PIP-on-a-chip: En etikettfri studie av protein-fosfinositid-interaktioner

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Här presenterar vi ett stödjande lipid-dubbelskikt i samband med en mikrofluidisk plattform för att studera interaktioner med protein-fosfinositid med en etikettfri metod baserad på pH-modulering.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Shengjuler, D., Sun, S., Cremer, P. S., Cameron, C. E. PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions. J. Vis. Exp. (125), e55869, doi:10.3791/55869 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Många cellulära proteiner interagerar med membranytor för att påverka väsentliga cellulära processer. Dessa interaktioner kan riktas mot en specifik lipidkomponent i ett membran, såsom i fallet med fosfoinositider (PIP), för att säkerställa specifik subcellulär lokalisering och / eller aktivering. PIP och cellulära PIP-bindande domäner har studerats i stor utsträckning för att bättre förstå deras roll i cellfysiologi. Vi tillämpade en pH-moduleringsanalys på stödda lipid-bilayers (SLB) som ett verktyg för att studera protein-PIP-interaktioner. I dessa studier används pH-känslig orto- sulforhodamin B-konjugerad fosfatidyletanolamin för att detektera protein-PIP-interaktioner. Vid bindning av ett protein till en PIP-innehållande membranyta moduleras gränsspotentialen ( dvs förändring i lokalt pH), förskjutning av sondens protoneringstillstånd. En fallstudie av den framgångsrika användningen av pH-moduleringsanalysen presenteras med användning av fosfolipas C delta1 Pleckstri Homologi (PLC-δ1 PH) domän och fosfatidylinositol-4,5-bisfosfat (PI (4,5) P 2) interaktion som ett exempel. Den uppenbara dissociationskonstanten ( Kd, app ) för denna interaktion var 0,39 ± 0,05 pM, liknande Kd, appvärden erhållna av andra. Såsom tidigare observerats, är PLC-δ1 PH-domänen PI (4,5) P 2 specifik, visar svagare bindning mot fosfatidylinositol 4-fosfat, och ingen bindning till rena fosfatidylkolin SLBs. PIP-on-a-chip-analysen är fördelaktig jämfört med traditionella PIP-bindningsanalyser, inkluderande men inte begränsat till lågprovvolym och inga krav på ligand / receptormärkning, förmågan att testa membraninteraktioner med hög och låg affinitet med både små och Stora molekyler och förbättrat signal-brusförhållande. Följaktligen kommer användningen av PIP-on-a-chip-tillvägagångssättet att underlätta belysningen av mekanismer för ett brett spektrum av membraninteraktioner. Dessutom kan denna metod eventuellt vara digSed i identifierande terapier som modulerar proteins förmåga att interagera med membran.

Introduction

Myriad interaktioner och biokemiska processer sker på tvådimensionellt flytande membranytor. Membran-slutna organeller i eukaryota celler är unika inte bara i biokemiska processer och deras associerade proteom utan även i deras lipidsammansättning. En exceptionell klass av fosfolipider är fosfinositider (PIP). Trots att de bara omfattar 1% av cellulär lipidom spelar de en avgörande roll i signaltransduktion, autofag och membranhandel, bland annat 1 , 2 , 3 , 4 . Dynamisk fosforylering av inositolhuvudgruppen med cellulära PIP-kinaser ger upphov till sju PIP-huvudgrupper som är mono-, bis- eller trisfosforylerade 5 . Dessutom definierar PIP den membranens subcellulära identitet och tjänar som specialiserade membran dockningsställen för proteiner / enzymer innehållande en eller flera fosforinoserItidbindande domäner, till exempel Pleckstrin Homology (PH), Phox Homology (PX) och epsin N-terminal Homology (ENTH) 6 , 7 . En av de bäst studerade PIP-bindande domäner är fosfolipas C (PLC) -δ1 PH-domänen som specifikt interagerar med fosfatidylinositol-4,5-bisfosfat (PI (4,5) P2) inom ett högt nanomolar-låg mikromolära området affinitet 8 , 9 , 10 , 11 .

En rad kvalitativa och kvantitativa in vitro- metoder har utvecklats och använts för att studera mekanismen, termodynamiken och specificiteten av dessa interaktioner. Bland de vanligast använda PIP-bindningsanalyserna är ytplasmonresonans (SPR), isotermisk kalorimetri (ITC), NMR-spektroskopi, NMR-analys, liposomflotation / sedimentationsanalys och lipid-blottar (Fett-Blots / PIP-remsor)12 , 13 . Trots att dessa används i stor utsträckning har de alla många nackdelar. Exempelvis kräver SPR, ITC och NMR stora mängder av prov, dyr instrumentation och / eller utbildad personal 12 , 13 . Vissa analysformat såsom antikroppsbaserade lipidblottar utnyttjar vattenlösliga former av PIP och presenterar dem på ett icke-fysiologiskt sätt 12 , 14 , 15 , 16 . Dessutom kan lipidblots inte kvantifieras på ett tillförlitligt sätt och de har ofta resulterat i falska positiva / negativa observationer 12 , 17 , 18 . För att övervinna dessa utmaningar och förbättra den nuvarande verktygssatsen upprättades en ny etikettfri metod baserad på ett stödjande lipid-dubbelskikt (SLB) i samband med am Mikrofluidisk plattform, som framgångsrikt användes vid studien av protein-PIP-interaktioner ( Figur 1 ) 19 .

Strategin som används för att detektera protein-PIP-interaktioner baseras på pH-moduleringsavkänning. Detta involverar ett pH-känsligt färgämne som har orto- sulforhodamin B ( o SRB) direkt konjugerad till fosfatidyletanolamin lipidhuvudgrupp 20 . O SRB-POPE-sond (Figur 2A) är mycket fluorescerande vid lågt pH och släcktes vid högt pH med ett pKa omkring 6,7 inom 7,5 mol-% PI (4,5) P2-innehållande SLBs (figur 5B). PLC-δ1 PH-domänen har använts i stor utsträckning för att validera protein-PIP-bindande metoder beroende på dess höga specificitet mot PI (4,5) P2 (figur 5A) 21, 22,"> 23, 24, 25 .Hence, resone vi att PLC-δ1 PH-domänen kan användas för att testa dess bindning till PI (4,5) P2 genom PIP-on-a-chip-analys. PH-domänen konstrukt Den används i denna studie har en positiv nettoladdning (pl 8,4), och attraherar därmed OH -. joner (Figur 5C) vid bindning till PI (4,5) P 2 -innehållande SLBs, ger PH-domänen OH - joner till den membranytan, som i sin tur modulerar den interfacial potential och förskjuter protonetillstånd o SRB-POPE (figur 5C) 26. som en funktion av PH-domän koncentrationen, är fluorescensen släckes (figur 6A). Slutligen, är den normaliserade data som passa till en bindande isotermen för att bestämma affiniteten hos PH-domänen-PI (4,5) P 2 interaktion (figur 6B, 6C). </ P>

I denna studie tillhandahålls ett detaljerat protokoll för att utföra proteinbindning till PIP-innehållande SLB i en mikrofluidisk plattform. Detta protokoll tar läsaren från att montera den mikrofluidiska enheten och vesikelpreparatet till SLB-bildning och proteinbindning. Dessutom till riktningar för analys av data extrahera affinitets information för PLC-δ1 PH-domänen-PI (4,5) P 2 interaktion tillhandahålls.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Rengör glasskyddet

  1. Torka 7x rengöringslösning (se materialbord ) 7-faldigt med avjoniserat vatten i en 100 mm djup borosilikatglasfat med en platt botten och värm upp till 95 ° C på en platt platt platta i 20 minuter eller tills den muliga lösningen blir klar .
    OBS: Lösningen blir varm, var försiktig för att undvika kroppsskador. 7x rengöringslösningen är en proprietär blandning av hexasodium [oxido- [oxido (fosfonatooxi) fosforyl] oxifosforyl] fosfat, 2- (2-butoxietoxi) etanol, natrium 1,4-bis (2-etylhexoxi) -1,4-dioxobutan -2-sulfonat och icke-farliga tillsatser.
  2. Med hjälp av pincett, ordna täckglas (40 mm längd x 22 mm bredd x 0,16-0,19 mm höjd) på ett aluminiumfärgningsstativ i alternerande riktningar. Håll en tom plats mellan varje täckglas så att de inte rör varandra.
  3. Dunkla färgstativet helt med täckglasen i rengöringslösningen. Håll täckglasen iLösningen i 1 timme.
    OBS! När vattnet avdunstar, fortsätt tillsätt färskt avjoniserat vatten för att hålla lösningskoncentrationen oförändrad.
  4. Ta ut färgningsställen ur rengöringslösningen och tvätta täckglasen med rikliga mängder avjoniserat vatten för att ta bort tvättmedlet.
  5. Torka täckglasen med kvävgas (ca 5 min per färgstativ) och lägg sedan täckglasen i en ugn i 6 timmar vid 550 ° C för glödgning.
    OBS! Detta är ett viktigt steg som släpper ut grova egenskaper på glasytan.
  6. Placera täckglasen i en plastbehållare och håll dem borta från damm.

2. Tillverkning av mikropatternerade PDMS-block

  1. Blanda polydimetylsiloxan (PDMS) prepolymer och härdningsmedlet vid 10: 1 (vikt / vikt) förhållande i en stor plastvägbåt och avgasar den i vakuum i 1 h med vakuumstyrka vid 500 Torr eller mindre.
    OBS: PDMS är en transparent och inert silikonpolymer. För att få önskat PDMS-block tHickness (0,5 cm), blanda 55 g av prepolymeren med 5,5 g härdningsmedlet.
  2. Placera kiselmastern som innehåller flera replikat av samma SU-8 mikropattern i en stor plastbåt med 10 cm basdiameter och häll i avgasad PDMS. Koka sedan i en torr ugn vid 60 ° C över natten.
    OBS! Mikropattern är tillräckligt stora för att ses med blotta ögat. Varje mönster innehåller 8 mikrokanaler (100 μm bredd x 40 μm höjd x 1 cm längd) med mellanrum 40 μm ( Figur 1A , 1B ). Silikonplattformen bestående av hårdbakad SU-8 fotoresist tillverkades i en nanofabrikationsanläggning 27 . Andra tillvägagångssätt för masterpreparation innefattar etsning av fluorflussyra (HF), högtemperaturvattenetsning, xurografi och 3D-utskrift 28 , 29 , 30 , 31 . kommersIalkällor för kiselmästerberedning kan också användas. Mönstren för den mikrofluidiska enheten var utformad med en mjukvara (se tabell över material). Den ursprungliga filen som innehåller mönsterdesignen tillhandahålls som en kompletterande fil "Pattern Design.dwg", som kan tillhandahållas direkt till tillverkaren.
  3. Skölj försiktigt PDMS från kiselmästaren med händerna. Markera gränserna för varje mikropattern i rektanglar med hjälp av en kirurgisk skalpell och en linjal. Skär sedan PDMS i block.
  4. Stansa 16 hål (8 inlopp och 8 utlopp per block) i båda ändarna av varje mikrokanal med en biopsipunch (1,0 mm håldiameter) enligt vad som visas i figur 3B .
  5. Applicera tejp över varje PDMS-block för att skydda mikropatternerna mot skador och damm. Förvara dem i en plastbehållare.

3. Förbereda små unilamellära vesiklar (SUV)

OBS: Negativ kontroll-dubbelskiktskompositionÄr 99,5 mol% 1-palmitoyl-2-oleoyl- sn- glycero-3-foskosolin (POPC) och 0,5 mol% orto- sulfforhodamin B-1-palmitoyl-2-oleoyl- sn- glycero-3-fosforetanolamin ( o SRB- PÅVE). Testlagersammansättning är 92,0 mol% POPC, 0,5 mol% o SRB-POPE och 7,5 mol% av antingen L-a-fosfatidylinositol-4-fosfat (PI4P) eller L-a-fosfatidylinositol-4,5-bisfosfat (PI 4,5) P 2). Nedan är det förfarande för framställning av 92,0 mol-% POPC, 0,5 mol-% o SRB-POPE, och 7,5 mol-% PI (4,5) P2-innehållande SUV. Syntesen av o SRB-POPE som användes i denna studie har tidigare beskrivits 20 .

  1. Beräkna volymen av POPC, PI (4,5) P2, och o SRB-POPE som måste blandas, som står för följande totala belopp: 2,22 mg POPC, 0,26 mg PI (4,5) P2, Och 2,1 x 10 -5 mg o SRB-POPE.
  2. Pipettera den beräknade volymen POPC, PI (4,5) P 2 , <Em> o SRB-POPE i en enda 20 ml glasscintillationsflaska.
    OBS: POPC och o SRB-POPE stamlösningar kommer i en kloroformlösning, medan PI (4,5) P 2 (och andra fosfoinositider) beståndsdelar kommer i en lösningsmedelsblandning med kloroform: metanol: vatten (20: 9: 1). För noggrannhet, blöta pipettspetsen med kloroform innan du använder den. För säkerheten bör detta steg ske i en kemisk avloppsugn.
  3. Torka blandningen i en kvävegasflaska i en kemisk avloppsugn i 10 minuter eller tills lösningsmedlet avdunstar och en tunn lipidfilm bildas på botten av flaskan.
  4. Torka blandningen under vakuum i 3 timmar vid en vakuumstyrka av 10 mTorr för avlägsnande av eventuellt kvarvarande organiskt lösningsmedel.
    ANMÄRKNING: 3 timmars förtorkningstid är tillräcklig för omfattningen av SUV-preparat som beskrivs i detta protokoll, vilket är lämpligt för 50 experiment. Om en större skala av SUV-förberedelse krävs, kan överdriven torkning utföras.
  5. Rehydrera drEn lipidfilm med 5 ml löpande buffert (20 mM HEPES, 100 mM NaCl vid pH 7,0) och placera det i ett ultraljudsbad vid en driftsfrekvens på 35 kHz i 30 minuter vid RT.
    ANMÄRKNING: Blandning av mängderna lipider som anges i steg 3.1 och tillsats av 5 ml löpande buffert i steg 3.5 ger en vesikelsuspension vid 0,5 mg / ml. Vid detta stadium är vesikelsuspensionen en blandning av unilamellära och multilamellära vesiklar ( Figur 2B ). Lösningen kommer att visas rosa / lila i färg och relativt grumlig.
  6. Frys-tina vesikel suspensionen med flytande kväve och vattenbad vid 40 ° C för att få unilamellära vesiklar. Upprepa frysning-tina 10 gånger.
    OBS: (Valfritt) För att säkerställa avsaknaden av icke-unilamellära vesiklar i suspensionen kan centrifugeringsteget appliceras 32 , 33 .
  7. Extrudera vesikel suspensionen genom ett 0,10 μm spår-etsat polykarbonatmembran med hjälp av en lipid extruder (seTabell av material) för att berika för SUV. Upprepa extruderingen 10 gånger.
    OBS! Ett 15 ml koniskt rör kan användas för att samla de extruderade blåsorna. Lösningen borde vara tom för grumlighet i detta skede. SUV-diametern kan bekräftas via dynamisk ljusspridning (DLS) ( Figur 2C ). SUV är bäst lämpade för att bilda SLB 34 .
  8. Täck det koniska röret med aluminiumfolie och förvara vid 4 ° C tills det är klart att använda.

4. Montering av mikrofluidisk enhet

  1. Testa inlopp och utlopp på PDMS-blocket för blockering genom att spruta avjoniserat vatten genom hålen med en tvättvattenflaska. Torka sedan PDMS-blocket med kvävgas.
    OBS! Det här steget tar även bort eventuella dammpartiklar som kan ha fångats i och / eller mellan kanaler. Om nödvändigt, avlägsna eventuella dammpartiklar för rengjorda täckglas med kvävgas.
  2. Placera PDMS-blocket och förrensatTäckglas (se avsnitt 1) ​​inuti syreplasmasystemet (se tabell över material) provkammaren exponeras med syreplasma i 45 s med effektinställning vid 75 watt, syreflödeshastighet vid 10 cm 3 / min och vakuumstyrka vid 200 mTorr .
  3. Placera den mönstrade ytan av PDMS-blocket i kontakt med täckglaset omedelbart efter syreplasma-behandlingen. Tryck försiktigt för att ta bort eventuella luftbubblor på kontaktplatser.
  4. Placera enheten på en platt plattplatta vid 100 ° C under 3 minuter för att förbättra bindningen.
  5. Använd en våt luddfri torka ( t.ex. kimwipe) med 100% etanol för att avlägsna eventuella dammpartiklar från toppen (PDMS) och botten (glas) på enheten. Tappa sedan på enheten ovanpå ett glasmikroskopglas.
    OBS! Använd inte en stor mängd etanol och undvik att etanol kommer in i inlopps- och utloppskanalerna. Utför detta steg medan enheten fortfarande är het rekommenderas för att etanolen avdunstas omedelbart. GlasmikroOscopy diabilder kan lagras i 100% etanollösning för att avlägsna damm och andra föroreningar.

5. Framställning av stödda lipid-bilayers (SLB)

  1. Överföra 100 mikroliter av PI (4,5) P2-innehållande SUV från steg 3,8 i en 0,65 ml mikrocentrifugrör. Justera lösningens pH till ~ 3,2 genom att tillsätta 6,4 μl 0,2 N saltsyra.
    OBS: Bekräfta lösningens pH med en pH-mätare utrustad med en mikro-pH-sond (se tabell över material).
  2. Pipettera 10 μl av den pH-justerade SUV-lösningen i varje kanal genom inloppet och applicera tryck genom pipetten tills lösningen når utloppet. Lossa spetsen från pipetten och låt den fästas på enheten.
  3. Upprepa ovanstående steg för varje kanal och inkubera sedan enheten i 10 minuter vid RT.
    OBS! Injektion av blåsor i mikrokanaler ska utföras omedelbart efter montering av enheten.
  4. Skär uppsättningar av inlopps- och utloppsslangar ea60 cm (inloppsrör) och 8 cm långa utloppsslangar.
    OBS: Skär röret diagonalt och skapa en skarp kant, vilket gör det lättare att sätta in slangen i inlopp och utlopp. Utloppsslangen ska ha en bågform. Inloppsrörets längd kan variera beroende på mikroskopuppsättningen. Rörets inre diameter är 0,05 cm.
  5. Använd pincett, anslut utloppsslangen som är inställd till enheten, och testa sedan enheten på ett mikroskopsteg.
  6. Dunkla ena änden av inloppsslangen som sätts i 25 ml löpande buffert i ett koniskt rör och tejpa det för att se till att slangen är fastsatt.
  7. Placera det koniska röret på en högre mark (~ 20 cm) än enheten för att trycka lösningen genom mikrokanalerna via gravitationen; En lab jack kan användas för att uppnå detta.
  8. För varje inloppsrör, använd en spruta för att rita 1 ml löpbuffert från rörets fria ände. Ta bort pipettspetsen från inloppet och sätt iFri ände av inloppsslangen i anordningen.
    ANMÄRKNING: Sätt in en droppe löpbuffert på inloppet för att minska sannolikheten för att en luftbubbla introduceras i kanalen under detta steg. När inloppsröret är fäst vid enheten, använd en luddfri torka för att avlägsna överskottsbufferten.
  9. Upprepa ovanstående steg för att ansluta alla inloppsrörstycken till enheten.
    OBS: Flödande körbuffert genom kanalerna bidrar till att avlägsna överskott av vesiklar och jämvikta dubbellagret till experimentella förhållanden.
  10. Öppna mikroskopkontrollprogrammet (se materialtabell). På den vänstra panelen klickar du på fliken "Mikroskop" och väljer "10X" -målet.
  11. Klicka på "Live" och sedan "Alexa 568" bildikoner på verktygsfältet. Använda fin- och kursjusteringsknappen, fokusera på mikrokanalerna.
  12. Skanna igenom enheten för att kontrollera kvaliteten på SLB och kanalerna ( Figur 8 ). Sedan,Klicka på "FL Shutter Closed" bildikon på verktygsfältet.
  13. Klicka på fliken "Förvärv" och under "Grundläggande inställningar" välj "Exponeringstid". Ställ in exponeringstiden till "200 ms".
  14. På den vänstra panelen, klicka på "Multidimensionell förvärv" och under filtermenyn välj den röda kanalen (markerad som "Alexa 568"). Klicka sedan på menyn "time lapse", ställ in tidsintervallet till 5 minuter, varaktighet till 30 minuter och klicka på "Start".
    OBS: Baserat på varaktighet (30 min) och flödeshastighet (~ 1,0 μL / min) används 30 μl löpbuffert för att jämvikta SLB i en kanal, dvs 240 μl löpbuffert används för alla 8 kanaler.
  15. Välj "Circle" -verktyget under fliken "Mätning" och dra en cirkel i vilken kanal som helst. Högerklicka medan cirkeln är vald och välj "Egenskaper". Under fliken "Profil", markera "all T" för att visaFluorescensintensitet som en funktion av tiden.
    1. Se till att denna kurva når en platå, som indikerar jämvikten, innan du fortsätter till nästa steg.
  16. Sänk buffertlösningen till samma mark som enheten för att stoppa flödet.
  17. Spara tidsförloppsfilen.

6. Testning PLC-δ1 PH-domänen interaktion med PI (4,5) P2-innehållande SLBs

  1. Förbered utspädningar av PH-domänen med användning av löpbufferten som utspädningsmedel.
    OBS! Eftersom det finns åtta kanaler inom enheten, använd minst två av dem för tomma kontroller. Välj de bortre ändarna på varje sida och använd de återstående kanalerna för proteinutspädningar. Följande PH-domänkoncentrationer testades: 0,10, 0,25, 0,50, 1,00 och 2,50 uM. Cirka 200 jil av varje utspädning var tillräcklig för att uppnå jämvikt inom 30 minuter.
  2. En åt gången, lossa varje utloppsslang och applicera 200 μl av varje proteinutspädning iUtloppskanalen använder en pipett. Applicera inte något tryck, låt gravitationen göra arbetet. Lossa spetsen från pipetten och låt den fästas på den mikrofluidiska enheten.
  3. Upprepa ovanstående steg för varje kanal och se till att luftbubblor inte introduceras i kanalerna under denna process.
  4. Sänk inloppsslangen till en mark under den mikrofluidiska enheten för att börja flöda proteinet genom mikrokanalerna. Tape den fria änden av röret till en spillbehållare. Flöda proteinutspädningarna under 30 minuter.
    OBS: Detta kommer att vända flödet och låta proteinet introduceras i kanalerna. Tiden att jämviktning och volymen av proteinutspädningar som behövs kommer att vara beroende av samspelets affinitet.
  5. På fliken "Time Lapse" på den vänstra panelen av programvaran, klicka på "Start" för att börja avbilda igen.
  6. Upprepa steg 5.15 för att säkerställa att jämvikt uppnås. När experimentet är klart, spara tidsförloppetfil.

7. Bedömning av membranfluiditet

OBS: Fluorescensåterhämtning Efter Photobleaching (FRAP) bör experiment utföras med varje nytt parti SUV och rengörda glasöverdrag för att säkerställa att SLB: erna är flytande.

  1. Följ proceduren för rengöring av glasskyddsglas (1.1-1.6), tillverkning av mikropatternas PDMS-block (2.1-2.5), förberedelse av SUV (3.1-3.8), montering av mikrofluidisk enhet (4.1-4.5) och bildning av SLB (5.1-5.17) som tidigare beskrivits.
  2. Fokusera mikroskopet på dubbelskiktet, sätt exponeringstiden till 200 ms och bunka till 1.
  3. Bildblek en cirkulär fläck med en 532 nm, 2 mW laserstråle (13 μM radius). Omedelbart efter fotobildning börjar du ta en serie bilder var 3: e sekund under de första 45 s, följt av ett 30 s intervall för resten av tiden (15 min total varaktighet). När dataöverföringen är klar spar du tidsförloppsfilen.
  4. Välj den blekta aRea använder cirkelteckningverktyget för att extrahera fluorescensintensitetsvärden som en funktion av tiden. Dessutom väljer du ytterligare två områden i närheten, en som motsvarar en oblekt region och en som motsvarar en region utan SLB.
  5. Beräkna fluorescensåtervinningen ( y ) med hjälp av följande ekvation:
    Ekvation
    OBS: Här F t representerar intensiteten hos den blekta regionen som en funktion av tiden, F i representerar fluorescensintensiteten före blekning (använd "1" som en normaliserat värde i detta fall); F 0 är bakgrundsintensiteten.
  6. Plot fluorescensåterställning (y-axel) som en funktion av tiden (x-axeln) för att generera en FRAP-kurva. Montera sedan data till en enda exponentiell funktion enligt följande,
    Ekvation
    OBS: Här representerar A den mobila fraktionen och t 1/2 ):
    Ekvation
  7. Använd t 1/2 för att beräkna diffusionskonstanten ( D ):
    Ekvation
    OBS: Här representerar R strålningsradie (13 μm). Spridningskonstanten för ett vätskebilag bör vara ≥1,0 ​​μm 2 / s.

8. Behandlingsdata

OBS: Rutin i dataanalysen kommer att vara beroende av mikroskop, bildbehandlingsprogram och den kurvmonterande mjukvaran som används.

  1. Öppna tidsfördröjningsfilerna från tidigare (från steg 5.17) och efter (från steg 6.6) titrerar PH-domänen. Gå till den sista ramen för varje gång lapse-fil och gör en linjeskanning över alla mikrokanalerna för att få fluorescensEnce intensitetsdata som en funktion av avståndet i pixlar ( Figur 6A ). Överför data till ett kalkylprogram.
  2. För varje mikrokanal (före och efter PH-domäntillägg), prova några data i kanalen och vardera sidan av kanalen som representerar baslinjen ( Figur 7A ).
    OBS: Fluorescensintensiteten i blankkanalen borde ha förbli oförändrad. Alla andra kanaler normaliseras till den tomma kanalen, så det är avgörande att ha två tomma kanaler och se till att deras fluorescensintensiteter förblir förenliga med varandra.
  3. Använd formeln nedan för att normalisera data till den tomma kanalen; En provberäkning ges i figur 7B .
    Ekvation
    OBS: Här representerar ΔF- protein den subtraherade fluorescensintensiteten hos proteinkanalen, AF- blank representerar den bakgrundsdragen fluorescensintensiteten hos blankkanalen, före och efter hänvisar till före och efter proteintitreringssteg, och a representerar korrigeringsfaktorn som är förhållandet mellan proteinkanals fluorescensintensiteter och blankkanalen ([ F- protein / F- ämne ] pre ) vid ett pre-proteintitreringssteg. Eftersom fluorescensintensiteten minskar som en funktion av PH-domänkoncentrationen kommer normaliserade data att vara negativa i värde.
  4. Använd en kurvmonteringsprogramvara (se Material tabell ), avbilda den normaliserade fluorescensen som en funktion av PH domänkoncentration och passa till en Langmuir isoterm ( Figur 6C ):
    Ekvation
    OBS: Här representerar ΔF förändringen i fluorescensintensiteten i förhållande till den maximala förändringen i fluoRescensintensitet när en mättnadskoncentration av protein är närvarande ( AF max ), medan Kd, app representerar den uppenbara dissociationskonstanten, vilken är lika med bulkproteinkoncentrationen ( [PLC-δ PH] ) vid vilken 50% täckning ( Membranbundet komplex) uppnås. Detta är ett jämviktsbaserat bindande mätvärde så att normaliserad data passar till en enkel Langmuir isoterm för att extrahera en uppenbar experimentell parameter K d, app . Baserad på den anpassningsprogramvaran Kd, app för PLC-δ1 PH-PI (4,5) P 2 interaktion är 0,39 ± 0,05 | iM (figur 6B).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi använt pH module analys för att studera PLC-δ1 PH-domänen-PI (4,5) P 2 interaktion inom en PIP-on-a-chip mikroanordning (figur 1). Genom ett detaljerat protokoll visade vi hur man förbereder och monterar mikrofluidiska komponentdelar, tillverkar små unilamellära vesiklar (SUV) ( Figur 2 ), bildar SLB i en enhet ( Figur 3 ) och testad proteinbindning till PIP-innehållande SLB. Ett flödesschema över ett typiskt SLB-bindande experiment visas i figur 4 . Principen av pH moduleringsanalysen illustreras i figur 5 med användning av PH-domänen-PI (4,5) P 2-bindning som ett exempel. Resultat erhållna från denna studie antydde att PH-domänen binder till PI (4,5) P2-innehållande SLBs. Mer specifikt observerade vi att vid bindning blev det lokala pH-värdet mer grundläggande. Detta Lokal pH-förändring avkändes av den o SRB-POPE fluorescerande proben närvarande inom SLB, vilken därefter släcktes i enlighet därmed ( Figur 6A , 6C ). Avkylningen var koncentrationsberoende och mättbar, så att passning av data till en Langmuir isoterm gav en Kd, app på 0,39 ± 0,05 uM ( Figur 6B , 6D ). PH-domänen uppvisade selektivitet mot PI (4,5) P2, eftersom ingen bindning observerades mot POPC (zwitterjonisk lipid), och svagare bindning mot PI4P-innehållande SLBs (Kd, app = 1,02 ± 0,20 pM) (fig 6B). En provberäkning ingår för att visa hur fluorescensdata behandlas ( Figur 7 ). I figur 8 presenteras serier av mikrokanalbilder för att ge visuella ledtrådar vid bestämning av kvaliteten på SLB och mikrokanalerna.

_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figur 1
Figur 1: Mikrofluidisk PIP-på-chip-enhet för studier av protein-PIP-interaktioner. ( A ) Den mikrofluidiska anordningen har 8 mikrokanaler med 8 inlopp och 8 utlopp. Färgade lösningar flödades igenom för att göra kanalerna synliga i den här bilden. Enheten är 2,0 cm i bredd (x), 0,5 cm i höjd (y) och 3,0 cm i längd (z). ( B ) Mikrokanalernas golv är glas, medan väggarna och taken består av polydimetylsiloxan (PDMS). Varje mikrokanal är 100 μm i bredd, 40 μm i höjd och 1 cm i längd. Avståndet mellan två intilliggande mikrokanaler är 40 μm. Stödda lipid bilayers (SLB) bildas ovanpå glasytan. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2
Figur 2. Små unilamellär vesikel (SUV) preparat och kvalitetskontrollstudier. ( A ) Lipidkomponenter som används vid framställning av vesiklar: orto- sulforhodamin B-POPE ( o SRB-POPE), L-a-fosfatidylinositol-4-fosfat (PI4P), L-a-fosfatidylinositol-4,5-bisfosfat PI (4,5) P2), och en-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (POPC). ( B ) Typer av lipidvesiklar: SUV, stor unilamellär vesikel (LUV), jätte unilamellär vesikel (GUV) och multilamellär vesikel (MLV). SUV är bäst lämpade för framställning av SLB 34 . ( C ) Dynamisk ljusspridning (DLS) baserad bekräftelse på storleken på blåsorna efter lipid extrudering (genom 0,1 μm filter). Hydrodynamisk radie (Rh) på 53,9 nm bekräftar att m Ean av vesikelstorleksfördelningen är ~ 100 nm. Resultat representerar mätningen från PI (4,5) P2-innehållande SUVs. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3
Figur 3: SLB-bildning på ett glasstöd. ( A ) Vesiklar av önskad lipidkomposition framställes och strömmar sedan genom mikrokanaler. Vesiklar adsorberas till glasytan och deformeras. När en kritisk ytvikt uppnåtts sprider vesiklarna spontant för att bilda SLB. Anpassad från referenser 35 , 36 . ( B ) SLB: er inom en enhet under 10X-mål visas. Alexa 568 filteruppsättning (excitation / emission vid 576/603 nm) används.Ource.jove.com/files/ftp_upload/55869/55869fig3large.jpg "target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 4
Figur 4: Flödesschema för ett typiskt SLB-bindningsexperiment. Mikrofluidiska komponentdelar, dvs mönstrade PDMS-block och rengjorda täckglas, behandlas med syreplasma för att göra båda ytorna hydrofila och sedan monterade. SUV sänds genom mikrokanaler för att bilda SLB. Överskott av vesiklar avlägsnas och SLB: erna balanseras till experimentella förhållanden genom att flyta en löpande buffertlösning. Därefter strömmar proteinutspädningar genom mikrokanaler. Slutligen analyseras fluorescensintensitetsdata, normaliseras och plottas som en funktion av proteinkoncentration. Den normaliserade data är lämplig för en funktion för att extrahera en uppenbar dissociationskonstant ( K d, app ) value. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 5
Figur 5: Principer för pH-moduleringsbaserad avkänning. (A) röntgenkristallstruktur av PLC-δ1 PH-domänen i komplex med PI (4,5) P 2 huvudgrupp inositol-1,4,5-trisfosfat (Ins (1,4,5) P3) (PDB ID: 1MAI) 37 . (B) o SRB-POPE proben är mycket fluorescerande vid lågt pH och släcktes vid högt pH med pKa 6,7 inom 7,5 mol-% PI (4,5) P 2 -innehållande SLBs som anges i det pH-titreringskurvan. ( C ) Den PH-domän som användes i denna studie har en isoelektrisk punkt (pI) på 8,4, så vid proteintillståndet (7,0) är proteinet positivt laddat. Med en netto positiv cHarge, lockar proteinet OH - joner. När PH-domänen binder till PI (4,5) P2-innehållande SLBs, medför den OH - joner till membranytan, är gränspotentialen module vilket i sin tur förskjuter protonetillstånd o SRB-POPE, och dess fluorescens Släckes i PH-domänkoncentrationsberoende sätt. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 6
Figur 6: PLC-δ1 PH-membranbindning övervakad via pH-modulering. ( A ) Mikrokanalernas uppfattning före och efter tillsättning av PH-domänen vid angivna koncentrationer. (B) Jämförelse av de affiniteter mot POPC, PI4P, och PI (4,5) P2-innehållande SLBs. PH-domänbindning till 7,5 mol-% PI (4,5) P2-innehållande SLBs gav ett Kd, app av 0,39 ± 0,05 ^ M. Svagare bindning observerades mot 7,5 mol% PI4P-innehållande SLB ( K d, app på 1,02 ± 0,20 μM) och ingen bindning observerades för rena POPC SLB. Felstavar indikerar SEM (n = 3). Two-tailed t-test användes för att jämföra de affiniteter mellan PI4P och PI (4,5) P 2-bindande (* p = 0,0396). (C) Fluorescensintensiteter från linjen avsöka över mikrokanaler är avsatta som en funktion av avståndet i pixlar för POPC, PI4P, och PI (4,5) P2 bindningsförsök. (D) Normaliserad och medelvärdes POPC, PI4P, och PI (4,5) P 2 bindningsdata plottas som en funktion av PLC-δ1 PH-domänen koncentration och sedan passa till en Langmuir isoterm för att extrahera Kd, app. Se ekvationen i steg 8.4 för detaljer."Target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 7
Figur 7: Provberäkning för databehandling. ( A ) Före (svart) och efter (röd) proteintitreringskanalsökningdata för tomt (nej protein) och proteinkanal, där fluorescensintensitetsdata presenteras som en funktion av avståndet i pixlar. Skuggade områden representerar de regioner som användes för att extrahera data för beräkningarna. Baslinjens fluorescensintensitetsdata extraheras strax före och efter varje kanal. ( B ) Data extraheras för tomma och proteinkanaler, både före och efter proteintitrering. Medelvärden tas för baslinjen och inom en kanalfluorescensdata. Efter baslinjedunktion normaliseras fluorescensdatan till blankkanalen. Se ekvationen i steg 8.3 för detaljer. Href = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55869/55869fig7large.jpg" target = "_ blank"> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 8
Figur 8: Bedömning av SLB: er och mikrokanalers integritet. ( A ) En bild som illustrerar högkvalitativa SLB och mikrokanaler. ( B ) Ofullständig fusion. ( C ) kondenserade mikrokanaler. ( D ) Dammpartikel fångad i en mikrokanal. ( E ) Luftbubblor fångade i mikrokanaler. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Kompletterande fil 1: Pattern_Design.dwgBlank "> Vänligen klicka här för att ladda ner filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Varje PIP-variant, om än i låga koncentrationer, är närvarande på den cytosoliska ytan av specifika organeller där de bidrar till upprättandet av en unik fysisk sammansättning och funktionell specificitet hos det organella membranet 1 . En av de viktigaste användningarna av PIP är som en specifik dockningsplattform för de många proteiner som kräver specifik subcellulär lokalisering och / eller aktivering 6 , 7 . På grund av sin roll i cellfysiologi och sjukdom är möjligheten att studera protein-PIP-interaktioner in vitro , i ett fysiologiskt relevant sammanhang viktigt. Analysformatet som beskrivs häri medger att man kan överväga protein-PIP-interaktioner i sammanhanget av ett fluidlipid-dubbelskikt, i närvaro av en blandning av fosfolipider, med den normala presentationen av polarhuvudgruppen och fettacylkedjor med naturlig längd.

Denna analys, i kombinationPå med pH-modulering som dess detekteringssystem och SLB som ett modellmembransystem som sätts i en mikrofluidisk plattform, ger unika fördelar jämfört med andra membranbindande tekniker. Först och främst sparar den mikrofluidiska plattformen på material på grund av de låga kraven för både protein och lipider (40 nL total kanalvolym, 1,0 mm 2 SLB ytarea). Dessutom kan fysiologiskt relevanta lipidkompositioner användas samtidigt som tvådimensionell membranfluiditet (≥1,0 μm 2 / s) 28 , 38 upprätthålls. Detekteringssystemet ger förbättrat signal-brusförhållande jämfört med ITC, SPR och kvartskristallmikrobalans med övervakning (QCM-D), vilket gör att man kan testa inte bara proteamembraninteraktioner utan jon, liten molekyl, peptid-membraninteraktioner som Brunn 19 , 20 , 39 , 40 . Den pH-känsliga fluorescerande proben är också mycket stabil och inte fotobleak under de försöksbetingelser som testats 19 , 20 , 41 . En annan fördel med denna plattform är möjligheten att observera membranytorna visuellt. Vissa interaktioner kan inducera lipidmikrodomänbildning och / eller påverka membranfluiditeten, som kan visualiseras direkt och / eller testas via fluorescensåtervinning efter fotobildning (FRAP) respektive 42 . Analysen som beskrivs här kräver ingen dyra instrumentation bortom ett fluorescensmikroskop. Slutligen, och viktigast av allt, att utvärdera membraninteraktioner i frånvaro av ligand / receptormärkning gör PIP-on-a-chip-analysen den föredragna metoden över de traditionella.

Även om PIP-on-a-chip-analysen är en kraftfull teknik kan perifera membranproteiner diffEr i den totala sammansättningen av katjoniska och anjoniska rester och deras fördelning inom / runt bindningsstället, vilket skapar vissa utmaningar. Vissa proteiner har PIP-bindningsställen som består av många basiska rester, medan andra endast har några. Därför, H + / OH - förhållandet vid bindningsstället kommer att vara annorlunda, och så är storleken av förändringen i lokala pH-värdet vid bindning. Stökiometrin för interaktionen och huruvida PIP-bindningen stabiliseras genom interaktioner med andra lipider komplicerar dessutom fallet. Följaktligen kan pI av ett protein, speciellt för ett stort protein, inte vara den enda indikatorn för den förväntade fluorescensändringen. Medan vissa protein-PIP-interaktioner kommer att resultera i stora fluorescensförändringar kan resten resultera i små fluorescensförändringar. I det senare fallet kan åtminstone två åtgärder vidtas för att förbättra signal-brusförhållandet: 1) Användning av större PIP-nivåer på dubbellagret för att öka antalet proteiner recruited till ytan, dvs ökning av antalet rekryterade OH - joner och antalet kylda o SRB-POPE-molekyler; 2) Öka o SRB-POPE-nivåerna för att förbättra signal-brusförhållandet.

Även om den nuvarande plattformen ger många fördelar för att studera perifer membranproteiner, har det några utmaningar för studien av transmembranproteiner. På grund av SLB-glasstödets närhet (vattenskiktet är ca 1-2 nm beroende på lipidsammansättningen) kan transmembranprotein-glasstödsinteraktion främja proteindetaturering, leda till funktionsförlust och immobilisering 34 , 43 , 44 , 45 . Trots att mer involverade har en mängd olika metoder utvecklats för att övervinna dessa utmaningar, såsom ytmodifikation av glasstödet för att tillhandahålla polymerkudde eller inkluderande lipopolymer(T ex PEGylerade lipider) i dubbelskiktet för att öka SLB-glasstödsavståndet 34 , 46 , 47 , 48 .

Att bilda högkvalitativa SLB-er är den mest kritiska aspekten av PIP-on-a-chip-analysen ( Figur 8A ). Använda rena täckglas och färska SUV rekommenderas för att säkerställa reproducerbarhet. På grund av närvaron av anjoniska lipider, såsom PI (4,5) P2, är SUVs negativt laddade, vilket sänker SUV bristning effektivitet och påverkar membranfluiditeten (figur 8B). Därför är pH-justering av SUV-lösning avgörande för att protonera PI (4,5) P2 huvudgrupps fosfater och minska den elektrostatiska repulsionen med glaset för att öka bristning effektiviteten 49, 50. SUV som inte innehåller anjoniska lIpids, kräver ingen pH-justering. Dessutom bör SUV: er injiceras i kanaler strax efter syreplasmabehandling och bindning, medan glasskyddsytan fortfarande är hydrofil, vilket krävs för SLB-bildning. Förutom SLB-kvalitet representerar dammpartiklar en annan fråga. Under anordningstillverkningsprocessen kan en dammpartikel som fastnar mellan kanaler orsaka kanalfusion, medan en dammpartikel som fångas inuti en kanal kan skada SLB och / eller minska flödeshastigheten för flödet ( Figur 8C, 8D ). Arbetsområdet bör rengöras regelbundet för att avlägsna damm. På liknande sätt bör exponering av en luftbubbla i en kanal undvikas vid vilket steg som helst som annars skadar SLB-oreversibelt ( Figur 8E ).

En annan parameter som bör beaktas vid planering av en PIP-på-chip-analys är proteinlagringsbufferten. Om de används vid höga koncentrationer, kan enskilda komponenter (Stabiliseringsmedel, reduktionsmedel, salter, antimikrobiella medel, kelateringsreagenser, etc. ) kan påverka fluorescens- och / eller SLB-integriteten. Därför bör lagringsbufferten titreras för att testa dess effekt. Om en effekt observeras bör även SLB: erna jämviktas till lagringsbuffertförhållandena före titreringen av proteinet för att förhindra en fluorescensdrift. Med tanke på att detta är en pH-moduleringsbaserad analys, bör det renade proteinet, om möjligt, även innehålla samma buffrande komponent som löpbufferten (i detta fall 20 mM HEPES vid pH 7,0) för att minimera driften i fluorescens orsakad av buffertmatchningen.

Sammanfattningsvis har vi visat att pH-moduleringsanalysen kan användas med framgång för att undersöka protein-PIP-interaktioner. Trots att tyngdpunkten var på PIP, kan denna plattform användas för att testa interaktioner med mer komplexa membransystem som inkluderar andra fysiologiskt relevanta lipider, såsom fosfatidylseriNe, fosfatidyletanolamin, fosfatidinsyra och kolesterol, bland annat 28 , 39 , 42 , 51 . Utöver cellulära proteiner kan denna analysplattform också vara till nytta för dem som studerar mänskliga patogener. Till exempel har proteiner kodade av virus och bakterier visat sig interagera med cellulära membran och vissa specifikt med PIP 52 , 53 , 54 , 55 , 56 . Följaktligen kan PIP-på-en-chip-analys tillhandahålla ett medel för att upptäcka och karakterisera småmolekylhämmare för protein-PIP-interaktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att avslöja.

Acknowledgments

DS och CEC stöddes delvis, genom bidrag AI053531 (NIAID, NIH); SS och PSC stöddes av bidrag N00014-14-1-0792 (ONR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coverslip
Glass Coverslips: Rectangles Fisher Scientific 12-544B 22 x 40 x 0.16 - 0.19 mm, No. 1 1/2; Borosilicate Glass
7X Cleaning Solution MP Biomedicals 976670 Detergent
PYREX Crystallizing Dish Corning 3140-190 Borosilicate glass dish with a flat bottom; Diameter x Height (190 x 100 mm); Distributor: VWR (89090-700)
Sentry Xpress 2.0 Paragon Industries SC-2 Kiln
Name Company Catalog Number Comments
PDMS
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 4019862 Polydimethylsiloxane (PDMS); Distributor: Ellsworth Adhesives
PYREX Desiccator VWR 89134-402 Vacuum Rated
Biopsy punch Harris 15110-10 Harris Uni-Core; 1.0 mm diameter; Miltex Biopsy Punch with Plunger (Cat. No. 15110-10) can be used as an alternative
Name Company Catalog Number Comments
Device
Plasma Cleaning System PlasmaEtch PE25-JW 2-stage Direct Drive Oil Vacuum Pump, O2 service (Krytox Charged)
Digital Hot Plate Benchmark H3760-H Purchased through Denville Scientific (Cat. No. 1005640)
Frosted Micro Slides VWR 48312-003 Frosted, Selected, and Precleaned; Made of Swiss Glass; Thickness: 1 mm; Dimensions: 75 x 25 mm; GR 144
Name Company Catalog Number Comments
Mold
AutoCAD Autodesk v.2016 Drafting software for the photomask design
Photomask CAD/Art Services N/A Design with black background and clear features was printed at 20k dpi resolution on a transparent mask (5 x 7 in) by CAD/Art Services
Silicone Wafers University Wafer 1575 Prime Grade, Single Side Polished; 100 mm (4 inch) Diameter; 525 um Thickness
SU-8 50 MicroChem Corp. N/A Negative Tone Photoresist; Penn State Nanofabrication Facility Property
SU-8 Developer MicroChem Corp. N/A Penn State Nanofabrication Facility Property
Name Company Catalog Number Comments
SUV
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850457C POPC
L-α-phosphatidylinositol-4-phosphate Avanti Polar Lipids 840045X PI4P
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate Avanti Polar Lipids 840046X PI(4,5)P2
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine Avanti Polar Lipids 850757C POPE; Required for the synthesis of oSRB-POPE
Lissamine Rhodamine B Sulfonyl Chloride (mixed isomers) ThermoFisher Scientific L-20 Required for the synthesis of oSRB-POPE
pH Sensitive Fluorescent Lipid Probe (oSRB-POPE) In-house N/A In-house Synthesis (Huang D. et al. 2013)
Glass Scintillation Vial VWR 66022-065 20 mL volume capacity
Aquasonic 250D VWR N/A Ultrasonic Water Bath
Nuclepore Track-Etched Membranes Whatman 110605 Polycarbonate Membrane; Diameter: 25 mm; Pore Size: 0.1 um; Distributor: Sigma-Aldrich
Chloroform VWR CX1054-6 HPLC grade
LIPEX Extruder Transferra Nanosciences T.001 LIPEX 10 mL Thermobarrel Extruder
Viscotek 802 DLS Malvern Instruments N/A Dynamic Light Scattering; Penn State X-Ray Crystallography Facility Property
Name Company Catalog Number Comments
Data Analysis
GraphPad Prism GraphPad Software v.6 Curve-fitting software for data analysis
Name Company Catalog Number Comments
Microscope
Axiovert 200M Epifluorescence Microscope Carl Zeiss Microscopy N/A Microscope
AxioCam MRm Camera Carl Zeiss Microscopy N/A Camera
X-Cite 120 Excelitas Technologies N/A Light Source
Alexa 568 Filter Set Carl Zeiss Microscopy N/A Ex/Em 576/603 nm
AxioVision LE64 v.4.9.1.0 Software Carl Zeiss Microscopy N/A Image Processing Software
Name Company Catalog Number Comments
Other
Tips VWR 10034-132 200 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the protein solution into the microfluidic channel
Tips VWR 53509-070 10 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the vesicle solution into the microfluidic channel
Orion Star A321 pH meter Thermo Scientific STARA3210 pH meter
Orion micro pH probe Thermo Scientific 8220BNWP micro pH probe
N-(2-Hydroxyethyl)-Piperazine-N'-(2-Ethanesulfonic Acid) VWR VWRB30487 HEPES, Free Acid
Sodium Chloride VWR BDH8014-2.5KGR NaCl
Tubing Allied Wire & Cable TFT-200-24 N Internal Diameter: 0.020-0.026 inches (0.051-0.066 cm); Wall Thickness: 0.010 inches (0.025 cm); Flexible Polytetrafluoroethylene Thin-Wall Tubing; Natural Color
Nitrogen Gas - Industrial Praxair N/A Local Provider
Oxygen Gas - Industrial Praxair N/A Local Provider
Liquid Nitrogen Praxair N/A Local Provider

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443, (7112), 651-657 (2006).
  2. Shewan, A., Eastburn, D. J., Mostov, K. Phosphoinositides in cell architecture. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (8), a004796 (2011).
  3. Picas, L., Gaits-Iacovoni, F., Goud, B. The emerging role of phosphoinositide clustering in intracellular trafficking and signal transduction. F1000Res. 5, (2016).
  4. Lystad, A. H., Simonsen, A. Phosphoinositide-binding proteins in autophagy. FEBS Lett. 590, (15), 2454-2468 (2016).
  5. Balla, T. Phosphoinositides: Tiny lipids with giant impact on cell regulation. Physiol Rev. 93, 1019-1137 (2013).
  6. Lemmon, M. A. Membrane recognition by phospholipid-binding domains. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, (2), 99-111 (2008).
  7. Kutateladze, T. G. Translation of the phosphoinositide code by PI effectors. Nat Chem Biol. 6, (7), 507-513 (2010).
  8. Harlan, J. E., Hajduk, P. J., Yoon, H. S., Fesik, S. W. Pleckstrin homology domains bind to phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate. Nature. 371, (6493), 168-170 (1994).
  9. Garcia, P., et al. The pleckstrin homology domain of phospholipase C-delta 1 binds with high affinity to phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in bilayer membranes. Biochemistry. 34, (49), 16228-16234 (1995).
  10. Lemmon, M. A., Ferguson, K. M., O'Brien, R., Sigler, P. B., Schlessinger, J. Specific and high-affinity binding of inositol phosphates to an isolated pleckstrin homology domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, (23), 10472-10476 (1995).
  11. Flesch, F. M., Yu, J. W., Lemmon, M. A., Burger, K. N. Membrane activity of the phospholipase C-delta1 pleckstrin homology (PH) domain. Biochem J. 389, 435-441 (2005).
  12. Narayan, K., Lemmon, M. A. Determining selectivity of phosphoinositide-binding domains. Methods. 39, (2), 122-133 (2006).
  13. Scott, J. L., Musselman, C. A., Adu-Gyamfi, E., Kutateladze, T. G., Stahelin, R. V. Emerging methodologies to investigate lipid-protein interactions. Integr Biol (Camb). 4, (3), 247-258 (2012).
  14. Dowler, S., Currie, R. A., Downes, C. P., Alessi, D. R. DAPP1: A dual adaptor for phosphotyrosine and 3-phosphoinositides. Biochem J. 342, 7-12 (1999).
  15. He, J., et al. Molecular basis of phosphatidylinositol 4-phosphate and ARF1 GTPase recognition by the FAPP1 pleckstrin homology (PH) domain. J Biol Chem. 286, (21), 18650-18657 (2011).
  16. Ceccarelli, D. F., et al. Non-canonical interaction of phosphoinositides with pleckstrin homology domains of Tiam1 and ArhGAP9. J Biol Chem. 282, (18), 13864-13874 (2007).
  17. Huang, S., Gao, L., Blanchoin, L., Staiger, C. J. Heterodimeric capping protein from Arabidopsis is regulated by phosphatidic acid. Mol Biol Cell. 17, (4), 1946-1958 (2006).
  18. Yu, J. W., et al. Genome-eide analysis of membrane targeting by S. cerevisiae pleckstrin homology domains. Mol Cell. 13, (5), 677-688 (2004).
  19. Jung, H., Robison, A. D., Cremer, P. S. Detecting protein-ligand binding on supported bilayers by local pH modulation. J Am Chem Soc. 131, (3), 1006-1014 (2009).
  20. Huang, D., Zhao, T., Xu, W., Yang, T., Cremer, P. S. Sensing small molecule interactions with lipid membranes by local pH modulation. Anal Chem. 85, (21), 10240-10248 (2013).
  21. Saxena, A., et al. Phosphoinositide binding by the pleckstrin homology domains of Ipl and Tih1. J Biol Chem. 277, (51), 49935-49944 (2002).
  22. Knödler, A., Mayinger, P. Analysis of phosphoinositide-binding proteins using liposomes as an affinity matrix. Biotechniques. 38, (6), 858-862 (2005).
  23. Baumann, M. K., Swann, M. J., Textor, M., Reimhult, E. Pleckstrin homology-phospholipase C-delta1 interaction with phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate containing supported lipid bilayers monitored in situ with dual polarization interferometry. Anal Chem. 83, (16), 6267-6274 (2011).
  24. Saliba, A. E., et al. A quantitative liposome microarray to systematically characterize protein-lipid interactions. Nat Methods. 11, (1), 47-50 (2014).
  25. Arauz, E., Aggarwal, V., Jain, A., Ha, T., Chen, J. Single-molecule analysis of lipid-protein interactions in crude cell lysates. Anal Chem. 88, (8), 4269-4276 (2016).
  26. Best, Q. A., Xu, R., McCarroll, M. E., Wang, L., Dyer, D. J. Design and investigation of a series of rhodamine-based fluorescent probes for optical measurements of pH. Org Lett. 12, (14), 3219-3221 (2010).
  27. Lee, J., Choi, K. H., Yoo, K. Innovative SU-8 lithography techniques and their applications. Micromachines. 6, (1), 1-18 (2014).
  28. Poyton, M. F., Sendecki, A. M., Cong, X., Cremer, P. S. Cu(2+) binds to phosphatidylethanolamine and increases oxidation in lipid membranes. J Am Chem Soc. 138, (5), 1584-1590 (2016).
  29. Karasek, P., Grym, J., Roth, M., Planeta, J., Foret, F. Etching of glass microchips with supercritical water. Lab Chip. 15, (1), 311-318 (2015).
  30. Thomas, M. S., et al. Print-and-peel fabrication for microfluidics: what's in it for biomedical applications? Ann Biomed Eng. 38, (1), 21-32 (2010).
  31. Waheed, S., et al. 3D printed microfluidic devices: enablers and barriers. Lab Chip. 16, (11), 1993-2013 (2016).
  32. Axmann, M., Schutz, G. J., Huppa, J. B. Single molecule fluorescence microscopy on planar supported bilayers. J Vis Exp. (105), e53158 (2015).
  33. Barenholz, Y., et al. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. Biochemistry. 16, (12), 2806-2810 (1977).
  34. Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surface Science Reports. 61, (10), 429-444 (2006).
  35. Hamai, C., Yang, T., Kataoka, S., Cremer, P. S., Musser, S. M. Effect of average phospholipid curvature on supported bilayer formation on glass by vesicle fusion. Biophys J. 90, (4), 1241-1248 (2006).
  36. Tero, R. Substrate effects on the formation process, structure and physicochemical properties of supported lipid bilayers. Materials. 5, (12), 2658-2680 (2012).
  37. Ferguson, K. M., Lemmon, M. A., Schlessinger, J., Sigler, P. B. Structure of the high affinity complex of inositol trisphosphate with a phospholipase C pleckstrin homology domain. Cell. 83, (6), 1037-1046 (1995).
  38. Simonsson, L., Hook, F. Formation and diffusivity characterization of supported lipid bilayers with complex lipid compositions. Langmuir. 28, (28), 10528-10533 (2012).
  39. Cong, X., Poyton, M. F., Baxter, A. J., Pullanchery, S., Cremer, P. S. Unquenchable surface potential dramatically enhances Cu(2+) binding to phosphatidylserine lipids. J Am Chem Soc. 137, (24), 7785-7792 (2015).
  40. Robison, A. D., et al. Polyarginine interacts more strongly and cooperatively than polylysine with phospholipid bilayers. J Phys Chem B. 120, (35), 9287-9296 (2016).
  41. Robison, A. D., Huang, D., Jung, H., Cremer, P. S. Fluorescence modulation sensing of positively and negatively charged proteins on lipid bilayers. Biointerphases. 8, (1), 1 (2013).
  42. Tabaei, S. R., et al. Formation of cholesterol-rich supported membranes using solvent-assisted lipid self-assembly. Langmuir. 30, (44), 13345-13352 (2014).
  43. Johnson, S. J., et al. Structure of an adsorbed dimyristoylphosphatidylcholine bilayer measured with specular reflection of neutrons. Biophys J. 59, (2), 289-294 (1991).
  44. Koenig, B. W., et al. Neutron reflectivity and atomic force microscopy studies of a lipid bilayer in water adsorbed to the surface of a silicon single crystal. Langmuir. 12, (5), 1343-1350 (1996).
  45. Tanaka, M., Sackmann, E. Polymer-supported membranes as models of the cell surface. Nature. 437, (7059), 656-663 (2005).
  46. Renner, L., et al. Supported lipid bilayers on spacious and pH-responsive polymer cushions with varied hydrophilicity. J Phys Chem B. 112, (20), 6373-6378 (2008).
  47. Wagner, M. L., Tamm, L. K. Tethered polymer-supported planar lipid bilayers for reconstitution of integral membrane proteins: Silane-polyethyleneglycol-lipid as a cushion and covalent linker. Biophys J. 79, (3), 1400-1414 (2000).
  48. Pace, H., et al. Preserved transmembrane protein mobility in polymer-supported lipid bilayers derived from cell membranes. Anal Chem. 87, (18), 9194-9203 (2015).
  49. Braunger, J. A., Kramer, C., Morick, D., Steinem, C. Solid supported membranes doped with PIP2: Influence of ionic strength and pH on bilayer formation and membrane organization. Langmuir. 29, (46), 14204-14213 (2013).
  50. Paridon, P. A., de Kruijff, B., Ouwerkerk, R., Wirtz, K. W. Polyphosphoinositides undergo charge neutralization in the physiological pH range: A 31P-NMR study. Biochim Biophys Acta. 877, (1), 216-219 (1986).
  51. Liu, C., Huang, D., Yang, T., Cremer, P. S. Monitoring phosphatidic acid formation in intact phosphatidylcholine bilayers upon phospholipase D catalysis. Anal Chem. 86, (3), 1753-1759 (2014).
  52. Saad, J. S., et al. Structural basis for targeting HIV-1 Gag proteins to the plasma membrane for virus assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, (30), 11364-11369 (2006).
  53. Hsu, N. Y., et al. Viral reorganization of the secretory pathway generates distinct organelles for RNA replication. Cell. 141, (5), 799-811 (2010).
  54. Del Campo, C. M., et al. Structural basis for PI(4)P-specific membrane recruitment of the Legionella pneumophila effector DrrA/SidM. Structure. 22, (3), 397-408 (2014).
  55. Kolli, S., et al. Structure-function analysis of vaccinia virus H7 protein reveals a novel phosphoinositide binding fold essential for poxvirus replication. J Virol. 89, (4), 2209-2219 (2015).
  56. Cho, N. J., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate is an HCV NS5A ligand and mediates replication of the viral genome. Gastroenterology. 148, (3), 616-625 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics