PIP-on-a-chip: En etikettfri studie av protein-fosfinositid-interaksjoner

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Her presenterer vi et støttet lipid-dobbeltlag i sammenheng med en mikrofluidisk plattform for å studere protein-fosfonositid-interaksjoner ved bruk av en etikettfri metode basert på pH-modulering.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Shengjuler, D., Sun, S., Cremer, P. S., Cameron, C. E. PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions. J. Vis. Exp. (125), e55869, doi:10.3791/55869 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Mange cellulære proteiner interagerer med membranoverflater for å påvirke viktige cellulære prosesser. Disse interaksjonene kan rettes mot en bestemt lipidkomponent i en membran, som i tilfelle fosforinositider (PIP), for å sikre spesifikk subcellulær lokalisering og / eller aktivering. PIP og cellulære PIP-bindende domener har blitt studert omfattende for å bedre forstå deres rolle i cellulær fysiologi. Vi brukte en pH-modulasjonsanalyse på støttede lipid-bilayers (SLB) som et verktøy for å studere protein-PIP-interaksjoner. I disse studiene brukes pH-følsom orto- Sulforhodamine B-konjugert fosfatidyletanolamin til å oppdage protein-PIP-interaksjoner. Ved binding av et protein til en PIP-holdig membranoverflate, blir grensepotensialet modulert ( dvs. forandring i lokal pH), skiftende protonasjonstilstanden til proben. En case-studie av den vellykkede bruken av pH-modulasjonsanalysen presenteres ved bruk av fosfolipase C delta1 Pleckstri Homologi (PLC-δ1 PH) domene og fosfatidylinositol 4,5-bisfosfat (PI (4,5) P-2) vekselvirkning som et eksempel. Den tilsynelatende dissosiasjonskonstanten ( K d, app ) for denne interaksjonen var 0,39 ± 0,05 uM, lik Kd, app- verdier oppnådd av andre. Som tidligere observert, PLC-δ1 PH domene er PI (4,5) P2 bestemt, viser svakere binding til fosfatidylinositol-4-fosfat, og ingen binding til rene fosfatidylcholin SLBs. PIP-on-a-chip-analysen er fordelaktig i forhold til tradisjonelle PIP-bindingsanalyser, inkludert men ikke begrenset til lavt prøvevolum og ingen krav til ligand / reseptormerking, evnen til å teste høy- og lavaffinitetsmembran-interaksjoner med både små og Store molekyler, og forbedret signal til støyforhold. Følgelig vil bruken av PIP-on-a-chip-tilnærmingen lette oppklaringen av mekanismer med et bredt spekter av membraninteraksjoner. Videre kan denne metoden potensielt være degSed i identifiserende terapi som modulerer proteinets evne til å interagere med membraner.

Introduction

Myriade interaksjoner og biokjemiske prosesser finner sted på todimensjonalt flytende membranoverflater. Membran-lukkede organeller i eukaryote celler er unike, ikke bare i biokjemiske prosesser og deres tilhørende proteom, men også i deres lipidsammensetning. En eksepsjonell klasse fosfolipider er fosfinositider (PIP). Selv om de bare utgjør 1% av det cellulære lipidomet, spiller de en avgjørende rolle i signaltransduksjon, autofag og membranhandel, blant annet 1 , 2 , 3 , 4 . Dynamisk fosforylering av inositolhovedgruppen med cellulære PIP-kinaser gir opphav til syv PIP-hodegrupper som er mono-, bis- eller tris-fosforylerte 5 . I tillegg definerer PIP den subcellulære identiteten til membraner og tjener som spesialiserte membrandokkingssteder for proteiner / enzymer som inneholder en eller flere fosforinosyrerItid-bindende domener, for eksempel Pleckstrin Homology (PH), Phox Homology (PX) og epsin N-terminal Homology (ENTH) 6 , 7 . En av de mest studerte PIP-bindende domener er fosfolipase C (PLC) -δ1 PH domene som spesifikt interagerer med fosfatidylinositol 4,5-bisfosfat (PI (4,5) P-2) innen et høy-nanomolar lavt mikromolområde affinitet 8 , 9 , 10 , 11 .

En rekke kvalitative og kvantitative in vitro- metoder har blitt utviklet og brukt til å studere mekanismen, termodynamikken og spesifisiteten av disse interaksjonene. Blant de mest brukte PIP-bindingsanalysene er overflateplasmonresonans (SPR), isotermisk kalorimetri (ITC), atommagnetisk resonans (NMR) spektroskopi, liposomflotasjon / sedimenteringsanalyse og lipidblots (Fat-blots / PIP-strips)12 , 13 . Selv om disse er mye brukt, har de alle mange ulemper. For eksempel krever SPR, ITC og NMR store mengder prøve, dyr instrumentering og / eller trent personell 12 , 13 . Noen analysemetoder som antistoffbaserte lipidblottene benytter vannløselige former av PIP og presenterer dem på en ikke-fysiologisk måte 12 , 14 , 15 , 16 . I tillegg kan lipidblots ikke kvantifiseres pålitelig, og de har ofte resultert i falske positive / negative observasjoner 12 , 17 , 18 . For å overvinne disse utfordringene og forbedre det nåværende verktøysettet ble det etablert en ny etikettfri metode basert på et støttet lipid-dobbeltlag (SLB) i sammenheng med am Mikrofluidisk plattform, som ble brukt til studier av protein-PIP-interaksjoner ( figur 1 ) 19 .

Strategien som brukes til å oppdage protein-PIP-interaksjoner, er basert på pH-moduleringsavkjenning. Dette innebærer et pH-følsomt fargestoff som har orto- sulforhodamin B ( o SRB) direkte konjugert til fosfatidyletanolamin lipid hode gruppe 20 . O SRB-POPE sonde (figur 2A) er meget fluorescerende ved lav pH, og reaksjonen stoppet ved høy pH med en pKa-verdi omkring 6,7 i løpet av 7,5 mol% PI (4,5) P-2 -holdige SLBs (figur 5B). PLC-δ1 PH domene har blitt brukt i stor utstrekning for å validere protein-PIP-bindende metoder på grunn av sin høye spesifisitet overfor PI (4,5) P2 (figur 5A) 21, 22,"> 23 , 24 , 25. Derfor redegjorde vi for at PLC-δ1 PH-domenet kan brukes til å teste dets binding til PI (4,5) P 2 gjennom PIP-on-a-chip-analysen. anvendt i denne studien har en netto positiv ladning (pl 8,4), og derved tiltrekker OH -. ioner (figur 5c) Ved binding til PI (4,5) P 2 -inneholdende SLBs, PH domene bringer de OH - ioner til membranoverflaten, hvilket i sin tur modulerer grenseflatepotensialet og forskyver protonering tilstand av o SRB-POPE (figur 5C) 26. som en funksjon av pH-domenet konsentrasjon blir fluorescens stanset (figur 6A). til slutt, er den normaliserte data passer til et bindende isotermen for å bestemme affiniteten av PH domene-PI (4,5) P2 interaksjon (figur 6B, 6C). '/ P>

I denne studien er det gitt en detaljert protokoll for å utføre proteinbinding til PIP-holdige SLB i en mikrofluidisk plattform. Denne protokollen tar leseren fra å samle den mikrofluidiske enheten og vesikelpreparatet til SLB-dannelse og proteinbinding. I tillegg til retninger for dataanalyse trekke ut informasjon affinitet for PLC-δ1 PH domene-PI (4,5) P2 interaksjon er gitt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Rengjøring av glassdeksler

  1. Fortynn 7x Rengjøringsløsning (se Materialebord ) 7 ganger med deionisert vann i en 100 mm dyp borosilikat glassfat med en flat bunn og varm den opp til 95 ° C på en varmepanne i 20 minutter eller til den overskyede løsningen blir klar .
    MERK: Løsningen blir varm, vær forsiktig for å unngå kroppsskader. 7x-rengjøringsløsningen er en proprietær blanding av heksasodium [oksydo- [oksido (fosfonatooksy) fosforyl] oksyfosforyl] fosfat, 2- (2-butoksyetoksy) etanol, natrium 1,4-bis (2-etylheksoksy) -1,4-dioksobutan -2-sulfonat og ikke-farlige tilsetninger.
  2. Ved hjelp av pincett, ordne dekselplatene (40 mm lengde x 22 mm bredde x 0,16-0,19 mm høyde) på et aluminiumfargestativ i vekslende retninger. Hold et tomt sted mellom hver deksel for å hindre at de berører hverandre.
  3. Fyll helt på fargestativet med dekslene i rengjøringsløsningen. Hold dekslene iLøsningen i 1 time.
    MERK: Når vannet fordamper, fortsett å legge til fersk deionisert vann for å holde løsningen konsentrasjon uendret.
  4. Ta fargestativene ut av rengjøringsløsningen og vask dekselet med store mengder avionisert vann for å fjerne vaskemiddelet.
  5. Tørk dekselglassene med nitrogengass (ca. 5 minutter per fargestativ), og legg deretter dekselplatene i en ovn i 6 timer ved 550 ° C for utglødning.
    MERK: Dette er et avgjørende skritt som glatter ut ujevnheter på glassoverflaten.
  6. Legg dekselplatene i en plastbeholder og hold dem vekk fra støv.

2. Fremstilling av mikropatternerte PDMS-blokker

  1. Bland polydimetylsiloksan (PDMS) prepolymer og herdemiddelet i forholdet 10: 1 (vekt / vekt) i en stor plastvektbåt og avgass den i vakuum i 1 time med vakuumstyrke ved 500 Torr eller mindre.
    MERK: PDMS er en gjennomsiktig og inert silikonpolymer. For å få ønsket PDMS blokk tHickness (0,5 cm), bland 55 g av prepolymeren med 5,5 g herdemiddelet.
  2. Plasser silisiummasteren som inneholder flere replikater av samme SU-8 mikropattern i en stor (10 cm bunndiameter) plastvektbåt og hell i den avgassede PDMS. Deretter herdes det i en tørr ovn ved 60 ° C over natten.
    MERK: Mikropatterner er store nok til å bli sett med det blotte øye. Hvert mønster inneholder 8 mikrokanaler (100 μm bredde x 40 μm høyde x 1 cm lengde) med mellomrom på 40 μm ( Figur 1A , 1B ). Silisiumskiveform bestående av hardbakt SU-8 fotoresist ble fremstilt i et nanofabrikasjonsanlegg 27 . Andre tilnærminger for masterpreparasjon inkluderer flussyre (HF) etsing, høytemperatur-vann-etsing, xurografi og 3D-utskrift 28 , 29 , 30 , 31 . commercIal kilder for silisium master forberedelse kan også brukes. Mønstrene for den mikrofluidiske enheten ble utformet med en utkastingsprogramvare (se tabell over materialer). Den originale filen som inneholder mønsterdesignet er gitt som en tilleggsfil "Pattern Design.dwg", som kan leveres direkte til produsenten.
  3. Skyll forsiktig PDMS fra silikonmesteren med hender. Merk grensene til hver mikropattern i rektangler ved hjelp av en kirurgisk skalpell og en linjal. Deretter kutte PDMS i blokker.
  4. Punch 16 hull (8 innløp og 8 uttak per blokk) i begge ender av hver mikrokanal med en biopsi-punch (1,0 mm hulldiameter) som angitt i figur 3B .
  5. Påfør tape over hver PDMS-blokk for å beskytte mikropatternene mot skade og støv. Oppbevar dem i en plastbeholder.

3. Forberedelse av små unilamellære vesikler (SUVer)

MERK: Negativ kontroll dobbeltlags sammensetninger 99,5 mol% 1-palmitoyl-2-oleoyl- sn-glycero-3-fosfocholin (POPC) og 0,5 mol% orto- Sulforhodamin B-1-palmitoyl-2-oleoyl- sn-glycero-3-fosfoetanolamin (o SRB- PAVE). Test tolagsblanding er 92,0 mol% POPC, 0,5 mol% o SRB-POPE og 7,5 mol% av enten L-a-fosfatidylinositol-4-fosfat (PI4P) eller L-a-fosfatidylinositol-4,5-bisfosfat (PI 4,5) P2). Nedenfor er fremgangsmåten for fremstilling av 92,0 mol% POPC, 0,5 mol% o SRB-POPE, og 7,5 mol% PI (4,5) P 2 -holdige SUVer. Syntesen av o SRB-POPE anvendt i denne studien ble tidligere beskrevet 20 .

  1. Beregn volumet POPC, PI (4,5) P 2 og o SRB-POPE som må blandes, som står for følgende totale mengder: 2,22 mg POPC, 0,26 mg PI (4,5) P 2 , Og 2,1 x 10 -5 mg o SRB-POPE.
  2. Pipett det beregnede volumet POPC, PI (4,5) P 2 , <Em> o SRB-POPE i en enkelt 20 ml glassscintillasjonsflaske.
    MERK: POPC og o SRB-POPE stamløsninger kommer i en kloroformløsning, mens PI (4,5) P 2 (og andre fosfoinositider) aksjer kommer i en kloroform: metanol: vann (20: 9: 1) løsningsmiddelblanding. For nøyaktighet, våt pipettespissen med kloroform før du bruker den. For sikkerhets skyld bør dette trinnet foregå inne i en kjemisk avtrekksdeksel.
  3. Tørk blandingen i en strøm av nitrogengass inne i en kjemisk avtrekksdeksel i 10 minutter eller til løsningsmidlet fordamper og en tynn lipidfilm dannes nederst på hetteglasset.
  4. Tørk blandingen under vakuum i> 3 timer ved en vakuumstyrke på 10 mTorr for å fjerne eventuelt resterende organisk løsningsmiddel.
    MERK: Den 3 timers tørkingstid er tilstrekkelig for omfanget av SUV-preparatet beskrevet i denne protokollen, som er tilstrekkelig for 50 eksperimenter. Hvis en større skala av SUV-preparat er påkrevd, kan over natten uttørking utføres.
  5. Rehydrer drHver lipidfilm med 5 ml løpebuffer (20 mM HEPES, 100 mM NaCl, ved pH 7,0) og plasser den i et ultralydbad ved en driftsfrekvens på 35 kHz i 30 minutter ved RT.
    MERK: Blanding av lipidene spesifisert i trinn 3.1 og tilsetning av 5 ml løpebuffer i trinn 3.5 gir en vesikelsuspensjon ved 0,5 mg / ml. På dette stadiet er vesikelsuspensjonen en blanding av unilamellære og multilamellære vesikler ( figur 2B ). Løsningen vil vises rosa / lilla i farge og relativt uklar.
  6. Frys-tin vesikelsuspensjonen med flytende nitrogen og vannbad ved 40 ° C for å få unilamellære vesikler. Gjenta frys-tining 10 ganger.
    MERK: (Valgfritt) For å sikre fravær av ikke-unilamellære vesikler i suspensjonen, kan sentrifugeringstrinnet påføres 32 , 33 .
  7. Ekstruder vesikelsuspensjonen gjennom en 0,10 μm spor-etset polykarbonatmembran ved hjelp av en lipidekstruder (seBord av materialer) for å berike for SUVer. Gjenta ekstruderingen 10 ganger.
    MERK: Et 15 ml konisk rør kan brukes til å samle de ekstruderte vesiklene. Løsningen bør være tom for uklarhet på dette stadiet. SUV-diameteren kan bekreftes via dynamisk lysspredning (DLS) ( figur 2C ). SUVer er best egnet for å danne SLB 34 .
  8. Dekk konisk rør med aluminiumsfolie og lagre ved 4 ° C til bruksklar.

4. Montering av mikrofluidisk enhet

  1. Test innløpene og utløpene til PDMS-blokken for blokkering ved å sprøyte deionisert vann gjennom hullene ved hjelp av en vaskemiddelflaske. Deretter tørk PDMS-blokken med nitrogengass.
    MERK: Dette trinnet fjerner også støvpartikler som kan ha blitt fanget i og / eller mellom kanaler. Hvis det er nødvendig, må du fjerne deksler med nitrogengass for å fjerne støvpartikler.
  2. Plasser PDMS-blokken og den forrensededekkglass (se avsnitt 1) på innsiden av oksygenplasma systemet (se tabell material) prøvekammeret for å eksponere med oksygenplasma i 45 s med effektinnstilling på 75 watt, oksygenstrømningshastigheten ved 10 cm3 / min, og vakuumfasthet ved 200 mTorr .
  3. Plasser den mønstrede overflaten av PDMS-blokken i kontakt med dekslet umiddelbart efter oksygenplasma-behandlingen. Trykk forsiktig for å fjerne eventuelle luftbobler på kontaktsteder.
  4. Plasser enheten på en varmepotteplate ved 100 ° C i 3 minutter for å forbedre bindingen.
  5. Bruk en våt, luddfri tørke ( f.eks. Kimwipe) med 100% etanol for å fjerne støvpartikler fra toppen (PDMS) og bunnen (glasset) på enheten. Deretter må du tape enheten på toppen av et glassmikroskop.
    MERK: Ikke bruk for mye etanol og unngå at etanol kommer inn i innløps- og utløpskanaler. Utfør dette trinnet mens enheten fortsatt er varmt, anbefales for å sikre at etanolen fordampes umiddelbart. Glass mikrOscopy lysbilder kan lagres i 100% etanol løsning for å fjerne støv og andre forurensninger.

5. Forming av støttede lipidbilayers (SLBs)

  1. Overfør 100 μl PI (4,5) P 2 -holdige SUVer fra trinn 3.8 i et 0,65 ml mikrocentrifugerør. Tilpas pH i løsningen til ~ 3,2 ved å tilsette 6,4 μL 0,2 N saltsyre.
    MERK: Bekreft pH i løsningen med en pH-meter utstyrt med en mikro-pH-sonde (se tabell over materialer).
  2. Pipetter 10 μl av den pH-justerte SUV-løsningen i hver kanal gjennom innløpet og påfør trykk gjennom pipetten til løsningen når utløpet. Ta av spissen fra pipetten og la den være festet til enheten.
  3. Gjenta trinnene ovenfor for hver kanal og inkuber deretter enheten i 10 minutter ved RT.
    MERK: Injeksjon av vesikler i mikrokanaler skal utføres umiddelbart etter enhetens montering.
  4. Klipp sett med innløps- og utløpsrør ea60 cm (innløpsrør) og 8 cm (utløpsrør) lang, henholdsvis.
    MERK: Ved å kutte slangen diagonalt og skape en skarp kant, blir det lettere å sette slangen inn i innløpene og uttakene. Utløpsslangen skal ha en bueform. Lengden på innløpsrøret kan variere basert på mikroskopoppsettet. Den indre diameteren av røret er 0,05 cm.
  5. Ved hjelp av pincett, koble utløpsrøret settet til enheten, og fest deretter enheten til et mikroskop-trinn.
  6. Dyp den ene enden av innløpsrøret som er satt i 25 ml løpebuffer inneholdt i et konisk rør og fest det for å sikre at slangen er festet.
  7. Plasser konisk rør på en høyere bakke (~ 20 cm) enn enheten for å presse løsningen gjennom mikrokanaler via tyngdekraftstrømmen; En lab jack kan brukes til å oppnå dette.
  8. For hvert innløpsrør, bruk en sprøyte for å tegne 1 ml løpebuffer fra den frie enden av slangen. Fjern pipettespissen fra innløpet og sett innFri ende av innløpsrøret inn i enheten.
    MERK: Sett inn en dråpe med løpebuffer på innløpet for å redusere sannsynligheten for at en luftboble blir introdusert i kanalen under dette trinnet. Etter at innløpsrøret er festet til enheten, bruk en luddfri tørke for å fjerne overflødig buffer.
  9. Gjenta ovennevnte trinn for å koble alle innløpsrørstykkene til enheten.
    MERK: Flytende løpebuffer gjennom kanalene bidrar til å fjerne overskytende vesikler og balansere bilaget til eksperimentelle forhold.
  10. Åpne mikroskopkontrollprogramvaren (se tabell over materialer). På venstre panel klikker du på "Mikroskop" -fanen og velger "10X" -målet.
  11. Klikk på "Live" og deretter "Alexa 568" bildeikoner på verktøylinjen. Ved hjelp av fin- og kursjusteringsknappene fokuserer du på mikrokanaler.
  12. Skann gjennom enheten for å kontrollere kvaliteten på SLBene og kanalene ( Figur 8 ). Deretter,Klikk på "FL Shutter Closed" bildeikonet på verktøylinjen.
  13. Klikk på "Oppkjøp" -fanen, og under "Grunnleggende justeringer" velg "Eksponeringstid". Still eksponeringstiden til "200 ms".
  14. På venstre panel klikker du på "Flerdimensjonal oppkjøp" og under filtermenyen velger du den røde kanalen (merket som "Alexa 568"). Deretter klikker du på "tidsavbrudd" -menyen, angi tidsintervallet til 5 minutter, varighet til 30 minutter, og klikk på "Start".
    MERK: På basis av varigheten (30 min) og strømningshastigheten (~ 1,0 μL / min) brukes 30 μL løpebuffer til å balansere SLB i en kanal, dvs. 240 μl løpebuffer brukes til alle 8 kanaler.
  15. Velg "Sirkel" -verktøyet under "Mål" -fanen og trekk en sirkel i en hvilken som helst kanal. Høyreklikk mens sirkelen er valgt og velg "Egenskaper". Under "Profil" -fanen, sjekk "all T" for å viseFluorescensintensitet som en funksjon av tiden.
    1. Pass på at denne kurven når et platå, som indikerer likevekt, før du fortsetter til neste trinn.
  16. Senk bufferoppløsningen til like bakken som enheten for å stoppe strømmen.
  17. Lagre tidsavbruddsfilen.

6. Testing PLC-δ1 PH domene interaksjon med PI (4,5) P 2 -holdige SLBs

  1. Forbered fortynninger av PH-domenet ved hjelp av løpebufferen som fortynningsmiddel.
    MERK: Siden det er åtte kanaler i enheten, bruker minst to av dem for tomme kontroller. Velg de ytre endene på hver side og bruk de resterende kanalene for proteinfortynninger. De følgende PH-domene-konsentrasjoner ble testet: 0,10, 0,25, 0,50, 1,00 og 2,50 μM. Omtrent 200 μl av hver fortynning var tilstrekkelig til å oppnå likevekt innen 30 minutter.
  2. En om gangen, løsne hvert utløpsrør og påfør 200 μl av hver proteinfortynning iUtløpskanalen bruker en pipette. Ikke bruk noe trykk, la tyngdekraften gjøre arbeidet. Ta av spissen fra pipetten og la den festes til mikrofluid-enheten.
  3. Gjenta trinnene ovenfor for hver kanal og sørg for at luftbobler ikke blir introdusert i kanalene under denne prosessen.
  4. Senk innløpsrøret til en bakke under den mikrofluidiske enheten for å begynne å strømme proteinet gjennom mikrokanaler. Tape den frie enden av slangen til en søppelbeholder. Vann proteinfortynningene i 30 minutter.
    MERK: Dette vil reversere strømmen og la proteinet bli introdusert i kanalene. Tiden til ekvilibrering og volumet av proteinfortynninger som trengs, vil være avhengig av samspillets affinitet.
  5. På venstre panel av programvaren, under "Time Lapse" -fanen, klikk på "Start" for å starte avbildning igjen.
  6. Gjenta trinn 5.15 for å sikre at likevekt nås. Når eksperimentet er fullført, lagre tidsperiodenfil.

