新世界Zikaウイルス感染クローンからの組換えウイルスの救出とキャラクタリゼーション

Immunology and Infection

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Summary

このプロトコールは、2プラスミドの感染性cDNAクローンからの感染性Zikaウイルスの回収を記載している。

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Weger-Lucarelli, J., Duggal, N. K., Brault, A. C., Geiss, B. J., Ebel, G. D. Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone. J. Vis. Exp. (124), e55857, doi:10.3791/55857 (2017).

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Abstract

感染性cDNAクローンは、ウイルスの遺伝子操作を可能にし、したがって、ワクチン、病原性、複製、伝達およびウイルスの進化に関する作業を容易にする。ここでは、アメリカで爆発的な流行を引き起こしているZikaウイルス(ZIKV)の感染クローンの構築について説明します。フラビウイルス由来のプラスミドでよく見られる細菌への毒性を防ぐために、我々はNS1遺伝子のゲノムを分離し、突然変異を伴わずに正常に回収できなかった完全長構築物よりも安定な2プラスミドシステムを作製した。 2つの断片を連結する消化およびライゲーションの後、全長ウイルスRNAを、T7 RNAポリメラーゼを用いたインビトロ転写によって生成することができる。転写されたRNAの細胞への電気穿孔の後、同様のインビトロでの増殖速度およびインビボでの病原性および感染表現型をマウスおよび蚊でそれぞれ示したウイルスが回収された。

Introduction

Zikaウイルス(ZIKV; Family FlaviviridaeFlavivirus属)は、2013-14年にブラジルに到着した蚊媒介性フラビウイルスであり、以後、アメリカ全土に広がった熱性疾患の大規模な発生に関連してます1 。さらに、ZIKVは、成人のギラン・バレー症候群や胎児や新生児の小頭症などの重篤な疾患の結果と関連している2 。西半球で急速に普及する前はZIKVについてほとんど知られていなかった。これには分子ツールの欠如が含まれており、したがって機構的研究が妨げられている。感染性cDNAクローンなどのウイルスのための分子ツールは、ワクチンおよび抗ウイルス治療の開発を容易にし、差別的ウイルス病原性、免疫応答およびウイルスの進化に関連するウイルス遺伝因子の評価を可能にする。

フラビウイルスの感染性クローンは、crのため細菌中で非常に不安定であることが知られているそれらのゲノムに存在する恒温性原核生物プロモーター3 。この問題を改善するためにいくつかのアプローチが用いられてきた。ゲノムを複数のプラスミド6に分割すること、低コピー数のベクター(細菌人工染色体を含む) 7,8およびウイルスゲノム9にイントロンを挿入することを含む、ウイルスゲノム9の上流にタンデムリピートの挿入を含む。 ZIKVについては、変更のない1つの全長システムが記載されている。しかし、このクローンは細胞培養およびマウスにおいて弱毒化されているようであった10 。他のグループは、イントロンをZIKVゲノムに組み込んで、インビトロで感染性ウイルス11の産生のために哺乳類細胞スプライシングされ得る細菌中の不安定な配列の破壊を可能にする 12 。さらに、感染性サブゲノム - アンプリコンと命名されたPCRベースのシステムは、ZIKV 13の原型MR766株を救済するために首尾よく使用されている。ここに記載されているアプローチは外来配列を必要とせず、以前は黄熱病6 、デング14,15および西ナイルウイルス16で成功裡に使用されている複数のプラスミドを使用することによって、不安定性の高い領域でゲノムを破壊する。さらに、ウイルスゲノム末端でのD型肝炎リボザイム配列の付加は、線状化部位の追加を必要とせずに本物の3 '末端の作製を容易にする。さらに、両方のプラスミドは、低コピー数ベクター(pACYC177、1細胞あたり約15コピー)で構築され、残留毒性を軽減する17 。回収されたウイルスは、哺乳動物および昆虫の両方から誘導された様々な細胞型を含む8細胞株におけるインビトロ増殖曲線における親ウイルスであり 、マウスにおいて同一の病原性プロファイルおよび蚊における感染、播種および感染率を示した18

本明細書では、感染性クローンプラスミドを増殖させ、インビトロで全長ウイルスRNA(ウイルスゲノム)を生成 、細胞培養で感染性ウイルスを回収する方法を記載するプロトコルを詳述する。まず、バクテリアにおけるプラスミドの増殖またはローリングサークル増幅(RCA)を用いた無細菌増幅について説明する。次に、2つのプラスミドがどのように消化され、続いて完全な長さのウイルスを生成するために一緒に連結されるかを示す。最後に、転写されたRNAの産生およびその後のVero細胞への電気穿孔、続いて回収されたウイルスの滴定( 図1 )について説明する。説明されたアプローチは迅速であり、fo1〜2週間で感染性ウイルス株を回収する。

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Protocol

感染性クローンプラスミドの形質転換および回収

  1. いくつかの改変を加えた市販の形質転換プロトコール( 例えば 、NEB 5分形質転換プロトコル)を用いて両方のプラスミド(別々に)を形質転換する。どちらのプラスミドもアンピシリン耐性をコードする遺伝子を含んでいるため、選択のためにアンピシリンまたはカルベニシリンを使用する。より安定であるので、カルベニシリンが好ましい。
    1. -80°Cの冷凍庫から細胞を取り出し(材料表を参照)、氷上で5〜10分間解凍する。 (LB-carb)と呼ばれるPrewarm lysogeny broth(LB)(10g / LのNaClおよび25μg/ mLのカルベニシリンを含む)プレートおよびカタボライト抑制を有するブロス(抗生物質を含まないSOC-細胞とともに)37℃。
    2. 1μLのプラスミドDNA中100μg〜10ngをコンピテント細胞50μLを含むチューブに加える;チューブを軽く叩いて軽く混ぜる。
    3. チューブを氷上で5分間インキュベートする。
    4. 42℃30秒間の熱ショックチューブ水浴中で。熱ショックの直後に2分間氷に戻す。
    5. 950μLの室温SOCを各チューブにピペットで分注し、ピペットで混合します。 100μLの細菌混合物をLB-炭プレート上に広げ、37℃で一晩インキュベートする(約12-14時間)。
  2. 12〜14時間のインキュベーション後に37℃のインキュベーターからプレートを取り除きます。コロニーを(約8〜9時間)増殖させ続けることができるように、プレートを室温の暗い引き出しに置きます。
  3. 5 mLのTerrificブロス(TB、25μg/ mLのカルベニシリンを含む、TB-carbと呼ばれる)を使用して、細菌シェーカー(およそ14〜16時間)中30℃で一晩各プラスミドについて5〜10個の小さなコロニーを増殖させます。
    注:小さなコロニーは、プラスミドが無傷であることを示す指標です。欠失、再編成または突然変異(本明細書では不安定性事象と呼ばれる)を含むプラスミドを有するコロニーは、より速く増殖し、したがってより大きくなる。したがって、プレート上で最小のコロニーを選択しようとする必要があります。存在する最大のコロニーを選択する。いくつかの中位のコロニーもまた完全性のために選択することができる。使用される温度が低いほど、細胞が繁殖する確率が低下する(OD 600が0.6-0.8を超える)。ほとんどの研究者が一晩成長するので、より多くの制御と過成長の可能性を減らすことができます。
  4. 液体培養物の濁度(約OD 600が0.6〜0.8)をチェックする。 4℃で濁ったチューブを置き、他のチューブを長く濁らせる。
    注:プラスミドの不安定性事象が発生する可能性があるため、バクテリアを推奨値を超えるOD 600値まで増殖させないでください。
  5. 市販のプラスミドミニプレップキット(材料表を参照)を用いてバクテリアからプラスミドDNAを抽出する。予め加熱した(加熱ブロック中70℃まで)溶出緩衝液15μLで溶出する。溶出緩衝液をカラム上で5分間インキュベートしてから遠心分離にかける。
    注:4℃でこのスターター培養物を少なくとも1mL保存してください。次のステップでさらに使用します。
  6. 培養中にプラスミドの不安定性事象が発生したかどうかを評価するために、回収したプラスミド10μLを消化する。
    注:pIをSalI / NheIで、p2をBamHI / HindIIIで37℃で1時間消化します。ゲル電気泳動による消化後の正しいバンドの存在を確認し( 図2a )、ステップ2に進みます。ローリングサークル増幅(RCA)によりプラスミドDNAを調製する場合、ミニプレップ溶出液の一部を鋳型として確保します。

ライゲーションのための十分なプラスミドDNAの調製

注:ライゲーションおよびその後のエレクトロポレーションには、maxiprepまたはRCAのいずれかを介して生成されなければならない十分な量のプラスミドDNAが必要です。マキシプレップは伝統的に使用されているアプローチですが、RCAはバクテリアを必要としないという利点を提供し、不安定な事象を引き起こす可能性のある細菌中のプラスミド誘発毒性の可能性を排除します。

  1. 前のセクションで正しい制限酵素消化パターンを示した各プラスミドについて、1LのTB-Carb(25μg/ mLカルベニシリン)ブロスに500μLのスターター培養液を加え、30℃で一晩振とうする(約14-16時間、およそ0.6〜0.8のOD 600 )。
    注:このOD 600値以上で培養液を増殖させないでください。これにより、プラスミド内で不安定な事象が生じる可能性がある。
  2. バクテリアを採取し、製造業者のプロトコールに従ってマキシプレップを行う(材料表参照)。
  • 手順1.6で保存したミニプレップを使用して、RCA手順について以下を実行します。
    1. 1μLのプラスミドDNAを50μLのサンプルバッファーを含むチューブに移す。
    2. 試料を95℃で3分間熱変性させ、使用するまで4℃でインキュベートする。
    3. 商業的増幅を準備するプレミックス( 材料表を参照)。氷上にセットしたチューブに50μLの反応バッファーと2μLの酵素ミックスを混合する。
      注意:増幅プレミックスは、使用準備が整うまで氷上に置かなければなりません。必要な数の増幅反応のための十分な試薬を組み合わせることにより、マスターミックスを調製することが便利である。未使用のプレミックスはすべて破棄する必要があります。
    4. 調製した増幅プレミックス50μLを変性サンプルに移す。
    5. 反応管を30℃で18時間インキュベートする。
    6. チューブを65℃で10分間インキュベートし、φ29DNAポリメラーゼを不活性化する。
    7. 使用準備が整うまで反応チューブを4°Cまたは-20°Cで保存する。
      注:この時点で、両方の方法で調製したプラスミドDNAを定量する必要があり(260 nmでの吸光度を使用)、ZIKVゲノムは完全にSangerで配列決定して、不安定な事象(欠失および再構成)
  • プライマー名シーケンス(5 '〜3')
    ZIKV PRVABC59 1。 AGTTGTTGATCTGTGTGAATCAGAC
    ZIKV Conserved 632For。 GCCCTATGCTGGATGAGG
    ZIKVは692Revを保存しました。 GGTTCCGTACACAACCCAAGTTG
    ZIKV保存1313Rev。 CTCCCTTTGCCAAAAAGTCCACA
    ZIKV保存された1201For。 CCAACACAAGGTGAAGCCTAC
    ZIKV保存された1663For。 GCAGACACCGGAACTCCACACT
    ZIKVは2008年に保存されました。 CAGATGGCGGTGGACATGC
    ZIKVは2350Revを保存しました。 GTGAGAACCAGGACATTCCTCC
    ZIKV保存された2605For。 TACAAGTACCATCCTGACTCCC
    ZIKVは3499Revを保存しました。 GCCTTATCTCCATTCCATACCA
    ZIKV保存3961Rev。 TTGCCAACCAGGCCAAAG
    ZIKV保存4132For。 CATTTGTCATGGCCCTGG
    ZIKVは4561Revを保存しました。 CTATTGGGTTCATGCCACAGAT
    ZIKV保存4665For。 GACCACAGATGGAGTGTACAGAGT
    ZIKV保存5189Rev。 AAGACAGTTAGCTGCTTCTTCTTCAG
    ZIKV保存5219用。 GAGAGTTCTTCCTGAAATAGTCCGTGA
    ZIKV保存された6086Rev。 CTTGCTTCAAGCCAGTGTGC
    ZIKVは6119のために保存されています。 GCCTCATAGCCTCGCTCTATCG
    ZIKV保存された6721Rev。 CCATTCCAAAGCCCATCTTCCC
    ZIKV保存6769For。 CCAGCCAGAATTGCATGTGTCC
    ZIKVは7209Revを保存しました。 ATCATTAGCAGCGGGACTCCAA
    ZIKV節約7343For。 GTTGTGGATGGAATAGTGGT
    ZIKV 8243用に保存されています。 TGCCCATACACCAGCACTATGA
    ZIKV PRVABC59 8893Rev。 TGCATTGCTACGAACCTTGTTG
    ZIKVは9133Forを保存しました。 AGCCCTTGGATTCTTGAACGAGGA
    ZIKV PRVABC59 9673Rev。 AACGCAATCATCTCCACTGACT
    ZIKVは9686用に保存されています。 GATGATAGGTTGCACATGCC
    ZIKVは10321Revを保存しました。 GTCCATGTACTTTTCTTCATCACCTAT
    ZIKV保存された10455For。 CAGGAGAAGCTGGGAAACC
    ZIKV保存された10621Rev。 CAGATTGAAGGGTGGGGAAGGTC

    表1:cDNAクローンを配列決定するためのプライマー。プラスミドは、記載されたプライマーを用いて完全に配列決定することができる。 「保存された」インディ(indi)としてマークされたプライマーそれらがZIKVのすべての遺伝子型を配列決定/増幅する可能性が高いことを示す。 「PRVABC59」と命名されたプライマーはこの株に特異的であるが、他のアジアの遺伝子型株および場合によっては他の遺伝子型についても機能し得る。

    インビトロで転写されたRNAの調製

    1. マキシプレップまたはRCA調製DNAの消化反応を設定する。
      1. p1消化のために、10x反応バッファー、3μLのApaLI、3μLのBamHI-HF、3μLのrSAPまたはCIP、および3.3μgのp1DNAを混合する。 100μLにddH 2 Oを加える。
      2. p2消化のために、10×反応バッファー、3μLのApaLI、3μLのEcoRI-HF、および13.3μgのp2 DNAを混合する。 100μLにddH 2 Oを加える。
      3. 37℃で1〜2時間インキュベートする。
      4. 市販のゲルとPCRクリーンアップキット(材料表を参照)を使用して精製する。加熱ブロック中で70℃に予熱した30μLの溶出緩衝液で溶出する(カラムを回転させる前に5分間)。
        注:後でゲルに1μLを流してください。
    2. ライゲーション反応を準備する。
      1. 10μLの10×T4 DNAライゲーション反応バッファー、3μLのT4 DNAリガーゼ(400U /μL)、29μLの精製したp1、および29μLの精製したp2を合わせる。 100μLにddH 2 Oを加える。
      2. 室温で2時間又は16℃で一晩インキュベートする。
      3. 市販のゲルとPCRクリーンアップキット(材料表を参照)を使用して精製する。加熱ブロック(スピンする前に5分間インキュベートカラム)中で70℃に予熱した溶出緩衝液10μLで溶出する。
        注:後でゲルに1μLを流してください。
    3. 消化されていないプラスミド、消化されたプラスミド、およびアガロースゲル上のライゲーションを実行する。連結産物は消化されたプラスミド単独よりも高い分子量バンド(約11kb)を有するべきであり、連結が成功したことを示している( 図2b )。
    4. T7 インビトロ転写反応をセットアップする。
      1. 2μLの2倍ARCA / NTPミックス、2μLのT7 RNAポリメラーゼミックス、および8μLの精製ライゲーション反応液を最終容量20μLに合わせて組み合わせます。
        注記:ミックスに含まれるARCAは、排他的に正しい方向に組み込まれたキャップアナログです。標準キャップ類縁体は、転写物の約50%のみが正しい向きでキャップを有することができる。
      2. 37℃で4時間インキュベートする。
      3. UV分光光度計でRNA濃度を測定する。必要に応じて、RNA転写物の長さを確認するために変性アガロースゲルを流す。

    4.エレクトロポレーションによる感染性ウイルスの救出

    1. 回収すべき構築物当たり1細胞のT182フラスコ(T150とT182との間の許容可能なもの、DMEM + 10%ウシ胎児血清(FBS)中で増殖させたもの)を調製する。モックトランスフェクションコントロールとして1 T182を含める。 Cellsは70〜80%のコンフルエンシーで使用する必要があります。
    2. 細胞が準備ができたら、37℃に加熱した水槽にDMEM + 15%FBS + 10 mM HEPESを12 mL /反応させます。
    3. 標準プロトコールを用いてトリプシン処理によって細胞を分離し、トリプシンを不活性化するために10%FBSを含む培地中の細胞を回収する; 4℃で5分間150 xgで細胞を遠心分離する。
    4. 細胞を1×リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、細胞を150 xgで5分間4℃でペレット化します。この手順を2回繰り返し、合計3回洗浄します。
    5. 200μLのRPMI 1640 + 10 mM HEPES(無菌)/サンプル数で細胞を再懸濁します。細胞懸濁液200μLを滅菌チューブに移す。細胞は〜0.5×10 7細胞/ mLでなければなりません。
    6. ステップ3.4で生成した20μLの水(偽陰性対照)または20μLのRNA(好ましくは5〜10μg)を細胞の各セットに加える。チューブをフリックして軽く混合し、チューブの内容物を2mmギャップのエレクトロポレーションキュベットに移す。
    7. electrを設定する0Vと950μF(約625V / cm、20msの時定数)のオメガ(抵抗値)を170V LVに変換します。使用可能な場合は、0または∞のいずれかの最低設定値に抵抗を設定します。
    8. 一度パルスし、ステップ4.2で温めたDMEM + 15%FBS + 10mM HEPES600μLを直ちに添加する。すべての細胞を除去するために、キュベットの内部を徹底的にすすぐ。 10mLの予熱した培地を含むT75組織培養フラスコに細胞を加える。キュベットに含まれているドロッパーを使用して、キュベットから追加のメディアを取り除きます。滅菌状態を維持するように注意してください。
    9. スワールフラスコを用いて培地と細胞を混合し、37℃のインキュベーターに入れます。
    10. 翌日に細胞生存率を確認し、50〜75%の細胞死が観察されるまで毎日行う。細胞死は、模擬電気穿孔対照と比較することによって観察される。
      注:ZIKV細胞変性効果(CPE)はVero細胞ではっきりしており、細胞を切り離して培養液中に浮遊させる。我々は持っています収穫に理想的であるとして8-10日の範囲を観察した。
    11. コニカルチューブで上清を回収し、4℃で10分間、> 3000 xgで細胞破片を除去するために遠心分離する。
    12. 清澄化した上清を新しいチューブに移し、20%FBS(100%ストック)の最終濃度で補充する。さらに、凍結している間(1Mの滅菌ストックから)のウイルス感染性を保存するための緩衝剤として最終濃度10mMの滅菌HEPESを添加する。
    13. ボルテックスでウイルスを混合し、アリコートをスクリューキャップのバイアルに入れます。将来の使用のために-80℃で保管してください。

    5.回収されたウイルスの滴定

    1. 滴定の前日に、適切な数のVero細胞の6または12ウェルプレートに播種する。
    2. 冷凍庫からウイルスを除去し、チューブまたは96ウェルプレート中のDMEM + 2%FBS中で連続的に10倍希釈する。
      注:回収されたクローンの期待される力価は、1×10 6〜5×10 7 PFU / mLです。
    3. 200 oを追加各希釈液400μLを12ウェルプレートまたは6ウェルプレートのウェルにそれぞれ2回ずつ加える。
    4. プレートを37℃のインキュベーターに置き、15分ごとに揺り動かし、合計で約1-1.5時間の吸着期間をおきます。
    5. ウイルス接種物を除去し、各ウェルに1mLの(12ウェル)または2mL(6ウェル)DMEM-Tragacanthオーバーレイを加える。
      注:ここでは、アガロース、寒天、メチルセルロースまたは他のオーバーレイ培地を使用することが可能です。
    6. 5日間37℃インキュベーターで細胞をインキュベートする。適切なプラーク形成の時間は、使用されるオーバーレイによって異なる。
    7. 細胞を固定するには、インキュベーターからプレートを取り出し、オーバーレイを静かに消毒剤に移す。
    8. 十分に20%エタノール/0.1%クリスタルバイオレット(CV)を各ウェルに加えて、混合して覆い、渦巻き状に混合する。
      注:他の多くの固定剤が存在し、ここで使用することができます。さらに、アガロースまたは寒天オーバレイを使用する場合、ニュートラルレッドと組み合わせて第2オーバーレイを使用して、固定せずにプラークを視覚化することができる。 20%エタノールは、以前の研究でエンベロープウイルスを不活性化するのに効果的である;エンベロープを持たないウイルスにはこの量を使用しないでください。
    9. プレートを室温で30〜60分間インキュベートする(クラスIIバイオセーフティーキャビネット内)。 CV(地方条例に従って)を捨て、プレートを水道水で洗う。
    10. プレートを乾燥させ、プラークを手動で数える。
      注記:参照番号20は、プラークアッセイを実施するためのさらなる参照として使用することができる。

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    Representative Results

    ここに記載されたプロトコルは、感染性クローン由来Zikaウイルスの回収を可能にする。非常に不安定な全長バージョン(データは示されていない)と比較して、2プラスミドの感染性クローンシステムを操作することは、慎重に行う場合には容易である。 2つの別個の断片の消化およびライゲーションの後、T7ポリメラーゼによるインビトロ転写を用いてキャップされたRNAを生成し次いでこれをVero細胞に電気穿孔する( 図1 )。正しいプラスミド配列は、ミニプレップ( 図2a )に続くプロキシとしての制限消化およびRCAまたはマキシプレップを用いた大規模DNA産生後のサンガー配列決定を用いてモニターすることができる。配列決定によるクローンの確認の後、感染性ウイルスの回収は消化、ライゲーション、 インビトロ転写および最後にエレクトロポレーションのみを必要とする。これらのステップは1日で実行できます。正しいダイジェストアガロースゲル電気泳動( 図2b )によってモニタリングすることができ、必要に応じてトラブルシューティングを行うことができます。

    図3に示すように、感染クローン由来のウイルスは、いくつかの細胞株においてin vitroで親分離株と同様のレベルに複製され、cDNAから回収されたウイルスが一次分離株と同様に複製することが示唆される。さらに、 Aedes aegypti蚊のマウスにおける生存率または感染率、播種率および感染率において、感染性クローン由来ウイルスと親分離株との間に有意差は観察されなかった( 図4 )。

    図1
    図1:2プラスミドcDNAクローンからのZIKVレスキューワークフロー。ZIKV株PRVABC59のゲノムを、pACYC177プラスミド骨格に2つの別個の断片でクローニングした。次いで、2つのプラスミドを消化し、T4DNAリガーゼで連結した。 インビトロ転写後、Vero細胞へのエレクトロポレーションにより、キャップされた感染性RNAが生成された。 (図21を参照)。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

    図2
    図2:cDNAクローンの消化およびライゲーションをモニターするためのゲル電気泳動。A )遺伝子安定性を評価するためのミニプレップ由来プラスミドの初期制限消化。 ( B )2プラスミドクローン系からの感染性ウイルスの回収中の消化およびライゲーション生成物の例。 href = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55857/55857fig2large.jpg" target = "_ blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

    図3
    図3:クローン由来ウイルスのインビトロ増殖速度。プラークアッセイによって、ヒト(SH-SY5Y、JarおよびNTERA2 cI.D1)、蚊(C6 / 36、Aag2)および非ヒト霊長類(Vero)細胞株に対する野生型PRVABC59および感染性クローン誘導ウイルスの増殖動態を評価した。 n = 3エラーバーは平均からの標準偏差を表す。 (図21を参照)。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

    55857fig4.jpg "/>
    図4:マウスおよび蚊におけるクローン由来ウイルスのin vivo特性。A )4週齢の雄および雌インターフェロンα、βおよびγ受容体ノックアウトAG129マウスに、1,000 PFUのPRVABC59または感染性クローン由来ウイルスを腹腔内接種し、生存期間(n = 11)を監視した。 Aedes aegyptiの蚊にZIKVを含む感染性の血粉を与え、14日後に解剖した。 ( B )プラークアッセイを使用して、感染性ウイルスの蚊体(感染)、脚(播種)または唾液分泌(感染)を評価した。速度は、試験された総蚊のパーセントとして提示される(図21参照)。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

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    Disclosures

    著者は何も開示することはない。

    Acknowledgments

    著者らは、クローン由来ウイルスの特徴づけを支援してくれたKristen Bullard-Feibelman、Milena Veselinovic、ClaudiaRückertに感謝したいと思います。この研究は、NIHのAI114675(BJG)およびAI067380(GDE)の下での国立アレルギーおよび感染症研究所の助成によって部分的に支持された。

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    NEB Stable CompetentE. coli New England BioLabs C3040H
    Carbenicillin, Disodium Salt various
    Zyppy Plasmid Miniprep Kit Zymo Research D4036
    ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit Zymo Research D4202
    SalI-HF New England BioLabs R3138S 20,000 units/ml
    NheI-HF New England BioLabs R3131S 20,000 units/ml
    ApaLI New England BioLabs R0507S 10,000 units/ml
    EcoRI-HF New England BioLabs R3101S 20,000 units/ml
    BamHI-HF New England BioLabs R3136S 20,000 units/ml
    HindIII-HF New England BioLabs R3104S 20,000 units/ml
    illustra TempliPhi 100 Amplification Kit GE Healthcare Life Sciences 25640010
    NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Macherey-Nagel 740609.5
    Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) New England BioLabs M0371S 1,000 units/ml
    Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) New England BioLabs M0290S 10,000 units/ml
    T4 DNA Ligase New England BioLabs M0202S 400,000units/mL
    HiScribe T7 ARCA mRNA Kit New England BioLabs E2065S
    Vero cells ATCC CCL-81
    ECM 630 High Throughput Electroporation System BTX 45-0423 Other machines are acceptable.
    LB Broth with agar (Miller) Sigma L3147 Can be homemade as well.
    Terrific Broth Sigma T0918 Can be homemade as well.
    Petri Dish Celltreat 229693
    Culture Tubes VWR International 60818-576
    T75 flasks Celltreat 229340
    T182 flasks Celltreat 229350
    1x PBS Corning 21-040-CV
    RPMI 1640 with L-glutamine Corning 10-040-CV
    DMEM with L-glutamine and 4.5 g/L glucose Corning 10-017-CV
    Fetal Bovine Serum (FBS) Atlas Biologicals FP-0500-A
    Tragacanth Powder MP Bio MP 104792
    Crystal Violet Amresco 0528-1006
    Ethanol Denatured VWR International BDH1156-1LP
    6 well plate Celltreat 229106
    12 well plate Celltreat 229111
    Sequencing Oligos IDT see table 1
    Qubit 3.0 ThermoFisher Qubit 3.0 other methods are acceptable.
    Qubit dsDNA BR Assay Kit ThermoFisher Q32850 other methods are acceptable.
    Qubit RNA HS Assay Kit ThermoFisher Q32852 other methods are acceptable.
    Class II Biosafety Cabinet Varies N/A This is necessary for live-virus work.

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    References

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