来自新世界Zika病毒感染性克隆的重组病毒的救援和表征

Immunology and Infection

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Summary

该方案描述了从双质粒感染性cDNA克隆中恢复感染性Zika病毒。

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Weger-Lucarelli, J., Duggal, N. K., Brault, A. C., Geiss, B. J., Ebel, G. D. Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone. J. Vis. Exp. (124), e55857, doi:10.3791/55857 (2017).

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Abstract

传染性cDNA克隆允许病毒的遗传操作,从而有助于疫苗,发病机理,复制,传播和病毒进化的工作。在这里,我们描述了Zika病毒(ZIKV)感染性克隆的构建,目前在美洲引起爆发性爆发。为了防止黄病毒衍生质粒通常观察到的对细菌的毒性,我们产生了一个双质粒系统,其将NS1基因的基因组分离,并且比不能在没有突变的情况下成功恢复的全长构建体更稳定。在消化和连接两个片段后,可以通过T7 RNA聚合酶的体外转录产生全长病毒RNA。在将转录的RNA电穿孔进入细胞后,分别在小鼠和蚊子中显示类似的体外生长动力学和体内毒力和感染表型的病毒。

Introduction

Zika病毒(ZIKV;家庭病毒科: 病毒属)是一种蚊子传播的黄病毒,于2013-14年抵达巴西,随后发生在美洲蔓延的发热性疾病的大规模爆发1 。此外,ZIKV已经与严重的疾病结果相关联,如成人的吉兰 - 巴雷综合征和胎儿和新生儿的小头症2 。在西半球迅速传播之前,关于ZIKV的知之甚少。这包括缺乏分子工具,从而阻碍机械研究。用于病毒的分子工具,例如感染性cDNA克隆,促进疫苗和抗病毒治疗发展,并允许评估与差异病毒发病机理,免疫应答和病毒进化相关的病毒遗传因素。

已知黄病毒感染性克隆由于cr而在细菌中高度不稳定其基因组中存在的原核启动子3 。已经采用了几种方法来改善这个问题;包括在病毒序列上游插入串联重复4 ,推定的原核启动子序列的突变5 ,将基因组分裂成多个质粒6 ,低拷贝数载体(包括细菌人造染色体) 7,8和内含子在病毒基因组9中的插入。 ZIKV已经描述了一个没有修改的全长系统;然而,该克隆似乎在细胞培养物和小鼠中减弱10 。其他组已经将内含子设计到ZIKV基因组中,允许细菌中不稳定序列的破坏,其可以在体外在哺乳动物细胞剪接以产生感染性病毒11 12 。另外,已经成功地使用了一种名为“传染性亚基因组扩增子”的基于PCR的系统来拯救ZIKV13原型MR766菌株。这里描述的方法不需要外来序列,而是通过使用先前已经成功用于黄热病6号 ,登革热14,15和西尼罗河病毒16的多个质粒来破坏高不稳定区域的基因组。此外,在病毒基因组末端添加丙型肝炎核酶序列有助于产生真实的3'端,而不需要添加线性化位点。另外,两种质粒都构建在低拷贝数载体(pACYC177,每个细胞约15个拷贝)中以减轻任何残留毒性17 。恢复的病毒显示出与之相当的增长特征包含来自哺乳动物和昆虫的各种细胞类型的8种细胞系中的亲代病毒在体外生长曲线中,并且在小鼠中表现出相同的致病性谱,并且在蚊子中具有感染,传播和传播率。

在这里,我们详细说明了如何生长感染性克隆质粒, 在体外产生全长病毒RNA(病毒基因组) 的方案,并在细胞培养物中回收感染性病毒。首先,我们描述了使用滚环扩增(RCA)的细菌在细菌或无细菌扩增中的繁殖。接下来,我们展示两种质粒如何消化,然后连接在一起以产生全长病毒。最后,我们描述转录的RNA的生产及其随后的电穿孔进入Vero细胞,然后滴定回收的病毒( 图1 )。描述的方法是快速的,允许fo在1-2周内恢复感染性病毒库存。

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Protocol

传染性克隆质粒的转化和恢复

  1. 使用商业转化方案( 例如 ,NEB 5分钟转化协议)转化两种质粒(单独)并进行一些修改。两种质粒含有编码氨苄青霉素抗性的基因,因此使用氨苄青霉素或羧苄青霉素进行选择。碳青霉素是较为稳定的。
    1. 从-80°C冰箱中取出细胞(参见材料表),并在冰上解冻5-10分钟。在37℃下,预热溶血培养液(LB)(含有10g / L NaCl和25μg/ mL羧苄青霉素,称为LB-碳水化合物)板和具有分解代谢阻抑(SOC(无抗生素))的肉汤)。
    2. 将1μL质粒DNA中的100pg-10ng加入含有50μL感受态细胞的管中;轻轻的轻轻捏合管子。
    3. 在冰上孵育管5分钟。
    4. 热冲击管在42°C 30 s在水浴中热休克后立即回冰2分钟。
    5. 将950μL室温SOC吸入每个管中,并通过移液进行混合。将100μL细菌混合物扩散到LB-碳板上,并在37℃(大约12-14小时)下孵育过夜。
  2. 培养12-14小时后,从37℃培养箱中取出板。将板放置在室内黑暗的抽屉中,以使菌落继续生长(约8-9小时)。
  3. 在细菌摇床(大约14-16小时)内,使用5mL的特殊肉汤(TB,含有25μg/ mL羧苄青霉素,称为TB-carb),每个质粒在30℃下生长5-10个小菌落。
    注意:小菌落是质粒完整的指标;含有缺失,重排或突变(这里称为不稳定事件)的质粒的菌落将生长得更快,因此更大。因此,应该尝试挑选盘子上最小的殖民地,特别是没有选择最大的殖民地存在。也可以选择一些中等大小的殖民地来完成。所用的较低温度降低了细胞过度生长的可能性(OD 600大于0.6-0.8)。随着大多数研究人员进行夜间生长,它允许更多的控制和减少的过度增长的机会。
  4. 检查液体培养物的浊度(大约OD 600为0.6-0.8)。将任何混浊的管放置在4°C,并允许其他管通过长时间生长变得浑浊。
    注意:由于质粒不稳定事件可能发生,不要将细菌生长到OD 600值超过推荐值。
  5. 用商业质粒微量稀释试剂盒(见材料表)从细菌中提取质粒DNA。在15μL预热(加热块中至70°C)洗脱缓冲液中洗脱。允许洗脱缓冲液在离心前在柱上孵育5分钟。
    注意:在4℃保存至少1 mL此起始培养物进一步用于下一步。
  6. 摘取10μL回收的质粒,以评估培养过程中是否发生质粒不稳定事件。
    注意:用SalI / NheI和p2与BamHI / HindIII在37℃下将p1消化1小时。通过凝胶电泳确认消化后存在正确的条带( 图2a ),并进入步骤2.如果通过滚环扩增(RCA)制备质粒DNA,请保留一些小批量洗脱液作为模板。

2.用于连接的足够的质粒DNA的制备

注意:连接和随后的电穿孔需要足够量的质粒DNA,必须通过maxiprep或RCA产生。虽然maxiprep是传统使用的方法,但RCA提供了不需要细菌的优点,从而消除了可能导致不稳定事件的细菌中质粒诱导的毒性的潜力。

  1. 对于前一节中证明正确的限制酶消化模式的每个质粒,向1L TB-Carb(25μg/ mL羧苄青霉素)肉汤中加入500μL起始培养物,并在30℃(大约14-16小时) ,大约OD 600为0.6-0.8)。
    注意:不要让文化成长超过OD 600值。这可能会导致质粒内的不稳定事件。
  2. 收集细菌并按制造商的方案执行maxipreps(见材料表)。
  • 使用步骤1.6中保存的miniprep,对RCA过程执行以下操作。
    1. 将1μL质粒DNA转移到含有50μL样品缓冲液的管中。
    2. 将样品在95℃下热变性3分钟,然后在4℃下孵育直到准备使用。
    3. 准备商业放大预混料(参见材料表 )。将50μL反应缓冲液与2μL酶混合物置于冰上的管中。
      注意:放大预混物应保存在冰上,直到准备使用。通过组合足够的试剂进行所需数量的扩增反应来制备主混合物是方便的。任何未使用的预混物都必须被丢弃。
    4. 将50μL制备的扩增预混物转移到变性样品中。
    5. 将反应管在30℃孵育18小时。
    6. 将管在65℃孵育10分钟以使ø29DNA聚合酶失活。
    7. 将反应管储存在4°C或-20°C直到准备使用。
      注意:此时,应通过两种方法制备的质粒DNA(使用260 nm处的吸光度),ZIKV基因组应完全进行Sanger测序,以确认在制备过程中不发生不稳定事件(缺失和重排)。
  • 入门名称序列(5' - 3')
    ZIKV PRVABC59 1 For。 AGTTGTTGATCTGTGTGAATCAGAC
    ZIKV保护632For。 GCCCTATGCTGGATGAGG
    ZIKV保护692Rev。 GGTTCCGTACACAACCCAAGTTG
    ZIKV保存1313Rev。 CTCCCTTTGCCAAAAAGTCCACA
    ZIKV保护1201For。 CCAACACAAGGTGAAGCCTAC
    ZIKV保护1663For。 GCAGACACCGGAACTCCACACT
    ZIKV保护2008年。 CAGATGGCGGTGGACATGC
    ZIKV保存2350Rev。 GTGAGAACCAGGACATTCCTCC
    ZIKV保护2605For。 TACAAGTACCATCCTGACTCCC
    ZIKV Conserved 3499Rev。 GCCTTATCTCCATTCCATACCA
    ZIKV Conserved 3961Rev。 TTGCCAACCAGGCCAAAG
    ZIKV保护4132For。 CATTTGTCATGGCCCTGG
    ZIKV保护4561Rev。 CTATTGGGTTCATGCCACAGAT
    ZIKV Conserved 4665For。 GACCACAGATGGAGTGTACAGAGT
    ZIKV Conserved 5189Rev。 AAGACAGTTAGCTGCTTCTTCTTCAG
    ZIKV保存5219For。 GAGAGTTCTTCCTGAAATAGTCCGTGA
    ZIKV保守6086Rev。 CTTGCTTCAAGCCAGTGTGC
    ZIKV保护6119For。 GCCTCATAGCCTCGCTCTATCG
    ZIKV保护6721Rev。 CCATTCCAAAGCCCATCTTCCC
    ZIKV保护6769For。 CCAGCCAGAATTGCATGTGTCC
    ZIKV保存7209Rev。 ATCATTAGCAGCGGGACTCCAA
    ZIKV Conserved 7343For。 GTTGTGGATGGAATAGTGGT
    ZIKV保存8243For。 TGCCCATACACCAGCACTATGA
    ZIKV PRVABC59 8893Rev。 TGCATTGCTACGAACCTTGTTG
    ZIKV保守9133For。 AGCCCTTGGATTCTTGAACGAGGA
    ZIKV PRVABC59 9673Rev。 AACGCAATCATCTCCACTGACT
    ZIKV保护9686For。 GATGATAGGTTTGCACATGCC
    ZIKV保守10321Rev。 GTCCATGTACTTTTCTTCATCACCTAT
    ZIKV保守10455For。 CAGGAGAAGCTGGGAAACC
    ZIKV保护10621Rev。 CAGATTGAAGGGTGGGGAAGGTC

    表1:用于测序cDNA克隆的引物。质粒可以用所列的引物完全测序。标记为“保守”印度的引物认为它们可能能够对ZIKV的所有基因型进行序列/扩增。标记为“PRVABC59”的引物对该菌株是特异性的,但也可用于其他亚洲基因型菌株和可能的其他基因型。

    3. 体外转录RNA的制备

    1. 建立maxiprep或RCA制备DNA的消化反应。
      1. 对于p1消化,混合10μL的10x反应缓冲液,3μL的ApaLI,3μL的BamHI-HF,3μL的rSAP或CIP,以及3.3μg的p1 DNA。加入ddH 2 O至100μL。
      2. 对于p2消化,混合10μL10x反应缓冲液,3μLApaLI,3μLEcoRI-HF和13.3μgp2 DNA。加入ddH 2 O至100μL。
      3. 在37℃孵育1-2小时。
      4. 使用商业化的凝胶和PCR清洁试剂盒进行纯化(参见材料表)。在加热块中预热至70℃的30μL洗脱缓冲液中洗脱(孵育柱旋转5分钟)。
        注意:保持1μL以后在凝胶上运行。
    2. 准备连接反应。
      1. 结合10μL10×T4 DNA连接反应缓冲液,3μLT4 DNA连接酶(400 U /μL),29μL纯化p1和29μL纯化p2。加入ddH 2 O至100μL。
      2. 在室温下孵育2小时或16℃过夜。
      3. 使用商业化的凝胶和PCR清洁试剂盒进行纯化(参见材料表)。在加热块中预热至70℃的10μL洗脱缓冲液中洗脱(在纺丝前孵育柱5分钟)。
        注意:保持1μL以后在凝胶上运行。
    3. 运行未消化的质粒,消化的质粒和在琼脂糖凝胶上连接。连接产物应该具有比单独消化的质粒更高的分子量带(约11kb),表明连接成功( 图2b )。
    4. 建立T7 体外转录反应。
      1. 结合10μL2x ARCA / NTP Mix,2μLT7 RNA聚合酶混合液和8μL纯化的连接反应,终体积为20μL。
        注意:混合中包含的ARCA是专门以正确方向结合的帽类似物。标准帽类似物可导致只有约50%的转录物具有正确方向的上限。
      2. 在37℃下孵育4小时。
      3. 通过紫外分光光度计测量RNA浓度。任选地,运行变性琼脂糖凝胶以证实RNA转录物的长度。

    4.通过电穿孔拯救传染病毒

    1. 在电穿孔之前几天,每个待回收的构建体准备1个T182瓶的Vero细胞(T150和T182之间是可接受的;在DMEM + 10%胎牛血清(FBS)中生长)。包括1 T182作为模拟转染控制。策lls应在70-80%的汇合处使用。
    2. 当细胞准备就绪时,将DMEM + 15%FBS + 10mM HEPES的12mL /反应置于加热到37℃的水浴中。
    3. 用标准方法通过胰蛋白酶消化分离细胞,并用含10%FBS的培养基回收细胞以灭活胰蛋白酶;在4℃下以150×g离心细胞5分钟。
    4. 在1×磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤细胞,在4℃下以150×g将细胞沉淀5分钟。重复此步骤两次,共三次洗涤。
    5. 将细胞重悬于每个样品200μL的RPMI 1640 + 10mM HEPES(无菌)中。将200μL细胞悬浮液转移到无菌管中。细胞应为〜0.5×10 7个细胞/ mL。
    6. 在每组细胞中加入20μL水(模拟阴性对照)或20μLRNA(优选5-10μg)。轻轻的轻轻混匀,将管内容物转移到2mm间隙的电穿孔试管中。
    7. 设一个电驱动器为170 V LV,Ω(Ω)为0和950μF(大致为625 V / cm,其他机器为20 ms时间常数)。将电阻设置为最低可用设置,0或∞(如果可用)。
    8. 脉冲一次并立即加入600μL在步骤4.2中加热的DMEM + 15%FBS + 10mM HEPES。彻底冲洗比色皿内部以除去所有细胞。将细胞加入到含有10mL预热培养基的T75组织培养瓶中。使用比色杯附带的滴管从比色皿中除去其他介质。小心保持不育。
    9. 旋转烧瓶将培养基和细胞混合并置于37℃培养箱中。
    10. 检查第二天的细胞活力,并且每天都这样做,直到观察到50-75%的细胞死亡。通过与模拟电穿孔对照相比观察细胞死亡。
      注意:在Vero细胞中,ZIKV细胞病变效应(CPE)是相当明显的,导致在培养基中分离和漂浮的圆形细胞。我们有观察到8-10天的范围是收获的理想选择。
    11. 在圆锥管中收获上清液并离心以在4℃下以> 3,000×g去除细胞碎片10分钟。
    12. 将澄清的上清液移除到新管中,并补充最终浓度为20%FBS(100%原液)。另外,加入终浓度为10mM的无菌HEPES作为缓冲剂,以保存病毒感染性,同时冷冻(来自1M无菌储备)。
    13. 通过涡旋混合病毒并将其等分成螺旋盖小瓶。储存于-80°C,以备将来使用。

    5.恢复病毒滴定

    1. 在滴定前一天种上适量数量的Vero细胞的6孔或12孔板。
    2. 从冷冻箱中取出病毒,并在管或96孔板中将DMEM + 2%FBS连续10倍稀释。
      注意:来自回收克隆的预期效价为1×10 6至5×10 7 PFU / mL。
    3. 加200 o将每次稀释液400μL分别复制到12孔或6孔板的孔中。
    4. 将板在37℃的培养箱和岩石中每15分钟放置一次,总共约1-1.5小时的吸附周期。
    5. 去除病毒接种物,并向每个孔中加入1mL(12孔)或2mL(6孔)DMEM-黄蓍胶覆盖物。
      注意:这里可以使用琼脂糖,琼脂,甲基纤维素或其他覆盖介质。
    6. 在37℃培养箱中孵育细胞5天。适当斑块形成的时间将根据所使用的覆盖层而变化。
    7. 为了修复细胞,将培养箱中的板取出并轻轻倒入消毒剂中。
    8. 向每个孔中加入足量的20%乙醇/ 0.1%结晶紫(CV),以覆盖和旋转混合。
      注意:许多其他固定剂存在,可以在这里使用。另外,如果使用琼脂糖或琼脂覆盖层,则可以使用第二层覆盖层与中性红色结合使用,以便不固定地显现斑块。 20%乙醇显示为在以前的研究中有效灭活包膜病毒;不要将这个数量用于非包络病毒,因为它们不会被灭活19
    9. 在室温下孵育板30-60分钟(在第二类生物安全柜中);丢弃CV(根据当地法规),并用自来水清洗板。
    10. 让板材干燥,并手动计数斑块。
      注意:参考文献20可用作执行噬斑测定的附加参考。

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    Representative Results

    这里描述的方案允许恢复感染性克隆衍生的Zika病毒。与高度不稳定的全长版本(数据未显示)相比,操作双质粒感染性克隆系统在小心执行时是简单的。在消化和连接两个不同的片段后,使用T7聚合酶的体外转录产生加帽的RNA,然后将其电穿孔至Vero细胞( 图1 )。在使用RCA或maxiprep进行大规模DNA生产后,可以使用限制性消化作为代谢物监测正确的质粒序列( 图2a )和通过Sanger测序。通过测序确认克隆后,感染性病毒的恢复仅需要消化,连接, 体外转录和最后的电穿孔。这些步骤可以在一天内完成。正确挖掘可以通过琼脂糖凝胶电泳( 图2b )监测茎和连接,如果需要,进行故障排除。

    如图3所示 ,感染性克隆衍生的病毒在几种细胞系中在体外复制到与亲本分离物相似的水平,表明来自cDNA的回收病毒与初级分离物类似地复制。另外,传染性克隆衍生的病毒与亲本分离株之间在小鼠存活率或埃及伊蚊的感染,传播和传播速率方面没有观察到显着差异( 图4 )。

    图1
    图1:来自双质粒cDNA克隆的ZIKV救援工作流程。将ZIKV菌株PRVABC59的基因组克隆到两个分开的片段中成为pACYC177质粒骨架。然后将两个质粒消化并与T4DNA连接酶连接。然后通过体外转录产生包被的感染性RNA,然后通过电穿孔进入Vero细胞。 (图参考文献21 )。 请点击此处查看此图的较大版本。

    图2
    图2:用于监测cDNA克隆的消化和连接的凝胶电泳。A )用于评估遗传稳定性的小批量衍生质粒的初始限制性消化。 ( B )从双质粒克隆系统回收感染性病毒时的消化和连接产物的实例。 href =“http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55857/55857fig2large.jpg”target =“_ blank”>请点击此处查看此图的较大版本。

    图3
    图3:克隆衍生病毒的体外生长动力学。通过斑块测定法评估野生型PRVABC59和感染性克隆衍生病毒对人(SH-SY5Y,Jar和NTERA2 cI.D1),蚊子(C6 / 36,Aag2)和非人灵长类动物(Vero)细胞系的生长动力学。 n = 3误差条表示与平均值的标准偏差。 (图参考文献21 )。 请点击此处查看此图的较大版本。

    / 55857fig4.jpg“
    图4:克隆衍生病毒在小鼠和蚊子中的体内表征。A )4周龄的雄性和雌性干扰素α,β和γ受体敲除,AG129,小鼠腹膜内接种1000PFU的PRVABC59或感染性克隆衍生的病毒,并随时间监测存活(n = 11)。给伊蚊伊蚊给予含有ZIKV的感染性血液,14天后解剖。 ( B )使用斑块测定来评估感染性病毒的蚊体(感染),腿(传播)或唾液分泌物(传播)。速率以被测试的总蚊子的百分比表示(图中参考文献21 )。 请点击此处查看此图的较大版本。

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    Disclosures

    作者没有什么可以披露的。

    Acknowledgments

    作者要感谢克里斯汀·布拉德·费贝尔曼,米拉娜·维塞利诺维奇和克劳迪娅·鲁克特(ClaudiaRückert)的帮助,以表征克隆衍生的病毒。这项工作部分得到NIH国家过敏和传染病研究所赠款AI114675(BJG)和AI067380(GDE)的支持。

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    NEB Stable CompetentE. coli New England BioLabs C3040H
    Carbenicillin, Disodium Salt various
    Zyppy Plasmid Miniprep Kit Zymo Research D4036
    ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit Zymo Research D4202
    SalI-HF New England BioLabs R3138S 20,000 units/ml
    NheI-HF New England BioLabs R3131S 20,000 units/ml
    ApaLI New England BioLabs R0507S 10,000 units/ml
    EcoRI-HF New England BioLabs R3101S 20,000 units/ml
    BamHI-HF New England BioLabs R3136S 20,000 units/ml
    HindIII-HF New England BioLabs R3104S 20,000 units/ml
    illustra TempliPhi 100 Amplification Kit GE Healthcare Life Sciences 25640010
    NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Macherey-Nagel 740609.5
    Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) New England BioLabs M0371S 1,000 units/ml
    Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) New England BioLabs M0290S 10,000 units/ml
    T4 DNA Ligase New England BioLabs M0202S 400,000units/mL
    HiScribe T7 ARCA mRNA Kit New England BioLabs E2065S
    Vero cells ATCC CCL-81
    ECM 630 High Throughput Electroporation System BTX 45-0423 Other machines are acceptable.
    LB Broth with agar (Miller) Sigma L3147 Can be homemade as well.
    Terrific Broth Sigma T0918 Can be homemade as well.
    Petri Dish Celltreat 229693
    Culture Tubes VWR International 60818-576
    T75 flasks Celltreat 229340
    T182 flasks Celltreat 229350
    1x PBS Corning 21-040-CV
    RPMI 1640 with L-glutamine Corning 10-040-CV
    DMEM with L-glutamine and 4.5 g/L glucose Corning 10-017-CV
    Fetal Bovine Serum (FBS) Atlas Biologicals FP-0500-A
    Tragacanth Powder MP Bio MP 104792
    Crystal Violet Amresco 0528-1006
    Ethanol Denatured VWR International BDH1156-1LP
    6 well plate Celltreat 229106
    12 well plate Celltreat 229111
    Sequencing Oligos IDT see table 1
    Qubit 3.0 ThermoFisher Qubit 3.0 other methods are acceptable.
    Qubit dsDNA BR Assay Kit ThermoFisher Q32850 other methods are acceptable.
    Qubit RNA HS Assay Kit ThermoFisher Q32852 other methods are acceptable.
    Class II Biosafety Cabinet Varies N/A This is necessary for live-virus work.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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