7. Vurdering av membranfluiditet

MERK: Fluorescensåtervinning Etter Photobleaching (FRAP) bør eksperimenter utføres med hver ny serie SUVer og rensede glassdeksler for å sikre at SLBene er flytende.

  1. Følg prosedyren for rengjøring av glassdeksler (1.1-1.6), fremstilling av mikropatternte PDMS-blokker (2.1-2.5), forberede SUVer (3.1-3.8), montering av mikrofluidisk enhet (4.1-4.5) og dannelse av SLBs (5.1-5.17) som tidligere rives.
  2. Fokus mikroskopet på bilaget, sett eksponeringstiden til 200 ms, og bunke til 1.
  3. Foto-blek et sirkulært sted ved hjelp av en 532 nm, 2 mW laserstråle (13 μM radius). Umiddelbart etter photobleaching, begynner å ta en serie bilder hver 3. s for de første 45 s, etterfulgt av et 30 s intervall for resten av tiden (15 min total varighet). Når datainnsamlingen er fullført, lagrer du tidsforløpingsfilen.
  4. Velg den blekte aRea bruker sirkel tegneverktøyet til å trekke ut fluorescensintensitetsverdier som en funksjon av tiden. I tillegg velger du to flere områder i nærheten, en som svarer til en ubleget region og en som tilsvarer en region uten SLB.
  5. Beregn fluorescensutvinningen ( y ) ved å bruke følgende ligning:
    ligningen
    MERK: Her F t representerer intensiteten av det blekede område som en funksjon av tid, Fj representerer fluorescensintensitet før bleking (bruk "1" som en normalisert verdi i dette tilfellet); F 0 er bakgrunnsintensiteten.
  6. Plot fluorescensgjenoppretting (y-akse) som en funksjon av tid (x-akse) for å generere en FRAP-kurve. Deretter passer dataene til en enkelt eksponensiell funksjon som følger,
    ligningen
    MERK: Her representerer A den mobile fraksjonen og t 1/2 ):
    ligningen
  7. Bruk t 1/2 til å beregne diffusjonskonstanten ( D ):
    ligningen
    MERK: Her representerer R laserstrålenes radius (13 μm). Diffusjonskonstanten for et flytende dobbeltlag skal være ≥1,0 ​​μm 2 / s.

8. Behandlingsdata

MERK: Rutinen for dataanalysen vil være avhengig av mikroskop, bildebehandlingsprogramvare og kurvepassende programvare som brukes.

  1. Åpne tidsavbruddsfilene fra før (fra trinn 5.17) og etter (fra trinn 6.6) titrerer PH-domenet. Gå til siste ramme av hver gang lapse fil og gjør en linje skanning over alle mikrokanaler for å få fluorescensEnce intensitetsdata som en funksjon av avstanden i piksler ( figur 6A ). Overfør dataene til en regnearkprogramvare.
  2. For hver mikrokanal (før og etter PH-domene tillegg), prøv noen data i kanalen og hver side av kanalen som representerer grunnlinjen ( Figur 7A ).
    MERK: Fluorescensintensiteten i tomkanalen skal ha vært uendret. Alle de andre kanalene er normalisert til den tomme kanalen, så det er avgjørende å ha to blanke kanaler og sørge for at deres fluorescensintensiteter forblir konsistente med hverandre.
  3. Bruk formelen nedenfor for å normalisere dataene til den tomme kanalen; En prøveberegning er gitt i figur 7B .
    ligningen
    MERK: Her representerer AP- protein bakgrunns-subtrahert fluorescensintensitet av proteinkanalen, A; F- blank representerer bakgrunns-subtraheret fluorescensintensitet av blindkanalen, pre og post refererer til før og etter proteintitreringstrinn, og a representerer korrigeringsfaktoren som er forholdet mellom fluorescensintensiteten i proteinkanalen og blindkanalen ([ F protein / F blank ] pre ) ved et pre-protein titreringstrinn. Siden fluorescensintensiteten minker som en funksjon av PH-domene-konsentrasjonen, vil normaliserte data være negative i verdi.
  4. Ved hjelp av en kurvepassende programvare (se Materialebord ), plot den normaliserte fluorescensen som en funksjon av PH-domene-konsentrasjonen og passe til en Langmuir isotherm ( Figur 6C ):
    ligningen
    MERK: Her representerer ΔF endringen i fluorescensintensitet i forhold til den maksimale forandringen i fluoRescensintensitet når en metningskonsentrasjon av protein er tilstede ( ΔF max ), mens K d, app representerer den tilsynelatende dissosiasjonskonstanten, som er lik bulkproteinkonsentrasjonen ( [PLC-δ1 PH] ) ved hvilken 50% dekning Membranbundet kompleks) oppnås. Dette er en likevektsbasert bindingsmåling, slik at de normaliserte dataene passer til en enkel Langmuir isoterm for å trekke ut en tilsynelatende eksperimentell parameter K d, app . Basert på den tilpasningsprogramvare K d, app for PLC-δ1 PH-PI (4,5) P-2 interaksjon er 0,39 ± 0,05 uM (figur 6B).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi brukte pH modulasjon assay for å studere PLC-δ1 PH domene-PI (4,5) P2 vekselvirkning innenfor et PIP-på-en-brikke microdevice (figur 1). Gjennom en detaljert protokoll demonstrerte vi hvordan du klargjør og monterer mikrofluidiske komponenter, lager små unilamellære vesikler (SUVer) ( figur 2 ), danner SLBer i en enhet ( Figur 3 ) og testet proteinbinding til PIP-holdige SLB. Et flytskjema for et typisk SLB-bindingseksperiment er vist i figur 4 . Prinsippet for den pH-modulasjon analysen er vist i figur 5 ved hjelp av PH domene-PI (4,5) P-2-binding som et eksempel. Resultater oppnådd fra denne studien antydet at pH-området bindes til PI (4,5) P 2 -holdige SLBs. Nærmere bestemt observert vi at ved binding ble den lokale pH blitt mer grunnleggende. Dette Lokal pH-forandring ble detektert av o SRB-POPE fluorescerende probe tilstede innenfor SLB, som deretter ble slukket tilsvarende ( figur 6A , 6C ). Slokkingen var konsentrasjonsavhengig og mettet, slik at dataene til en Langmuir isoterm ga en Kd , app på 0,39 ± 0,05 μM ( Figur 6B , 6D ). PH-domene viste selektivitet overfor PI (4,5) P2, siden ingen binding ble observert mot POPC (zwitterionisk lipid), og svakere binding mot PI4P-inneholdende SLBs (Kd, app = 1,02 ± 0,20 uM) (figur 6B). En prøveberegning er inkludert for å vise hvordan fluorescensdata behandles ( figur 7 ). I figur 8 er serier av mikrokanalbilder presentert for å gi visuelle ledetråder for å bestemme kvaliteten på SLB og mikrokanaler.

_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figur 1
Figur 1: PIP-on-a-chip mikrofluidisk enhet for å studere protein-PIP-interaksjoner. ( A ) Den mikrofluidiske enheten har 8 mikrokanaler med 8 inntak og 8 uttak. Fargede løsninger ble gjennomstrømmet for å gjøre kanalene synlige i dette bildet. Enheten er 2,0 cm i bredden (x), 0,5 cm i høyden (y) og 3,0 cm i lengden (z). ( B ) Mikrokanalens gulv er glass, mens veggene og takene består av polydimetylsiloksan (PDMS). Hver mikrokanal er 100 μm i bredde, 40 μm i høyde og 1 cm i lengde. Avstanden mellom to tilstøtende mikrokanaler er 40 μm. Støttede lipid-bilayere (SLBer) dannes på toppen av glassoverflaten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2
Figur 2. Små unilamellar vesicle (SUV) forberedelse og kvalitetskontroll studier. ( A ) Lipidkomponenter anvendt ved fremstilling av vesikler: orto- sulforhodamin B-POPE ( o SRB-POPE), L-a-fosfatidylinositol-4-fosfat (PI4P), L-a-fosfatidylinositol-4,5-bisfosfat PI (4,5) P-2), og 1-palmitoyl-2-oleoyl- sn-glycero-3-fosfocholin (POPC). ( B ) Typer av lipidvesikler: SUV, stor unilamellær vesikkel (LUV), gigantisk unilamellær vesikkel (GUV) og multilamellær vesikkel (MLV). SUVer passer best til forberedelse av SLB 34 . ( C ) Dynamisk lysspredning (DLS) basert bekreftelse på størrelsen på vesiklene etter lipid ekstrudering (gjennom 0,1 μm filter). Hydrodynamisk radius (Rh) på 53,9 nm bekrefter at m Ean av vesikkelstørrelsesfordelingen er ~ 100 nm. Resultatene representerer måling fra PI (4,5) P 2 -holdige SUVer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3
Figur 3: SLB-formasjon på en glassstøtte. ( A ) Vesikler av ønsket lipidsammensetning fremstilles og strømmer deretter gjennom mikrokanaler. Vesikler blir adsorbert til glassoverflaten og deformert. Når en kritisk overflate dekning er oppnådd, spreder vesikler spontant for å danne SLB. Tilpasset fra referanser 35 , 36 . ( B ) SLBer innenfor en enhet under et 10X objektiv er vist. Alexa 568 filtersett (excitasjon / utslipp ved 576/603 nm) benyttes.Ource.jove.com/files/ftp_upload/55869/55869fig3large.jpg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4
Figur 4: Flytskjema for et typisk SLB-bindingsforsøk. Mikrofluidiske komponenter, dvs. mønstret PDMS-blokk og rensede dekselglass, behandles med oksygenplasma for å gjøre begge overflatene hydrofile og deretter montert. SUVer strømmer gjennom mikrokanaler for å danne SLB. Overskydende vesikler fjernes, og SLBs blir ekvilibrert til eksperimentelle forhold ved å flyte en løpebufferløsning. Deretter strømmer proteinfortynninger gjennom mikrokanaler. Til slutt analyseres fluorescensintensitetsdataene, normaliseres og plottes som en funksjon av proteinkonsentrasjon. De normaliserte dataene passer til en funksjon for å trekke ut en tilsynelatende dissosiasjonskonstant ( K d, app ) value. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5
Figur 5: Prinsipper for pH-modulasjonsbasert avkjenning. ( A ) Røntgenkrystallstruktur av PLC-δ1 PH-domenet i kompleks med PI (4,5) P 2- hovedgruppeinositol 1,4,5-trisfosfat (Ins (1,4,5) P 3 ) ID: 1MAI) 37 . (B) o SRB-POPE sonde er meget fluorescerende ved lav pH, og reaksjonen stoppet ved høy pH med en pKa-verdi på 6,7 i løpet av 7,5 mol% PI (4,5) P2 -holdige SLBs som angitt i pH-titreringskurven. ( C ) PH-domenet som ble brukt i denne studien, har et isoelektrisk punkt (pI) på 8,4, så ved eksperimentell pH (7,0) blir proteinet positivt ladet. Med en netto positiv cHarge, proteinet tiltrekker seg OH - ioner. Når pH-området bindes til PI (4,5) P-2-inneholdende SLBs, bringer de OH - ioner til membranoverflaten, blir grenseflatepotensialet modulert som i sin tur forskyver protonering tilstand av o SRB-POPE, og dens fluorescens Slokkes i PH-domene konsentrasjonsavhengig måte. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 6
Figur 6: PLC-δ1 PH-membranbinding overvåket via pH-modulering. ( A ) Utsikten over mikrokanaler før og etter å legge til PH-domenet ved angitte konsentrasjoner. (B) sammenligning av de affiniteter mot POPC, PI4P, og PI (4,5) P 2 -holdige SLBs. PH domenebinding til 7,5 mol% PI (4,5) P 2 -holdige SLBs ga en K d, app av 0,39 ± 0,05 pm. Svakere binding ble observert mot 7,5 mol% PI4P-holdige SLB ( K d, app på 1,02 ± 0,20 μM) og ingen binding ble observert for rene POPC SLB. Feilstenger indikerer SEM (n = 3). To-halet t-test ble anvendt for å sammenligne affiniteter mellom PI4P og PI (4,5) P2-bindende (* p = 0,0396). ( C ) Fluorescensintensiteter fra linjeskanningen over mikrokanaler er plottet som en funksjon av avstanden i piksler for POPC, PI4P og PI (4,5) P 2 bindingsforsøk. (D) Normalisert og i gjennomsnitt POPC, PI4P, og PI (4,5) P2-bindingsdata blir plottet som en funksjon av PLC-δ1 PH domene konsentrasjon og deretter passe til en Langmuir-isotermen for å ekstrahere K d, appen. Se ligningen i trinn 8.4 for detaljer."Target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 7
Figur 7: Eksempelberegning for databehandling. ( A ) Før (svart) og etter (rød) proteintitrering linjeskanne data for tomt (nei protein) og proteinkanal, hvor fluorescensintensitetsdata presenteres som en funksjon av avstanden i piksler. Skyggefulle områder representerer regionene som ble brukt til å trekke ut data for beregningene. Baseline fluorescensintensitetsdata ekstraheres rett før og etter hver kanal. ( B ) Data blir ekstrahert for blanke og proteinkanaler, både før og etter proteintitrering. Gjennomsnitt er tatt for baseline og innenfor en kanalfluorescensdata. Etter baseline subtraksjon normaliseres fluorescensdataene til den tomme kanalen. Se ligningen i trinn 8.3 for detaljer. Href = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55869/55869fig7large.jpg" target = "_ blank"> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 8
Figur 8: Vurdering av integriteten til SLB og mikrokanaler. ( A ) Et bilde som illustrerer høy kvalitet SLB og mikrokanaler. ( B ) Ufullstendig fusjon. ( C ) smeltede mikrokanaler. ( D ) Støvpartikkel fanget i en mikrokanal. ( E ) Luftbobler fanget i mikrokanaler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende fil 1: Pattern_Design.dwgBlank "> Vennligst klikk her for å laste ned filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hver PIP-variant, om enn i lave konsentrasjoner, er tilstede på den cytosoliske overflaten av spesifikke organeller hvor de bidrar til etableringen av en unik fysisk sammensetning og funksjonell spesifisitet av organellarmembranen 1 . En av de viktigste bruksområdene til PIP er som en spesifikk dockingsplattform for mangfoldet av proteiner som krever spesifikk subcellulær lokalisering og / eller aktivering 6 , 7 . På grunn av sin rolle i cellulær fysiologi og sykdom er evnen til å studere protein-PIP-interaksjoner in vitro i en fysiologisk relevant sammenheng viktig. Assayformatet beskrevet heri tillater en å vurdere protein-PIP-interaksjoner i sammenheng med et fluidlipid-dobbeltlag, i nærvær av en blanding av fosfolipider, med den normale presentasjon av polarhovedgruppen og fettacylkjeder med naturlig lengde.

Denne analysen, i kombinasjonVidere med pH-modulering som sitt deteksjonssystem og SLB som et modellmembransystem satt i en mikrofluidisk plattform, gir unike fordeler i forhold til andre membranbindende teknikker. Først og fremst sparer mikrofluidplattformen på materialer på grunn av de lave volumkravene både for protein og lipider som brukes (40 nL totalt kanalvolum, 1,0 mm 2 SLB overflateareal). I tillegg kan fysiologisk relevante lipidblandinger benyttes, samtidig som det opprettholdes todimensjonal membranfluiditet (≥1,0 μm 2 / s) 28 , 38 . Deteksjonssystemet gir forbedret signal-støyforhold sammenlignet med ITC, SPR og kvartskrystallmikrobalanse med dissipation (QCM-D) -overvåking, noe som gjør at man kan teste ikke bare proteinmembran-interaksjoner, men ion, lite molekyl, peptid-membraninteraksjoner som Vel 19 , 20 , 39 , 40 . Den pH-følsomme fluorescerende proben er også svært stabil og ikke fotobleak under de eksperimentelle forholdene som ble testet 19 , 20 , 41 . En annen fordel med denne plattformen er evnen til å observere membranflatene visuelt. Visse interaksjoner kan indusere dannelse av lipidmikrodomin og / eller påvirke membranfluiditet, som kan visualiseres direkte og / eller testet via fluorescensgjenvinning etter fotoblekking (FRAP) henholdsvis 42 . Analysen beskrevet her krever ikke noe dyrt instrumentering utover et fluorescensmikroskop. Til slutt, og aller viktigst, vurderer membraninteraksjoner i fravær av ligand / reseptormærkning, PIP-on-a-chip-analysen den foretrukne metoden over de tradisjonelle.

Selv om PIP-on-a-chip-analysen er en kraftig teknikk, kan perifere membranproteiner diffEr i den samlede sammensetningen av kationiske og anioniske rester og deres fordeling innenfor / rundt bindingsstedet, som skaper visse utfordringer. Noen proteiner har PIP-bindingssteder som består av mange grunnleggende rester, mens andre har bare noen få. Derfor vil H + / OH - forholdet på bindingsstedet være forskjellig, og så er størrelsen på endringen i den lokale pH ved binding. Støkiometrien til samspillet og hvorvidt PIP-bindingen stabiliseres ved interaksjoner med andre lipider, kompliserer ytterligere saken. Følgelig kan pI av et protein, spesielt for et stort protein, ikke være den eneste indikatoren for den forventede fluorescensendringen. Mens noen protein-PIP-interaksjoner vil resultere i store fluorescensendringer, kan resten resultere i små fluorescensendringer. I sistnevnte tilfelle kan det tas minst to tiltak for å forbedre signal-støyforholdet: 1) ved å bruke større PIP-nivåer på bilaget for å øke antall proteiner rEkstrudert til overflaten, dvs. økning av antall rekrutterte OH - ioner og antall slokkede o SRB-POPE-molekyler; 2) øke o SRB-POPE nivåene for å forbedre signalet til støyforholdet.

Selv om den nåværende plattformen gir mange fordeler for å studere perifere membranproteiner, har det noen utfordringer for studiet av transmembrane proteiner. På grunn av SLB-glassstøttenes nærhet (vannlag er ca. 1-2 nm avhengig av lipidsammensetningen), kan transmembranprotein-glass-støtteinteraksjonen fremme proteindetaturering, føre til funksjonsfeil og immobilisering 34 , 43 , 44 , 45 . Selv om det er mer involvert, har en rekke tilnærminger blitt utviklet for å overvinne disse utfordringene, slik som overflate modifisering av glassstøtten for å gi polymerpute eller innbefattende lipopolymerRettere (for eksempel PEGylerte lipider) i dobbeltlaget for å øke SLB-glassstøtteavstanden 34 , 46 , 47 , 48 .

Å lage høy kvalitet SLB er det mest kritiske aspektet av PIP-on-a-chip-analysen ( Figur 8A ). Bruk av rene deksler og friske SUVer anbefales for å sikre reproduserbarhet. På grunn av tilstedeværelsen av anioniske lipider, for eksempel PI (4,5) P2, blir SUVer negativt ladet, noe som senker den SUV sprekker effektivitet og påvirke membranfluiditet (figur 8B). Derfor er pH-justering av SUV-løsningen avgjørende for protonering av PI (4,5) P 2- hodegruppefosfater og redusering av elektrostatisk avstøtning med glasset for å øke ruptureringseffektiviteten 49 , 50 . SUVer som ikke inneholder anioniske lIpids, krever ingen pH justering. I tillegg bør SUV injiseres i kanaler rett etter oksygenplasmabehandling og -binding, mens glassdekseloverflaten fortsatt er hydrofil, noe som kreves for SLB-dannelse. Foruten SLB-kvalitet representerer støvpartikler et annet problem. Under produksjonsprosessen kan en støvpartikkel fanget mellom kanaler forårsake kanalfusjon, mens en støvpartikkel som er fanget i en kanal, kan skade SLB og / eller redusere løsningshastigheten ( Figur 8C, 8D ). Arbeidsområdet bør rengjøres periodisk for å fjerne støv. På samme måte bør eksponering av en luftboble inn i en kanal unngås ved hvert trinn, noe som ellers vil skade SLB'en irreversibelt ( figur 8E ).

En annen parameter å vurdere når du planlegger en PIP-på-en-chip-analyse er proteinlagringsbufferen. Hvis det brukes i høye konsentrasjoner, kan enkelte komponenter (Stabiliseringsmidler, reduksjonsmidler, salter, antimikrobielle midler, chelateringsreagenser, etc. ) kan påvirke fluorescens- og / eller SLB-integriteten. Lagringsbufferen bør derfor titreres for å teste dens effekt. Hvis en effekt observeres, bør SLBene også equilibreres til lagringsbufferbetingelsene før titrering av proteinet for å hindre en drift i fluorescens. Med tanke på at dette er en pH-modulasjonsbasert analyse, bør det rensede proteinet også inneholde den samme bufferkomponent som løpebufferen (i dette tilfellet 20 mM HEPES ved pH 7,0) for å minimere driften i fluorescens forårsaket av buffer-mismatchen.

Som konklusjon har vi vist at pH-modulasjonsanalysen kan brukes med suksess for å undersøke protein-PIP-interaksjoner. Selv om vekten var på PIP, kan denne plattformen brukes til å teste samspill med mer komplekse membran systemer som inkluderer andre fysiologisk relevante lipider som fosfatidylseriNe, fosfatidyletanolamin, fosfatidinsyre og kolesterol, blant annet 28 , 39 , 42 , 51 . Utover cellulære proteiner, kan denne analyseplanen også være gunstig for de som studerer humane patogener. For eksempel har proteiner kodet av virus og bakterier vist seg å interagere med cellulære membraner og noen spesifikt med PIP 52 , 53 , 54 , 55 , 56 . Følgelig kan PIP-on-a-chip-analyse gi et middel til å oppdage og karakterisere småmolekylhemmere av protein-PIP-interaksjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

DS og CEC ble støttet, delvis, ved tildeling AI053531 (NIAID, NIH); SS og PSC ble støttet av stipend N00014-14-1-0792 (ONR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coverslip
Glass Coverslips: Rectangles Fisher Scientific 12-544B 22 x 40 x 0.16 - 0.19 mm, No. 1 1/2; Borosilicate Glass
7X Cleaning Solution MP Biomedicals 976670 Detergent
PYREX Crystallizing Dish Corning 3140-190 Borosilicate glass dish with a flat bottom; Diameter x Height (190 x 100 mm); Distributor: VWR (89090-700)
Sentry Xpress 2.0 Paragon Industries SC-2 Kiln
Name Company Catalog Number Comments
PDMS
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 4019862 Polydimethylsiloxane (PDMS); Distributor: Ellsworth Adhesives
PYREX Desiccator VWR 89134-402 Vacuum Rated
Biopsy punch Harris 15110-10 Harris Uni-Core; 1.0 mm diameter; Miltex Biopsy Punch with Plunger (Cat. No. 15110-10) can be used as an alternative
Name Company Catalog Number Comments
Device
Plasma Cleaning System PlasmaEtch PE25-JW 2-stage Direct Drive Oil Vacuum Pump, O2 service (Krytox Charged)
Digital Hot Plate Benchmark H3760-H Purchased through Denville Scientific (Cat. No. 1005640)
Frosted Micro Slides VWR 48312-003 Frosted, Selected, and Precleaned; Made of Swiss Glass; Thickness: 1 mm; Dimensions: 75 x 25 mm; GR 144
Name Company Catalog Number Comments
Mold
AutoCAD Autodesk v.2016 Drafting software for the photomask design
Photomask CAD/Art Services N/A Design with black background and clear features was printed at 20k dpi resolution on a transparent mask (5 x 7 in) by CAD/Art Services
Silicone Wafers University Wafer 1575 Prime Grade, Single Side Polished; 100 mm (4 inch) Diameter; 525 um Thickness
SU-8 50 MicroChem Corp. N/A Negative Tone Photoresist; Penn State Nanofabrication Facility Property
SU-8 Developer MicroChem Corp. N/A Penn State Nanofabrication Facility Property
Name Company Catalog Number Comments
SUV
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850457C POPC
L-α-phosphatidylinositol-4-phosphate Avanti Polar Lipids 840045X PI4P
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate Avanti Polar Lipids 840046X PI(4,5)P2
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine Avanti Polar Lipids 850757C POPE; Required for the synthesis of oSRB-POPE
Lissamine Rhodamine B Sulfonyl Chloride (mixed isomers) ThermoFisher Scientific L-20 Required for the synthesis of oSRB-POPE
pH Sensitive Fluorescent Lipid Probe (oSRB-POPE) In-house N/A In-house Synthesis (Huang D. et al. 2013)
Glass Scintillation Vial VWR 66022-065 20 mL volume capacity
Aquasonic 250D VWR N/A Ultrasonic Water Bath
Nuclepore Track-Etched Membranes Whatman 110605 Polycarbonate Membrane; Diameter: 25 mm; Pore Size: 0.1 um; Distributor: Sigma-Aldrich
Chloroform VWR CX1054-6 HPLC grade
LIPEX Extruder Transferra Nanosciences T.001 LIPEX 10 mL Thermobarrel Extruder
Viscotek 802 DLS Malvern Instruments N/A Dynamic Light Scattering; Penn State X-Ray Crystallography Facility Property
Name Company Catalog Number Comments
Data Analysis
GraphPad Prism GraphPad Software v.6 Curve-fitting software for data analysis
Name Company Catalog Number Comments
Microscope
Axiovert 200M Epifluorescence Microscope Carl Zeiss Microscopy N/A Microscope
AxioCam MRm Camera Carl Zeiss Microscopy N/A Camera
X-Cite 120 Excelitas Technologies N/A Light Source
Alexa 568 Filter Set Carl Zeiss Microscopy N/A Ex/Em 576/603 nm
AxioVision LE64 v.4.9.1.0 Software Carl Zeiss Microscopy N/A Image Processing Software
Name Company Catalog Number Comments
Other
Tips VWR 10034-132 200 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the protein solution into the microfluidic channel
Tips VWR 53509-070 10 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the vesicle solution into the microfluidic channel
Orion Star A321 pH meter Thermo Scientific STARA3210 pH meter
Orion micro pH probe Thermo Scientific 8220BNWP micro pH probe
N-(2-Hydroxyethyl)-Piperazine-N'-(2-Ethanesulfonic Acid) VWR VWRB30487 HEPES, Free Acid
Sodium Chloride VWR BDH8014-2.5KGR NaCl
Tubing Allied Wire & Cable TFT-200-24 N Internal Diameter: 0.020-0.026 inches (0.051-0.066 cm); Wall Thickness: 0.010 inches (0.025 cm); Flexible Polytetrafluoroethylene Thin-Wall Tubing; Natural Color
Nitrogen Gas - Industrial Praxair N/A Local Provider
Oxygen Gas - Industrial Praxair N/A Local Provider
Liquid Nitrogen Praxair N/A Local Provider

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443, (7112), 651-657 (2006).
  2. Shewan, A., Eastburn, D. J., Mostov, K. Phosphoinositides in cell architecture. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (8), a004796 (2011).
  3. Picas, L., Gaits-Iacovoni, F., Goud, B. The emerging role of phosphoinositide clustering in intracellular trafficking and signal transduction. F1000Res. 5, (2016).
  4. Lystad, A. H., Simonsen, A. Phosphoinositide-binding proteins in autophagy. FEBS Lett. 590, (15), 2454-2468 (2016).
  5. Balla, T. Phosphoinositides: Tiny lipids with giant impact on cell regulation. Physiol Rev. 93, 1019-1137 (2013).
  6. Lemmon, M. A. Membrane recognition by phospholipid-binding domains. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, (2), 99-111 (2008).
  7. Kutateladze, T. G. Translation of the phosphoinositide code by PI effectors. Nat Chem Biol. 6, (7), 507-513 (2010).
  8. Harlan, J. E., Hajduk, P. J., Yoon, H. S., Fesik, S. W. Pleckstrin homology domains bind to phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate. Nature. 371, (6493), 168-170 (1994).
  9. Garcia, P., et al. The pleckstrin homology domain of phospholipase C-delta 1 binds with high affinity to phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in bilayer membranes. Biochemistry. 34, (49), 16228-16234 (1995).
  10. Lemmon, M. A., Ferguson, K. M., O'Brien, R., Sigler, P. B., Schlessinger, J. Specific and high-affinity binding of inositol phosphates to an isolated pleckstrin homology domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, (23), 10472-10476 (1995).
  11. Flesch, F. M., Yu, J. W., Lemmon, M. A., Burger, K. N. Membrane activity of the phospholipase C-delta1 pleckstrin homology (PH) domain. Biochem J. 389, 435-441 (2005).
  12. Narayan, K., Lemmon, M. A. Determining selectivity of phosphoinositide-binding domains. Methods. 39, (2), 122-133 (2006).
  13. Scott, J. L., Musselman, C. A., Adu-Gyamfi, E., Kutateladze, T. G., Stahelin, R. V. Emerging methodologies to investigate lipid-protein interactions. Integr Biol (Camb). 4, (3), 247-258 (2012).
  14. Dowler, S., Currie, R. A., Downes, C. P., Alessi, D. R. DAPP1: A dual adaptor for phosphotyrosine and 3-phosphoinositides. Biochem J. 342, 7-12 (1999).
  15. He, J., et al. Molecular basis of phosphatidylinositol 4-phosphate and ARF1 GTPase recognition by the FAPP1 pleckstrin homology (PH) domain. J Biol Chem. 286, (21), 18650-18657 (2011).
  16. Ceccarelli, D. F., et al. Non-canonical interaction of phosphoinositides with pleckstrin homology domains of Tiam1 and ArhGAP9. J Biol Chem. 282, (18), 13864-13874 (2007).
  17. Huang, S., Gao, L., Blanchoin, L., Staiger, C. J. Heterodimeric capping protein from Arabidopsis is regulated by phosphatidic acid. Mol Biol Cell. 17, (4), 1946-1958 (2006).
  18. Yu, J. W., et al. Genome-eide analysis of membrane targeting by S. cerevisiae pleckstrin homology domains. Mol Cell. 13, (5), 677-688 (2004).
  19. Jung, H., Robison, A. D., Cremer, P. S. Detecting protein-ligand binding on supported bilayers by local pH modulation. J Am Chem Soc. 131, (3), 1006-1014 (2009).
  20. Huang, D., Zhao, T., Xu, W., Yang, T., Cremer, P. S. Sensing small molecule interactions with lipid membranes by local pH modulation. Anal Chem. 85, (21), 10240-10248 (2013).
  21. Saxena, A., et al. Phosphoinositide binding by the pleckstrin homology domains of Ipl and Tih1. J Biol Chem. 277, (51), 49935-49944 (2002).
  22. Knödler, A., Mayinger, P. Analysis of phosphoinositide-binding proteins using liposomes as an affinity matrix. Biotechniques. 38, (6), 858-862 (2005).
  23. Baumann, M. K., Swann, M. J., Textor, M., Reimhult, E. Pleckstrin homology-phospholipase C-delta1 interaction with phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate containing supported lipid bilayers monitored in situ with dual polarization interferometry. Anal Chem. 83, (16), 6267-6274 (2011).
  24. Saliba, A. E., et al. A quantitative liposome microarray to systematically characterize protein-lipid interactions. Nat Methods. 11, (1), 47-50 (2014).
  25. Arauz, E., Aggarwal, V., Jain, A., Ha, T., Chen, J. Single-molecule analysis of lipid-protein interactions in crude cell lysates. Anal Chem. 88, (8), 4269-4276 (2016).
  26. Best, Q. A., Xu, R., McCarroll, M. E., Wang, L., Dyer, D. J. Design and investigation of a series of rhodamine-based fluorescent probes for optical measurements of pH. Org Lett. 12, (14), 3219-3221 (2010).
  27. Lee, J., Choi, K. H., Yoo, K. Innovative SU-8 lithography techniques and their applications. Micromachines. 6, (1), 1-18 (2014).
  28. Poyton, M. F., Sendecki, A. M., Cong, X., Cremer, P. S. Cu(2+) binds to phosphatidylethanolamine and increases oxidation in lipid membranes. J Am Chem Soc. 138, (5), 1584-1590 (2016).
  29. Karasek, P., Grym, J., Roth, M., Planeta, J., Foret, F. Etching of glass microchips with supercritical water. Lab Chip. 15, (1), 311-318 (2015).
  30. Thomas, M. S., et al. Print-and-peel fabrication for microfluidics: what's in it for biomedical applications? Ann Biomed Eng. 38, (1), 21-32 (2010).
  31. Waheed, S., et al. 3D printed microfluidic devices: enablers and barriers. Lab Chip. 16, (11), 1993-2013 (2016).
  32. Axmann, M., Schutz, G. J., Huppa, J. B. Single molecule fluorescence microscopy on planar supported bilayers. J Vis Exp. (105), e53158 (2015).
  33. Barenholz, Y., et al. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. Biochemistry. 16, (12), 2806-2810 (1977).
  34. Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surface Science Reports. 61, (10), 429-444 (2006).
  35. Hamai, C., Yang, T., Kataoka, S., Cremer, P. S., Musser, S. M. Effect of average phospholipid curvature on supported bilayer formation on glass by vesicle fusion. Biophys J. 90, (4), 1241-1248 (2006).
  36. Tero, R. Substrate effects on the formation process, structure and physicochemical properties of supported lipid bilayers. Materials. 5, (12), 2658-2680 (2012).
  37. Ferguson, K. M., Lemmon, M. A., Schlessinger, J., Sigler, P. B. Structure of the high affinity complex of inositol trisphosphate with a phospholipase C pleckstrin homology domain. Cell. 83, (6), 1037-1046 (1995).
  38. Simonsson, L., Hook, F. Formation and diffusivity characterization of supported lipid bilayers with complex lipid compositions. Langmuir. 28, (28), 10528-10533 (2012).
  39. Cong, X., Poyton, M. F., Baxter, A. J., Pullanchery, S., Cremer, P. S. Unquenchable surface potential dramatically enhances Cu(2+) binding to phosphatidylserine lipids. J Am Chem Soc. 137, (24), 7785-7792 (2015).
  40. Robison, A. D., et al. Polyarginine interacts more strongly and cooperatively than polylysine with phospholipid bilayers. J Phys Chem B. 120, (35), 9287-9296 (2016).
  41. Robison, A. D., Huang, D., Jung, H., Cremer, P. S. Fluorescence modulation sensing of positively and negatively charged proteins on lipid bilayers. Biointerphases. 8, (1), 1 (2013).
  42. Tabaei, S. R., et al. Formation of cholesterol-rich supported membranes using solvent-assisted lipid self-assembly. Langmuir. 30, (44), 13345-13352 (2014).
  43. Johnson, S. J., et al. Structure of an adsorbed dimyristoylphosphatidylcholine bilayer measured with specular reflection of neutrons. Biophys J. 59, (2), 289-294 (1991).
  44. Koenig, B. W., et al. Neutron reflectivity and atomic force microscopy studies of a lipid bilayer in water adsorbed to the surface of a silicon single crystal. Langmuir. 12, (5), 1343-1350 (1996).
  45. Tanaka, M., Sackmann, E. Polymer-supported membranes as models of the cell surface. Nature. 437, (7059), 656-663 (2005).
  46. Renner, L., et al. Supported lipid bilayers on spacious and pH-responsive polymer cushions with varied hydrophilicity. J Phys Chem B. 112, (20), 6373-6378 (2008).
  47. Wagner, M. L., Tamm, L. K. Tethered polymer-supported planar lipid bilayers for reconstitution of integral membrane proteins: Silane-polyethyleneglycol-lipid as a cushion and covalent linker. Biophys J. 79, (3), 1400-1414 (2000).
  48. Pace, H., et al. Preserved transmembrane protein mobility in polymer-supported lipid bilayers derived from cell membranes. Anal Chem. 87, (18), 9194-9203 (2015).
  49. Braunger, J. A., Kramer, C., Morick, D., Steinem, C. Solid supported membranes doped with PIP2: Influence of ionic strength and pH on bilayer formation and membrane organization. Langmuir. 29, (46), 14204-14213 (2013).
  50. Paridon, P. A., de Kruijff, B., Ouwerkerk, R., Wirtz, K. W. Polyphosphoinositides undergo charge neutralization in the physiological pH range: A 31P-NMR study. Biochim Biophys Acta. 877, (1), 216-219 (1986).
  51. Liu, C., Huang, D., Yang, T., Cremer, P. S. Monitoring phosphatidic acid formation in intact phosphatidylcholine bilayers upon phospholipase D catalysis. Anal Chem. 86, (3), 1753-1759 (2014).
  52. Saad, J. S., et al. Structural basis for targeting HIV-1 Gag proteins to the plasma membrane for virus assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, (30), 11364-11369 (2006).
  53. Hsu, N. Y., et al. Viral reorganization of the secretory pathway generates distinct organelles for RNA replication. Cell. 141, (5), 799-811 (2010).
  54. Del Campo, C. M., et al. Structural basis for PI(4)P-specific membrane recruitment of the Legionella pneumophila effector DrrA/SidM. Structure. 22, (3), 397-408 (2014).
  55. Kolli, S., et al. Structure-function analysis of vaccinia virus H7 protein reveals a novel phosphoinositide binding fold essential for poxvirus replication. J Virol. 89, (4), 2209-2219 (2015).
  56. Cho, N. J., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate is an HCV NS5A ligand and mediates replication of the viral genome. Gastroenterology. 148, (3), 616-625 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics