कल्चरल हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स में Synaptic पुटिका Endocytosis को मापने

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Neuroscience

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Summary

Synaptic पुटिका endocytosis pHluorin Synaptic पुटिका प्रोटीन और पुटिका के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ जुड़े के प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा पता चला है ।

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Villarreal, S., Lee, S. H., Wu, L. G. Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons. J. Vis. Exp. (127), e55862, doi:10.3791/55862 (2017).

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Abstract

endocytosis के दौरान, जुड़े synaptic बुलबुले तंत्रिका टर्मिनलों पर प्राप्त कर रहे हैं, पुटिका रीसाइक्लिंग के लिए अनुमति देता है और इस प्रकार दोहराव तंत्रिका गोलीबारी के दौरान synaptic संचरण के रखरखाव । रोग की स्थिति में बिगड़ा endocytosis synaptic शक्ति और मस्तिष्क कार्यों में कमी आती है । यहां, हम ंयूरॉन संस्कृति में स्तनधारी हिप्पोकैम्पस synapse में synaptic पुटिका endocytosis उपाय करने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों का वर्णन । हम एक synaptic vesicular झिल्ली प्रोटीन से इनकार करके synaptic पुटिका प्रोटीन endocytosis पर नजर रखी, synaptophysin और VAMP2/synaptobrevin, vesicular लुमेन के साथ, pHluorin के साथ, एक पीएच-संवेदी ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन है कि बढ़ जाती है अपने प्रतिदीप्ति तीव्रता के रूप में पीएच बढ़ जाती है । exocytosis के दौरान, vesicular लुमेन पीएच बढ़ जाती है, जबकि endocytosis vesicular लुमेन पीएच के दौरान पुन: acidified है. इस प्रकार, pHluorin प्रतिदीप्ति तीव्रता की वृद्धि फ्यूजन इंगित करता है, जबकि एक कमी बला synaptic पुटिका प्रोटीन की endocytosis इंगित करता है । endocytosis रिकॉर्ड करने के लिए pHluorin इमेजिंग विधि का उपयोग करने के अलावा, हम vesicular झिल्ली endocytosis से इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (EM) सहिजन peroxidase (एचआरपी) की माप बुलबुले द्वारा निगरानी । अंत में, हम उच्च पोटेशियम प्रेरित ध्रुवीकरण के बाद विभिन्न समय में तंत्रिका टर्मिनल झिल्ली गड्ढ़े के गठन पर नजर रखी । एचआरपी के समय पाठ्यक्रम और झिल्ली गड्ढे गठन endocytosis के समय पाठ्यक्रम को इंगित करता है ।

Introduction

न्यूरोट्रांसमीटर synaptic बुलबुले में संग्रहीत और exocytosis द्वारा जारी कर रहे हैं. synaptic पुटिका झिल्ली और प्रोटीन तो endocytosis द्वारा आंतरिक है, और exocytosis के अगले दौर में reused । synaptic बुलबुले के Endocytosis synaptic पुटिका पूल को बनाए रखने और प्लाज्मा झिल्ली से फैला हुआ बुलबुले को हटा के लिए महत्वपूर्ण है । पीएच के प्रति संवेदनशील ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन pHluorin, जो अंलीय परिस्थितियों में बुझती है और तटस्थ पीएच में बुझती है, को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है endocytosis समय पाठ्यक्रम में रहते है कोशिकाओं1,2,3। pHluorin प्रोटीन आमतौर पर synaptic पुटिका प्रोटीन के लुमेन पक्ष से जुड़ा हुआ है, जैसे synaptophysin या VAMP2/synaptobrevin । आराम में, pHluorin synaptic बुलबुले के ५.५ पीएच लुमेन में बुझती है । प्लाज्मा झिल्ली को पुटिका फ्यूजन extracellular समाधान के लिए vesicular लुमेन उजागर जहां पीएच ~ ७.३ है, pHluorin प्रतिदीप्ति में वृद्धि में जिसके परिणामस्वरूप । exocytosis के बाद, बढ़ी हुई प्रतिदीप्ति क्षय, synaptic पुटिका प्रोटीन के endocytosis के कारण पुटिका पुनः के बाद उन बरामद बुलबुले के भीतर अंलीकरण । हालांकि क्षय दोनों endocytosis और vesicular पुनः अंलीकरण को दर्शाता है, यह ज्यादातर endocytosis को दर्शाता है, क्योंकि पुनः अंलीकरण सबसे अधिक परिस्थितियों में endocytosis से तेज है1,4। पुनः अंलीकरण का समय लगातार 3-4 s या कम5,6है, जो आम तौर पर तेजी से 10 एस या अधिक पुटिका endocytosis4,5के लिए आवश्यक है । यदि प्रयोगों को पुनः अंलीकरण से endocytosis भेद करने की जरूरत है, एसिड शमन प्रयोग 4-Morpholineethanesulfonic एसिड (एमईएस) समाधान का उपयोग (25 मिमी) ५.५ के एक पीएच के साथ निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि क्या synaptic पुटिका प्रोटीन प्राप्त कर रहे हैं प्लाज्मा झिल्ली से endocytosis1,3,4के माध्यम से । इस प्रकार, pHluorin प्रतिदीप्ति तीव्रता वृद्धि exo के एक संतुलन को दर्शाता है-और endocytosis, और तंत्रिका उत्तेजना के बाद कमी विशेष रूप से endocytosis को दर्शाता है ।

pHluorin इमेजिंग न केवल endocytosis के समय पाठ्यक्रम को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह भी synaptic पुटिका पूल के आकार7,8, और पैदा की संभावना जारी और सहज रिलीज9। कई कारकों और प्रोटीन endocytosis को विनियमित करने में शामिल, जैसे कैल्शियम, घुलनशील NSF-अनुलग्नक प्रोटीन रिसेप्टर (जाल) प्रोटीन, मस्तिष्क व्युत्पंन neurotrophic फैक्टर (बीडीएनएफ), और calcineurin pHluorin इमेजिंग का उपयोग कर पहचान की गई है1 , 2 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16. इसके अलावा, न्यूरोट्रांसमीटर के रिलीज न केवल प्राथमिक ंयूरॉंस में पता लगाया जा सकता है लेकिन TIRFM17के साथ neuroblastoma कोशिकाओं में । हाल ही में, pHluorin वेरिएंट, dsRed, mOrange और pHTomato एक एकल synapse18,19में कई कारकों की एक साथ रिकॉर्डिंग की निगरानी के लिए विकसित किया गया । उदाहरण के लिए, pHTomato synaptophysin के साथ जुड़े हुए है और एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम संकेतक (GCaMP5K) के साथ प्रयोग किया जाता है presynaptic पुटिका संलयन और सीए2 + आमद postsynaptic डिब्बे में20पर नजर रखने के लिए । इसलिए, synaptic प्रोटीन से जुड़ी pHluorin endocytosis और exocytosis के बीच संबंधों का विश्लेषण करने के लिए एक उपयोगी तरीका प्रदान करता है ।

EM सामांय endocytosis अध्ययन, उच्च स्थानिक संकल्प है कि endocytosis के दौरान ultrastructural परिवर्तन से पता चलता है के कारण के लिए इस्तेमाल किया एक और तरीका है । दो सामान्य क्षेत्रों में21 न्यूरॉन कोशिकाओं और ट्रैक पुटिका प्रोटीन22के भीतर रोग परिवर्तन कल्पना करने की क्षमता है. विशेष रूप से, synaptic पुटिका के अवलोकन, झिल्ली वक्रता periactive क्षेत्र में clathrin द्वारा लेपित है, और endosomal संरचनाओं के साथ संभव है EM3,23,24,25 ,26,27,28. जबकि EM ऐसे निर्धारण प्रेरित विकृतियों के रूप में संभावित कलाकृतियों, शामिल है, कि endocytosis को प्रभावित कर सकते हैं, और डेटा विश्लेषण श्रम गहन है, संकल्प एक आकर्षक सेलुलर संरचना कल्पना अवसर प्रदान करता है । संभावित निर्धारण समस्याओं और उंहें लौकिक संकल्प में सीमा उच्च दबाव ठंड से दूर किया जा सकता है, endocytosis27के दौरान मौजूद नाजुक संरचनाओं को स्थिर करने के एक तेज और गैर रासायनिक विधि प्रदान करते हैं ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > नोट: निम्न प्रोटोकॉल का वर्णन करता है pHluorin इमेजिंग विधियों और em विधियों में cultureed हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स का उपयोग किया जाता है । pHluorin पर नज़र रखता है synaptic पुटिका प्रोटीन जीवित कोशिकाओं में और em का पता लगाता है synaptic पुटिका की और ultrastructural परिवर्तन.

< p class = "jove_content" > पशु देखभाल और प्रक्रिया का पालन NIH दिशानिर्देश और NIH पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किए गए थे ।

< p class = "jove_title" > 1. pHluorin इमेजिंग

  1. हिप्पोकैम्पस ंयूरॉन culture
    1. 4 मिमी हिप्पोकैंपस NaHCO 3 और 5 मिमी के संयोजन से HEPES बफर (एचबी) तैयार करने और 5 मीटर NaOH के साथ पीएच ७.३ के लिए समायोजित करें । neurobasal मध्यम, 2% B27, ०.५ मिमी एल-glutamine और 1% पेनिसिलिन-streptomycin मिश्रण द्वारा संस्कृति माध्यम बनाओ । इसके अतिरिक्त, 20% भ्रूण गोजातीय सीरम (एचबी/20% FBS) के साथ एचबी बफर का मिश्रण तैयार करें ।
      नोट: इस संवर्धन प्रोटोकॉल Sankaranarayanan पर आधारित है, एट अल. < सुप वर्ग = "xref" > 29 व वु , एट अल. < सुप वर्ग = "xref" > २४
    2. Decapitate माउस पिल्ले के बीच प्रसव दिन 0 को संस्कृति माध्यम में, और 4 में मस्तिष्क निकालने & #176; ग एचबी/20% FBS । hippocampi को बेनकाब करने के लिए brainstem और thalamus को हटा दें । टुकड़े बाहर hippocampi, brainstem और thalamus के हटाने के द्वारा इसे उजागर करने के बाद, और ताजा 4 & #176 के लिए स्थानांतरण; C HB/20% FBS.
      नोट: आमतौर पर, यील्ड के आसपास है 4 x 10 5 कोशिकाओं/एमएल एक पिल्ला के लिए (दो hippocampi) । चिमटी या कैंची का उपयोग कर पालन झिल्ली से साफ है, तो ताजा करने के लिए स्थानांतरण 4 & #176; ग एचबी/20% FBS । dentate गाइरस को अनरोल करें और subiculum को कैंची से काट कर अलग करें, फिर फ्रेश 4 & #176 पर ट्रांसफर करें; C एचबी/20% FBS.
    3. प्रत्येक हिप्पोकैंपस, अंत से अंत तक काटने के बारे में 10 स्लाइस में विभाजित है और एक 15 मिलीलीटर के लिए उंहें हस्तांतरण शंकु ट्यूब ।
    4. ऊतक बसने के लिए अनुमति देने के बाद, hb/20% FBS के 10 मिलीलीटर से धो लें, और फिर तीन बार एचबी के 10 मिलीलीटर के साथ धो लें ।
    5. १३७ मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, 7 मिमी Na2HPO 4 , और 25 मिमी HEPES के पाचन समाधान तैयार है, और 5 मीटर NaOH के साथ पीएच ७.२ के लिए समायोजित करें । supernatant को hippocampi से निकाल दें । trypsin के 10 मिलीग्राम और पाचन समाधान के 2 मिलीलीटर के लिए DNase के 1 मिलीग्राम जोड़ें, और एक बाँझ ०.२२ & #181 के माध्यम से फिल्टर, नमूना गोली पर सीधे एम झिल्ली.
    6. 5 मिनट के लिए hippocampi पर ३७ & #176; सी, फिर दो बार एचबी/20% FBS के 10 मिलीलीटर के साथ धोने, और फिर एक बार एचबी के 10 मिलीलीटर के साथ धो लो ।
    7. अलग के साथ कोशिकाओं को 6 मिलीग्राम MgSO 4 & #8729; 7H 2 ओ और 1 मिलीग्राम DNase के लिए 2 मिलीलीटर एचबी और बाँझ फिल्टर के माध्यम से hippocampi गोली पर एक बाँझ ०.२२ & #181; मी फिल्टर. धीरे से सावधान triturating द्वारा कोशिकाओं अलग, जबकि देखभाल करने के लिए हवा के बुलबुले शुरू से बचने के लिए ले । अनुमति ऊतक कण 2 मिनट के लिए व्यवस्थित करने के लिए, और फिर धीरे से एक और ट्यूब के लिए supernatant हस्तांतरण ।
    8. 3 मिलीलीटर एचबी/20% FBS सेल निलंबन, और केंद्रापसारक या 10 मिनट में 4 & #176; C और १,००० rpm पर जोड़ें । supernatant को त्यागें और संस्कृति माध्यम में पुनर्स्थगित करें.
    9. प्लेट ६०,००० कक्ष १५० में निलंबित & #181; एल संस्कृति माध्यम एक पाली-डी पर Lysine लेपित 25 मिमी व्यास coverslip, coverslip बंद बिखेर बिना । चढ़ाना के बाद पूर्व गर्म संस्कृति मध्यम 2 एच के 2 मिलीलीटर जोड़ें । Coverslips 6-well संवर्धन प्लेट्स या बाँझ पेट्री व्यंजन में बनाए रखे जाते हैं ।
    10. पर कोशिकाओं को बनाए रखने ३७ & #176; सी में एक 5% सह 2 humidified मशीन के लिए संस्कृति माध्यम में रिकॉर्डिंग करने से पहले 14-21 दिन । कल्चरल ग्रोथ के दौरान टॉप हाफ को हफ्ते में दो बार बदलें ।
  2. अभिकर्मक
    1. 6-7 दिनों के बाद चढ़ाना, transfect synaptophysin-pHluorin 2x (SpH) या VAMP2-pHluorin में हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स. SpH के लिए, एक Cytomegalovirus (सीएमवी) प्रवर्तक का उपयोग करें, एक pcDNA3 वेक्टर में डाला < सुप वर्ग = "xref" > 30 . VAMP2-pHluorin के लिए, एक pCI वेक्टर में संमिलित सीएमवी प्रवर्तक का उपयोग करें < सुप वर्ग = "xref" > 31 .
    2. Transfect लिपिड वाहक द्वारा या तो वेक्टर लक्ष्य कोशिकाओं में, का उपयोग कर 1 & #181; g of प्लाज्मिड. अभिकर्मक के लिए, जो सीरम का अभाव है प्रोटोकॉल कदम 1.1.1 से संस्कृति माध्यम का उपयोग करें । विषाक्तता को कम करने के लिए अभिकर्मक के बाद मध्यम 2 ज बदलें.
      नोट: बूटोंस में SpH की कम अभिव्यक्ति के मामले में, डीएनए एकाग्रता को बढ़ाने के लिए 2 & #181; g या लिपिड वाहक के साथ मशीन समय, जब तक कोशिकाओं अस्वस्थ हैं. सामान्यतया, 4-10 कक्ष (0.006-0.008%) न्यूरॉन्स की transfected.
    3. थे
  3. हल्का माइक्रोस्कोपी
    1. ११९ mM NaCl से बना सामान्य खारा घोल तैयार करें, 2 एमएम CaCl 2 , २.५ एमएम KCl, 25 एमएम HEPES (पीएच ७.४), 30 एमएम ग्लूकोज, 2 एमएम MgCl 2 , ०.०१ एमएम 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2, 3-दिोनों ( CNQX), और ०.०५ मिमी डीएल-2-एमिनो-5-phosphonovaleric एसिड (AP5) । संस्कृति मध्यम प्लेट और एक इमेजिंग चैंबर कि क्षेत्र उत्तेजना, स्नेहक और सीलेंट का उपयोग करने के लिए लीक से बचने की अनुमति देता है पर जगह से एक coverslip ले लो । प्लेट से एक coverslip के स्थानांतरण के दौरान गिलास को सुखाकर तुरंत जोड़कर चेम्बर को देने से बचें ७५० & #181; L साधारण खारा समाधान.
      नोट: CNQX और AP5 postsynaptic गतिविधि है, जो आवर्तक गतिविधि के लिए क्षमता है ब्लॉक करने के लिए इस्तेमाल किया गया । एक औंधा प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर एक कक्ष रखने से पहले, की पुष्टि करने के लिए कि चैंबर रिसाव नहीं करता है सफाई ऊतक का उपयोग करें । धीमी गति से रिसाव हो रहा है सामांय खारा और विसर्जन तेल, जो अपवर्तन सूचकांक में परिवर्तन में परिणाम के मिश्रण से रिकॉर्डिंग के दौरान ध्यान परिवर्तन का कारण बनता है ।
    2. उत्तेजना और रिकॉर्डिंग एक 60X (१.४ संख्यात्मक एपर्चर) एक धातु halide दीपक के साथ तेल विसर्जन लेंस के साथ एक औंधा widefield माइक्रोस्कोप पर
      1. छवि । ४८० एनएम, एक ४९० एनएम लंबे पास दर्पण, एक 500-550 एनएम उत्सर्जन फिल्टर, और एक मैनुअल फ्लिप शटर के एक उत्तेजना चोटी के लिए सेट एक फिल्टर के साथ pHluorin कल्पना करो । छवियों पर कब्जा हर १०० एमएस, के साथ 2 एक्स 2 बिन्नी, एक इलेक्ट्रॉन गुणा आरोप युग्मित डिवाइस (EMCCD) कैमरे का उपयोग.
        नोट: photobleaching से बचने के लिए उचित शर्तों को हासिल करने के लिए कई फीचर्स पर विचार किया जाना चाहिए, जिनमें इमेज कैप्चर इंटरवल और फिल्टर और बिन्नी शामिल हैं, जो उपकरणों पर निर्भर हैं । फोकल इमेजिंग के मामले में, लेजर शक्ति और जोखिम समय photobleaching से बचने के लिए विचार किया जाना चाहिए । सेटअप की रिकॉर्डिंग के बाद निर्धारित किया गया था कम 3 उत्तेजना के बिना मिनट और रिकॉर्डिंग के लिए प्रदर्शन किया गया था कम 10 उत्तेजना के बिना एस photobleaching के लिए जांच करने के लिए ।
      2. प्रत्येक प्रयोग में विश्लेषण में आसानी के लिए बूटोंस के एक उच्च घनत्व के साथ एक क्षेत्र का चयन करें । बूटोंस.
      3. के बीच bouton और सतत अभिव्यक्ति में गोल या अंडाकार अभिव्यक्ति पैटर्न पर जोर देने के साथ, उनके ग्रीन प्रतिदीप्ति संकेत द्वारा transfected कोशिकाओं की पहचान
      4. क्षेत्र उत्तेजना द्वारा endocytosis प्रेरित एक 1 एमएस पल्स, 20 एमए कार्रवाई संभावित (एपी) एक पल्स उत्तेजितकर्ता से आपूर्ति का उपयोग कर और उत्तेजना अलगाव इकाई के भीतर एक प्लेटिनम इलेक्ट्रोड के माध्यम से दिया । छवि उत्तेजना के पाठ्यक्रम पर प्रतिदीप्ति गतिविधि और सेल वसूली के दौरान ।
        नोट: मृत कोशिकाओं के मामले में, अभिव्यक्ति बूटोंस रहने से मजबूत था और बूटोंस.
      5. के बीच एक patched पैटर्न दिखाया
  4. इमेज एनालिसिस
    1. किसी एकल bouton में प्रतिदीप्ति तीव्रता का विश्लेषण करने के लिए, १.५ x १.५ & #181 के रूप में ब्याज का एक क्षेत्र (ROI) सेट करें; m वर्ग; एक bouton का आकार लगभग १.५ & #181 के भीतर है; m. उत्तेजना से पहले का प्रयोग करें photobleaching के लिए जांच करें और पृष्ठभूमि के रूप में घटाना ।
    2. मानकर प्रतिदीप्ति परिवर्तन (& #916; च) समीकरण के साथ: < img alt = "समीकरण" ऊंचाई = "11" src = "//cloudflare2.jove.com/files/ftp_upload/55862/55862eq1.jpg" चौड़ाई = "172"/>
      जहां f मैक्स और f 0 उत्तेजना के बाद अधिक से अधिक वृद्धि का उल्लेख और आधारभूत प्रतिदीप्ति, क्रमशः । pHluorin प्रतिदीप्ति की अधिकतम बिंदु के बाद पहली 4-10 एस के दौरान क्षय की दर के रूप में endocytosis दरों को मापने. समय लगातार प्राप्त करें (& #964;) endocytosis की फिटिंग द्वारा pHluorin प्रतिदीप्ति क्षय एक मोनो-घातीय समारोह के साथ आधारभूत करने के लिए पीक वृद्धि से.
< p class = "jove_title" > 2. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी

  1. एक पाली-डी-Lysine लेपित 6-अच्छी तरह से प्लेट ०.०१% बाँझ-फ़िल्टर किए गए पाली-डी-Lysine समाधान के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से 1 ज के लिए कमरे के तापमान पर, तो तीन बार धोने के साथ १.५ मिलीलीटर लागू करने के लिए तैयार निष्फल पानी । टुकड़े, संस्कृति, और बनाए रखने हिप्पोकैम्पस ंयूरॉंस कदम में के रूप में 1.1.1, 1.1.2, और 1.1.3, क्रमशः ।
  2. तैयार एक उच्च K + उत्तेजना समाधान के साथ एचआरपी के रूप में ३१.५ mM NaCl, 2 मिमी CaCl 2 , ९० मिमी KCl, 25 मिमी HEPES (पीएच ७.४), 30 मिमी ग्लूकोज, 2 मिमी MgCl 2 , ०.०१ मिमी CNQX, ०.०५ मिमी AP5, और 5 मिलीग्राम/एमएल एचआरपी, फिर 5 मीटर NaOH के साथ पीएच ७.४ के लिए समायोजित करें ।
    1. १.५ मिलीलीटर उच्च K के साथ हिप्पोकैम्पस ंयूरॉन संस्कृति को उत्तेजित + कमरे के तापमान पर उत्तेजना समाधान (कश्मीर के रूप में संदर्भित + ) के अलावा १.५ मिलीलीटर के लिए एक अच्छी तरह से ९० एस के लिए । आराम हालत में (आर के रूप में संदर्भित), ९० एस के लिए 5 मिलीग्राम/एमएल एचआरपी की एक ही एकाग्रता लागू होते हैं, लेकिन सामांय खारा समाधान के साथ । वसूली नमूने के लिए, कश्मीर + नमूना के साथ के रूप में उच्च k + उत्तेजना समाधान लागू होते हैं, तो तेजी से धोने और 10 मिनट के लिए सामान्य खारा और मशीन के साथ प्रतिस्थापित.
  3. निर्धारण और दाग
    1. तैयार ०.१ M ना cacodylate बफर का प्रयोग २१.४ g/L ना cacodylate पर pH ७.४. 4% glutaraldehyde के साथ कोशिकाओं को ठीक ०.१ मी ना cacodylate बफर के लिए कमरे के तापमान पर कम से 1 ज । धो 7 मिनट के लिए ०.१ मी न cacodylate बफर के साथ तीन बार प्रत्येक.
    2. तैयार Diaminobenzidine (ढाब) समाधान, ०.३% के साथ ढाब के ०.५ मिलीग्राम/एमएल के शामिल 2 o 2 में ddH 2 हे, और एक ०.२२ & #181; मी फिल्टर के साथ फिल्टर । Apply १.५ एमएल ढाब के लिए समाधान 30 मिनट पर ३७ & #176; C. धो के साथ तीन बार ०.१ M न cacodylate बफर के लिए 7 मिनट प्रत्येक.
      सावधानी: ढाब विषैला और संदिग्ध यलो है । कृपया दस्ताने और लैब कोट का उपयोग करें ।
      नोट: ढाब के साथ लेबलिंग एच 2 2 द्वारा अपने ऑक्सीकरण के कारण होता है, catalyzed के रूप में एचआरपी द्वारा । नमूने में एक बढ़ी हुई संकेत में घटक परिणाम में छोटे बढ़ाता है । एचआरपी की एकाग्रता बढ़ाने से उत्प्रेरक के प्रभाव को गति मिलती है । एच 2 2 के पर्याप्त बड़े सांद्रता एचआरपी के साथ दुर्बल पक्ष प्रतिक्रियाओं के लिए अनुमति देते हैं, लेबलिंग के प्रभाव में बाधा < सुप वर्ग = "xref" > ३२ . इस काम में, इस लेबलिंग सिस्टम की सांद्रता को वर्तमान में उपलब्ध शोध के आधार पर चुना गया < सुप class = "xref" > 33 , < सुप class = "xref" > 34 .
    3. के साथ न्यूरॉन्स १.५ मिलीलीटर की 1% OsO 4 में ०.१ M ना cacodylate बफर के लिए 1 ज पर 4 & #176; ग के रूप में पद निर्धारण के संबंध में । 7 मिनट के लिए ०.१ मीटर न cacodylate बफर के १.५ मिलीलीटर के साथ तीन बार धो.
      चेतावनी: विषाक्तता और OsO 4 की प्रतिक्रिया के कारण, एक रासायनिक डाकू में बर्फ पर नमूना रखते हुए कई मामलों में बेहतर है के लिए एक फ्रिज का उपयोग करने के लिए मशीन ।
    4. १३.६१ g/l सोडियम एसीटेट और ११.४३ मिलीलीटर/l हिमनदों एसिटिक एसिड के साथ ०.१ एम सोडियम एसीटेट बफर तैयार करें । 7 मिनट के लिए पीएच ५.० पर १.५ मिलीलीटर ०.१ एम एसीटेट बफर के साथ तीन बार धो प्रत्येक और १.५ एमएल के साथ मशीन 1% uranyl एसीटेट में ०.१ एम एसीटेट बफर पर 1 ज के लिए 4 & #176; C. धो 7 मिनट के लिए १.५ मिलीलीटर ०.१ एम एसीटेट बफर के साथ तीन बार प्रत्येक.
  4. Epoxy embedding
    1. निर्जलीकरण एक १.५ मिलीलीटर के साथ ंयूरॉन संस्कृति ५०%, ७०%, और ९०% इथेनॉल की बहाकर, प्रत्येक में 7 मिनट के लिए और फिर एक धुएं डाकू में 7 मिनट के लिए १.५ मिलीलीटर १००% इथेनॉल के 3 बहाकर ।
    2. मिश्रण ४८५ मिलीलीटर/L bisphenol-A-(epichlorhydrin) epoxy राल, १६० मिलीलीटर/l dodecenyl succinic एनहाइड्राइड (DDSA), ३४० ml/l मिथाइल-5-Norbornene-2, 3-Dicarboxylic एनहाइड्राइड (एनएमए), और 15 मिलीलीटर/l 2, 4, 6-tris (dimethylaminomethyl) phenol (DMP-30) epoxy बनाने के लिए राल. मिश्रण अच्छी तरह से, तो वैक्यूम के तहत स्टोर करने के लिए हवा के बुलबुले को दूर ।
      नोट: यह राल में हवा के बुलबुले को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से उन नग्न आंखों के लिए दिखाई से छोटे, क्योंकि वे अनुभागिंग के दौरान राल में गुहाओं का कारण बन सकता है.
    3. एक शेखर पर कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इथेनॉल में ५०% epoxy राल के साथ इथेनॉल की जगह से नमूना घुसपैठ, तो ७०% एक शेखर पर कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इथेनॉल में epoxy राल ।
    4. १००% epoxy राल के साथ epoxy राल समाधान स्विच और ५० & #176 पर 10 मिनट के लिए मशीन; c. 1 h के लिए ५० & #176 पर नए सिरे से १००% epoxy राल के दो आदान प्रदान प्रदर्शन; c. ताजा १००% epoxy राल जोड़ें और ५० & #176 पर कठोर करने की अनुमति; सी रात भर और फिर ६० & पर #17 6; सी के लिए ३६ से अधिक एच के लिए कठोर ।
  5. एक ज्वेलर के साथ muti-वेल प्लेट से प्रत्येक नमूने निकालें & #39; s handsaw. ब्याज के क्षेत्रों का चयन करें, कोशिकाओं के घने सांद्रता, एक औंधा प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग, और फिर microtome द्वारा खोदी के लिए ७० से ८० एनएम ब्लॉकों में कटौती । microtome चक में कट क्षेत्र माउंट और microtome लोड । microtome में चक स्थिति और ब्लॉक की सतह के समानांतर किनारे के साथ एक हीरे की चाकू माउंट । सीधे व्यक्तिगत ग्रिड पर ७० से ८० एनएम मोटाई के वर्गों को इकट्ठा ।
  6. पानी में वजन से एक 1% समाधान के लिए uranyl एसीटेट भंग, और अलग से वजन से एक 3% समाधान के लिए पानी में सीसा साइट्रेट भंग । Counterstain के साथ डुबकी द्वारा वर्गों 1% जलीय uranyl एसीटेट के लिए 15 मिनट और फिर 3% जलीय 5 मिनट के लिए साइट्रेट का नेतृत्व नमूनों के विपरीत में सुधार करने के लिए.
  7. EM इमेजिंग
    1. एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ वर्गों की जांच करें और एक सीसीडी डिजिटल कैमरा के साथ रिकॉर्ड छवियों 10000 की एक प्राथमिक आवर्धन पर-20, 000X 3 .
  8. सांख्यिकी
    1. नियंत्रण और प्रायोगिक नमूनों के बीच माप () के माध्य और मानक त्रुटि की तुलना करके महत्वपूर्ण अंतरों की पहचान करने के लिए t s.e.m.-परीक्षण निष्पादित करें ।

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Representative Results

लिपिड वाहक विधि का उपयोग, SpH हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स में व्यक्त किया गया था, बूटोंस की पहचान के लिए अनुमति देता है (चित्र 1a). exocytosis प्रेरित कोशिकाओं की विद्युत उत्तेजना, और प्रतिदीप्ति तीव्रता में एक इसी वृद्धि हुई है । उत्तेजना (चित्र 1b) को समाप्त करने से प्रतिदीप्ति (ΔF) में वृद्धि रोकी गई । endocytosis के कारण बढ़ी हुई प्रतिदीप्ति धीमी कमी के बाद हुई । VAMP2-pHluorin के मामले में, VAMP2 उत्तेजना के बाद एक bouton से axon के साथ फैलाना4. कच्चे डेटा मनमाने ढंग से इकाइयों का इस्तेमाल किया, और आधारभूत करने के लिए क्षय की दर और τ (चित्रा 2a-सी) प्राप्त करने के लिए सामान्यीकृत था । चूंकि माप एक सामान्यीकृत ट्रेस से किए गए थे, क्षय की दर पीक ΔF प्रति सेकंड (ΔF/s) के प्रतिशत में प्रतिदीप्ति के प्रारंभिक क्षय को दर्शाता है । हमारी प्रयोगात्मक स्थितियों में, endocytosis (आमतौर पर अब से 10 s) reacidification (~ 3-4 s)4,5से बहुत धीमी थी । इस प्रकार pHluorin का प्रतिदीप्ति क्षय मुख्यतः endocytosis,को दर्शाता है. presynaptic बूटोंस में, ΔF bouton को छोड़कर axon से बड़ा है और शुरुआत के समय की वृद्धि विद्युत उत्तेजना की दीक्षा के साथ मिलान किया गया था । bouton को छोड़कर axon में, ΔF बूटोंस और समय की शुरुआत के साथ क्षेत्रों की तुलना में कम था बिजली उत्तेजना (चित्रा बीसी) की दीक्षा की तुलना में देरी थी । bouton को छोड़कर bouton और axon में प्रेरित ΔF ८२.९ ± ९.०% (एन = 5 प्रयोग) और २३.२ ± ४.०% (एन = 5 प्रयोग), क्रमशः (चित्रा 2 बी) था । १७.७ ± ०.३ (n = 5 प्रयोगों) और २०.७ ± ०.२ (n = 4 प्रयोगों) में ५० एपी और २०० एपी, क्रमशः (चित्रा 1b) के एक τ के साथ SpH खोखली मोनो-तेजी से ΔF । २०० एपी में, τ से पहले या आधारभूत के साथ सामांय होने के बाद काफी अलग नहीं था । VAMP2-pHluorin transfected कोशिकाओं के मामले में, VAMP2-pHluorin का अभिव्यक्ति स्तर SpH (चित्रा 3-सी) से अधिक था । VAMP2-pHluorin के निशान भी आधारभूत (चित्र बी) को सामान्य करने के द्वारा प्राप्त किए गए थे.

उंहें प्रसंस्कृत ंयूरॉंस में प्रदर्शन किया और clathrin लेपित बुलबुले की तुलना में जांच की थी नियंत्रण के नमूने है, जो 5 मिलीग्राम/९० के लिए एचआरपी की प्रेरणा (चित्र 4a-b) के अभाव में एस के साथ मशीन थे । clathrin लेपित गड्ढ़े उत्तेजना के अभाव में bouton प्रति ०.०५ की संभावना पर मनाया गया । उच्च के साथ उत्तेजना+ प्रेरित थोक endosome और synaptic बुलबुले तेज है, जो एचआरपी लेबलिंग (चित्रा धारा 5) द्वारा की पहचान की गई । Synaptic बुलबुले एक व्यास से कम ५० एनएम के साथ बुलबुले के रूप में परिभाषित किया गया था और थोक endosomes ८० एनएम पर एक व्यास या एक ८० एनएम पुटिका से अधिक के पार अनुभागीय क्षेत्र के साथ होने के रूप में परिभाषित किया गया । सामान्य खारा (फिगर 5b) के साथ वसूली से प्रेरित थोक endosome को कम किया गया था ।

