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Repetiu a coleta de sangue da veia da cauda de ratos não anestesiados com um sistema de coleta de sangue do vácuo

Medicine
 

Summary

Aqui, descrevemos um método de amostragem de sangue de veia de cauda simples em ratos não anestesiados, usando um sistema de tubo de aspiração. Este método reduz o risco de exposição direta a sangue e simplifica a recolha de amostras múltiplas de uma única punção venosa.

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Zou, W., Yang, Y., Gu, Y., Zhu, P., Zhang, M., Cheng, Z., Liu, X., Yu, Y., Peng, X. Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System. J. Vis. Exp. (130), e55852, doi:10.3791/55852 (2017).

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Abstract

Sangue pode ser coletadas de ratos em um número de locais de amostragem. Por exemplo, a veia da cauda é uma excelente localização para amostragem de sangue. No entanto, a veia da cauda é fina, para que às vezes é difícil de perfurar. Além disso, a veia da cauda tem fluxo sanguíneo baixo e requer um tempo de amostragem longo para obter sangue suficiente. O presente relato descreve um método de amostragem de sangue simples, o método de coleta de sangue do vácuo, que geralmente é usado para obter amostras de sangue de pacientes, aqui usados para ratos não anestesiados. A ponta da agulha 22g borboleta foi inserida dentre as veias de cauda lateral, aproximadamente 2-3 cm da ponta da cauda em um ângulo de aproximadamente 20° e o sangue foi coletado no tubo de vácuo coleção inserindo o va o fim de borracha da agulha borboleta cuum tubo de coleta de sangue. Os presentes resultados experimentais mostram que a taxa de sucesso foi de 95% no grupo experimental e 90% no grupo iniciante. A taxa de sucesso e punção vezes foram semelhantes entre os dois grupos. A duração da amostragem foi significativamente menor no grupo experimental comparado ao grupo de iniciante. Em conclusão, este método de coleta de sangue do vácuo para amostragem sequencial de sangue da veia cauda de ratos não anestesiados é viável e fácil de aprender, que pode servir como uma alternativa confiável para outros convencionalmente usado técnicas de recolha de amostras de sangue para ratos.

Introduction

Colheita de sangue de ratos é necessária para uma grande variedade de estudos experimentais. Técnicas para coleta de sangue de rato incluem a punção do coração, plexo retrô-orbital, veia jugular, veia safena, os vasos sanguíneos de cauda, artéria carótida, aorta abdominal e veia cava. A maioria das técnicas (exceto a veia safena e punção de vaso sanguíneo de cauda) requerem anestesia1,2. Veias da cauda do rato são rotineiramente perfuradas para amostragem de sangue e injeção vascular. Após ter tratado a cauda com água morna, os vasos sanguíneos são bem dilatada e apropriado para a manipulação, mesmo quando os ratos são anestesiados3.

Apesar do desenvolvimento de técnicas novas e melhoradas para obter amostras de sangue em animais de laboratório pequeno2, não sempre é fácil obter sangue suficiente quando a amostragem de pequenos animais. A veia da cauda de ratos é uma excelente localização para amostragem de sangue4. No entanto, a veia da cauda é fina, assim às vezes é difícil de perfurar e levaria muito tempo para obter sangue suficiente devido ao seu fluxo de sangue baixa. Coleta de sangue através de um sistema de tubo de vácuo extração é um método típico na prática clínica diária. Este sistema fechado para coleta de sangue, reduz o risco de exposição direta a sangue e tornou mais fácil de tirar amostras múltiplas de uma única punção venosa5. O presente relato descreve um método de amostragem de sangue de veia de cauda simples em ratos não anestesiados, usando o sistema de tubo de aspiração. Esse método é fácil de dominar e pode ser usado para obter um grande volume de sangue repetidamente em ratos.

Protocol

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Conselho de faculdade médica de Tongji na Animal conta Comissão de Huazhong Universidade de ciência e tecnologia (Wuhan, China). O manuscrito foi preparado de acordo com a chegada (pesquisa Animal: relato de experimentos In Vivo ) orientações6.

1. produção animal

  1. Usar ratos Sprague-Dawley (SD) (n = 20, 10 machos, 8 semanas de idade, pesando 261 para 291 g, quer dizer = 272.85 g de ±9.07) do centro de animais experimentais de Huazhong Universidade de ciência e tecnologia e manter ratos de acordo com o guia para o cuidado e o uso de Animais de laboratório, publicados por nos National Institute of Health (NIH publicação No.85-23, revista em 1996)
  2. Casa em condições normais, com livre acesso à comida e água potável. Mantém ratos em gaiolas de2 cm 530 com madeira-corte do fundamento. Casa de dois ratos em cada gaiola. Manter todas as gaiolas abertas para o ambiente da sala (não microisolamento ou enjaular ventilado)
  3. Assegure que o pessoal envolvido no protocolo experimental lidar regularmente com os ratos.
  4. Manter a temperatura entre 21 ° e 23 ° C. Dê uma dieta normal de sal-taxas (0,3% NaCl) ao longo do estudo.

2. procedimento de coleta de sangue

Nota: O sistema de coleta de sangue do vácuo consiste de uma agulha de duas pontas [22g (0,7 x 25 mm)], um suporte de plástico e uma série de tubos de vácuo (2 mL) com rolhas de borracha (Figura 1).

  1. Coloque o rato em um suporte plástico de restrição e lavar a cauda com água para remover qualquer sujeira visível ou fezes (20-30 ° C). Enquanto o assistente tem a cauda na posição estendida, limpar o rabo com etanol a 70% e limpar com gaze para esclarecer a veia.
  2. Inserir a ponta da agulha 22g borboleta em uma das veias da cauda lateral (cerca de 5 mm) em uma posição aproximadamente 2-3 cm da ponta da cauda em ângulo de aproximadamente 20 ° (Figura 2). Colher o sangue no tubo de vácuo de coleta por introduzindo a ponta de borracha da agulha borboleta no tubo de coleta de sangue do vácuo (Figura 3).
    Nota: O volume de sangue coleção máxima é de 1,2 mL7.
  3. Após a coleta de sangue, retirar a agulha e aplicar suavemente a pressão para o local de punção com gaze por 15-30 s para parar o fluxo de sangue. Em seguida, solte o rato do suporte plástico para restrição e retornar o rato para sua gaiola.
  4. Use tubos que contenham EDTA como anticoagulante para coleta de plasma de sangue. Inverta suavemente o tubo várias vezes para misturar anticoagulante no sangue e colocar as amostras no gelo verticalmente.
  5. Centrifuga os tubos de colheita de amostra de sangue numa centrifugadora refrigerada a 2.000 x g durante 10 minutos separar o soro ou plasma.
  6. Extraia o soro/plasma, tomando cuidado para não perturbar as camadas de células do sangue vermelho e branco. Para coletar o soro sanguíneo, use tubos sem anticoagulante. Ambos os tipos de amostra podem ser usados imediatamente, ou armazenados a-80 ° C por até um ano.
    Nota: Coleta de sangue bem sucedida foi definida como obter sangue de 1,2 mL cada vez. Tempo de punção máxima foi definido para três julgamentos, se o volume de sangue total foi inferior a 1,2 mL após a terceira punção, foi definido como uma coleção de sangue falhou. A duração da amostragem começa a partir de punção de veia da cauda para a remoção da agulha borboleta após a coleta de sangue.
  7. Colete sangue duas vezes dentro de duas semanas7.
    1. Para testar e verificar a viabilidade deste método, trem de dois estudantes de medicina (iniciantes) 2 h antes de executar este protocolo de coleta de sangue. Use vinte ratos e tirar sangue de 10 ratos por 2 companheiros experientes (grupo experimental) e de 10 ratos por estudantes de medicina 2 (grupo de iniciante).

3. análise estatística

  1. Dados como um valor médio ± desvio-padrão de expressar e analisar com SPSS estatística 17. Um valor α de 0,05 foi escolhido, portanto p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Representative Results

Duração da amostragem, massa corporal e volume de coleta de sangue dos dois grupos
Sangue foi coletado de 10 ratos (5 machos) duas vezes dentro de duas semanas em cada grupo. A massa média do corpo em ambos os grupos foi semelhante (272,00 ±9.66 e ±8.87 273.70 g). Duração de amostragem foi significativamente menor no grupo experimental comparado ao grupo iniciante (2.77 min ±0.53 vs 3,28 ±0.83 min, p < 0,05) (tabela 1).

Sucesso rate e punção vezes dos dois grupos
A taxa de sucesso foi de 95% (19/20) no grupo experimental e 90% (18/20) no grupo iniciante (p > 0,05). Vezes de punção não foram significativamente diferentes entre os dois grupos (1.50 min ±0.61 vs 1,85 ±0.75 min, p > 0,05) (tabela 2). Estes resultados indicam que esse método é fácil de aprender, e a técnica poderia ser dominada após o treinamento por 2 h.

Figure 1
Figura 1 : tubo de coleta de sangue do vácuo 2 mL (à esquerda); agulha tipo borboleta 22g (centro); o suporte plástico de restrição (à direita). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : a ponta da agulha foi inserida na veia lateral da cauda (cerca de 5 mm) na posição aproximadamente 2-3 cm da ponta da cauda em ângulo de aproximadamente 20 °. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Punção venosa sucesso. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Grupo experimental Grupo iniciante
Sexo Peso (g) Volume de sangue coletado (mL) duração da amostragem (min) Sexo Peso (g) Volume de sangue coletado (mL) duração da amostragem (min)
E1-1 macho 291 1.2 3.12 B1-1 macho 282 1.2 3.18
E1-2 macho 291 1.2 2,73 B1-2 macho 282 1.2 2.18
E2-1 macho 276 1.2 2.3 B2-1 macho 264 1.2 3,73
E2-2 macho 276 1.2 2.37 B2-2 macho 264 1.2 2.47
E3-1 macho 267 1.2 2,73 B3-1 macho 265 1.2 3.52
E3-2 macho 267 1.0 3,88 B3-2 macho 265 1.2 2.53
E4-1 macho 263 1.2 2.41 B4-1 macho 289 1.2 2.32
E4-2 macho 263 1.2 2,52 B4-2 macho 289 1.2 3.62
E5-1 macho 265 1.2 3.61 B5-1 macho 277 1.2 3.48
E5-2 macho 265 1.2 2.42 B5-2 macho 277 1.2 3.12
E6-1 fêmea 285 1.2 3.33 B6-1 fêmea 274 0.9 4,87
E6-2 fêmea 285 1.2 3.03 B6-2 fêmea 274 1.2 3.37
E7-1 fêmea 271 1.2 2,82 B7-1 fêmea 268 1.0 3,93
E7-2 fêmea 271 1.2 2.42 B7-2 fêmea 268 1.2 3.82
E8-1 fêmea 268 1.2 1.93 B8-1 fêmea 262. 1.2 2,07
E8-2 fêmea 268 1.2 3.05 B8-2 fêmea 262. 1.2 3,67
E9-1 fêmea 273 1.2 2,52 B9-1 fêmea 281 1.2 4.38
E9-2 fêmea 273 1.2 3.17 B9-2 fêmea 281 1.2 4,57
E10-1 fêmea 261 1.2 1.82 B10-1 fêmea 275 1.2 2.53
E10-2 fêmea 261 1.2 3,25 B10-2 fêmea 275 1.2 2.28
Média 2,77 3.28
Pt-1: número de série dos ratos no grupo experimental para a primeira coleta de sangue.
Pt-2: número de série dos ratos no grupo experimental para a segunda coleta de sangue.
BN-1: número de série dos ratos no grupo de iniciante para a primeira coleta de sangue.
BN-2: número de série dos ratos no grupo de iniciante para a segunda coleta de sangue.

Tabela 1: Resultados de sangue coletados no grupo experimental e o grupo de iniciante.

Tempos de coleta de sangue Tempos médios de punção Uma punção de tempo Duas vezes da punctura Três vezes da punctura Falhou Taxa de sucesso
Grupo experimental 20 ±0.61 1.50 11 8 0 1 95%
Grupo iniciante 20 ±0.75 1,85 7 9 2 2 90%
Uma punção de tempo: número de ratos com coleta de sangue bem sucedido após a primeira punção
Duas vezes punção: número de ratos com coleta de sangue bem sucedido após a segunda punção
Três vezes punção: número de ratos com coleta de sangue bem sucedido após a terceira punção
Falha: número de ratos com falha de coleta de sangue após a terceira punção

Tabela 2: Comparação entre os tempos de punção e taxas de sucesso do grupo experimental e do grupo de iniciante.

Discussion

O presente relato descreve um método de coleta de sangue fácil de aprender em ratos. Nossos resultados mostraram que esse método é viável para repetidamente coletar um grande volume de sangue dos ratos. Além disso, esse método poderia ser facilmente dominado com uma curva de aprendizagem a curto prazo. Este procedimento pode ser realizado em ratos não anestesiados e só faz com que o mínimo de estresse para os animais.

Sangue pode ser coletadas de ratos em vários locais. A veia da cauda é uma excelente localização para amostragem de sangue4. No entanto, não sempre é fácil de obter suficiente volume de sangue da veia sangue fino e baixo fluxo cauda dos ratos. O sistema de coleta de sangue do vácuo é geralmente usado para coletar amostras de sangue dos pacientes na prática clínica diária. Este sistema de coleta de sangue do vácuo tem sido usado em pacientes e animais de pesquisa por um longo tempo8,9,10. Este sistema consiste de um tubo de coleta de sangue do vácuo com agulha de parede e borboleta silicone revestido tubo interno. Ele baseou-se no princípio da pressão negativa do vácuo e permite o desenho contínuo de sangue sem o risco de coleta de sangue, o que também reduz a chance de contaminação e a hemólise11. O volume da amostra de sangue no cateter é cerca de 0,3 mL. Depois de retirar a agulha da veia da cauda, o sangue bloqueado o cateter vai fluir no tubo de vácuo de coleta devido o vácuo. Este método também é aplicável para a coleta de sangue de ratos com menos de 100 g com o uso de uma agulha de punção menor.

Este método de coleta de sangue tem várias vantagens. Este procedimento só causa lesão mínima para ratos e coleta de sangue pode ser realizada sem o uso de anestésicos, assim a influência da resposta ao estresse e anestésicos sobre a amostra de sangue pode ser evitada. Nossas observações mostraram que ratos estavam quietos no suporte de plástico restrição durante o procedimento e havia sem mortes durante estas experiências. Em segundo lugar, repetido a coleta de sangue, cada um ou dois dias é possível, que permite a amostragem frequente de sangue com um volume adequado para vários fins de pesquisa. Finalmente, esse método é fácil de aprender e foi facilmente dominado por iniciantes após um período de aprendizagem de curta (2H), conforme indicado pelas taxas de sucesso semelhantes e punção vezes entre os grupos experimentais e iniciante neste relatório. Em um relatório anterior, Lee et al demonstraram um método similar de amostragem de sangue da veia lateral da cauda do rato4. Nosso método é mais simples do que o relatado por Lee et al . 4 em que nós diretamente inserir a agulha de punção da veia da cauda e a outra extremidade do tubo está diretamente ligado ao tubo de vácuo para coleta de sangue, sem o uso de uma seringa extra e aspiração manual do sangue e sem a necessidade de ' leite ing' a veia para facilitar o fluxo de sangue. Coleta de sangue com esse sistema fechado reduz a possibilidade de contaminação do sangue. Uso do plástico titular restrição também reduz o estresse para o rato e facilita a fixação da cauda.

As duas etapas seguintes são críticas para o sucesso da aplicação desse método. 1) estender a cauda e evitar o movimento da cauda; 2) suavemente punção da veia em um ângulo de 20 ° para evitar a punção na veia e manter a agulha de punção na veia.

Em conclusão, o método de coleta de sangue do vácuo adotado em ratos é segura, viável e fácil de prática. Esse método permite a amostragem frequente de sangue com um volume adequado de sangue obtido de ratos não anestesiados.

Disclosures

Os autores não têm nada a divulgar

Acknowledgments

Os autores têm não há agradecimentos a fazer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
a double-pointed needle Shanghai Kang Nong medical instrument co., LTD, China 22G  (0.7×25mm)
vacuum tubes Wuhan Zhi Yuan, medical science and technology co., LTD, China 2 ml
rat restraining holder  Shanghai Kang Nong medical instrument co., LTD, China 250g rat hoder model
normal salt diet for rats Rats received a normal salt diet (0.3% NaCl) throughout the study
SPSS software for statistical analysis SPSS Inc,  Chicago; USA  Version 17.0. 

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References

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