युगपत और माप के HDAC1 HeLa में HDAC6 गतिविधि कक्ष का उपयोग कर UHPLC-MS

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Chemistry

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Summary

Isoform-विशिष्ट inhibitors HeLa कोशिकाओं में histone deacetylases (HDAC) के एकाधिक substrates के UHPLC-MS विश्लेषण द्वारा की पहचान करने के लिए वर्तमान पद्धति है कार्य करता है। यह एक एंटीबॉडी-मुक्त विधि में रहने वाले HDAC1 और HDAC6 गतिविधि को प्रतिबिंबित करने के लिए विकसित किया है सेल पर्यावरण, एकल-isoform सेल-नि: शुल्क assays के विपरीत।

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Simões-Pires, C. A., Zwick, V., Cretton, S., Cuendet, M. Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS. J. Vis. Exp. (126), e55878, doi:10.3791/55878 (2017).

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Abstract

दवाओं की खोज में रुचि बढ़ाने के नए histone deacetylase (HDAC) inhibitors के लिए खोज है। Isoform selectivity romidepsin, एक वर्ग के अनुमोदन के बाद से सुर्खियों में रहा है मैं HDAC कैंसर थेरेपी, और एकाधिक myeloma के लिए HDAC6-विशिष्ट inhibitors की नैदानिक जांच के लिए अवरोध करनेवाला। वर्तमान पद्धति पर HDAC1 और HDAC6 कोशिकाओं में परीक्षण यौगिकों की निरोधात्मक गतिविधि निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है। Isoform गतिविधि अल्ट्रा उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (UHPLC-MS) के साथ इलाज किया और इलाज HeLa कोशिकाओं incubated विशिष्ट substrates के विश्लेषण का उपयोग करके मापा जाता है। विधि कक्ष पर्यावरण, जैव रासायनिक सेल मुक्त assays पर अलग isoforms आयोजित विपरीत भीतर अंतर्जात HDAC गतिविधि को दर्शाती का फायदा है। क्योंकि यह सिंथेटिक substrates के मात्रा का ठहराव पर आधारित है, इसके अलावा, विधि एंटीबॉडी अंतर्जात acetylated प्रोटीन की पहचान की आवश्यकता नहीं है। यह आसानी से कई सेल लाइनों और एक स्वचालित प्रक्रिया के लिए अनुकूल है। विधि पहले से ही neuroblasts में HDAC6-चयनात्मक यौगिकों को खोजने में उपयोगी साबित कर दिया है। प्रतिनिधि परिणाम यहाँ दिखाए गए हैं मानक HDAC inhibitors trichostatin के साथ एक (गैर विशेष), MS275 (HDAC1-विशिष्ट), और tubastatin (HDAC6-विशिष्ट) HeLa कोशिकाओं का उपयोग कर।

Introduction

HDACs एंजाइमों histones chromatin संरचना के भीतर deacetylate कर के एक परिवार के हैं। वे भी अन्य प्रोटीन substrates में cytosol है और विभिन्न सेल डिब्बों में स्थित हैं। कुल 18 HDAC isoforms की अब तक पहचान की गई है और कई सेल तंत्र, प्रतिलेखन कारकों और जीन अभिव्यक्ति, अच्छी तरह के रूप में सेल सिग्नलिंग के विनियमन शामिल करने के लिए संबंधित किया गया है और1,2,3,4,5,6,7परिवहन। HDAC उत्प्रेरक inhibitors कैंसर थेरेपी के लिए संभावित चिकित्सीय दवाओं के रूप में उभरा है। वर्तमान में एफडीए द्वारा अनुमोदित सबसे HDAC inhibitors T-कोशिका लिंफोमा और एकाधिक myeloma के उपचार के लिए कर रहे हैं, और गैर-विशिष्ट HDAC inhibitors की तरह, जैसे vorinostat (साहा), belinostat, और panobinostat8,9कर रहे हैं। हालांकि, पक्ष प्रभाव की एक श्रृंखला पैन-inhibitors के साथ संबद्ध किया गया है, और isoform-विशिष्ट छोटे अणुओं के लिए खोज औषधीय रसायन और दवा की खोज में एक गर्म विषय है। तदनुसार, कक्षा मैं (HDAC1-3 और HDAC8) चयनात्मक अवरोध करनेवाला romidepsin है एक पहले से ही अनुमोदित दवा10, जबकि HDAC6-विशिष्ट inhibitors नैदानिक परीक्षणों, एकाधिक myeloma11,12,13,14,15में बढ़ी हुई चिकित्सीय क्षमता के साथ के अंतर्गत वर्तमान में कर रहे हैं।

Assays HDAC विशेषताएँ करने के लिए स्क्रीनिंग inhibitors (एकल isoform, परमाणु निकालें या सेल lysate) एक एंजाइमी स्रोत के साथ एक HDAC सब्सट्रेट के इन्क्यूबेशन पर आधारित हैं। सब्सट्रेट आमतौर पर एक cleavable fluorophore (उदा., coumarin), करने के लिए मिलकर एक एसिटाइल lysine अवशेषों से युक्त एक छोटे पेप्टाइड अनुक्रम है जैसे N-(4-methyl-7-aminocoumarinyl)-Nα-(t-butoxycarbonyl)-Nω-acetyllysineamide (मल)16। Isoform-विशिष्ट गतिविधियों के बीच अंतर करने के लिए अलग सेल मुक्त assays प्रत्येक isoform से संबंधित जरूरी हैं और जीवित कोशिकाओं में असली isoform गतिविधि को प्रतिबिंबित नहीं हो सकता है। Isoform-विशिष्ट substrates benzyl जैसे व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं (S)-[1-(4-methyl-2-oxo-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)-5-propionylaminopentyl]carbamate (MOCPAC, HDAC1 विशिष्ट सब्सट्रेट) और (S)-[5-acetylamino-1-(2-oxo-4-trifluoromethyl-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)pentyl]carbamic एसिड टर्ट-ब्यूटाइल एस्टर (BATCP, HDAC6 विशिष्ट सब्सट्रेट) (आंकड़ा 1B)। यह देखते हुए कि वे एक ही cleavable fluorophore सहन हालांकि, एक बहु सब्सट्रेट मिश्रण युक्त मल, MOCPAC, और BATCP करने के लिए जीवित कोशिकाओं को देखते हुए अलग-अलग deacetylated उत्पादों का पता लगाने fluorometric माप द्वारा, की अनुमति नहीं होगी।

यहाँ वर्णित विधि का पता लगाने और प्रत्येक सब्सट्रेट और HeLa कोशिकाओं UHPLC-ईएसआई-MS/MS विश्लेषण17द्वारा पीछा किया एक बहु सब्सट्रेट परख का उपयोग में इसके deacetylated उत्पाद के सापेक्ष मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है। एक HDAC परख HDAC निरोधात्मक गतिविधि अंतर्जात HDACs पर परीक्षण यौगिकों की विशिष्टता की और सीधे पहचान सक्षम करने के लिए HeLa कोशिकाओं पर आयोजित किया जाता है। HDAC1 और HDAC6, जो एक साथ मूल्यांकन कर रहे हैं पर ध्यान केंद्रित है। एक एकल ऊष्मायन परख में इन एंजाइमी माप को प्राप्त करने के लिए, गैर-विशिष्ट और विशिष्ट HDAC substrates के एक मिश्रण एक 96-अच्छी तरह से थाली पर चढ़ाया इलाज किया और इलाज HeLa कोशिकाओं को जोड़ा जाता है। एक इन्क्यूबेशन कदम निम्नलिखित कोशिकाओं substrates और उनके संबंधित प्रतिक्रिया उत्पादों जो अलग हो रहे हैं और एक UHPLC-MS विधि (चित्र c 1को इंगित) का उपयोग कर पाया, जारी करने के लिए lysed हैं। मल, MOCPAC, और BATCP substrates के deacetylated उत्पादों deacetylated मल (dMAL), deacetylated MOCPAC (dMOCPAC), और deacetylated BATCP (dBATCP), क्रमशः रहे हैं। खुराक-प्रतिक्रिया घटता सक्रिय यौगिकों के साथ बनाया जा सकता है।

Figure 1
आकृति 1: एकाधिक substrates के UHPLC-MS विश्लेषण द्वारा HDAC1 - और HDAC6-विशिष्ट inhibitors की पहचान करने के लिए कक्ष-आधारित HDAC परख के लिए सामान्य योजना. (A) योजना के एक ठेठ 96-अच्छी तरह से प्लेट इलाज (परीक्षण यौगिकों) युक्त और अनुपचारित (नियंत्रण) HeLa कोशिकाओं, के साथ ही फ़्री सेल रिक्त स्थान। (B) substrates एक मिश्रण (21 सुक्ष्ममापी प्रत्येक) के रूप में अंतर्जात HDACs द्वारा deacetylated किया जा करने के लिए जोड़ा की रासायनिक संरचना। (C) विशिष्ट UHPLC-MS chromatogram (मल, MOCPAC, और BATCP) जोड़ा गया substrates और अपने deacetylated उत्पादों की चोटियों दिखा रहा है (dMAL, dMOCPAC, और dBACTP, क्रमशः)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Protocol

1. सेल संस्कृति

नोट: निम्न चरणों का पालन एक मानक टिशू कल्चर हुड में प्रदर्शन कर रहे हैं। बाँझ तकनीक के साथ अपनेपन की उम्मीद है।

  1. HeLa कोशिकाओं T75 सेल संस्कृति कुप्पी में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ, पेनिसिलिन जी पूरक MEM में 80% confluency करने के लिए संस्कृति (U/100ml), और streptomycin (100 मिलीग्राम/एमएल)।
    नोट:: सेल संस्कृति, उपचार, और lysis चरणों लामिना प्रवाह, 5% CO2 बाँझ परिस्थितियों का एक humidified वातावरण में की गई 37 ° C पर सेल ऊष्मायन चरणों के साथ नीचे आयोजित की जाती हैं।
  2. दो बार DPBS की 5 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं, DPBS aspirate को धोकर सेल पृथक्करण अभिकर्मक की 1 मिलीलीटर जोड़ें। कोशिकाओं को अलग करने के लिए 5 मिनट के लिए 37 ° C पर सेते हैं।
  3. MEM संस्कृति मध्यम की 9 मिलीलीटर जोड़ें, अच्छी तरह से resuspend सेल सस्पेंशन, और एक hemocytometer का उपयोग करके कक्षों की गणना।
  4. 6 x 104 कोशिकाओं/एमएल MEM में करने के लिए कोशिका निलंबन के घनत्व को समायोजित करें।
  5. 100 µL सेल सस्पेंशन का नियंत्रण करने के लिए जोड़ें और एक बाँझ, फ्लैट-नीचे, टिशू कल्चर-इलाज 96-अच्छी तरह से प्लेट (1A चित्रा) के कुओं का परीक्षण करें।
  6. MEM संस्कृति मध्यम के 100 µL 96-अच्छी तरह से प्लेट (चित्र 1 क) की खाली कुओं को जोड़ें।
  7. 24 घंटे के लिए 37 ° C पर 96-अच्छी तरह से प्लेट सेते हैं।
    नोट: एक 24 एच ऊष्मायन HeLa कोशिकाओं में अंतर्जात HDAC गतिविधि के लिए परीक्षण करने के लिए एक उपयुक्त समय है। विभिन्न कोशिका प्रकार अज्ञात HDAC गतिविधि के साथ नियंत्रण कक्ष के एक timecourse मूल्यांकन की आवश्यकता हो सकती।

2. सेल उपचार परीक्षण यौगिकों और HDAC Substrates के साथ

  1. 96-अच्छी तरह से थाली के कुओं से मध्यम aspirate.
  2. 25 µL परीक्षण यौगिकों x 2 के जोड़ें (उदाहरण के लिए, trichostatin A, MS275, और tubastatin A) MEM कुओं का परीक्षण करने के लिए में। 25 µL मेम के नियंत्रण और खाली कुओं के लिए जोड़ें।
    नोट: कम से कम 5 अंतिम परीक्षण सांद्रता (अच्छी तरह से प्रति एक एकाग्रता) की एक श्रेणी प्रदान करने के लिए समायोजित किया जा करने के लिए परीक्षण यौगिकों की एकाग्रता है। DMSO अंतिम एकाग्रता परीक्षा परिसर में 0.5% से अधिक नहीं होनी चाहिए और हर तरह से रिक्तियों और नियंत्रणों सहित, में एक ही होना चाहिए। अंतिम ऊष्मायन मात्रा 50 µL प्रति अच्छी तरह से है। Trichostatin A 1.95 के लिए 500 से लेकर 5 सांद्रता पर परीक्षण किया है (1:4 कमजोर पड़ने) nM. MS275 और tubastatin A के लिए 6.17 8,000 से लेकर 5 सांद्रता पर परीक्षण कर रहे हैं समुद्री मील (1:6 पतला करने की क्रिया)। प्रत्येक परीक्षण परिसर के लिए इच्छित अंतिम परीक्षण एकाग्रता प्रत्येक अलग-अलग उपयोगकर्ता द्वारा एक खुराक प्रतिक्रिया वक्र बनाने के द्वारा निर्धारित की जानी चाहिए।
  3. 25 µL सब्सट्रेट मिश्रण (मल, MOCPAC की 42 सुक्ष्ममापी और मेम में BATCP की 42 माइक्रोन के 42 माइक्रोन) का नियंत्रण और परीक्षण के कुओं को जोड़ें। मेम के 25 µL खाली कुओं को जोड़ें।
    नोट: प्रत्येक सब्सट्रेट के अंतिम एकाग्रता 21 सुक्ष्ममापी. है MOCPAC और BATCP के बीच HDAC1 और HDAC6 गतिविधि, भेद क्रमशः (आंकड़ा 1B)। जब कोई गतिविधि उन substrates के साथ मनाया जाता है, मल का उपयोग संभावित रूप से किसी अन्य HDAC isoform के विरुद्ध गतिविधि की पहचान करने के लिए ले जा सकता।
  4. एक humidified 5% में 8 घंटे के लिए 37 ° C पर 96-अच्छी तरह से प्लेट सेते हैं CO2 मशीन।
    नोट: इस ऊष्मायन समय HeLa कोशिकाओं के लिए उपयुक्त है और अंतर्जात HDAC सिंथेटिक substrates के साथ बातचीत करने के लिए अनुमति देता है। विभिन्न सेल लाइनों ऊष्मायन समय और/या सब्सट्रेट एकाग्रता में समायोजन की आवश्यकता हो सकती।

3. सेल Lysis और UHPLC-ईएसआई-MS/MS के लिए नमूना तैयार करने

सावधानी: कार्बनिक रसायन, जो अत्यधिक ज्वलनशील और घूस या साँस लेना द्वारा विषाक्त हैं नमूना तैयारी चरणों का उपयोग करें। उचित व्यक्तिगत सुरक्षा, जैसे दस्ताने और सुरक्षा चश्मा पहनते हैं।

  1. Protease अवरोध करनेवाला प्रत्येक अच्छी तरह से 96-अच्छी तरह से थाली के साथ पूरक (10 x RIPA बफ़र से पतला) 6 x RIPA बफ़र के 10 µL जोड़ें।
  2. ठंड acetonitrile के 160 µL करने के लिए हर तरह से जोड़कर प्रतिक्रिया को रोकने और ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण।
    नोट: इस चरण से पहले-20 ° C पर acetonitrile रखें।
  3. थाली एक-80 ° C 10 मिनट के लिए फ्रीजर में रखें।
  4. थाली को फ्रीजर से निकालें और 220 µL की हर तरह से सामग्री की एक गैर-बाँझ, शंक्वाकार नीचे (V-तल) 96-अच्छी तरह से थाली में निकाल लें। Centrifuge 5,000 x जी और 10 मिनट के लिए 4 ° C पर प्लेट।
    नोट: यह चरण प्रोटीन और लवण को हटाने पर करना है। यदि आवश्यक हो, तो समाधान होते हैं करने से पहले अलग-अलग शंकु अपकेंद्रित्र ट्यूबों के लिए स्थानांतरित किया जा सकता है या 96-अच्छी तरह से, 0.65 सुक्ष्ममापी PVDF फ़िल्टर प्लेटों का एक सेट के माध्यम से फ़िल्टर किया गया। वेग की सफल निकालने से पहले UHPLC विश्लेषण आवश्यक है।
  5. UHPLC सिस्टम के साथ संगत एक 96-अच्छी तरह से थाली में 200 µL तैरनेवाला (या छानना) का स्थानांतरण और यह सील peelable, heat-sealing पन्नी के साथ एक प्लेट मुहर का उपयोग कर।
    नोट: छर्रों pipetting जब supernatants को निकालने से बचें। UHPLC विश्लेषण नहीं तुरंत किया जा सकता, तो थाली 24 घंटे की एक अधिकतम के लिए 4 ° C पर विश्लेषण तक संग्रहीत किया जा सकता।

4. UHPLC/एमएस-एमएस विश्लेषण

  1. यह मोबाइल चरण प्रणाली (95% A:5% B) के साथ भरने के द्वारा UHPLC सिस्टम तैयार करें:
    एक: 0.1% फॉर्मिक एसिड युक्त H2O, HPLC-ग्रेड, (1 L तैयार)
    B: Acetonitrile, HPLC, ग्रेड-0.1% फॉर्मिक एसिड युक्त (1 L तैयार करें)।
    सावधानी: कार्बनिक रसायन, जो अत्यधिक ज्वलनशील और घूस या साँस लेना द्वारा विषाक्त कर रहे हैं मोबाइल चरण शामिल हैं। उचित व्यक्तिगत सुरक्षा, जैसे दस्ताने और सुरक्षा चश्मा पहनते हैं।
  2. 96-अच्छी तरह से प्लेट युक्त एक प्लेट धारक नमूना प्रबंधक में जगह है। UHPLC-ईएसआई-MS/MS तालिका 1में दिए गए शर्तों के अनुसार नमूनों को चलाने।
    नोट: हर स्तंभ विश्लेषणात्मक 96-अच्छी तरह से प्लेट की एक अच्छी तरह से नियंत्रण और एक रिक्त अच्छी तरह से ( 1A चित्राकी प्लेट योजना में दिखाया गया के रूप में) होना चाहिए। जबकि रिक्तियाँ हैं चाहे MS स्रोत सुसंगत पृष्ठभूमि प्रदान कर रहा है की जाँच करने के लिए 100% का परीक्षण सेल लाइन में एंजाइमी गतिविधि के प्रतिनिधि नियंत्रण कर रहे हैं। असामान्य MS चोटियों में एक दिए गए खाली पाया गया MS संवेदनशीलता परिवर्तन को रोकने के लिए जांच की जानी चाहिए।

5. डेटा विश्लेषण

  1. पीक क्षेत्र प्रत्येक सब्सट्रेट और अपने deacetylated उत्पाद की कोई उपयुक्त UHPLC एकीकरण सॉफ्टवेयर के साथ एकीकृत।
    नोट: स्वचालित एकीकरण पैरामीटर के साथ एक चौरसाई विधि (मतलब, विंडो का आकार 3, और की संख्या 2, उदाहरण के लिए चिकनी) का उपयोग करें। क्रोमेटोग्राफिक तालिका 1में दिए गए शर्तों का उपयोग कर, मार्जन क्रम dMAL (5.8 मिनट), dBATCP (6.0 मिनट), dMOCPAC (6.2 मिनट), मल (7.6 मिनट), MOCPAC (8.9 मिनट) और BATCP (9.8 मिनट), चित्रा c 1को इंगितमें दिखाया गया के रूप में है।
  2. प्रत्येक सब्सट्रेट के लिए, पीक क्षेत्र अनुपात (deacetylated/प्रत्येक chromatogram (परीक्षण और नियंत्रण नमूने) में acetylated) की गणना।
  3. प्रत्येक परीक्षण नमूना का प्रतिशत HDAC निषेध की गणना:
    Equation
    नोट: HDAC1 निषेध dMOCPAC/MOCPAC के शिखर क्षेत्र अनुपात का उपयोग कर की गणना की जाती है; HDAC6 निषेध dBATCP/BATCP के साथ गणना की जाती है। अनुपात dMAL/मल सामान्य HDAC निषेध व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता।

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Representative Results

HDAC1 के लिए गैर-चयनात्मक और चयनात्मक inhibitors की पहचान करने के लिए आवेदन की विधि का प्रदर्शन करने के लिए (कक्षा) और HDAC6 (वर्ग IIb), HeLa कोशिकाओं ज्ञात मानक यौगिकों के साथ इलाज किया गया: trichostatin A (गैर-चयनात्मक HDAC1 और HDAC6 के बीच)18, MS275 (HDAC1-चयनात्मक अवरोध करनेवाला)19, और tubastatin (HDAC6-चयनात्मक अवरोध करनेवाला)20। वर्तमान पद्धति है (चित्र 1) का उपयोग करके, आईसी50 मान सीधे जीवित कोशिकाओं में HDAC1 (से MOCPAC deacetylation पर तलाश में) के लिए और HDAC6 के लिए (पर BATCP deacetylation देख कर) निर्धारित किया जा सका (चित्रा 2)। Trichostatin HDAC1 और HDAC6 की ओर एक शक्तिशाली लेकिन गैर-चयनात्मक अवरोध करनेवाला था। Tubastatin A HDAC6 के लिए स्पष्ट रूप से चयनित किया गया था, जबकि दूसरे हाथ पर, MS275, HDAC1 के लिए चयनित किया गया था।

Figure 2
चित्रा 2: आईसी50 खुराक प्रतिक्रिया घटता एक साथ प्राप्त HDAC1 और HDAC6 तीन मानक HDAC inhibitors के लिए: गैर-चयनात्मक trichostatin A, HDAC1-चयनात्मक MS275, और HDAC6-चयनात्मक tubastatin ए आईसी50 मान सन्निकट तालिका में प्रस्तुत हैं तीन स्वतंत्र माप का मतलब ± SD. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

इंजेक्शन मात्रा 5 ΜL
स्तंभ सी18 (2.6 सुक्ष्ममापी, 100 मिमी x 3 मिमी आईडी)
स्तंभ तापमान 40 ° C
मार्जन प्रवाह की दर 0.8 मिलीलीटर/मिनट (विशिष्ट दबाव रेंज: 400-600 सलाखों)
मार्जन ग्रैडिएंट 10 मिनट में 5-45% B
2 मिनट में 45-98% B
चरण धो लें 2 मिनट के लिए 98% B
कदम equilibrating 4 मिनट के लिए 5% B
क रा बी-MS/MS कोन वोल्टेज, 30 V; केशिका स्रोत वोल्टेज, 3.0 केवी; केशिका तापमान, 350 ° C; स्रोत के तापमान 120 डिग्री सेल्सियस; म्यान गैस - नाइट्रोजन (600 L/h); टक्कर गैस दबाव, आर्गन 3 x 10-3 मिलीबार करने के लिए सेट करें
टक्कर पैरामीटर और समय वास 0.1 के साथ अनुकूलित प्रतिक्रिया चैनल s, 0.01 interscan देरी और टकराव ऊर्जा की 20 eV पर सेट।
मल मास संक्रमण 446 346 (मल) और 404 → → 304 (dMAL) के साथ का पता लगाने।
MOCPAC बड़े पैमाने पर संक्रमण 494 449 (MOCPAC) और 439 → → 394 (dMOCPAC) के साथ का पता लगाने।
BATCP बड़े पैमाने पर संक्रमण 500 400 (BATCP) और 476 → → 376 (dBATCP) के साथ का पता लगाने।

तालिका 1: UHPLC-ईएसआई-MS/MS शर्तों।

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Discussion

HDAC निषेध दवाओं की खोज, कैंसर थेरेपी21के लिए HDAC6-चयनात्मक inhibitors पर वर्तमान ध्यान के साथ में एक गर्म विषय है। HDAC selectivity आमतौर पर हाई-थ्रूपुट, सेल-मुक्त assays, जो अलग-अलग HDAC isoforms21की ओर निरोधात्मक शक्ति निर्धारित करना चाहते हैं की एक श्रृंखला द्वारा मूल्यांकन किया जाता है। हालांकि, selectivity एक अवरोध करनेवाला के साथ ही जीवित कोशिकाओं में अंतर्जात प्रोटीन histones जैसे substrates, के acetylation की स्थिति का मूल्यांकन द्वारा पुष्टि की जानी चाहिए (के लिए कक्षा मैं HDACs) और tubulin (HDAC6) के लिए। इसलिए, सेल assays एंटीबॉडी मान्यता (उदा., immunostaining, वेस्टर्न ब्लॉट, प्रवाह cytometry, और एलिसा) को शामिल कर रहे हैं आम तौर पर आवश्यक isoform का एक मात्रात्मक या अर्द्ध मात्रात्मक मूल्यांकन प्राप्त करने के लिए एक दिए गए परिसर में रहने वाले की शक्ति21कोशिकाओं। यह एक यौगिक है कि एक सेल से मुक्त एंजाइमी परख में चयनात्मक था गैर-चयनात्मक कोशिकाओं या ऊतकों17,22, और उपाध्यक्ष विपरीत19होना करने के लिए पता चला है कि दुर्लभ नहीं है। यह गैर-मानकीकृत एंजाइमी स्रोतों और सह कारकों के अभाव में मतभेद या जैव रासायनिक assays21में प्रोटीन भागीदारों द्वारा समझाया जा सकता है।

यहाँ वर्णित विधि पर्यावरण17सेल एक तेजी से, एंटीबॉडी-मुक्त विकल्प मैं (HDAC1) और वर्ग IIb (HDAC6) निरोधात्मक शक्ति में रहने वाले वर्ग के प्रत्यक्ष मापन के लिए अनुमति देता है। विधि का एक और लाभ यह है कि यह आसानी से करने के लिए विभिन्न सेल लाइनों, neuroblasts23, सूक्ष्म कणों और अन्य कक्ष-आधारित assays24के लिए पहले वर्णित के रूप में स्वचालन के लिए संभावना के साथ जैसे अनुकूलित किया जा सकता। मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विशिष्ट substrates के डिटेक्शन deacetylated उत्पादों, तुलनीय मात्रात्मक परिणाम प्रदान करने का सटीक माप के लिए योगदान देता है। यह जीवित कोशिकाओं में विशिष्ट HDAC isoforms की ओर आईसी50 मान निर्धारित करने के लिए पहली विधि उपलब्ध है। तुलना की बात के रूप में, गैर-मात्रात्मक चयनित प्रोफ़ाइल द्वारा वेस्टर्न ब्लॉट मनाया HDAC inhibitors के गया दिखा दिया पद्धति से प्राप्त selectivity प्रोफ़ाइल के साथ कतार में होना करने के लिए यहाँ वर्णित17। भले ही इस विधि नया वर्ग-चयनात्मक HDAC inhibitors की खोज के लिए विकसित किया गया है, यह भी एक रोग के पाठ्यक्रम पर सेल मॉडल के भीतर HDAC गतिविधि को मापने के लिए लागू किया जा सका। यह प्रासंगिक रोगों में epigenetic और आणविक तंत्र की व्याख्या करने के लिए योगदान कर सके और संभावित रूप से दवा उम्मीदवारों की पहचान कर सके। इस विधि HDAC isoforms HDAC1 और HDAC6 के अलावा किसी अन्य की ओर देखते हुए extrapolating, नई चयनात्मक HDAC substrates के विकास दृढ़ता से प्रोत्साहित किया जाता है। इसके अलावा, MOCPAC और BATCP की सब्सट्रेट विशिष्टता पूरी तरह से एकल isoforms लक्ष्यीकरण के संदर्भ में विशेषता हो जाना चाहिए। वास्तव में, जबकि MOCPAC एक HDAC1-विशिष्ट सब्सट्रेट के रूप में वर्गीकृत है (कक्षा मैं द्वितीय वर्ग से अधिक), यह अधिक संभावना है कि यह एक सामान्य कक्षा मैं (HDAC3 isoform सहित), सब्सट्रेट पहले प्रदर्शन25के रूप में है। तदनुसार, BATCP है, एक अच्छी तरह से ज्ञात HDAC6 चयनात्मक सब्सट्रेट (द्वितीय वर्ग से अधिक कक्षा मैं HDACs), लेकिन अपनी विशिष्टता अन्य वर्ग II HDACs, HDAC4, जैसे की ओर आगे लक्षण वर्णन25के हकदार हैं।

एंजाइमी गतिविधि सेल लाइन पर निर्भर करता है अलग है, सेल नंबर, confluency, और ऊष्मायन समय हो सकता है। जब एक कोशिका लाइन परख में पहली बार के लिए उपयोग किया जाता है, यह अलग समय अंक UHPLC-MS (उदाहरण के लिए, एक Michaelis-Menten साजिश के माध्यम से) द्वारा एंजाइम कैनेटीक्स का विश्लेषण करने के लिए, नियंत्रण कक्ष में सब्सट्रेट सांद्रता की एक सीमा का परीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह सबसे उपयुक्त ऊष्मायन समय और सब्सट्रेट एकाग्रता का चयन करने के लिए शोधकर्ताओं की अनुमति होगी। यह चुनाव दो प्रमुख मानकों पर निर्भर करता है: 1) एंजाइम कैनेटीक्स और 2) substrates और अपने deacetylated उत्पादों का पता लगाने। जब एंजाइम कैनेटीक्स का विश्लेषण, यह प्रारंभिक वेग मूल्यों (जब उत्पाद गठन रैखिक सीमा के भीतर हैयानी, ) का मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक है एंजाइम कैनेटीक्स स्थापित करने के लिए। कैनेटीक्स अनुसार, Km अंतर्गत सब्सट्रेट सांद्रता का निषेध, प्रतिस्पर्धी और अप्रतिस्पर्धी inhibitors26मामले में विशेष रूप से एक सटीक प्रतिशत प्रदान करने के लिए चुना जाना चाहिए। दूसरी ओर, चुनी substrate एकाग्रता detectable और मात्रात्मक MS सिग्नल सब्सट्रेट और deacetylated उत्पाद (सिग्नल के लिए शोर अनुपात ≥20)17के लिए प्रदान करना चाहिए। जब एकाधिक substrates का उपयोग करते हैं, विश्लेषण किया जा करने के लिए सभी चोटियों की जुदाई क्रोमेटोग्राफिक विधि यह सुनिश्चित करना चाहिए। वैकल्पिक क्रोमेटोग्राफिक सिस्टम जुदाई ढाल और स्तंभ प्रकार में परिवर्तन की आवश्यकता हो सकता है।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखक लागत क्रिया CM1406 स्वीकार करते हैं (Epigenetic रासायनिक जीव विज्ञान)। शोध में इस प्रकाशन की सूचना पियरे Mercier फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BATCP Sigma-Aldrich B4061
MAL Sigma-Aldrich SCP0168 Synonym: BOC-Ac-Lys-AMC
MOCPAC Sigma-Aldrich M2195
MS275 Sigma-Aldrich EPS002
Trichostatin A Sigma-Aldrich T8552
Tubastatin A Sigma-Aldrich SML0044
Acetonitrile, HPLC grade Fisher Scientific 10660131
Formic acid, LC/MS grade Fisher Scientific 10596814
H2O, HPLC grade distilled H2O filtered through a Milli-Q purification system
HeLa cells ATCC ATCC CRM-CCL-2
Cell dissociation reagent TrypLE Express ThermoFisher Scientific 12604013
DMSO, cell culture grade Applichem 146463
DPBS ThermoFisher Scientific 14190144
Fetal bovine serum Biowest S1810
MEM ThermoFisher Scientific 22561021
Penicillin-Streptomycin Bioconcept 4-01F00-H
10x RIPA buffer Abcam ab156034
SigmaFast protease inhibitor tablets Sigma-Aldrich S8820
96-well plates, sterile, flat-bottom, tissue culture treated Corning VWR 29442-058
96-well plates, non-sterile, V-bottom Corning VWR 29442-404 used in the centrifugation step
96-well plate, conical bottom, Nunc ThermoFisher Scientific 249944 compatible with the Acquity UHPLC system
T75 cell culture flasks Corning Sigma-Aldrich CLS430641
Peelable heat sealing foil Waters 186002789
Acquity UPLC system Waters
Eppendorf Centrifuge 5810 R Fisher Scientific 05-413-323
Integration software: MassLynx V4.1 Waters Catalog number not available
Combi thermo-sealer SP-0669/240 Waters Catalog number not available
Quattro micro API Tandem Quadrupole System Waters Catalog number not available

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References

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