Figure 1
चित्रा 1: SpH transfected ंयूरॉंस की छवियां और SpH transfected सेल प्रतिक्रियाओं के निशान विद्युत उत्तेजना के लिए । () liposome वितरण द्वारा SpH के साथ कल्चरल हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स transfected की एक नमूना छवि. SpH अत्यधिक बूटोंस में व्यक्त की, axon साथ अपेक्षाकृत कम अभिव्यक्ति के साथ सर्कल या अंडाकार पैटर्न, पेश किया गया । सफेद बक्से रॉय युक्त बूटोंस (१.५ x १.५ µm) से संकेत मिलता है । स्केल बार: 20 µm. (b) SpH transfected कोशिकाओं की प्रतिक्रियाएं 20 हर्ट्ज (n = 5 प्रयोग) में ५० एपी की एक विद्युत उत्तेजना या 20 हर्ट्ज (एन = 4 प्रयोगों) पर २०० एपी. प्रत्येक प्रयोग 20-60 बूटोंस पर आधारित था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: endocytosis के लिए क्षय और ताऊ मान की दर । (a) उत्तर करने के लिए ५० एपी पर 20 हर्ट्ज मनमाने ढंग से इकाइयों से परिवर्तित किया गया सामान्यीकृत अंश (n = 5). प्रतिदीप्ति परिवर्तन आधारभूत करने के लिए सामान्यीकृत किया गया था । यह आंकड़ा वू एट अल, २०१६3से संशोधित किया गया है । () बूटोंस में 20 हर्ट्ज पर २०० एपी को सामान्यीकृत प्रतिक्रियाएं (काले, n = 4 प्रयोग, बाएं पैनल) और axon छोड़कर bouton (लाल, n = 4 प्रयोग, बाएं पैनल) । प्रतिदीप्ति परिवर्तन आधारभूत करने के लिए सामान्यीकृत किया गया था । धराशायी बॉक्स सही पैनल में बढ़ाया है । () सामान्यीकृत आधार रेखा का उपयोग करते हुए, क्षय या τ की दर ५० एपी (n = 5 प्रयोगों) और २०० एपी (n = 4 प्रयोगों) में 20 हर्ट्ज पर गणना की गई थी । गणना करने से पहले, ΔF १००% करने के लिए सामान्यीकृत था । endocytosis का τ अधिकतम प्रतिदीप्ति के समय और प्रयोग के अंत के बीच सामान्यीकृत ट्रेस से प्राप्त किया गया था । क्षय की दर (मतलब + s.e.m., ऊपरी पैनल) और τ (मतलब + s.e.m., लोअर पैनल) द्वारा प्रेरित ५० एपी और २०० एपी ।  कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: VAMP2-pHluorin transfected न्यूरॉन्स और अंश के उदाहरण की छवियाँ. () liposome प्रसव के द्वारा VAMP2-pHluorin के साथ कल्चरल हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स की एक नमूना छवि transfected. सफेद बक्से रॉय बूटोंस (१.५ x १.५ µm) युक्त संकेत मिलता है । स्केल बार: 20 µm. (b) 20 हर्ट्ज (n = 4 प्रयोग) पर २०० एपी को VAMP2-pHluorin प्रतिक्रियाओं के लिए निशान । प्रतिदीप्ति परिवर्तन आधारभूत करने के लिए सामान्यीकृत किया गया था । () चआधार (a.u.) (mean + s.e.m.) in VAMP2-pHluorin (n = 4 गडबड) and SpH (n = 7 गडबड) transfected बूटोंस. * *, प & #60; ०.०१. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: presynaptic टर्मिनल में उंहें की छवियां । (एक) Synaptic बुलबुले में दिखाया गया था हिप्पोकैम्पस ंयूरॉंस का उपयोग कर उंहें । यह आंकड़ा वू एट अल, २०१६3से संशोधित किया गया है । स्केल बार = २०० एनएम । () clathrin लेपित गड्ढ़े दिखा छवि बढ़ाया । स्केल बार: ५० एनएम । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: उच्च पोटेशियम के साथ उत्तेजित न्यूरॉन्स में presynaptic टर्मिनल की छवियाँ. (एक) उंहें ंयूरॉंस की छवियां । कोशिकाओं उत्तेजना के बिना तय किया गया (नि.), तुरंत ९० mM KCl के साथ उत्तेजना के बाद ९० एस युक्त घुलनशील एचआरपी (K+), या उत्तेजना के बाद और फिर सामांय खारा में 10 मिनट के लिए मशीन । यह आंकड़ा वू से संशोधित किया गया हैएट अल., २०१६3. स्केल बार = २०० एनएम । () नियंत्रण की तुलना में, एचआरपी (-) synaptic बुलबुले कम हो गए थे और एचआरपी (+) बुलबुले KCl द्वारा वृद्धि की गई । थोक endosome KCl द्वारा प्रेरित किया गया था और धीरे से वसूली की कमी हुई (मतलब + s.e.m., प्रत्येक समूह 40-100 synaptic प्रोफाइल से था) । * प & #60; ०.१; * * p & #60; ०.०१, आराम करने के लिए महत्वपूर्ण; # #p & #60; ०.०१, K करने के लिए महत्वपूर्ण है+. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

यहां हम synaptic पुटिका endocytosis की निगरानी के लिए दो तरीकों का प्रदर्शन । पहली विधि में, हम निगरानी pHluorin transfected ंयूरॉंस में एक synaptic पुटिका प्रोटीन के साथ जुड़े और बाद में विद्युत उत्तेजित । दूसरे, हम एचआरपी के रूप में KCl द्वारा प्रेरित EM इमेजिंग का इस्तेमाल किया । हम दो कारणों के लिए अलग उत्तेजनाओं का इस्तेमाल किया । सबसे पहले, उच्च पोटेशियम आवेदन संस्कृति में सभी न्यूरॉन्स के ध्रुवीकरण लाती है. यह है कि हमारे उंहें पद्धति गैर-उत्तेजित और उत्तेजित ंयूरॉंस के बीच अंतर नहीं कर सका दिया है कि उंहें परीक्षा की सुविधा । दूसरा, अल्ट्रा संरचनात्मक रूपात्मक परिवर्तन अधिक मज़बूती से उच्च पोटेशियम उत्तेजना के रूप में तीव्र उत्तेजना, के बाद मनाया गया, जबकि pHluorin प्रतिदीप्ति परिवर्तन कार्रवाई क्षमता या एक भी कार्रवाई की एक संक्षिप्त ट्रेन के बाद मनाया जा सकता है संभावित.

pHluorin का उपयोग कर प्रकाश माइक्रोस्कोपी इमेजिंग synaptic पुटिका प्रोटीन फ्यूजन और जीवित कोशिकाओं में उच्च लौकिक संकल्प के साथ तेज से पता चलता है । यह तंत्र है कि endocytosis समय पाठ्यक्रम और synaptic पुटिका पूल के आकार को विनियमित अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । pHluorin इमेजिंग न केवल synaptic प्रोटीन endocytosis निगरानी के लिए इस्तेमाल किया गया है, लेकिन यह भी पैदा की निगरानी या सहज एकल पुटिका जारी करने के लिए, अल्पकालिक synaptic प्लास्टिक, और जारी संभावना३५की माप के लिए । pHluorin का उपयोग कर पता चला है कि synaptic vesicular प्रोटीन पूल जारी किया जा रहा है उन के रूप में ही नहीं कर रहे है प्राप्त३६,३७। हाल ही में, synaptic प्रोटीन के साथ जुड़े pHluorin के भाग्य का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था नए बुलबुले३८जुड़े, और थोक endocytosis३९। इसलिए, pHluorin एक synaptic प्रोटीन के साथ जुड़े रहने synapses में अध्ययन exocytosis और endocytosis के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है ।

इस तकनीक की सीमा यह है कि प्रतिदीप्ति की तीव्रता का क्षय न केवल endosomes को दर्शाता है, बल्कि vesicular पुनः अंलीकरण भी है. इन दो घटकों संभवतः bafilomycin के साथ उपचार से अलग किया जा सकता है, वी के एक अवरोधक-ATPase10,४०। इसके अलावा, विद्युत उत्तेजना के दौरान प्रतिदीप्ति वृद्धि exocytosis और endocytosis के शुद्ध परिणाम को दर्शाता है । हालांकि pHluorin इमेजिंग झिल्ली invagination का पता नहीं लगा सका, इस सीमा को अंय तकनीकों से दूर किया जा सकता है, विशेष रूप से उंहें ।

उंहें में, दृढ़ता से उत्तेजित कोशिकाओं एचआरपी-सकारात्मक synaptic बुलबुले और थोक endosomes बढ़ दिखाया । इन थोक endosomes धीरे से फिर से गायब हो synaptic बुलबुले में फिर से पैदा24। यह तकनीक दोनों नियंत्रण और उत्तेजित कोशिकाओं में presynaptic टर्मिनल में ultrastructure खुलासा करके synaptic पुटिका से पता चलता है । इस तकनीक के लिए एक खामी का आकलन है synaptic पुटिका कोशिकाओं में रहने के बजाय स्थिर कोशिकाओं में । इसके अतिरिक्त, एक निर्धारण प्रेरित विरूपण साक्ष्य की संभावना को शामिल नहीं किया जा सकता । झिल्ली को प्रभावित करने वाले ज्ञात कलाकृतियों blebbing, झिल्ली कटाव, और प्रोटीन परिवर्तन४१शामिल हैं । एक कोशिका के स्वाभाविक रूप से होने वाली स्थिति से ये मतभेद कोशिकाओं visualizing के सभी तरीकों के लिए एक अंतर्निहित चिंता का विषय हैं, और विशेष रूप से ध्यान ऐसी कलाकृतियों की संभावना का आकलन करने के लिए प्रस्तुत डेटा के लिए भुगतान किया गया था४१,४२ ,४३. जबकि अकेले इस तकनीक synaptic प्रोटीन के कार्यात्मक endocytosis नहीं दिखा सकते हैं, यह प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन है, जो endocytosis प्रक्रिया के लाइव चित्र प्रदान कर सकते हैं, इस सेलुलर तंत्र का एक और पूरा दृश्य बनाता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम synaptophysin-pHluorin2x निर्माण प्रदान करने के लिए डॉ योंग लिंग झू धंयवाद, और डॉ जेंस ई. रोथमान प्रदान करने के लिए VAMP2-phluorin । हम उनकी तकनीकी सहायता और मदद के लिए डॉ Susan चेंग और वर्जीनिया NINDS इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी की सुविधा का धंयवाद । यह काम संयुक्त राज्य अमेरिका में मस्तिष्क संबंधी विकार और स्ट्रोक अंदर अनुसंधान कार्यक्रम के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था और KRIBB अनुसंधान पहल कार्यक्रम से अनुदान (कोरियाई जैव चिकित्सा वैज्ञानिक फैलोशिप कार्यक्रम), कोरिया के अनुसंधान संस्थान जैव विज्ञान और बायोटेक्नोलॉजी, रिपब्लिक ऑफ कोरिया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lipofectamine LTX with Plus Thermo Fisher 15338-100 Transfection of plasmid DNA including synaptophysin or VAMP2-pHluorin
neurobasal medium Thermo Fisher 21103-049 Growth medium for neuron, Warm up to 37°C before use
B27 Thermo Fisher 17504-044 Gradient for neuronal differentiation
Glutamax Thermo Fisher 35050-061 Gradient for neuronal culture
Poly-D-Lysine coated coverslip Neuvitro GG-25-pdl Substrate for neuronal growth and imaging of pHluorin
Trypsin XI from bovine pancrease Sigma T1005 Neuronal culture-digest hippocampal tissues
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma D5025 Neuronal culture-inhibits viscous cell suspension
pulse stimulator A-M systems model 2100 Apply electrical stimulation
Slotted bath with field stimulation Warner Instruments RC-21BRFS Apply electrical stimulation
stimulus isolation unit Warner Instruments SIU102 Apply electrical stimulation
lubricant Dow corning 111 pHluorin imaging-seal with coverslip and imaging chamber, avoid leak from chamber
AP5 Tocris 3693 Gradient for normal saline, selective NMDA receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity
CNQX Tocris 190 Gradient for normal saline, competitive AMPA/kainate receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity
Illuminator Nikon C-HGFI Metal halide light source for pHluorin
EMCCD camera Andor iXon3 pHluorin imaging, detect pHluorin fluorescence intensity
Inverted microscopy Nikon Ti-E Imaging for synaptophysin or VAMP2 pHluorin transfected cells
NIS-Elements AR Nikon NIS-Elements Advanced Research Software for imaging acquisition and analysis
Igor Pro WaveMetrics Igor pro Software for imaging analysis and data presentation
imaging chamber Warner Instruments RC21B pHluorin imaging, apply field stimulation on living cells
poly-l-lysine Sigma P4832 Electron microscopy, substrate for neuronal growth, apply on multiwell plate for 1 h at room temperature then wash with sterilized water 3 times
Horseradish peroxidase(HRP) Sigma P6782 Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by catalyzing DAB in presence hydrogen peroxide, final concentration is 5 mg/mL in normal saline, make fresh before use
Na cacodylate Electron Microscopy Sciences 12300 Electron microscopy, buffer for fixatives and washing, final concentration is 0.1 N
3,3′-Diaminobenzidine(DAB) Sigma D8001 Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles, substrate for HRP, final concentration is 0.5 mg/mL in DDW and filtered, make fresh before use
Hydrogen peroxide solution Sigma H1009 Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by inducing HRP-DAB reaction, final concentration is 0.3% in DDW, make fresh before use
glutaraldehyde Electron Microscopy Sciences 16365 Electron microscopy, fixatives, final concentration is 4% in Na-cacodylate buffer, make fresh before use, shake well before to use
TEM JEOL 200CX Electron microscopy, imaging of endocytosed vesicles and ultrastructural changes
CCD digital camera AMT XR-100 Electron microscopy, capturing images
Lead citrate Leica microsystems 16707235 Electron microscopy, grid staining

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