fisher 21-170J Bulb comes with the microcap tubes.
Hot plate Fisher SP88857200
Magnetic bar Fisher 1451352
Micropipette Sigma Z683884-1EA
25 mm gauge needle Fisher 14-826-49
Microscalpel Roboz Surgical RS-6270
Scissors Fine Science Tools 14081-09
Forceps World Precision Instruments 501985
Hot bead sterilizer Sigma Z378550-1EA
Stereoscope Nikon SMZ800N
Micro-spatula Fisher S50821
Rat tail type I collagen Corning 354236 Maintain at 4 ºC and remove only when needed. Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tube Fisher 02-681-256
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher SS2661
Hydrochloric acid (HCl) Fisher SA48-1
Litmus paper Fisher 09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS) Invitrogen 14170112 Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA Invitrogen 25200056 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (Dnase) I Sigma 10104159001 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with Ham's F-12 Nutrient Mixture Gibco 11330-032 Store at 4 ºC.
Fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals S11195 Store at -20ºC.
Postnatal day 0 or day 1 Sprague Dawley rat pups Charles River Strain 001
Neurobasal embryonic neuron basal medium Invitrogen 21103049 Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 serum free supplement Invitrogen 12587010 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamine Invitrogen 35050061 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
G5 astrocytic supplement Invitrogen 17503012
Sprague Dawley embryonic day 18 rats Charles River Strain 001
Pasteur pipette Fisher 22-042816
15 mL centrifuge tube EMESCO 1194-352099
Vortex Fisher 02-215-414
Centrifuge Fisher 05-413-115
Hemocytometer Fisher 02-671-6
Incubator Fisher 13 998 076
Formaldehyde 40% Fisher F77P-4 Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.
Glass cover slip Fisher 12-548-5M
Nail polish Electron Microscopy Sciences (EMS) 72180
Fluoromont mounting medium Southern Biotech 0100-01
Poly-L-lysine Sigma P4707
Phosphate buffered saline Fisher BP3994
Triton X-100 Sigma T8787
Normal horse serum Gibco 16050-122
Rabbit anti-glial acidic fibrillary protein (GFAP) primary antibody Millipore AB5804 Store at -20ºC.
Mouse anti-beta-tubulin III primary antibody Sigma T8578 Store at -20ºC.
Rabbit anti-collagen I primary antibody Abcam ab34710 Store at -20ºC.
Rabbit anti-vimentin Millipore AB3400 Store at -20ºC.
Mouse anti-nestin Millipore AB5326 Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody Invitrogen A10037 Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 568 secondary antibody Invitrogen A10042 Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody Invitrogen A21206 Store at 4ºC.
Hoechst 33342, Trihydrochloride Invitrogen H3570 Store at 4ºC. Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen. Therefore, it must be disposed of in a separate container.
Calcein AM Sigma C1359 4 mM in anhydrous DMSO
Ethidium homodimer-1 Life Technologies E1169 2 mM in DMSO/H2O 1:4 (v/v)
Dimethyl sulfoxane (DMSO) Sigma 276855
A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope Nikon Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S Microscope Nikon Used for taking the phase-contrast images. With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).

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