3D-FRAP顕微鏡によるmiRNAのギャップジャンクション依存的転写の解析

Biology

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Summary

ここでは、miRNAのギャップジャンクション依存シャトルを解析するために、光漂白(3D-FRAP)後の3次元蛍光回復の適用について説明します。一般的に適用される方法とは対照的に、3D-FRAPはリアルタイムで高空間/時間分解能で小RNAの細胞間移動の定量化を可能にする。

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Lemcke, H., Voronina, N., Steinhoff, G., David, R. Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy. J. Vis. Exp. (124), e55870, doi:10.3791/55870 (2017).

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Abstract

miRNAおよびsiRNAのような小さなアンチセンスRNAは、細胞生理学および病理学において重要な役割を果たし、さらにいくつかの疾患の治療において治療薬として使用することができる。 miRNA / siRNA治療のための新しく革新的な戦略の開発は、根底にあるメカニズムの広範な知識に基づいています。最近のデータは、小さなRNAがギャップ結合依存的な様式で細胞間で交換され、それによってレシピエント細胞における遺伝子調節効果を誘導することを示唆している。分子生物学的技術およびフローサイトメトリー分析は、miRNAの細胞間交換を研究するために一般的に用いられる。しかしながら、これらの方法は、ギャップジャンクションの分子束を研究する際に必要とされる、高い時間分解能を提供しない。したがって、細胞内シグナル伝達分子としてのmiRNA / siRNAの影響を調べるためには、細胞レベルでのこれらの小さなRNAの分析を可能にする新規ツールが必要である。現在のプロトコルは、心臓細胞間のmiRNA分子のギャップジャンクション依存的交換を解明するために、光退色(3D-FRAP)顕微鏡法後の三次元蛍光回復の襞付け。重要なことに、この直接的で非侵襲的な生細胞イメージング手法により、蛍光標識された小さなRNAのギャップジャンクショナルシャトルを、時空間分解能の高いリアルタイムで視覚化および定量化することができます。 3D-FRAPによって得られたデータは、細胞間ネットワーク内のシグナリング分子として小さなRNAが作用する、細胞間遺伝子調節の新規な経路を確認する。

Introduction

小さな非コードRNAは、細胞遺伝子調節において重要な役割を担っている。これらの分子は、特定の標的mRNAに結合する20〜25個のヌクレオチドから構成され、翻訳の妨害またはmRNA分解に導く1,2 。 miRNAやsiRNAなどの小規模RNAが担う遺伝子調節プロセスは、多くの異なる種に見られる高度に保存されたメカニズムです3 。特に、miRNA分子は、増殖、分化および再生を含む様々な生理学的過程に極めて重要である4,5。さらに、miRNA発現の調節不全は、多くの病理学的障害に起因する。相応して、miRNAは、診断のためのバイオマーカーとして、および遺伝子治療のための治療剤として適切であることが実証されている6,7。

ギャップジャンクション(GJ)は分子量が最大1kDの分子の拡散交換を可能にする2つの隣接する細胞の原形質膜における特殊なタンパク質構造である。それらは、組織発生、分化、細胞死、および癌または心臓血管疾患などの病理学的障害にとって重要であることが示されている8,9,10。いくつかの分子は、イオン、代謝産物、およびヌクレオチドを含むGJチャネルを横切ることができると記載されている。興味深いことに、GJはまた、小RNA 11,12の細胞間移動のための経路を提供することが見出された。したがって、miRNAは、それらが産生される細胞内だけでなく、レシピエント細胞内でも作用することができる。これは、細胞間シグナル伝達系におけるmiRNAの役割を強調している。同時に、このデータは、ギャップジャンクショナル細胞間連絡はmiRNA機能と密接に関連している。組織恒常性、病理学および診断にmiRNAおよびGJが顕著に及ぼす影響のため、GJの機能およびmiRNAの関連する細胞間動態の包括的な理解は、miRNAに基づく疾患のメカニズムを明らかにし、 miRNA療法。

ギャップ接合カップリングの程度に依存して、細胞間のmiRNA分子の移動は非常に迅速なプロセスであり得る。したがって、これらの調節シグナル伝達分子の迅速な細胞間移動の視覚化および定量化を可能にする方法論が必要である。一般的に、フローサイトメトリーおよび分子生物学的技術が、小RNA 11,12,13,14のシャトルを実証するために適用されている。しかし、FRAPマイクロとは対照的にこれらの手法は、高い時間分解能を欠いており、これはGJを介したmiRNAの交換を分析する際に必須である。さらに、FRAP顕微鏡法は侵襲性が低く、したがって、いくつかの細胞タイプ15,16,17における分子のGJ依存性交換を評価するための強力で新規な生細胞撮像技術を代表する。

ここでは、心筋細胞間のmiRNAシャトルを評価するための3D-FRAPの応用を記述する詳細なプロトコルを提示する。この目的のために、心筋細胞を蛍光標識されたmiRNAでトランスフェクトした。このmiRNAでマークされた細胞を光退色させ、隣接する細胞からのギャップ接合型miRNA再流入を時間依存的に記録した。 FRAP実験の高い時間分解能は、生存細胞間のmiRNAおよびsiRNAの細胞間移動の正確な評価のための動態学的研究を行う可能性を提供する。モレエFRAP顕微鏡法は、GJがそれぞれのシャトルプロセスにどの程度関わっているかを明らかにするのに役立ちます18 。さらに、3D-FRAPは、GJ透過性における生理学的および病理学的変化および小RNA伝達に対するその影響を調べるために使用することができる15,19。

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Protocol

新生児マウスを含むこのプロトコールの全てのステップは、ロストック大学メディカルセンターの動物飼育に関する倫理ガイドラインに従って実施した。

1.細胞培養用調製物および心筋細胞培養用培地の調製

  1. PBS中の0.1%ゼラチンで細胞培養プレートをコートし、37℃で4時間または4℃で一晩インキュベートする。ゼラチンを除去し、滅菌層流の下で乾燥させる。
  2. 10%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリン/ストレプトマイシン(P / S)を補充した50mLのDMEMからなる細胞培養培地を調製する。 37℃に予熱してください。

新生児心筋細胞の単離

  1. 新生仔マウス(1〜2日齢)を無菌ハサミで断頭し、胸骨に沿って胸を開ける。鉗子を使用して胸郭を軽く押しながら心臓を取り出し、心臓を氷冷HBSSを含む24ウェルプレートに移す(Ca 2+およびMg 2+なし )。
  2. 滅菌鉗子を使用して非心臓組織およびより大きな血管を除去する。洗浄した心臓を氷冷HBSSを入れた1.5mLチューブに移す。酵素消化にはチューブあたり最大5心を使用してください。
  3. 小さなハサミでハートを0.5〜1mm³未満の小片にします。
  4. 1mLのマイクロリットルピペットを用いてHBSSを吸引/添加することにより、細かい心臓をHBSSで2回洗浄する。酵素を添加する前に、HBSSを完全に除去する。
  5. 新生児の心臓を酵素消化するには、市販のキットを使用し、メーカーのプロトコールに従ってください( 表の表を参照 )。 35分間37℃で酵素と共にインキュベートしながら、5分ごとに細かい心臓を含むチューブを振る。
  6. 非心筋細胞画分の接着を可能にするために、1.5-2時間、細胞培養培地を含む非被覆細胞培養皿上に細胞を懸濁させた。高純度の心筋細胞が必要である。必要に応じて、非心筋細胞画分をさらに培養する。
    注:15心の細胞懸濁液については、75cm 2細胞培養フラスコ上でプレプレーティング工程を実施することができる。通常、1つの新生児の心臓から約5×10 5個の細胞が得られる。
  7. 上清を15mLコニカルチューブに集め、300xgで10分間遠心分離する。 1mLの細胞培養培地に細胞を再懸濁する。
  8. Neubauerチャンバー血球計で細胞を数えるか、同等の方法を使用してください。
  9. 3×10 5細胞/ cm 2の密度を有する6ウェルプレート上のプレート単離心筋細胞。 37℃および5%CO 2で一晩細胞をインキュベートする。
    注:任意で、この時点で細胞をトランスフェクトすることもできます。しかし、細胞をエレクトロポレーションに供する前に1日間培養した場合、生存率の増加が観察された。

3.蛍光標識されたmiRNAによるトランスフェクション

  1. 事前に、水浴または同等の装置中で37℃まで温かい細胞培養培地(ステップ1.2参照)を添加する。
  2. RNaseフリー滅菌水に蛍光miRNAの20μMストック溶液を調製します。
  3. 90mM Na 2 HPO 4、90mM NaH 2 PO 4、5mM KCl、10mM MgCl 2および10mMコハク酸ナトリウムを含むエレクトロポレーション緩衝液を調製し、pHを7.2に調整する;エレクトロポレーション緩衝液は-20℃で数ヶ月保存することができます。
  4. 0.05%トリプシンを用いて5分間培養皿から細胞を分離する。細胞培養培地を添加してトリプシンを不活性化する。
  5. Neubauerチャンバー血球計で細胞を数えるか、同等の方法を使用してください。細胞を300xgで10分間遠心分離する。
  6. 細胞をエレクトロポレーション緩衝液に再懸濁し、100μLあたり4×10 5細胞の濃度を得る。
  7. チューブ内に100μLの細胞懸濁液を蛍光miRNA(最終濃度0.25μM)と混合し、混合物をエレクトロポレーションキュベットに入れる。
    1. 細胞の種類に応じて、miRNAの適切な量を実験的に決定する。
  8. 「G-009」プログラムを用いてエレクトロポレーション装置( 表の表を参照 )を用いてエレクトロポレーションを行う。
  9. あらかじめ加温した細胞培養液500μLを加え、4ウェルガラス底チャンバースライドのウェルに細胞懸濁液全体(4 x 10 5細胞)を移す。 37℃、5%CO 2雰囲気下で1日培養する。
    注:FRAP分析では、~80%の細胞密度が最適です。標識されたmiRNAのトランスフェクションは、エレクトロポレーションを用いて排他的に行われるべきである。標識されたmiRNA分子の均質な分布はFRAP測定に有益であるため、試薬ベースのトランスフェクションは推奨されません。

4. 3D-FRAP顕微鏡検査の適用(3日目)

  1. 顕微鏡インキュベーターを温めて37°; Cと熱平衡を確立し、ドリフトの可能性を減少させるためにFRAP測定の少なくとも2時間前に共焦点顕微鏡システムをスイッチオンする。可能であれば、5%CO 2雰囲気を維持する。
  2. チャンバーのスライドをステージのサンプルホルダーに挿入します。
  3. 1.4 NAの油性対物レンズ(400倍の倍率)と、570-680 nmの検出範囲で、低レーザーパワーで561 nmレーザー励起光を使用して、トランスフェクトされた心筋細胞のクラスターを見つける。
    注:FRAP設定、画像取得、および分析の定義は、顕微鏡専用のソフトウェアを使用して行った( 表の表を参照 )。
  4. "Setup Manager"で "z-Stack"、 "Time Series"、 "Bleaching"、 "Regions"の各ボタンを有効にします。
  5. FRAPパラメータを定義します。
    1. 「取得モード」メニューで画像取得設定を定義するには、「フレームサイズ4; 「ラインステップ」を1に、「スキャン時間」を<1秒に設定します。
    2. "Channels"メニューで、レーザーパワー、オフセット、ゲインの設定を調整して、最小レーザー励起( :レーザーパワー:1〜5%)から最大限の蛍光を得ます。強度の飽和を避けるために調整します。 「ピンホールサイズ」を2μmに設定します。
    3. 次に、[領域]メニューで[ROI描画ツール]を選択し、カーソルを使用してターゲットセル、参照セル、および背景領域をマークします。必要に応じて、光退色のためのいくつかの標的細胞を選択する。
    4. 「漂白」メニュー( 例えば、反復:9-14、光退色用レーザ出力:100%、画像取得間隔:60秒、周期:15)における光退色設定を調整する。最初の3回のスキャンの後に漂白の開始を定義する。
    5. 「z-Stack」メニューでは、セルの厚さに応じて、zスタック取得の限度を定義します。 「番号を調整する」f z層 "を12~15とする。
    6. FRAP実験を開始し、蛍光回復を記録する。
      注:FRAP実験の設定は、細胞型、蛍光色素、および顕微鏡システムに依存するため、パイロット実験を実施してFRAPの最適パラメータを決定することが最善です。漂白は、初期蛍光強度を少なくとも50%低下させるのに十分でなければならない。典型的には、プラトー相に達するまで蛍光回復を30〜60秒ごとに記録する必要があります。

5.データ解析

  1. 得られたz-スタックの最大投影を作成し、漂白標的細胞、参照細胞およびバックグラウンドの蛍光強度値を得る。顕微鏡固有のソフトウェアを使用して、「処理」→「最大輝度投影」→ファイル選択→「適用」をクリックします。
    1. あるいは、同等の画像解析ツール(
  2. ターゲット細胞、バックグラウンド、および参照細胞からの蛍光強度データをすべての時点でスプレッドシートにコピーします。
    1. 取得プロセス中に生じた光退色を補正するために、標的細胞の強度値から基準細胞のバックグラウンド強度および強度を差し引く。各時点でバックグラウンドセルとリファレンスセルの補正を実行します。
    2. 各値を初期蛍光で割ることにより、漂白前の初期蛍光強度に補正されたFRAPデータを正規化する。
    3. FRAP曲線を得るために、各時点の強度値から減算することによって、漂白直後の蛍光強度にベースラインを設定する。

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Representative Results

ここでは、我々は新生児の心筋細胞内の蛍光miRNAのギャップジャンクショナルシャトルを研究する非侵襲的な技術として3D-FRAP顕微鏡法を提示する。単離された心筋細胞は、典型的な線条α-アクチニンパターンを示し、細胞間境界に沿ってCx43の大きなプラークを含んでいた( 図1A 、白矢印)。単離した心筋細胞の純度を、α-アクチニン陽性細胞の微量定量によって評価した。一部の非心筋細胞(α-アクチニン陰性細胞)が培養液中に存在したが、新生児の心筋細胞は、単離後に主要細胞型を示した(79.62±3.68%; 図1B )。

miRNAのギャップジャンクション交換を調べるために、細胞を蛍光標識されたmiRNAでトランスフェクトした。エレctroporationは、高いトランスフェクション効率とトランスフェクションされた化合物の均質な分布を確実にするので、細胞にmiRNA分子を送達するための選択方法です。これはFRAP分析に必須です。我々の実験装置では、フローサイトメトリー( 図2A )によって決定されるように、〜45%のトランスフェクション効率を達成した。 FRAPのための心筋細胞の調製には、培養プレートからの分離、エレクトロポレーション、およびチャンバースライドへの再付着が含まれる。フローサイトメトリー生/死アッセイは、大部分の細胞が高い生存能力を示し、ギャップジャンクション通信を分析する際に重要であることを明らかにした( 図2B )。さらに、細胞密度はFRAPの結果に影響を与える重要なパラメーターです。最適なFRAP測定のためには、細胞クラスターの形成および細胞間の機能的なギャップジャンクションの確立を可能にするために、細胞を約80%の密度で播種すべきである( 2C)。

FRAP分析のために、標的細胞は細胞クラスター内で選択され、100%レーザー出力で光退色され、選択された細胞におけるmiRNA蛍光が減少する( 図3A 、漂白剤)。続いて、蛍光回収を記録して、隣接細胞からのmiRNAの漂白領域への移動を可視化する。 13分後に蛍光回復のプラトー相に達したので、この時間間隔をFRAP実験における画像取得に使用した。取得したデータの定量分析および標準化は、20%の平均回復を示した。このデータはまた、FRAP顕微鏡法が、高い時間分解能でのmiRNAシャトルの迅速な記録を可能にすることを実証した。色素特性に応じて、取得パラメータを変更して時間分解能をさらに高めることができます。

3D-FRAPの使用により、異なる条件下でのmiRNAに対するGJ透過性の比較。これを実証するために、本発明者らは、Cx43のsiRNA媒介性ノックダウンを誘導し、タンパク質発現の減少( 図3C )およびギャップジャンクションコミュニケーションの阻害を導く。その結果、蛍光回収率は50%以上減少し、miRNA導入の効率は細胞間のギャップジャンクションカップリングの程度に強く依存することが示された( 図3B 、Cx43ノックダウン)。蛍光回収が、分離したDy547タグではなく、蛍光標識されたmiRNAの通過を反映することを確認するために、カルセイン色素のFRAPデータも得た( 図3D )。カルセインはDy547の分子量に匹敵する分子量を有し、したがって同様の伝達動態を有する。 Dy547標識miRNAの蛍光回収とは対照的に、カルセインはギャップジャンクション交換の増加を示し、これはDy547タグimiRNA分子から分離していない( 図3D )。

安定した焦点条件は、特に長期測定が行われる場合、FRAP実験を通して必須である。 2Dアプリケーションと比較して、3D-FRAPは潜在的なフォーカスドリフトを補うことができます。 図4に示すように、単一の2D層がFRAP実験に使用された場合( 図4B )、わずかな焦点変化でもmiRNAの蛍光シグナルの適切な検出に影響があります。対照的に、3D-FRAPでは、標的細胞のzスタック全体が記録され、最大投影がデータ解析に供される( 図4A )。フォーカスドリフトが正規化された蛍光強度曲線に及ぼす影響を図4Cに示す 。 3D-FRAPでは時間の経過とともに蛍光回復が着実に増加するが、2D-FRAP取得では減少する蛍光シグナル。

焦点変化の補償のほかに、3D-FRAPはmiRNAのギャップジャンクショナル交換の空間データも提供します。 図5は、FRAP実験の3Dサーフェスレンダリングを示しています。最大予測と比較して、zスタックの取得は、細胞内のmiRNAの局在と移動性を調べるために3D再構成を作成するために使用できます( 図5 )。オルガネラとの同時標識は、miRNA移入における他の細胞成分の関与の調査を可能にする。

図1
図1:分離された新生児心筋細胞の代表的な顕微鏡画像。A )構造化照明顕微鏡法は、Cx43の高い発現を示し、これは大きなp細胞 - 細胞境界(矢頭)でラク。隣接する細胞とのGJの顕著な形成は、miRNAを含む小分子の広範な交換を可能にする。スケールバー=20μm( B )単離された心筋細胞の純度。 α-アクチニンの標識は、単離後の心筋細胞が主要な細胞型であることを示している。スケールバー=50μm。細胞を抗Cx43(緑色)および抗α-アクチニン抗体(赤色)で染色した。核はDAPI(青色)を用いて視覚化した。構造化照明顕微鏡法および免疫学的標識化の説明は、以前の刊行物20に記載されている。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図2
図2:トランスフェクション効率、生存率 、および新生児心筋細胞培養の細胞密度。 ( A )フローサイトメトリーにより、miR547エレクトロポレーションは〜45%のトランスフェクション効率をもたらした。 ( B )FRAPに使用される心筋細胞の細胞生存率。単離、エレクトロポレーション、および再付着後、心筋細胞を生死細胞染色し、高い細胞生存率を示した。 ( C )FRAP顕微鏡検査のために調製したmir547トランスフェクト心筋細胞の顕微鏡画像。 80-90%の細胞密度は、ギャップ接合細胞 - 細胞接触の顕著な形成を確実にする。スケールバー=50μm。トランスフェクション効率および生存性染色のフローサイトメトリー分析のための方法は、以前の刊行物20,21に記載されている。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

ontent "fo:keep-together.within-page =" 1 "> 図3
図3:新生児心筋細胞におけるmiRNAのGJ依存性交換。A )FRAP実験の代表的な画像。標識されたmiRNAでトランスフェクションした後、細胞クラスター内の標的細胞は強力なレーザーパルス(前漂白剤対漂白剤)によって光退色する。ギャップ接合カップリングの程度に依存して、隣接細胞からのmiRNAのギャップ接合流入は、漂白された標的細胞における蛍光強度の増加をもたらす(漂白後t = 3,6,9および13分)。スケールバー=20μm( B )取得したFRAPデータの定量分析は、13分後に20%の蛍光回復を示す。 miRNAの細胞間移行に関与するGJを確認するために、cx43ノックダウンを行い、蛍光回復(50%)の強力な減少をもたらした。 ( C )抗Cx43による免疫染色その後の共焦点顕微鏡検査は、タンパク質レベルでのCx43ノックダウンの効率を実証する。スケールバー=50μm。 ( D )miR547とカルセイン色素のFRAPデータの比較は、異なる伝達動態を示す。カルセインの分子量が小さいほど、dy547タグ付きmiRNA分子と比較して蛍光回収が増加した。 FRAP曲線は平均±SEMとして示されるn≧56細胞のデータを要約する。統計的解析は、二元配置ANOVA、続いてBonferroniのポストホック検定(* P <0.05、** P <0.01、*** P <0.001)を用いて行った。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図4
図4:3D-FRAP顕微鏡を用いたフォーカスドリフトの補正。B )光退色細胞(赤線)の代表的な画像は、3Dおよび2D-FRAP実験中の蛍光強度に対するフォーカスドリフトの影響を示す。 ( A )3D-FRAPでは、各時点ごとにzスタックが記録され、最大投影がデータ解析に使用され、フォーカスドリフトを補正します。スケールバー=20μm。 ( B )対照的に、2D-FRAPの場合、ただ1つの2D層がデータ解析を受ける。したがって、全体的な蛍光強度は、焦点の変化によって大きく減少する。スケールバー=20μm。 ( C )3Dおよび2D-FRAP実験の代表的な正規化蛍光強度曲線は、蛍光回復に対するフォーカスドリフトの強い影響を示し、細胞間miRNAシャトルを研究する場合の3D獲得の利点を示す。 thのより大きなバージョンを表示するにはここをクリックしてください数字です。

図5
図5:3D-FRAP実験の3Dサーフェスレンダリング (左)FRAP測定の最大投影。光退色細胞(赤色フレーム)は、隣接する細胞からのmiRNA移入に起因する蛍光強度の増加を示す。 (右)同じ光退色細胞(赤色)のzスタックを取得し、miRNAの空間分布を視覚化するために3Dサーフェスレンダリングを行いました。スケールバー=20μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

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Discussion

miRNAは、細胞生理学における重要な役割を果たしており、とりわけGJを細胞間の経路11,12,22の経路として使用することで、シグナル伝達分子として働くことが示されています。現在のプロトコールは、細胞クラスター内の蛍光miRNAを用いてこのGJ依存シャトルを特徴付けるインビトロ生細胞撮像技術を提示している。

プロトコールは、細胞モデル系として心筋細胞上に開発された。しかし、このアプローチは、エレクトロポレーションがmiRNAトランスフェクションに適した方法であれば、いくつかの細胞タイプに適用することができます。細胞間の交換に加えて、提示された技術は、miRNA分子の細胞内移動性を調べるのにも適している( 例えば、細胞内の可能な輸送機構の同定のため) 23,24

FRAP顕微鏡法によるmiRNA導入の研究では、蛍光標識されたmiRNA分子が必要です( 図2 )。特定の細胞miRNAの標識が可能でないため、導入された外来miRNAのみを3D-FRAPに使用して、我々の実験では、250nMのmiRNAで細胞をトランスフェクションしたが、この濃度は、miRNAレベルが細胞あたり10〜50,000分子の範囲である生理学的条件と比較してはるかに高かった27,28 。十分な蛍光シグナルを得るため、およびバックグラウンド蛍光と蛍光標識されたmiRNAとの間の適切な識別を確実にするために、あるレベルの蛍光miRNA分子が必要とされるが、共焦点イメージングシステムおよび色素特性に依存して、 -nM範囲は、FRAPアッセイのために実行可能であるべきである。/ p>

フローサイトメトリー、PCR、ルシフェラーゼレポーターアッセイ12,13を含むさまざまな技術が細胞間miRNAの伝達を研究するために一般的に適用されています。これらの方法は、低い時間分解能( すなわち、数時間から数日)でmiRNAのシャトルを検出する。対照的に、3D-FRAP顕微鏡法は、リアルタイムでmiRNAの移動および移動の視覚化および定量化を可能にする。ギャップ結合細胞 - 細胞接触に加えて、miRNAの細胞間シャトルリングは、エキソソーム18,29,30などの他のメカニズムによっても媒介される。 3D-FRAPのみが、エキソソームとギャップジャンクション転写とを区別するのに十分に高い時間分解能を提供する。したがって、これは、異なる病理学的または生理学的条件下でのmiRNAシグナリングに対するGJ透過性の直接的効果に対する特異的な調査を可能にする( Figu2)。

従来の2D-FRAPよりも優れた3D-FRAPを使用することをお勧めします。これは、GJ依存性miRNA伝達に関するより正確なデータを提供するためです。 3D-FRAP測定には、大量のバルクセルタイプを使用する場合に重要な、全セル容積が含まれます。さらに、2D-FRAPでの蛍光回復を著しく損なうことが示された、焦点の変化または細胞の動きを補償することができます( 図3 )。最後に、3D-FRAP実験でのzスタックの記録は、蛍光強度の分析にただ1つの2D層を使用する場合には実現不可能な空間情報を得る可能性を提供する( 図3B )。

蛍光回収は隣接細胞からのmiRNAの流入に依存するので、漂白細胞に接続された細胞の数は重要であり、信頼性の高いデータを得るためには異なる測定にわたって同様でなければならない。したがって、高い細胞密度が要求されるFRAP分析に最も適した細胞クラスターの形成を確実にする。さらに、高いレーザー強度25,26によって引き起こされる光毒性効果を避けるために穏やかな漂白条件( すなわち、レーザー出力、漂白時間およびスキャン設定)を選択する予備実験を実施しなければならない。これはまた、取得プロセス中に起こる光退色を減少させるのにも役立つ。

この制限にもかかわらず、我々のデータは、3D-FRAPが、細胞ネットワーク内のシグナル分子としてのmiRNAの役割を評価する強力なツールであることを示している。 miRNAのシャトルへのコネキシン組成の影響または特定のmiRNAに対するGJの選択的な透過性は、輸送効率の直接的な定量化で対処することができます。 3D-FRAPは、miRNAおよびsiRNAを特徴とする新しい治療法の開発を改善するための重要な情報を提供することができます。例えば、配布を容易にする適切な条件を定義することによってn個の小型RNA GJネットワーク31,32 を介して増幅する。

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Disclosures

著者らは、利害の対立を宣言していない。

Acknowledgments

この作業は、ドイツ連邦教育研究省(FKZ 0312138AおよびFKZ 316159)、EU構造基金(ESF / IVWM-B34-0030 / 10およびESF / IVBM-B35-0010 / 12)、DFG(DA1296-1)、およびドイツ心臓財団(F / 01/12)が含まれる。さらに、RDは、ロストック大学医療センター(889001)のFORUNプログラム、DAMP財団、およびBMBF(VIP + 00240)によってサポートされています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
neonatal NMRI mice Charles River
Gelatin Sigma Aldrich G7041 0.1% solution in PBS, sterilized
PBS Pan Biotech P04-53500
Dulbecco´s modified medium Pan Biotech P04-03550
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 100 U/mL, 100µg/mL
Fetal bovine serum Pan Biotech P30-3306
Cell culture plastic TPP
Primary Cardiomyocyte Isolation Kit Thermo Fisher Scientific 88281
HBSS Thermo Fisher Scientific 88281 included in primary cardiomyocyte isolation kit
Trypan blue Thermo Fisher Scientific 15250061
miRIDIAN Dy547 labeled microRNA Mimic Dharmacon CP-004500-01-05 dissolve in RNAse free water, stock solution 20µM
Sodium phosphate monobasic Sigma S3139
Sodium phosphate dibasic Carl Roth T877.2
Potassium chloride Sigma P9333
Magnesium chloride Serva 28305.01
Sodium succinate Carl Roth 3195.1
0.05% Trypsin/EDTA solution Merck L2153
4-well- Glass bottom chamber slides IBIDI 80827 coat with 0.1% gelatin solution
Amaxa Nucleofector II Lonza program G-009 was used for Electroporation 
LSM 780 ELYRA PS.1 system Zeiss
Excel software Microsoft
α-actinin antibody Abcam ab9465 dilution 1:200
Connexin43 antibody Santa Cruz sc-9059 dilution 1:200
goat anti-mouse Alexa 594 antibody Thermo Fisher Scientific A-11005 dilution 1:300
goat anti-rabbit Alexa 488 antibody Thermo Fisher Scientific A-11034 dilution 1:300
Connexin43 siRNA Thermo Fisher Scientific AM16708 ID158724 final concentration 250 nM
Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher Scientific L10119
CellTrace Calcein Red-Orange Thermo Scientific C34851
DAPI nuclear stain Thermo Scientific D1306

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