PIP על שבב: מחקר ללא תווית של אינטראקציות חלבון- phosphoinositide

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

כאן אנו מציגים bilayer שומנים בדם בהקשר של פלטפורמת microfluidic ללמוד אינטראקציות חלבון- phosphoinositide בשיטה ללא תווית המבוססת על אפנון pH.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Shengjuler, D., Sun, S., Cremer, P. S., Cameron, C. E. PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions. J. Vis. Exp. (125), e55869, doi:10.3791/55869 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

חלבונים תאיים רבים אינטראקציה עם משטחי קרום להשפיע על תהליכים תאיים חיוניים. אינטראקציות אלו יכולות להיות מכוונות כלפי רכיב שומנים מסוים בתוך קרום, כמו במקרה של phosphoinositides (PIPs), כדי להבטיח לוקליזציה תת-תאית ספציפית ו / או הפעלה. PIPs ותחומים PIP מחייב הסלולר נחקרו בהרחבה כדי להבין טוב יותר את תפקידם פיזיולוגיה הסלולר. אנו להחיל assay pH אפנון על bilayers השומנים הנתמכים (SLBs) ככלי ללמוד אינטראקציות חלבון PIP. במחקרים אלה, phosphatidylethanolamine אורתו רגיש pH -Sulforhodamine B מצומדות משמש לזיהוי אינטראקציות חלבון-PIP. על מחייב של חלבון על משטח קרום המכיל PIP, פוטנציאל interfacial מאופנן ( כלומר שינוי pH המקומי), הזזת מצב פרוטוניון של בדיקה. מחקר מקרה של שימוש מוצלח של assay אפנון pH מוצג באמצעות phospholipase C delta1 Pleckstrב Homology (PLC-δ1 PH) תחום ו phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI (4,5) P 2 ) אינטראקציה כדוגמה. קבועה דיסוציאציה לכאורה ( K ד, App ) עבור אינטראקציה זו היה 0.39 ± 0.05 מיקרומטר, בדומה K , ד ערכים שהושגו על ידי אחרים. כפי שנצפה בעבר, תחום PLC-δ1 PH הוא PI (4,5) P 2 ספציפי, מראה מחייב חלש יותר כלפי phosphatidylinositol 4-phosphate, ולא מחייב טהור phosphatidylcholine SLBs. ה- PIP על שבב assay הוא יתרון על פני מבחני PIP מחייב המסורתית, כולל אך לא מוגבל נפח מדגם נמוך ולא ליגנד / קולטן תיוג דרישות, היכולת לבדוק אינטראקציות קרום גבוה זיקה נמוכה זיקה עם קטן ו מולקולות גדולות, ושיפור האות לרעש יחס. לפיכך, השימוש בגישה PIP-on-a-chip יאפשר הבהרה של מנגנונים של מגוון רחב של אינטראקציות קרום. יתר על כן, שיטה זו עלולה להיות uSed בזיהוי תרפויטים המווסתים את יכולתו של החלבון לקיים אינטראקציה עם ממברנות.

Introduction

אינטראקציות מרובות תהליכים ביוכימיים מתרחשים על משטחים נוזל מימדי דו מימדי. אורגניזמים בממברנה בתאים אאוקריוטים ייחודיים לא רק בתהליכים ביוכימיים ובפרוטאומה הקשורה אליהם, אלא גם בהרכב השומנים שלהם. מחלקה יוצאת דופן אחת של phospholipids היא phosphoinositides (PIPs). למרות שהם מהווים רק 1% של lipidome הסלולר, הם ממלאים תפקיד מכריע transduction האות, autophagy, וסחר קרום, בין היתר 1 , 2 , 3 , 4 . זרחון דינמי של קבוצת הראש inositol על ידי קינאזות PIP הסלולר מעורר שבעה קבוצות ראשיות PIP כי הם מונו, bis, או tris-phosphorylated 5 . בנוסף, PIPs מגדירים את הזהות התת-תאית של הממברנות ומשמשים כאתרי עגינה מיוחדים לממברנות / אנזימים המכילים פוספוינוס אחד או יותרתחומים מחייב, למשל, Pleckstrin הומולוגיה (PH), Phox הומולוגיה (PX), epsin N- מסוף הומולוגיה (ENTH) 6 , 7 . אחד התחומים הנחקרים ביותר PIP מחייב הוא phospholipase C (PLC) -δ1 PH תחום זה באופן ספציפי אינטראקציה עם phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI (4,5) P 2 ) בתוך טווח גבוה nromomolar נמוך מיקרומטר טווח זיקה 8 , 9 , 10 , 11 .

מגוון של שיטות איכותיות וכמותיות במבחנה פותחו והשתמשו כדי ללמוד את המנגנון, התרמודינמיקה, ואת הספציפיות של אינטראקציות אלה. בין מבחני ה- PIP המחוברים הנפוצים ביותר הם תהודה של פלסמון על פני השטח (SPR), קלורימטרי איזותרמי (ITC), ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית (NMR), הצפת ליפוזום / אסאי משקעים, כתמי שומנים (כתמי שומן / רצועות PIP)12 , 13 . למרות אלו הם בשימוש נרחב, לכולם יש חסרונות רבים. לדוגמה, SPR, ITC ו- NMR דורשים כמויות גדולות של מדגם, מכשור יקר ו / או כוח אדם מיומן 12 , 13 . כמה פורמטים assay כגון נוגדנים מבוססי ליפידים כתמים לנצל מים מסיסים צורות של PIPs ולהציג אותם בצורה לא פיזיולוגיים 12 , 14 , 15 , 16 . בנוסף, כתמי שומנים לא ניתן לכמת באופן מהימן והם הביאו לעתים קרובות תצפיות כוזבות / שליליות כוזבות 12 , 17 , 18 . כדי להתגבר על אתגרים אלה ולשפר על הכלי הנוכחי להגדיר, שיטה חדשה ללא תווית הוקם מבוסס על השומנים נתמך bilayer (SLB) בהקשר של am פלטפורמה icrofluidic, אשר הוחל בהצלחה במחקר של אינטראקציות חלבון PIP ( איור 1 ) 19 .

האסטרטגיה המשמשת לגילוי אינטראקציות חלבון PIP מבוססת על חישה אפנון pH. זה כרוך צבע רגיש-pH כי יש B Ortho -Sulforhodamine (o SRB) מצומד ישירות לקבוצת ראש השומנים phosphatidylethanolamine 20. O SRB-POPE בדיקה ( איור 2 א ) הוא פלואורסצנטי מאוד ב pH נמוך ו הרווה ב pH גבוה עם pKa סביב 6.7 בתוך 7.5% מול PI (4,5) P 2 המכיל SLBs ( איור 5 ב ). תחום ה- PLC-δ1 PH נעשה בהרחבה לאימות מתודולוגיות של חלבונים-PIP, בשל הייחודיות הגבוהה שלו כלפי PI (4,5) P 2 ( איור 5 א ' ) 21 , 22 ,"> 23 , 24 , 25 .לפיכך, הנחנו כי תחום ה- PLC-δ1 PH יכול לשמש לבדיקת המחיצה ל- PI (4,5) P 2 דרך ה- PIP-on-a-chip. השתמשו במחקר זה יש מטען חיובי נטו (PI 8.4), ובכך מושך OH -. יונים (איור 5 ג) עם קשירה PI (4,5) P 2 SLBs המכילים, תחום PH מביא את OH - יונים אל משטח הממברנה, אשר בתורו מודולציה פוטנציאל interfacial משמרות מדינת protonation של o SRB-האפיפיור (איור 5 ג) 26. כפועל יוצא של ריכוז תחום PH, הקרינה הוא רווה (איור 6 א). לבסוף, הנתונים המנורמלים הוא כדי להתאים את הזיקה של PH-PI (4,5) P 2 אינטראקציה ( איור 6 ב , 6 ג ). </ P>

במחקר זה, פרוטוקול מפורט מסופק לבצע חלבון מחייב PIP המכילים SLBs בתוך פלטפורמה microfluidic. פרוטוקול זה לוקח את הקורא מ הרכבה את המכשיר microfluidic הכנה שלפוחית ​​כדי היווצרות SLB וחלבון מחייב. בנוסף, ניתנים הוראות לניתוח נתונים כדי לחלץ מידע זיקה עבור האינטראקציה PLC-δ1 PH-PI (4,5) P 2 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ניקוי זכוכית Coverslips

  1. לדלל ניקוי 7x פתרון (ראה טבלה חומרים ) 7-פי עם מים deionized ב 100 מ"מ עמוק בורוסיליקט צלחת זכוכית עם תחתית שטוחה לחמם אותו עד 95 מעלות צלזיוס על צלחת חמה ברמה במשך 20 דקות או עד פתרון מעונן מתבהר .
    הערה: הפתרון יהיה חם, יש לנקוט משנה זהירות כדי למנוע פציעות גופניות. פתרון ניקוי 7x הוא תערובת קניינית של hexasodium [oxido- [oxido (phosphonatooxy) phosphoryl] oxyphosphoryl] פוספט, 2 (2-butoxyethoxy) אתנול, נתרן 1,4-bis (2-ethylhexoxy) -1,4-dioxobutane -2-sulfonate ותוספות לא מסוכנים.
  2. באמצעות פינצטה, לארגן את coverslips (40 מ"מ אורך x 22 מ"מ רוחב x 0.16-0.19 מ"מ גובה) על מכתים אלומיניום מדף לסירוגין כיוונים. שמור נקודה ריקה בין coverslip כל כדי למנוע מהם נוגעים זה בזה.
  3. לגמרי להטביע את המדף מכתים עם coverslips בפתרון ניקוי. שמור את coverslips בהפתרון עבור 1 h.
    הערה: כמו המים מתאדה, לשמור על הוספת מים deionized טריים כדי לשמור על ריכוז הפתרון ללא שינוי.
  4. קח את המדפים מכתים מתוך פתרון ניקוי ולשטוף את coverslips עם כמויות רבות של מים deionized להסיר את חומר הניקוי.
  5. יבש coverslips עם גז חנקן (כ 5 דקות לכל מדף מכתים), ולאחר מכן למקם coverslips בכבשן עבור 6 שעות ב 550 מעלות צלזיוס עבור חישול.
    הערה: זהו צעד מכריע אשר מחליקה תכונות גסות על משטח הזכוכית.
  6. מניחים את coverslips במיכל פלסטיק ולשמור אותם הרחק אבק.

2. בודה Micropatterned PDMS בלוקים

  1. מערבבים polydimethylsiloxane (PDMS) prepolymer ואת סוכן ריפוי ב 10: 1 (w / w) יחס פלסטיק גדול לשקול סירה degas אותו ואקום עבור 1 שעות עם כוח ואקום ב 500 טור או פחות.
    הערה: PDMS הוא פולימר סיליקון שקוף ואינרטי. כדי לקבל את לחסום PDMS הרצוי לא(0.5 ס"מ), לערבב 55 גרם של prepolymer עם 5.5 גרם של סוכן ריפוי.
  2. מניחים את יחידת הסיליקון המכיל מספר משכפל של micropattern SU-8 אותו בקוטר גדול (10 ס"מ בסיס) פלסטיק לשקול סירה ויוצקים PDMS degassed. לאחר מכן, לרפא אותו בתנור יבש ב 60 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    הערה: Micropatterns הם גדולים מספיק כדי להיראות בעין בלתי מזוינת. כל תבנית מכילה 8 microchannels (100 מיקרומטר רוחב x 40 מיקרומטר גובה x 1 ס"מ אורך) עם המרווח 40 מיקרומטר בין ( איור 1A , 1B ). עובש סיליקון עובש המורכב קשה אפוי SU-8 photoresist היה מפוברק במתקן nanofabrication 27 . גישות אחרות להכנת האב כוללות חומצה הידרופלואורית (HF) תחריט, טמפרטורת מים בטמפרטורה גבוהה, xurography, והדפסה 3D 28 , 29 , 30 , 31 . CommercIal מקורות להכנת אבץ סיליקון יכול לשמש גם. הדפוסים של המכשיר microfluidic תוכנן עם תוכנת שרטוט (ראה טבלה של חומרים). הקובץ המקורי המכיל את תבנית העיצוב מסופק כקובץ משלים "תבנית Design.dwg", אשר ניתן לספק ישירות ליצרן.
  3. בעדינות, לקלף את PDMS מאסטר הסיליקון עם הידיים. סמן את הגבולות של כל micropattern במלבנים באמצעות מנתח כירורגי וסרגל. לאחר מכן, לחתוך את PDMS לתוך בלוקים.
  4. אגרוף 16 חורים (8 מפרצון 8 שקעים לכל בלוק) בשני הקצוות של כל microchannel עם אגרוף ביופסיה (1.0 מ"מ חור בקוטר) כפי שצוין באיור 3 ב .
  5. החל קלטת על כל בלוק PDMS כדי להגן על micropatterns מפני נזק ואבק. אחסן אותם במיכל פלסטיק.

3. הכנת קטן Unilamar שלפוחית ​​(SUVs)

הערה: שלילי שליטה bilayer הרכבהוא 99.5 mol% 1-Palmitoyl-2-oleoyl- SN -glycero-3-phosphocholine (POPC) ו 0.5% mol יָשָׁר Sulforhodamine B-1-Palmitoyl-2-oleoyl- SN -glycero-3-phosphoethanolamine (o SRB- אַפִּיפיוֹר). הבדיקה bilayer הרכב הוא 92.0 mol% POPC, 0.5 mol% o SRB-POPE, 7.5% מול של או L-α-phosphatidylinositol-4-Posphate (PI4P) או L-α-phosphatidylinositol- 4,5-bisphosphate (PI ( 4,5) P 2 ). להלן הליך להכנת 92.0 mol% POPC, 0.5 mol% o SRB-POPE, ו 7.5 מול% PI (4,5) P 2- SUVs המכילים. הסינתזה של o SRB-האפיפיור השתמשו במחקר זה היה בעבר תיאר 20.

  1. לחשב את עוצמת הקול של POPC, PI (4,5) P 2 , ו- o SRB-POPE אשר צריך לערבב, אשר מהווה את הסכומים הבאים: 2.22 מ"ג של POPC, 0.26 מ"ג של PI (4,5) P 2 , ו 2.1 x 10 -5 מ"ג של האפיפיור SRB o.
  2. פיפטה נפח מחושב של POPC, PI (4,5) P 2 , <Em> o SRB-POPE לתוך בקבוק יחיד 20 מ"ל בקבוק נצנץ.
    הערה: פתרונות POPC ו- O -SRB-POPE מגיעים בפתרון של כלורופורם, ואילו PI (4,5) P 2 (ופוספויוסיטידים) מגיע במלאי ממיצוי: כלורופורם: מתנול: מים (20: 9: 1). לקבלת דיוק, רטוב קצה פיפטה עם כלורופורם לפני השימוש בו. עבור בטיחות, שלב זה צריך להתקיים בתוך מכסה המנוע קטר כימי.
  3. יבש את התערובת בזרם של גז חנקן בתוך מכסה המנוע כימיים קטר במשך 10 דקות או עד המאייד מתאדים סרט סרט שומנים דק בתחתית הבקבוקון.
  4. לתמצת את התערובת תחת ואקום עבור ≥ 3 בשעה כוח ואקום של 10 mTorr להסיר כל שאריות אורגני ממס.
    הערה: 3 שעות זמן יובש מספיק בקנה מידה של הכנה SUV המתואר בפרוטוקול זה, אשר מתאים ל -50 ניסויים. אם בקנה מידה גדול יותר של הכנה SUV נדרש, ייבוש לילה יכול להתבצע.
  5. Rehydrate את ד"רIed ליפיד הסרט עם 5 מ"ל של חיץ פועל (20 מ"מ HEPES, 100 mM NaCl, ב pH 7.0) ומניחים אותו באמבט קולי בתדר הפעלה של 35 קילוהרץ במשך 30 דקות ב RT.
    הערה: ערבוב כמויות השומנים המפורטים בשלב 3.1 והוספת 5 מ"ל של חיץ פועל בשלב 3.5 מניב השעיית השעיה ב 0.5 מ"ג / מ"ל. בשלב זה, ההשעיה שלפוחית ​​הוא שילוב של unilamellar ו multilamellar שלפוחית ​​( איור 2 ב ). הפתרון יופיע בצבע ורוד / סגול ועכורים יחסית.
  6. הקפאה להפשיר את ההשעיה שלפוחית ​​עם חנקן נוזלי אמבט מים ב 40 מעלות צלזיוס כדי לקבל שלפוחית ​​unilamellar. חזור על ההקפאה להפשיר 10 פעמים.
    הערה: (אופציונלי) כדי להבטיח את היעדר unilamellar שלפוחית ​​ההשעיה, צעד צנטריפוגה ניתן להחיל 32 , 33 .
  7. Extrude ההשעיה שלפוחית ​​דרך 0.10 מיקרומטר מסלול חרוט פוליקרבונט פוליקרבונט באמצעות extruder השומנים (ראהטבלה של חומרים) כדי להעשיר עבור SUV. חזור על הבלטה 10 פעמים.
    הערה: צינור חרוטי 15 מ"ל ניתן להשתמש כדי לאסוף את שלפוחית ​​extruded. הפתרון צריך להיות ריק של עכירות בשלב זה. קוטר SUV ניתן לאשר באמצעות פיזור אור דינמי (DLS) ( איור 2 ג ). רכבי השטח הם המתאימים ביותר ליצירת SLBs 34 .
  8. מכסים את צינור חרוטי עם רדיד אלומיניום לאחסן ב 4 ° C עד מוכן לשימוש.

4. הרכבת המכשיר Microfluidic

  1. בדוק את פתחי הכניסה של שקע PDMS לחסימה על ידי מתיז מים deionized דרך החורים באמצעות בקבוק לשטוף מים. לאחר מכן, יבש את בלוק PDMS עם גז חנקן.
    הערה: צעד זה גם להסיר כל חלקיקי אבק שאולי היה לכוד בתוך ו / או בין הערוצים. במידת הצורך, dedust מראש ניקוי coverslips עם גז חנקן כדי להסיר כל חלקיקי אבק.
  2. מניחים את PDMS לחסום מראש לנקות(ראה טבלה 1) בתוך מערכת פלזמה חמצן (ראה טבלה של חומרים) תא המדגם לחשוף עם פלזמה חמצן עבור 45 שניות עם הגדרת כוח ב 75 וואט, מהירות זרימת החמצן ב 10 ס"מ 3 / min, כוח ואקום ב 200 mTorr .
  3. מניחים את פני השטח בדוגמת לחסום PDMS במגע עם coverslip מיד לאחר הטיפול פלזמה חמצן. לחץ בעדינות כדי להסיר בועות אוויר באתרי קשר.
  4. מניחים את המכשיר על צלחת חמה ברמה ב 100 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות כדי לשפר את מליטה.
  5. השתמש רטוב מוך חינם לנגב ( למשל kimwipe) עם אתנול 100% להסיר כל חלקיקי אבק מהחלק העליון (PDMS) ואת התחתון (זכוכית) של המכשיר. לאחר מכן, הקלטת את המכשיר על גבי שקופית מיקרוסקופ זכוכית.
    הערה: אין להשתמש בכמות מופרזת של אתנול ולמנוע אתנול להיכנס לערוצי הכניסה והשקע. ביצוע שלב זה בעוד המכשיר עדיין חם מומלץ על מנת להבטיח אתנול מתאדה מיד. זכוכית micrOscopy שקופיות ניתן לאחסן בפתרון אתנול 100% כדי להסיר אבק ומזהמים אחרים.

5. יצירת Blayers שומנים נתמכים (SLBs)

  1. העברת 100 μL של PI (4,5) P 2 המכילים SUVs משלב 3.8 לתוך צינור microcentrifuge 0.65 מ"ל. התאם את ה- pH של הפתרון ~ 3.2 על ידי הוספת 6.4 μL של 0.2 N חומצה הידרוכלורית.
    הערה: לאשר את ה- pH של הפתרון עם מטר pH מצויד בדיקה מיקרו pH (ראה טבלה של חומרים).
  2. פיפטה 10 μL של ה- pH מותאם SUV פתרון לתוך כל ערוץ דרך כניסת ולהחיל לחץ דרך פיפטה עד הפתרון מגיע לשקע. לנתק את קצה מהפיפטה ולהשאיר אותו מחובר למכשיר.
  3. חזור על השלב הנ"ל עבור כל ערוץ ולאחר מכן דגירה המכשיר למשך 10 דקות ב RT.
    הערה: הזרקת שלפוחית ​​לתוך microchannels צריך להתבצע מיד לאחר הרכבה המכשיר.
  4. גזור סטים של כניסת מפרצון צינורות EACh 60 ס"מ (צינורות מפרצון) ו 8 ס"מ (צינורות מוצא) ארוך, בהתאמה.
    הערה: חיתוך צינורות באלכסון ויצירת קצה חד, מקל להכניס את צינורות לתוך פתחים שקעים. צינורות מוצא צריך להיות בצורת קשת. אורך צינורות כניסת עשוי להשתנות בהתאם להגדרת המיקרוסקופ. הקוטר הפנימי של הצינור הוא 0.05 ס"מ.
  5. באמצעות פינצטה, לחבר את צינור מוצא למכשיר, ולאחר מכן הקלטת המכשיר על הבמה מיקרוסקופ.
  6. לצלול סוף אחד של צינורות כניסת כניסה 25 מ"ל של חיץ פועל הכלול צינור חרוטי קלטת זה כדי לוודא כי הצינור מאובטח.
  7. מניחים את צינור חרוטי על קרקע גבוהה יותר (~ 20 ס"מ) מאשר המכשיר כדי לדחוף את הפתרון דרך microchannels באמצעות זרימת הכבידה; שקע במעבדה ניתן להשתמש כדי להשיג זאת.
  8. עבור כל צינור מפרצון, להשתמש מזרק לצייר 1 מ"ל של חיץ פועל מהקצה החופשי של הצינור. הסר את קצה פיפטה מן כניסת ולהכניס אתסוף חינם של כניסת צינורות לתוך המכשיר.
    הערה: הכניסו טיפה של חיץ פועל על המפרק כדי להפחית את ההסתברות של בועה אווירית לתוך הערוץ במהלך שלב זה. לאחר צינור הכניסה מחוברת למכשיר, השתמש במחק ללא מוך כדי להסיר את המאגר עודף.
  9. חזור על השלב לעיל כדי לחבר את כל חלקי צינורות הכניסה למכשיר.
    הערה: זרימת חיץ פועל דרך הערוצים מסייעת להסיר שלפוחיות עודף לאזן את bilayer לתנאים ניסיוניים.
  10. פתח את תוכנת בקרת מיקרוסקופ (ראה טבלה של חומרים). בחלונית השמאלית, לחץ על הכרטיסייה "מיקרוסקופ" ובחר את "10X" המטרה.
  11. לחץ על "Live" ולאחר מכן "Alexa 568" סמלים התמונה על סרגל הכלים. באמצעות הכפתורים בסדר התאמה כמובן, להתמקד microchannels.
  12. סרוק דרך ההתקן כדי לבדוק את האיכות של SLBs והערוצים ( איור 8 ). לאחר מכן,לחץ על סמל "Shutter Closed" סגור בסרגל הכלים.
  13. לחץ על הכרטיסייה "רכישה", תחת "התאמות בסיסיות" בחר "זמן חשיפה". הגדר את זמן החשיפה ל - "200 ms".
  14. בחלונית השמאלית, לחץ על "רכישה רב ממדית" ותחת תפריט המסננים בחר את הערוץ האדום (מסומן "Alexa 568"). לאחר מכן, לחץ על "זמן לשגות" בתפריט, להגדיר את מרווח הזמן ל 5 דקות, משך עד 30 דקות, ולחץ על "התחל".
    הערה: בהתבסס על משך (30 דקות) ואת קצב הזרימה (~ 1.0 μL / min), 30 μL של חיץ פועל משמש כדי לאזן את SLB בתוך ערוץ, כלומר 240 μL של חיץ פועל משמש לכל 8 ערוצים.
  15. בחר בכלי 'מעגל' שמתחת לכרטיסייה 'מדידה' וצייר מעגל בכל ערוץ. לחץ לחיצה ימנית בזמן שהמעגל נבחר ובחר "מאפיינים". תחת "פרופיל" הכרטיסייה, לבדוק "כל T" כדי להציג אתעוצמת הקרינה כפונקציה של זמן.
    1. ודא עקומה זו מגיעה הרמה, אשר מציין שיווי משקל, לפני שתמשיך לשלב הבא.
  16. הנמך את תמיסת המאגר לקרקע שוות כמכשיר כדי לעצור את הזרימה.
  17. שמור את הקובץ לשגות זמן.

6. אינטראקציה תחום PH בדיקת PLC-δ1 עם PI (4,5) P 2 המכילים SLBs

  1. הכן דילולים של תחום PH באמצעות המאגר פועל כמפחית.
    הערה: מכיוון שיש שמונה ערוצים בתוך המכשיר, השתמש לפחות שניים מהם עבור פקדים ריקים. בחר את הקצוות הרחוקים בכל צד ולהשתמש בערוצים הנותרים עבור דילולים חלבון. ריכוזי ה- PH הבאים נבדקו: 0.10, 0.25, 0.50, 1.00 ו- 2.50 מיקרומטר. כ 200 μL של דילול כל היה מספיק כדי להגיע שיווי המשקל בתוך 30 דקות.
  2. אחד בכל פעם, לנתק כל צינור מוצא ולהחיל 200 μL של דילול כל חלבון לתוךאת ערוץ מוצא באמצעות פיפטה. אין להפעיל לחץ כלשהו, ​​תן כוח הכבידה לעשות את העבודה. לנתק את קצה מהפיפטה ולהשאיר אותו מחובר למכשיר microfluidic.
  3. חזור על השלב הנ"ל עבור כל ערוץ ולוודא כי בועות אוויר לא הציג לתוך הערוצים במהלך תהליך זה.
  4. מנמיכים את צינורות מפרצון לקרקע מתחת למכשיר microfluidic להתחיל לזרום את החלבון דרך microchannels. קלטת את הקצה החופשי של הצינור למיכל פסולת. תזרים דילולים חלבון למשך 30 דקות.
    הערה: זה יהיה להפוך את זרימת ולאפשר החלבון להיות הציג לתוך הערוצים. הזמן כדי equilibration ונפח של דילולים חלבון הצורך יהיה תלוי הזיקה של האינטראקציה.
  5. בחלונית השמאלית של התוכנה, תחת לשונית "זמן לשגות", לחץ על "התחל" כדי להתחיל הדמיה שוב.
  6. חזור על הצעד 5.15 כדי להגיע לשיווי משקל בטוח. כאשר הניסוי הושלם, שמור את הזמן לשגותקוֹבֶץ.

7. הערכת קרום הממברנה

הערה: פלואורסצנטי לשחזר לאחר Photobleaching (FRAP) ניסויים צריך להתבצע עם אצווה חדשה של רכבי השטח ו coverslips זכוכית נקי כדי להבטיח כי SLBs הם נוזל.

  1. בצע את ההליך לניקוי coverslips זכוכית (1.1-1.6), בודה micropatterned בלוקים PDMS (2.1-2.5), הכנת SUVs (3.1-3.8), הרכבה של המכשיר microfluidic (4.1-4.5) ויצירת SLBs (5.1-5.17) כמו בעבר מְתוּאָר.
  2. פוקוס המיקרוסקופ על bilayer, להגדיר את זמן החשיפה 200 ms, ואת binning ל 1.
  3. תמונה להלבין נקודה מעגלית באמצעות 532 ננומטר, 2 לייזר לייזר MW (רדיוס 13 מיקרומטר). מיד לאחר photobleaching, להתחיל לכידת סדרה של תמונות כל 3 שניות עבור 45 הראשון, ואחריו מרווח של 30 למשך שארית הזמן (15 דקות משך כולל). לאחר רכישת הנתונים הושלם, שמור את הקובץ זמן לשגות.
  4. בחר את מולבן אRea באמצעות כלי ציור מעגל לחלץ ערכים עוצמת הקרינה כפונקציה של זמן. בנוסף, בחר שני אזורים נוספים בקרבת מקום, אחד המתאים לאזור לא צמוד ואחד המתאים לאזור ללא SLBs.
  5. חישוב התאוששות פלואורסצנטי ( y ) באמצעות המשוואה הבאה:
    משוואה
    הערה: כאן F t מייצג את עוצמת האזור המולבן כפונקציה של הזמן, F אני מייצג את עוצמת הקרינה לפני הלבנה (השתמש "1" כערך מנורמל במקרה זה); F 0 הוא עוצמת הרקע.
  6. Plot התאוששות הקרינה (ציר y) כפונקציה של זמן (ציר x) כדי ליצור עקומת FRAP. לאחר מכן, להתאים את הנתונים לפונקציה מעריכי יחיד כדלקמן,
    משוואה
    הערה: כאן מייצגת את השבר נייד t 1/2 ):
    משוואה
  7. השתמש t 1/2 לחשב את קבוע דיפוזיה ( D ):
    משוואה
    הערה: כאן R מייצג את רדיוס קרן הלייזר (13 מיקרומטר). קבוע דיפוזיה עבור bilayer נוזל צריך להיות ≥ 1.0 מיקרומטר 2 / s.

8. נתוני עיבוד

הערה: שגרת ניתוח הנתונים תהיה תלויה במיקרוסקופ, תוכנת עיבוד תמונה, ואת התוכנה מתאים עקומת בשימוש.

  1. פתח את הקבצים לשגות זמן של לפני (משלב 5.17) ואחרי (מ 6.6 שלב) טיטרציה תחום PH. עבור אל המסגרת האחרונה של כל קובץ זמן לשגות ולעשות סריקה קו על פני כל microchannels להשיג את fluorescEnce נתוני עוצמת כפונקציה של המרחק בפיקסלים ( איור 6 א ). להעביר את הנתונים לתוכנת גיליון אלקטרוני.
  2. עבור כל microchannel (לפני ואחרי PH תחום בנוסף), מדגם כמה נתונים בתוך הערוץ ואת צדי הערוץ המייצג את הבסיס ( איור 7 א ).
    הערה: עוצמת הקרינה ערוץ ריק צריך להישאר ללא שינוי. כל הערוצים האחרים הם מנורמל לערוץ ריק, ולכן זה חיוני יש שני ערוצים ריקים ולוודא כי עוצמות הקרינה שלהם להישאר עקבית אחד עם השני.
  3. החל את הנוסחה שלהלן כדי לנרמל את הנתונים לערוץ הריק; חישוב מדגם מסופק באיור 7 ב .
    משוואה
    הערה: כאן ΔF חלבון מייצג את עוצמת הקרינה מופחתת רקע של ערוץ חלבון, Δ, F ריק מייצג את עוצמת הרקע הקרינה מופחתת של הערוץ הריק, מראש לכתוב מתייחסים לפני ואחרי צעדים טיטרציה חלבון, ו α מייצג את גורם תיקון שהוא היחס בין עוצמות הקרינה של ערוץ חלבון הערוץ הריק ([ F חלבון / F ריק ] מראש ) בשלב טרום חלבונים. מאז עוצמת הקרינה פוחתת כפונקציה של ריכוז תחום PH, נתונים מנורמל יהיה שלילי ערך.
  4. באמצעות תוכנה עקומת הולם (ראה טבלת חומרים ), העלילה הקרינה מנורמל כפונקציה של ריכוז תחום PH ו בכושר האיזותרמה Langmuir ( איור 6 ג ):
    משוואה
    הערה: כאן ΔF מייצג את השינוי בעוצמת הקרינה ביחס לשינוי המרבי בפלו( ΔF max ), בעוד ש- K d, מייצג את קבוע הדיסוציאציה, השווה לריכוז החלבון ( [PLC-δ1 PH] ), שבו כיסוי של 50% קרום מאוגד מורכב) מושגת. זהו שיווי משקל מבוסס מחייב מדידה כך הנתונים מנורמל מתאים ל isherm Langmuir פשוט לחלץ פרמטר ניסיוני לכאורה K ד, App . בהתבסס על התוכנה הולם K D, App עבור PLC-δ1 PH-PI (4,5) אינטראקציה P 2 הוא 0.39 ± 0.05 מיקרומטר ( איור 6 ב ).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

השתמשנו assay אפנון pH ללמוד את PLC-δ1 PH תחום PI (4,5) P 2 אינטראקציה בתוך מיקרופרוויס PIP על שבב ( איור 1 ). באמצעות פרוטוקול מפורט, אנחנו הוכיחו כיצד להכין ולהרכיב רכיבים המכשיר microfluidic, לעשות קטן שלפוחית ​​unilamellar (SUVs) ( איור 2 ), טופס SLBs בתוך המכשיר ( איור 3 ), וחלבון נבדק מחייב PIP המכילים SLBs. תרשים זרימה של ניסוי טיפוסי של SLB מתואר באיור 4 . העיקרון של assay אפנון pH מודגם באיור 5 באמצעות PH- תחום PI (4,5) P 2 מחייב כדוגמה. התוצאות שהתקבלו במחקר זה הציע כי תחום PH נקשר PI (4,5) P 2 SLBs המכילים. ליתר דיוק, ראינו כי על מחייב, ה- pH המקומי הפך בסיסי יותר. זֶה שינוי ה- pH המקומי היה חשה על ידי o -SRP-POPE בדיקה ניאון נוכח בתוך SLBs, אשר לאחר מכן הרווה בהתאם ( איור 6 א , 6C ). מרווה היה תלוי ריכוז ו saturable, כך הולם את הנתונים כדי איזותרמה Langmuir הניב K ד, App של 0.39 ± 0.05 מיקרומטר ( איור 6 ב , 6D ). תחום ה- PH הראה סלקטיביות כלפי PI (4,5) P 2 מאחר שלא נצפתה שום מחייב כלפי POPC (ליפידים zwitterionic), וחלשה חלשה יותר ל- SLBs המכילים PI4P ( K d, app = 1.02 ± 0.20 מיקרומטר) ( איור 6 ב ). חישוב מדגם כלול כדי להראות כיצד הנתונים פלואורסצנציה מעובד ( איור 7 ). באיור 8 , סדרה של תמונות microchannel מוצגים לספק רמזים חזותיים בקביעת איכות SLBs ו microchannels.

_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> איור 1
איור 1: PIP על שבב מכשיר microfluidic לחקר אינטראקציות חלבון PIP. ( א ) המכשיר microfluidic יש 8 microchannels עם 8 פתחים ו 8 שקעים. פתרונות צבעוניים היו זורמים דרך להפוך את הערוצים גלויים בתמונה זו. המכשיר הוא 2.0 ס"מ רוחב (x), 0.5 ס"מ גובה (y), ו 3.0 ס"מ אורך (z). ( ב ) הרצפה של microchannels הוא זכוכית, ואילו הקירות והתקרות מורכבים polydimethylsiloxane (PDMS). כל microchannel הוא 100 מיקרומטר רוחב, 40 מיקרומטר גובה, ו 1 ס"מ אורך. המרווח בין שני microchannels סמוך הוא 40 מיקרומטר. תמיכה bilayers השומנים (SLBs) נוצרים על גבי משטח הזכוכית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. קטן unilamellar שלפוחית ​​(SUV) הכנה ומחקרי בקרת איכות. ( א ) מרכיבי שומנים המשמשים לייצור שלפוחית: אורתו -סולפורחמין B-POPE ( O -SRB-POPE), L-α-phosphatidylinositol-4-phosphate (PI4P), L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate PI (4,5) P 2 ), ו- 1-palmitoyl-2-oleoyl- sn -glycero-3-phosphocholine (POPC). ( B ) סוגי שלפוחית ​​השומנים: SUV, שלפוחית ​​unilamellar גדול (LUV), שלפוחית ​​unilamellar ענק (GUV), ו multilamellar שלפוחית ​​(MLV). רכבי השטח הם המתאימים ביותר להכנת SLBs 34 . ( ג ) דינאמי אור פיזור (DLS) אישור מבוסס על גודל שלפוחית ​​שלאחר השומנים שלפוחית ​​(דרך 0.1 מיקרומטר מסנן). רדיוס הידרודינמי (Rh) של 53.9 ננומטר מאשר כי m EAN של התפלגות גודל שלפוחית ​​הוא ~ 100 ננומטר. התוצאות מייצגות את המדידה מ PI (4,5) P 2- SUVs המכילים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: היווצרות SLB על זכוכית תמיכה. ( א ) שלפוחית ​​הרכב השומנים הרצוי מוכנים ואז זרמו דרך microchannels. שלפוחית ​​הם adsorbed על משטח זכוכית מעוות. לאחר כיסוי משטח קריטי מושגת, שלפוחית ​​לקרוע באופן ספונטני כדי ליצור SLBs. הסתגלות הפניות 35 , 36 . ( ב ) SLBs בתוך מכשיר תחת מטרה 10X מוצג. אלקסה 568 סט מסנן (עירור / פליטה ב 576/603 ננומטר) משמש."לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו." Target = "_ blank" לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: תרשים זרימה של ניסוי SLB טיפוסי. רכיבי המכשיר Microfluidic כלומר דפוסים PDMS לחסום coverslips ניקה, מטופלים עם פלזמה חמצן לעשות שני משטחים הידרופילית ולאחר מכן התאספו. רכבי השטח זורמים דרך microchannels כדי ליצור SLBs. עודף שלפוחית ​​יוסרו SLBs הם equilibrated לתנאים ניסיוניים על ידי זרימת פתרון חיץ פועל. לאחר מכן, דילולים חלבון זורמים דרך microchannels. לבסוף, הנתונים עוצמת הקרינה מנותח, מנורמל, ו זממו כפונקציה של ריכוז החלבון. הנתונים מנורמל מתאים פונקציה כדי לחלץ קבוע דיסוציאציה לכאורה ( K ד, App ) vaלואו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5: עקרונות החישה המבוססת על אפנון pH. ( A ) מבנה גביש רנטגן של תחום PLC-δ1 PH במתחם עם PI (4,5) P 2 קבוצת ראש inositol 1,4,5-trisphosphate (Ins (1,4,5) P 3 ) (PDB מזהה: 1MAI) 37 . (ב) בדיקה o SRB-האפיפיור הוא פלורסנט מאוד ב- pH נמוך הרווה ב- pH גבוה עם pKa של 6.7 בתוך PI 7.5 mol% (4,5) P 2 המכילים SLBs כמצוין עקומת טיטרציה pH. ( ג ) תחום PH המשמש במחקר זה יש נקודת isoelectric (pI) של 8.4, כך ב pH ניסיוני (7.0) החלבון הוא טעון חיובי. נשיאת חיובי נטו cHarge, חלבון מושך OH - יונים. כאשר תחום PH נקשר PI (4,5) P 2 המכילים SLBs, זה מביא את OH - יונים על פני שטח הקרום, פוטנציאל interfacial הוא מווסת שבתורה מסיטה את מדינת protonation של o SRB-אפיפיור, הקרינה שלה הוא הרווה ב PH תחום תלוי ריכוז. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6: PLC-δ1 PH- ממברנה מחייב פיקוח באמצעות אפנון pH. ( א ) את התצוגה של microchannels לפני ואחרי הוספת תחום PH בריכוזים שצוינו. ( ב ) השוואה של הזיקה POPC, PI4P, ו PI (4,5) P 2 המכיל SLBs. PH תחום מחייב עד 7.5 mol% PI (4,5) P 2 המכיל SLBs הניב K ד, App של 0.39 ± 0.05 מיקרומטר. חלש חלש נצפתה סביב 7.5% MOL PI4P המכילים SLBs ( K ד, App של 1.02 ± 0.20 מיקרומטר) ולא מחייב נצפתה עבור POPC SLBs טהור. ברים שגיאה מצביעים על SEM (n = 3). שני זנב t- test שימש כדי להשוות את הזיקה בין PI4P ו PI (4,5) P 2 מחייב (* p = 0.0396). (ג) עוצמות הקרינה מקו לסרוק את פני microchannels נרשמות כפונקציה של המרחק בפיקסלים עבור POPC, PI4P, ו PI (4,5) P 2 ניסויים מחייב. ( D ) מנורמל וממוצע POPC, PI4P ו- PI (4,5) P 2 נתונים מחייב הוא זממו כפונקציה של ריכוז תחום PLC-δ1 PH ולאחר מכן להתאים איזותרם Langmuir לחלץ K , ד . ראה את המשוואה בשלב 8.4 לפרטים."Target =" _ blank "> לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 7
איור 7: חישוב מדגם לעיבוד נתונים. ( A ) לפני (שחור) ואחרי (אדום) חלבון קו טיטרציה לסרוק נתונים עבור ריק (לא חלבון) וחלבון ערוץ, שבו נתונים עוצמת הקרינה מוצג כפונקציה של המרחק בפיקסלים. אזורים מוצלים מייצגים את האזורים ששימשו לחלוקת נתונים עבור החישובים. נתוני עוצמת הקרינה הבסיסית מופק ממש לפני ואחרי כל ערוץ. ( B ) נתונים מופק עבור ערוצי ריק חלבונים, לפני ואחרי טיטרציה חלבון. ממוצעים נלקחים על בסיס ובתוך נתוני פלואורסצנטי ערוץ. לאחר החיסור הבסיסי, הנתונים הקרינה הוא מנורמל לערוץ ריק. ראה את המשוואה בשלב 8.3 לפרטים. Href = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55869/55869fig7large.jpg" target = "_ blank"> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

הספרה 8
איור 8: הערכת שלמות SLBs ו microchannels. ( א ) תמונה הממחישה איכות גבוהה SLBs ו microchannels. ( ב ) היתוך לא שלם. ( ג ) microchannels התמזגו. ( ד ) חלקיק אבק לכוד בתוך microchannel. ( ה ) בועות אוויר לכודים בתוך microchannels. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

קובץ משלים 1: Pattern_Design.dwgריק "> אנא לחץ כאן להורדת הקובץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כל חלופה PIP, אם כי בריכוזים נמוכים, נמצא על פני השטח cytosolic של האברונים ספציפיים שבו הם תורמים להקמת הרכב פיזי ייחודי סגוליות תפקודית של קרום organellar 1 . אחד השימושים החשובים ביותר של PIPs הוא כמו פלטפורמת עגינה ספציפית עבור שפע של חלבונים המחייבים לוקליזציה subcellular ספציפיים ו / או הפעלה 6 , 7 . בשל תפקידם בפיזיולוגיה של תאים ומחלות, היכולת ללמוד אינטראקציות חלבון-PIP במבחנה , בהקשר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית חשובה. פורמט assay המתואר כאן מאפשר אחד לשקול אינטראקציות חלבון PIP בהקשר של bilayer שומנים נוזלים, בנוכחות תערובת של phospholipids, עם המצגת הרגילה של קבוצת הראש הקוטב, ואורך טבעי שרשרת שומן acyl.

Assay זה, ב combinatiב עם אפנון pH כמו מערכת איתור שלה, SLBs כמערכת קרום מודל להגדיר פלטפורמה microfluidic, מספק יתרונות ייחודיים לעומת טכניקות אחרות מחייב קרום. קודם כל, פלטפורמת microfluidic חוסך על חומרים בשל דרישות נפח נמוך הן עבור חלבון שומנים בשימוש (40 nL נפח ערוץ הכולל, 1.0 מ"מ 2 שטח משטח SLB). בנוסף, קומפוזיציות השומנים הרלוונטיים מבחינה פיזיולוגית ניתן להשתמש, תוך שמירה על נזילות קרום דו מימדי (≥ 1.0 מיקרומטר 2 / s) 28 , 38 . מערכת האיתור מספקת יחס משופר של אות לרעש בהשוואה ל - ITC, SPR ו - Microbalance קריסטל של קוורץ עם ניטור (QCM-D), המאפשר לבחון לא רק אינטראקציות קרום חלבון, אלא יון, מולקולה קטנה, אינטראקציות קרום פפטיד טוב 19 , 20 , 39 , 40 . כמו כן, ה- pH בדיקה פלואורסצנטי רגיש הוא יציב מאוד לא photobleach בתנאים ניסויים נבדקו 19 , 20 , 41 . יתרון נוסף של פלטפורמה זו הוא היכולת לבחון את המשטחים קרום חזותית. אינטראקציות מסוימות עלולות לגרום היווצרות microdomain השומנים ו / או להשפיע על נזילות הממברנה, אשר יכול להיות דמיינו ישירות ו / או נבדק באמצעות התאוששות הקרינה לאחר photobleaching (FRAP), בהתאמה 42 . Assay המתואר כאן אינו דורש כל מכשור יקר מעבר מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לבסוף, והכי חשוב, הערכת אינטראקציות הממברנה בהעדר תיוג ליגנד / קולטן עושה את ה- PIP על שבב assay השיטה המועדפת על אלה המסורתית.

אף על פי ה- PIP- על שבב assay היא טכניקה חזקה, חלבונים ממברנה היקפיים יכול הבדלEr בהרכב הכולל של שאריות קטיוני ואניוני והפצה שלהם בתוך / סביב האתר מחייב, אשר יוצרים אתגרים מסוימים. לחלק מהחלבונים יש אתרים המחייבים פיפ המורכבים משאריות בסיסיות רבות, ואילו לאחרים יש רק מעטים. לכן, יחס H + / OH - באתר הכריכה יהיה שונה, וכך גם גודל השינוי ב- pH המקומי על הכריכה. Stoichiometry של האינטראקציה והאם או לא PIP מחייב מיוצב על ידי אינטראקציות עם שומנים אחרים עוד מסבך את המקרה. לפיכך, PI של חלבון, במיוחד עבור חלבון גדול, לא יכול להיות המדד היחיד לשינוי הקרינה הצפויה. בעוד כמה אינטראקציות חלבון PIP תגרום שינויים הקרינה גדול, והשאר עלול לגרום לשינויים פלואורסצנטי קטן. במקרה האחרון, לפחות שתי פעולות ניתן לנקוט כדי לשפר את יחס אות לרעש: 1) באמצעות רמות PIP גדול על bilayer להגדיל את מספר חלבונים r, כלומר להגדיל את מספר גויסו OH - יונים ומספר מרווה o SRB-POPE מולקולות; 2) להגדיל את רמות SRB-POPE o כדי לשפר את יחס אות לרעש.

למרות הפלטפורמה הנוכחית מספקת יתרונות רבים לחקר חלבונים ממברנה היקפיים, יש כמה אתגרים לחקר חלבונים טרנסממברני. בשל הקרבה תמיכה SLB זכוכית (שכבת מים הוא בערך 1-2 ננומטר בהתאם הרכב השומנים), אינטראקציה זכוכית חלבון טרנסממברני יכול לקדם denaturation חלבון, להוביל לאובדן של תפקוד, immobilization 34 , 43 , 44 , 45 . אף יותר מעורב, מגוון של גישות פותחו כדי להתגבר על אתגרים אלה, כגון שינוי פני השטח של תמיכה זכוכית לספק כרית פולימר או כולל lipopolymeR tethers (למשל ליגידים PEGylated) בתוך bilayer להגדיל את התמיכה תמיכה SLB זכוכית 34 , 46 , 47 , 48 .

יצירת באיכות גבוהה SLBs הוא ההיבט הקריטי ביותר של ה- PIP על שבב assay ( איור 8 א ). באמצעות coverslips נקי SUVs טרי מומלץ להבטיח reproducibility. בשל נוכחות של שומנים anionic, כגון PI (4,5) P 2 , SUVs הם טעונים שלילי, אשר מוריד את SUV יעילות rupturing להשפיע על נזילות הממברנה ( איור 8 ב ). לכן, התאמת ה- pH של פתרון SUV הוא קריטי כדי protonate PI (4,5) P 2 ראש קבוצת phosphates ולהפחית את הדחייה האלקטרוסטטית עם הזכוכית כדי להגביר את יעילות קורעת 49 , 50 . רכבי השטח שאינם מכילים אניוני lIpids, אינם דורשים כל התאמה pH. בנוסף, SUVs צריך להיות מוזרק לערוצים מיד לאחר הטיפול פלזמה חמצן מליטה, בעוד משטח coverslip זכוכית עדיין הידרופילית, אשר נדרש עבור היווצרות SLB. מלבד איכות SLB, חלקיקי אבק מייצגים בעיה נוספת. במהלך תהליך ייצור המכשיר, חלקיק אבק לכוד בין הערוצים יכול לגרום היתוך ערוץ, ואילו חלקיק אבק לכוד בתוך ערוץ יכול לפגוע SLB ו / או להפחית את מהירות זרימת הפתרון ( איור 8C, 8D ). אזור העבודה יש ​​לנקות מעת לעת כדי להסיר אבק. כמו כן, החשיפה של בועת אוויר לתוך ערוץ יש להימנע בכל שלב, אשר אחרת יפגע SLB בלתי הפיך ( איור 8E ).

פרמטר נוסף שיש לקחת בחשבון בעת ​​תכנון PIP- על שבב assay הוא מאגר אחסון חלבונים. אם משתמשים בריכוזים גבוהים, רכיבים בודדים (ייצוב סוכנים, צמצום סוכנים, מלחים, סוכני מיקרוביאלית, chelating ריאגנטים, וכו ' ) עשויים להשפיע על הקרינה ו / או SLB שלמות. לכן, המאגר האחסון צריך להיות טיטרציה כדי לבדוק את השפעתה. אם ההשפעה היא נצפתה, SLBs צריך להיות גם equilibrated לתנאי המאגר האחסון לפני טיטרציה את החלבון כדי למנוע סחיפה של פלואורסצנטי. בהתחשב בכך כי assay pH מבוסס assay, אם אפשר, חלבון מטוהרים צריך גם להכיל את מרכיב חציצה זהה למאגר פועל (במקרה זה 20 מ"מ HEPES ב pH 7.0) כדי למזער את הסחף ב הקרינה שנגרמה על ידי חוסר התאמה המאגר.

לסיכום, הוכחנו כי assay אפנון pH ניתן להשתמש בהצלחה כדי לחקור אינטראקציות חלבון PIP. למרות הדגש היה על PIPs, פלטפורמה זו יכולה לשמש כדי לבדוק אינטראקציות עם מערכות קרום מורכבות יותר הכוללים שומנים פיזיולוגיים רלוונטיים אחרים כגון phosphatidylseriNe, phosphatidylethanolamine, חומצה phosphatidic, וכולסטרול, בין היתר 28 , 39 , 42 , 51 . מעבר חלבונים סלולריים, פלטפורמה זו assay יכול גם להיות מועיל עבור אלו הלומדים פתוגנים האדם. לדוגמה, חלבונים המקודדים על ידי וירוסים וחיידקים נמצאו אינטראקציה עם ממברנות הסלולר וחלקם במיוחד עם PIPs 52 , 53 , 54 , 55 , 56 . לפיכך, Assay PIP- על שבב יכול לספק אמצעי לגלות ולאפיין מעכבי מולקולה קטנה של אינטראקציות חלבון- PIP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

DS ו CEC נתמכו, בין היתר, על ידי מתן AI053531 (NIAID, NIH); SS ו- PSC נתמכו על ידי מענק N00014-14-1-0792 (ONR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coverslip
Glass Coverslips: Rectangles Fisher Scientific 12-544B 22 x 40 x 0.16 - 0.19 mm, No. 1 1/2; Borosilicate Glass
7X Cleaning Solution MP Biomedicals 976670 Detergent
PYREX Crystallizing Dish Corning 3140-190 Borosilicate glass dish with a flat bottom; Diameter x Height (190 x 100 mm); Distributor: VWR (89090-700)
Sentry Xpress 2.0 Paragon Industries SC-2 Kiln
Name Company Catalog Number Comments
PDMS
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 4019862 Polydimethylsiloxane (PDMS); Distributor: Ellsworth Adhesives
PYREX Desiccator VWR 89134-402 Vacuum Rated
Biopsy punch Harris 15110-10 Harris Uni-Core; 1.0 mm diameter; Miltex Biopsy Punch with Plunger (Cat. No. 15110-10) can be used as an alternative
Name Company Catalog Number Comments
Device
Plasma Cleaning System PlasmaEtch PE25-JW 2-stage Direct Drive Oil Vacuum Pump, O2 service (Krytox Charged)
Digital Hot Plate Benchmark H3760-H Purchased through Denville Scientific (Cat. No. 1005640)
Frosted Micro Slides VWR 48312-003 Frosted, Selected, and Precleaned; Made of Swiss Glass; Thickness: 1 mm; Dimensions: 75 x 25 mm; GR 144
Name Company Catalog Number Comments
Mold
AutoCAD Autodesk v.2016 Drafting software for the photomask design
Photomask CAD/Art Services N/A Design with black background and clear features was printed at 20k dpi resolution on a transparent mask (5 x 7 in) by CAD/Art Services
Silicone Wafers University Wafer 1575 Prime Grade, Single Side Polished; 100 mm (4 inch) Diameter; 525 um Thickness
SU-8 50 MicroChem Corp. N/A Negative Tone Photoresist; Penn State Nanofabrication Facility Property
SU-8 Developer MicroChem Corp. N/A Penn State Nanofabrication Facility Property
Name Company Catalog Number Comments
SUV
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850457C POPC
L-α-phosphatidylinositol-4-phosphate Avanti Polar Lipids 840045X PI4P
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate Avanti Polar Lipids 840046X PI(4,5)P2
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine Avanti Polar Lipids 850757C POPE; Required for the synthesis of oSRB-POPE
Lissamine Rhodamine B Sulfonyl Chloride (mixed isomers) ThermoFisher Scientific L-20 Required for the synthesis of oSRB-POPE
pH Sensitive Fluorescent Lipid Probe (oSRB-POPE) In-house N/A In-house Synthesis (Huang D. et al. 2013)
Glass Scintillation Vial VWR 66022-065 20 mL volume capacity
Aquasonic 250D VWR N/A Ultrasonic Water Bath
Nuclepore Track-Etched Membranes Whatman 110605 Polycarbonate Membrane; Diameter: 25 mm; Pore Size: 0.1 um; Distributor: Sigma-Aldrich
Chloroform VWR CX1054-6 HPLC grade
LIPEX Extruder Transferra Nanosciences T.001 LIPEX 10 mL Thermobarrel Extruder
Viscotek 802 DLS Malvern Instruments N/A Dynamic Light Scattering; Penn State X-Ray Crystallography Facility Property
Name Company Catalog Number Comments
Data Analysis
GraphPad Prism GraphPad Software v.6 Curve-fitting software for data analysis
Name Company Catalog Number Comments
Microscope
Axiovert 200M Epifluorescence Microscope Carl Zeiss Microscopy N/A Microscope
AxioCam MRm Camera Carl Zeiss Microscopy N/A Camera
X-Cite 120 Excelitas Technologies N/A Light Source
Alexa 568 Filter Set Carl Zeiss Microscopy N/A Ex/Em 576/603 nm
AxioVision LE64 v.4.9.1.0 Software Carl Zeiss Microscopy N/A Image Processing Software
Name Company Catalog Number Comments
Other
Tips VWR 10034-132 200 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the protein solution into the microfluidic channel
Tips VWR 53509-070 10 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the vesicle solution into the microfluidic channel
Orion Star A321 pH meter Thermo Scientific STARA3210 pH meter
Orion micro pH probe Thermo Scientific 8220BNWP micro pH probe
N-(2-Hydroxyethyl)-Piperazine-N'-(2-Ethanesulfonic Acid) VWR VWRB30487 HEPES, Free Acid
Sodium Chloride VWR BDH8014-2.5KGR NaCl
Tubing Allied Wire & Cable TFT-200-24 N Internal Diameter: 0.020-0.026 inches (0.051-0.066 cm); Wall Thickness: 0.010 inches (0.025 cm); Flexible Polytetrafluoroethylene Thin-Wall Tubing; Natural Color
Nitrogen Gas - Industrial Praxair N/A Local Provider
Oxygen Gas - Industrial Praxair N/A Local Provider
Liquid Nitrogen Praxair N/A Local Provider

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443, (7112), 651-657 (2006).
  2. Shewan, A., Eastburn, D. J., Mostov, K. Phosphoinositides in cell architecture. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (8), a004796 (2011).
  3. Picas, L., Gaits-Iacovoni, F., Goud, B. The emerging role of phosphoinositide clustering in intracellular trafficking and signal transduction. F1000Res. 5, (2016).
  4. Lystad, A. H., Simonsen, A. Phosphoinositide-binding proteins in autophagy. FEBS Lett. 590, (15), 2454-2468 (2016).
  5. Balla, T. Phosphoinositides: Tiny lipids with giant impact on cell regulation. Physiol Rev. 93, 1019-1137 (2013).
  6. Lemmon, M. A. Membrane recognition by phospholipid-binding domains. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, (2), 99-111 (2008).
  7. Kutateladze, T. G. Translation of the phosphoinositide code by PI effectors. Nat Chem Biol. 6, (7), 507-513 (2010).
  8. Harlan, J. E., Hajduk, P. J., Yoon, H. S., Fesik, S. W. Pleckstrin homology domains bind to phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate. Nature. 371, (6493), 168-170 (1994).
  9. Garcia, P., et al. The pleckstrin homology domain of phospholipase C-delta 1 binds with high affinity to phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in bilayer membranes. Biochemistry. 34, (49), 16228-16234 (1995).
  10. Lemmon, M. A., Ferguson, K. M., O'Brien, R., Sigler, P. B., Schlessinger, J. Specific and high-affinity binding of inositol phosphates to an isolated pleckstrin homology domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, (23), 10472-10476 (1995).
  11. Flesch, F. M., Yu, J. W., Lemmon, M. A., Burger, K. N. Membrane activity of the phospholipase C-delta1 pleckstrin homology (PH) domain. Biochem J. 389, 435-441 (2005).
  12. Narayan, K., Lemmon, M. A. Determining selectivity of phosphoinositide-binding domains. Methods. 39, (2), 122-133 (2006).
  13. Scott, J. L., Musselman, C. A., Adu-Gyamfi, E., Kutateladze, T. G., Stahelin, R. V. Emerging methodologies to investigate lipid-protein interactions. Integr Biol (Camb). 4, (3), 247-258 (2012).
  14. Dowler, S., Currie, R. A., Downes, C. P., Alessi, D. R. DAPP1: A dual adaptor for phosphotyrosine and 3-phosphoinositides. Biochem J. 342, 7-12 (1999).
  15. He, J., et al. Molecular basis of phosphatidylinositol 4-phosphate and ARF1 GTPase recognition by the FAPP1 pleckstrin homology (PH) domain. J Biol Chem. 286, (21), 18650-18657 (2011).
  16. Ceccarelli, D. F., et al. Non-canonical interaction of phosphoinositides with pleckstrin homology domains of Tiam1 and ArhGAP9. J Biol Chem. 282, (18), 13864-13874 (2007).
  17. Huang, S., Gao, L., Blanchoin, L., Staiger, C. J. Heterodimeric capping protein from Arabidopsis is regulated by phosphatidic acid. Mol Biol Cell. 17, (4), 1946-1958 (2006).
  18. Yu, J. W., et al. Genome-eide analysis of membrane targeting by S. cerevisiae pleckstrin homology domains. Mol Cell. 13, (5), 677-688 (2004).
  19. Jung, H., Robison, A. D., Cremer, P. S. Detecting protein-ligand binding on supported bilayers by local pH modulation. J Am Chem Soc. 131, (3), 1006-1014 (2009).
  20. Huang, D., Zhao, T., Xu, W., Yang, T., Cremer, P. S. Sensing small molecule interactions with lipid membranes by local pH modulation. Anal Chem. 85, (21), 10240-10248 (2013).
  21. Saxena, A., et al. Phosphoinositide binding by the pleckstrin homology domains of Ipl and Tih1. J Biol Chem. 277, (51), 49935-49944 (2002).
  22. Knödler, A., Mayinger, P. Analysis of phosphoinositide-binding proteins using liposomes as an affinity matrix. Biotechniques. 38, (6), 858-862 (2005).
  23. Baumann, M. K., Swann, M. J., Textor, M., Reimhult, E. Pleckstrin homology-phospholipase C-delta1 interaction with phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate containing supported lipid bilayers monitored in situ with dual polarization interferometry. Anal Chem. 83, (16), 6267-6274 (2011).
  24. Saliba, A. E., et al. A quantitative liposome microarray to systematically characterize protein-lipid interactions. Nat Methods. 11, (1), 47-50 (2014).
  25. Arauz, E., Aggarwal, V., Jain, A., Ha, T., Chen, J. Single-molecule analysis of lipid-protein interactions in crude cell lysates. Anal Chem. 88, (8), 4269-4276 (2016).
  26. Best, Q. A., Xu, R., McCarroll, M. E., Wang, L., Dyer, D. J. Design and investigation of a series of rhodamine-based fluorescent probes for optical measurements of pH. Org Lett. 12, (14), 3219-3221 (2010).
  27. Lee, J., Choi, K. H., Yoo, K. Innovative SU-8 lithography techniques and their applications. Micromachines. 6, (1), 1-18 (2014).
  28. Poyton, M. F., Sendecki, A. M., Cong, X., Cremer, P. S. Cu(2+) binds to phosphatidylethanolamine and increases oxidation in lipid membranes. J Am Chem Soc. 138, (5), 1584-1590 (2016).
  29. Karasek, P., Grym, J., Roth, M., Planeta, J., Foret, F. Etching of glass microchips with supercritical water. Lab Chip. 15, (1), 311-318 (2015).
  30. Thomas, M. S., et al. Print-and-peel fabrication for microfluidics: what's in it for biomedical applications? Ann Biomed Eng. 38, (1), 21-32 (2010).
  31. Waheed, S., et al. 3D printed microfluidic devices: enablers and barriers. Lab Chip. 16, (11), 1993-2013 (2016).
  32. Axmann, M., Schutz, G. J., Huppa, J. B. Single molecule fluorescence microscopy on planar supported bilayers. J Vis Exp. (105), e53158 (2015).
  33. Barenholz, Y., et al. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. Biochemistry. 16, (12), 2806-2810 (1977).
  34. Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surface Science Reports. 61, (10), 429-444 (2006).
  35. Hamai, C., Yang, T., Kataoka, S., Cremer, P. S., Musser, S. M. Effect of average phospholipid curvature on supported bilayer formation on glass by vesicle fusion. Biophys J. 90, (4), 1241-1248 (2006).
  36. Tero, R. Substrate effects on the formation process, structure and physicochemical properties of supported lipid bilayers. Materials. 5, (12), 2658-2680 (2012).
  37. Ferguson, K. M., Lemmon, M. A., Schlessinger, J., Sigler, P. B. Structure of the high affinity complex of inositol trisphosphate with a phospholipase C pleckstrin homology domain. Cell. 83, (6), 1037-1046 (1995).
  38. Simonsson, L., Hook, F. Formation and diffusivity characterization of supported lipid bilayers with complex lipid compositions. Langmuir. 28, (28), 10528-10533 (2012).
  39. Cong, X., Poyton, M. F., Baxter, A. J., Pullanchery, S., Cremer, P. S. Unquenchable surface potential dramatically enhances Cu(2+) binding to phosphatidylserine lipids. J Am Chem Soc. 137, (24), 7785-7792 (2015).
  40. Robison, A. D., et al. Polyarginine interacts more strongly and cooperatively than polylysine with phospholipid bilayers. J Phys Chem B. 120, (35), 9287-9296 (2016).
  41. Robison, A. D., Huang, D., Jung, H., Cremer, P. S. Fluorescence modulation sensing of positively and negatively charged proteins on lipid bilayers. Biointerphases. 8, (1), 1 (2013).
  42. Tabaei, S. R., et al. Formation of cholesterol-rich supported membranes using solvent-assisted lipid self-assembly. Langmuir. 30, (44), 13345-13352 (2014).
  43. Johnson, S. J., et al. Structure of an adsorbed dimyristoylphosphatidylcholine bilayer measured with specular reflection of neutrons. Biophys J. 59, (2), 289-294 (1991).
  44. Koenig, B. W., et al. Neutron reflectivity and atomic force microscopy studies of a lipid bilayer in water adsorbed to the surface of a silicon single crystal. Langmuir. 12, (5), 1343-1350 (1996).
  45. Tanaka, M., Sackmann, E. Polymer-supported membranes as models of the cell surface. Nature. 437, (7059), 656-663 (2005).
  46. Renner, L., et al. Supported lipid bilayers on spacious and pH-responsive polymer cushions with varied hydrophilicity. J Phys Chem B. 112, (20), 6373-6378 (2008).
  47. Wagner, M. L., Tamm, L. K. Tethered polymer-supported planar lipid bilayers for reconstitution of integral membrane proteins: Silane-polyethyleneglycol-lipid as a cushion and covalent linker. Biophys J. 79, (3), 1400-1414 (2000).
  48. Pace, H., et al. Preserved transmembrane protein mobility in polymer-supported lipid bilayers derived from cell membranes. Anal Chem. 87, (18), 9194-9203 (2015).
  49. Braunger, J. A., Kramer, C., Morick, D., Steinem, C. Solid supported membranes doped with PIP2: Influence of ionic strength and pH on bilayer formation and membrane organization. Langmuir. 29, (46), 14204-14213 (2013).
  50. Paridon, P. A., de Kruijff, B., Ouwerkerk, R., Wirtz, K. W. Polyphosphoinositides undergo charge neutralization in the physiological pH range: A 31P-NMR study. Biochim Biophys Acta. 877, (1), 216-219 (1986).
  51. Liu, C., Huang, D., Yang, T., Cremer, P. S. Monitoring phosphatidic acid formation in intact phosphatidylcholine bilayers upon phospholipase D catalysis. Anal Chem. 86, (3), 1753-1759 (2014).
  52. Saad, J. S., et al. Structural basis for targeting HIV-1 Gag proteins to the plasma membrane for virus assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, (30), 11364-11369 (2006).
  53. Hsu, N. Y., et al. Viral reorganization of the secretory pathway generates distinct organelles for RNA replication. Cell. 141, (5), 799-811 (2010).
  54. Del Campo, C. M., et al. Structural basis for PI(4)P-specific membrane recruitment of the Legionella pneumophila effector DrrA/SidM. Structure. 22, (3), 397-408 (2014).
  55. Kolli, S., et al. Structure-function analysis of vaccinia virus H7 protein reveals a novel phosphoinositide binding fold essential for poxvirus replication. J Virol. 89, (4), 2209-2219 (2015).
  56. Cho, N. J., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate is an HCV NS5A ligand and mediates replication of the viral genome. Gastroenterology. 148, (3), 616-625 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics