HER2 मछली के लिए प्रोटोकॉल का उपयोग कर एक गैर पार से जोड़ने, Formalin मुक्त ऊतक निर्धारण क्रायो-संरक्षण और Formalin निर्धारण के लाभ गठबंधन करने के लिए

Cancer Research
 

Summary

प्रतिदीप्ति में-सीटू संकरण (मछली) अक्सर व्यक्तिगत चिकित्सा में चिकित्सा के चयन के लिए histopathology और आणविक निदान के साथ संयोजन में आवश्यक है । एक उपंयास गैर पार से जोड़ने, formalin मुक्त ऊतक निर्धारण है कि उच्च गुणवत्ता सुघड़, आणविक और मछली एक ही नमूना से विश्लेषण के अलावा एक पोस्ट-निर्धारण कदम से पहले मछली प्रस्तुत किया जाता है की अनुमति देता है ।

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Loibner, M., Oberauner-Wappis, L., Viertler, C., Groelz, D., Zatloukal, K. Protocol for HER2 FISH Using a Non-cross-linking, Formalin-free Tissue Fixative to Combine Advantages of Cryo-preservation and Formalin Fixation. J. Vis. Exp. (130), e55885, doi:10.3791/55885 (2017).

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Abstract

formalin के सुघड़ आकलन-फिक्स्ड, आयल-एंबेडेड (FFPE) ऊतक के नमूनों के कारण दशकों के लिए कैंसर निदान के लिए स्वर्ण मानक आकृति विज्ञान के उत्कृष्ट संरक्षण के लिए किया गया है । निजीकृत दवा तेजी से व्यक्तिगत अनुकूलित और लक्षित चिकित्सा संयुक्त रूपात्मक और आणविक विश्लेषणात्मक प्रौद्योगिकियों और निदान द्वारा सक्षम विशेषता व्यक्तिगत रोगों के लिए प्रदान करता है । एक ही FFPE नमूना से सुघड़ और आणविक परख का प्रदर्शन रासायनिक संशोधन और न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन के पार से जोड़ने के कारण formalin के नकारात्मक प्रभाव के कारण चुनौतीपूर्ण है । एक गैर-पार से जोड़ने, formalin-मुक्त ऊतक निर्धारण हाल ही में दोनों आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए विकसित किया गया है, अर्थात्, क्रायो-संरक्षण जैसे FFPE और अणुओं की तरह आकृति विज्ञान की रक्षा के लिए. के बाद से मछली अक्सर histopathology और आणविक निदान के साथ संयोजन में आवश्यक है, हम इस नए निर्धारण के साथ इलाज के ऊतकों पर मछली प्रोटोकॉल की प्रयोज्यता का परीक्षण किया । हमने पाया है कि गैर-पार formalin के ऊतकीय वर्गों के बाद निर्धारण, formalin मुक्त और आयल-एंबेडेड (NCFPE) स्तन कैंसर ऊतक मानव FFPE वृद्धि कारक रिसेप्टर 2 में एपिडर्मल ऊतक के साथ उन लोगों के लिए समकक्ष परिणाम उत्पंन (HER2) मछली विश्लेषण । इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे एक मछली परख मूल रूप से विकसित और FFPE ऊतक के लिए मांय ऊतकीय वर्गों के एक साधारण पद निर्धारण कदम से NCFPE ऊतकों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Introduction

निजीकृत दवा तेजी से बहु-पैरामीटर रूपात्मक और आणविक ऊतक विश्लेषण को शामिल परीक्षणों पर निर्भर करता है । सोने के मानक के रूप में ऊतकों के Formalin निर्धारण उत्कृष्ट सुघड़ गुणवत्ता1,2प्रदान करता है । हालांकि, formalin-प्रेरित रासायनिक संशोधन और पार प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड की3,4,5 नकारात्मक आणविक विश्लेषण6के साथ हस्तक्षेप । इन आणविक संशोधनों न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन की गुणवत्ता की सीमा और जीन अनुक्रम कलाकृतियों में परिणाम हो सकता है7 या पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) के कम संवेदनशीलता-परख8आधारित । हालांकि FFPE ऊतक के लिए आणविक परीक्षणों का अनुकूलन करने के लिए प्रमुख प्रयास किए गए थे, ऊतकों के क्रायो-संरक्षण formalin निर्धारण करने के लिए बेहतर सामान्य में है, यह विभिन्न संरक्षण प्रक्रियाओं के लिए ऊतक के नमूनों को विभाजित करने के लिए आवश्यक बना रही है. आणविक विश्लेषणों के लिए क्रायो-संरक्षण की आवश्यकता से बचने के लिए एक गैर-पार से जोड़ने वाला, formalin-मुक्त निर्धारण, PAXgene ऊतक विकसित किया गया. यह व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रणाली एक निर्धारण और विभिंन अल्कोहल, एसिटिक एसिड और एक घुलनशील कार्बनिक यौगिक युक्त एक स्थिरीकरण समाधान के होते हैं । न्यूक्लिक एसिड का उचित संरक्षण, (phospo) प्रोटीन और आकृति विज्ञान कई अध्ययनों में दिखाया गया था6,9,10,11,12,13.

कैंसर निदान में एक विशेष आवेदन मछली इस तरह के अनुवादन, सूक्ष्म विलोपन और प्रवर्धन 14के रूप में गुणसूत्र परिवर्तन, की एक व्यापक रेंज का पता लगाने है । उदाहरण के लिए, आक्रामक स्तन कैंसर ट्यूमर के बीस प्रतिशत मानव एपिडर्मल वृद्धि कारक रिसेप्टर 2 के प्रवर्धन (HER2) जीन15,16,17, जो गरीब रोग का निदान 18 के साथ जुड़ा हुआ है ,19. HER2 के निर्धारण और स्तन कैंसर में प्रवर्धन स्थिति मछली द्वारा संकल्प विरोधी HER2 के लिए रोगियों का चयन करने की जरूरत है-चिकित्सा निर्देशित और एक साथी नैदानिक फेडरल ड्रग एसोसिएशन (एफडीए) द्वारा सूचीबद्ध है (http://www.fda.gov/ MedicalDevices/ProductsandMedicalProcedures/InVitroDiagnostics/ucm301431.htm)17. आदेश में मछली के एक व्यापक आवेदन स्वास्थ्य देखभाल में आधारित साथी निदान की अनुमति के लिए, परख विकसित और FFPE ऊतकों के लिए अनुमोदित किया गया ।

पिछले एक अध्ययन में, हमें पता चला है कि NCFPE ऊतकों मछली परख जो FFPE ऊतक के लिए अनुमोदित किया गया है के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता । हालांकि, 4% के साथ NCFPE ऊतकों के विभिंन पोस्ट निर्धारण प्रक्रियाओं की समय श्रृंखला के परीक्षण बफ़र्ड formaldehyde से पता चला कि पद निर्धारण 18 ज या NCFPE ऊतक वर्गों के लंबे समय के FFPE ऊतकों के साथ उन लोगों के लिए समकक्ष परिणाम प्राप्त14

इस अध्ययन में, हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं और एक ही प्राथमिक ऊतक नमूना से HER2 मछली और आरएनए गुणवत्ता के लिए इस्तेमाल किया वर्गों पर गैर-पार से जोड़ने, formalin-मुक्त ऊतक निर्धारण और 24 ज 4% बफर formaldehyde पद निर्धारण के प्रभाव का प्रदर्शन.

Figure 1
चित्रा 1: प्रतिदीप्ति के लिए कदम दिखा आरेख सीटू संकरण (मछली) और आरएनए विश्लेषण formalin फिक्स्ड आयल एंबेडेड (FFPE) और गैर-पार से जोड़ने, formalin मुक्त फिक्स्ड आयल एंबेडेड (NCFPE) ऊतकों । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Protocol

अध्ययन में मेडिकल यूनिवर्सिटी ऑफ चरने (संदर्भ संख्या 20-066), ऑस्ट्रिया की एथिक्स कमेटी द्वारा अनुमोदित किया गया था । रोगियों को लिखित सूचित सहमति दिए जाने के बाद ऊतक के नमूनों को शल्य चिकित्सा से संप्रदायिक प्राथमिक इनवेसिव स्तन कैंसर के दो मामलों से प्राप्त किया गया.

1. ऊतक निर्धारण

नोट: ऊतक निर्धारण मानक बफ़र्ड formalin समाधान (SBFS) के साथ या तो किया जाता है, 10% formalin समाधान के रूप में परिभाषित ३.७% की एक जन अंश से युक्त (4% के एक खंड अंश के अनुरूप) formaldehyde पीएच ६.८ के लिए बफर के अनुसार केंद्र/ 16827-1:2015 या गैर-पार से जोड़ने, formalin-मुक्त ऊतक निर्धारण प्रणाली (भी नीचे वैकल्पिक निर्धारण समाधान के रूप में संदर्भित) एक निर्धारण और कमरे के तापमान (आरटी) में एक स्थिरतापूर्ण समाधान शामिल है ।

  1. दो हिस्सों में एक बाँझ स्केलपेल के साथ स्तन कैंसर के ऊतकों के नमूनों में कटौती प्रत्येक 4 मिमी मोटी पर्याप्त ऊतक मात्रा सुनिश्चित करने के लिए. NCFPE या SBFS ऊतक निर्धारण के लिए अधिकतम आकार 4 x 15 x 15 मिमी का उपयोग करें ।
  2. एक मानक ऊतक कैसेट में ट्यूमर नमूना के प्रत्येक आधे प्लेस और SBFS या मात्रा अनुपात प्रति एक मात्रा के साथ 24 घंटे के लिए वैकल्पिक निर्धारण समाधान में डूब (v/v) 4 भागों निर्धारण और एक भाग ऊतक (4 मिलीलीटर/1 ग्राम ऊतक (आदर्श रूप में 10 मिलीलीटर/
  3. कंटेनर खोलने से 2-72 ज के लिए स्थिरतापूर्ण समाधान में वैकल्पिक रूप से तय नमूनों स्थानांतरण, १८० ° द्वारा ऊतक कैसेट मोड़ और यह विलय ।
  4. SBFS के साथ ऊतक कैसेट प्लेस-२५० मिलीलीटर ७०% के लिए आरटी पर 30 मिनट के लिए अवशिष्ट SBFS को हटाने में तय नमूनों ।
    नोट: यह चरण स्वचालित ऊतकों प्रोसेसर में गैर-पार से जोड़ने वाले निर्धारण-उपचार के नमूनों के SBFS संदूषण से बचने के लिए महत्वपूर्ण है, जो कि गैर-क्रॉस-fixatives के संरक्षण के लिए लाभकारी गुणों को नष्ट करेगा ।
    चेतावनी: SBFS एक खतरनाक समाधान है, त्वचा की जलन का कारण बनता है, गंभीर नेत्र क्षति, एक एलर्जी त्वचा की प्रतिक्रिया का कारण हो सकता है, आनुवंशिक दोषों के कारण का संदेह है, कैंसर का कारण हो सकता है, श्वसन जलन, तंद्रा और अंगों को नुकसान का कारण बनता है. वैकल्पिक निर्धारण साँस लेना द्वारा विषाक्त है, त्वचा के साथ संपर्क में और अगर निगल लिया, आंखों और त्वचा के लिए परेशान, साँस लेना के माध्यम से बहुत गंभीर अपरिवर्तनीय प्रभाव के खतरे, त्वचा के साथ संपर्क में और निगल लिया. साँस लेना और शारीरिक संपर्क दोनों निर्धारण समाधान के लिए टाल दिया जाना चाहिए. उपयुक्त सुरक्षात्मक कपड़े, दस्ताने, और आंख और चेहरा संरक्षण पहनें । एक धुएं डाकू में काम करते हैं ।
  5. ऊतक प्रसंस्करण, embedding और ऊतक खंड (2 वर्गों और 3) के लिए आगे बढ़ें ।

2. ऊतक प्रसंस्करण और embedding

  1. ७०% (2 x 15 मिनट), ८०% (30 मिनट), ९०% (६० मिनट), और ९९% (2 x ६० मिनट) इथेनॉल, xylene द्वारा पीछा (2 x ६० मिनट) में तय ऊतक नमूनों के साथ ऊतक कैसेट्स के stepwise निर्जलीकरण प्रदर्शन । फिर एक स्वचालित ऊतक प्रोसेसर (4 x ४५ मिनट) में तेल के साथ घुसपैठ ।
  2. संदंश का उपयोग कर, निर्जलित और तेल घुसपैठ नमूनों (वैकल्पिक रूप से और SBFS-फिक्स्ड) धातु molds में जगह है ।
  3. एक तेल embedding साधन का उपयोग 5-10 मिलीलीटर पिघला हुआ आयल (solidification बिंदु 56-58 डिग्री सेल्सियस) में नमूनों एंबेड ।
  4. 30 मिनट के लिए-5 डिग्री सेल्सियस पर एक ठंडा प्लेट पर molds प्लेस ।
  5. मोल्ड से आयल-एंबेडेड ऊतक ब्लॉकों को पुनर्प्राप्त करें ।
  6. स्टोर परिणामी ब्लॉकों (वैकल्पिक रूप से फिक्स्ड, आयल-एंबेडेड (NCFPE) और SBFS-फिक्स्ड आयल-एंबेडेड (FFPE)) 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में उपयोग तक ।

3. ऊतक अनुभाग और मछली के लिए स्लाइड तैयार

नोट: FFPE वर्गों सीधे मछली के लिए उपयोग किया जाता है, जबकि NCFPE वर्गों के साथ स्लाइड के बाद SBFS में 24 ज के लिए मछली की प्रक्रिया से पहले तय कर रहे हैं ।

  1. microtome में एक एकल उपयोग ब्लेड डालें और microtome को 10 µm में समायोजित करें ।
  2. कूलिंग प्लेट से पहले ब्लॉक लें और इसे इंस्ट्रूमेंट में डालें ।
  3. एक भी सतह हासिल की है जब तक ब्लॉक छांटो । एक ब्रश का उपयोग कर microtome साफ और यह 3 µm के लिए समायोजित करें । पहले 2-3 अनुभागों को छोड़ें ।
  4. NCFPE और FFPE ब्लॉकों के 3 µm वर्गों को काटें और उन्हें ठंडे पानी के स्नान (ultrapure water) में रखें ।
    नोट: अतिव्यापी नाभिक के बिना बेहतर तस्वीरें प्राप्त करने के लिए, यहाँ, निर्माता ´ एस निर्देशों में सिफारिश के रूप में 3-5 µm के बजाय 2 µm वर्गों की छवियों को दिखाया जाता है.
  5. ऊतक वर्गों के आसंजन के लिए एक लेपित माइक्रोस्कोप स्लाइड पर एक ठीक रंग ब्रश और एक सुई के साथ प्रत्येक चल अनुभाग उठाओ ।
  6. एक गर्म (४० डिग्री सेल्सियस) पानी स्नान में इस स्लाइड डुबकी और खंड पूरी तरह से खिंचाव देते हैं ।
  7. खंड को ध्यान से स्लाइड पर वापस रखो पानी से बाहर स्लाइड खींच और झुर्रियों से बचें ।
  8. सभी वर्गों 1 एच के लिए कमरे के तापमान पर शुष्क चलो ।
  9. तेल पिघलने के लिए एक मशीन में 30 मिनट के लिए ७० डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड गर्मी ।
  10. स्लाइड को एक ग्लास धुंधला जार में क्षैतिज रूप में रखें ।
  11. २५० मिलीलीटर के साथ भरा धुंधला जार में RT पर stepwise वर्गों reहाइड्रेट निम्नलिखित तरल पदार्थ के प्रत्येक: १००% xylene 2 x 15 मिनट, ९६% इथेनॉल 2 x 15 मिनट, ९०% इथेनॉल 2 मिनट, ८०% इथेनॉल 2 मिनट, ७०% इथेनॉल 2 मिनट, ५०% इथेनॉल 2 मिनट , और आसुत जल 2 x 10 मिनट ।
    चेतावनी: एक धुएं डाकू में deparaffinization और निर्जलीकरण कदम प्रदर्शन, विषाक्त volatilized सॉल्वैंट्स श्वास नहीं है ।
    नोट: वर्गों और ऊतक पर निर्भर करता है, यह अग्रिम में विभिन्न मशीन समय का परीक्षण करने के लिए आवश्यक हो सकता है.

4. NCFPE नमूनों का पद-निर्धारण

  1. NCFPE स्लाइड के बाद निर्धारण के लिए उंहें एक नया धुंधला SBFS से आर टी में 24 ज के लिए भरा जार में डाल द्वारा प्रदर्शन । 24 एच पद निर्धारण कदम के दौरान एक धुएं के हुड में जार रखें ।
  2. फॉस्फेट बफर खारा के साथ धोने से अतिरिक्त SBFS निकालें (3 x 10 मिनट) और आसुत जल (2 x 10 मिनट) ।

5. प्रतिदीप्ति में सीटू संकरण (मछली)

नोट: यहां मछली निर्माता के निर्देशों के अनुसार व्यावसायिक रूप से उपलब्ध HER2/CEN17 दोहरी रंग जांच किट का उपयोग किया जाता है । संकरण और वाशिंग स्टेप्स के दौरान टिश्यू सेक्शन को ड्राई न होने दें । डीएनए जांच और 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) डीएनए counterstain समाधान के लिए एक लंबी अवधि के लिए प्रकाश को उजागर करने की अनुमति नहीं देते । lightproof कंटेनरों का उपयोग कर अंधेरे में इन चरणों का पालन करें । उंर और निर्धारण नमूना सामग्री के कदम पर निर्भर करता है, बढ़ाने या कम denaturing और बेहतर संकरण परिणाम प्राप्त करने के लिए तापमान धो लो ।

  1. एक दाग एक ९८ डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में गर्मी पूर्व उपचार समाधान साइट्रिक के २५० मिलीलीटर युक्त जार प्लेस ।
  2. जगह reहाइड्रेटेड FFPE और पोस्ट-जार में फिक्स्ड NCFPE स्लाइड और 15 मिनट के लिए मशीन ।
धुंधला जार प्रति छह से अधिक स्लाइड का उपयोग न करें ।
  • RT पर 3 मिनट के लिए आसुत जल में स्लाइड धो एक नया धुंधला जार में ।
  • प्रोटियोलिसिस के लिए, ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक तापमान नियंत्रित संकरण प्रणाली में स्लाइड प्लेस ।
    1. तुरंत, लागू करने के लिए उपयोग पेप्सिन समाधान (2mg/एमएल) dropwise (~ 30 µ एल ड्रॉप प्रति) ऊतक वर्गों के लिए जब तक यह पूरी तरह से कवर किया जाता है । संकरण प्रणाली में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 9 मिनट के लिए मशीन ।
      नोट: 5-15 मिनट की एक मशीन समय की सिफारिश की है । प्रोटियोलिसिस के लिए इष्टतम समय अग्रिम में पता लगाया जाना चाहिए ।
    2. एक धोने बफर एसएससी युक्त जार में स्लाइड प्लेस और 5 मिनट के लिए मशीन ।
    3. RT पर 1 मिनट के लिए आसुत जल में स्लाइड कुल्ला ।
    4. निंनलिखित वर्गीकृत शराब में वर्गों के निर्जलीकरण प्रदर्शन: ५०%, ७०%, ९०% और १००% 1 मिनट के लिए प्रत्येक वर्गों सूखी हवा ।
    5. संकरण के लिए, पिपेट 10 µ एल के HER2/CEN17 की जांच सूखे ऊतक वर्गों पर, एक coverslip के साथ एक नमूना कवर और यह रबर सीमेंट के साथ सील ।
      नोट: जांच के 10 µ एल प्रति 22 x 22 मिमी ऊतक क्षेत्र की सिफारिश की है । जांच के एक सौंय वार्मिंग pipetting प्रक्रिया को आसान बनाता है । बुलबुले और प्रकाश करने के लिए जांच के लंबे समय से जोखिम से बचें ।
    6. सह-स्वभाव जांच और नमूना डीएनए संकरण प्रणाली में ७५ ° c पर 10 मिनट के लिए ।
    7. ३७ डिग्री सेल्सियस और रात भर संकरण के लिए संकरण प्रणाली सेट करें ।
    8. पोस्ट-संकरण और डिटेक्शन के लिए संदंश के साथ रबर सीमेंट को सावधानीपूर्वक निकालें ।
    9. एक धुंधला जार में स्लाइड के साथ ३७ ° c पूर्व गर्म 1 एक्स धो बफर एक 5 मिनट के लिए coverslips निकालें ।
    10. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए एक दो बार पूर्व गर्म 1 एक्स धोने बफर का उपयोग कर स्लाइड धो लें ।
    11. ७०%, ९०% और १००% इथेनॉल, 1 मिनट प्रत्येक में स्लाइड निर्जलीकरण ।
    12. नमूनों को हवा में सुखाएं और प्रकाश से बचाएं ।
    13. धुंधला के लिए, 30 µ l DAPI-समाधान के बुलबुले से बचने के संकरित क्षेत्र के लिए लागू होते हैं । एक coverslip के साथ वर्गों को कवर ।
    14. 15 मिनट प्रकाश से सुरक्षित के लिए मशीन ।
    15. ध्यान से हटाने के अतिरिक्त DAPI-समाधान धीरे फिल्टर कागज के बीच स्लाइड दबाकर ।
    16. 2-8 ° c अंधेरे में करने के लिए 2 सप्ताह तक मूल्यांकन तक फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा स्लाइड की दुकान ।
  • 6. फोकल इमेजिंग और मछली स्लाइड की स्कैनिंग

    1. फोकल इमेजिंग और एक 40x/1.2 ना उद्देश्य, quad बैंड फिल्टर (DAPI/FITC/TRITC/Cy5) और एक 5.5 mpx, 16 बिट, कूल्ड वैज्ञानिक पूरक धातु ऑक्साइड अर्धचालक (CMOS) कैमरा के साथ सुसज्जित एक फोकल डिजिटल स्कैनर पर स्लाइड की स्कैनिंग प्रदर्शन ।
    2. हरे रंग के लिए फिल्टर के साथ छवियों मोल (उत्तेजना: ५०३ एनएम, उत्सर्जन: ५२८ एनएम) और नारंगी (उत्तेजना: ५४७ एनएम, उत्सर्जन: ५७२ एनएम) चैनल ।

    7. व्याख्या

    नोट: HER2/CEN17 जांच का एक मिश्रण है एक लाल fluorochrome-लेबल CEN17 जांच विशिष्ट के लिए अल्फा के उपग्रह centromeric क्षेत्र के 17 गुणसूत्र (D17Z1) और fluorochrome जीन के लिए एक हरे HER2-बला HER2 जांच विशिष्ट (जांच स्थान 17q12) । एक HER2 के साथ ट्यूमर नमूनों: CEN17 अनुपात नाभिक प्रति ≤ २.० सामांय रूप में बनाए जाते हैं, जबकि एक HER2: CEN17 अनुपात ≥ २.० के साथ उन जबकि17प्रवर्धित के रूप में रन बनाए हैं ।

    1. मुक्त स्रोत CaseViewer २.१20के साथ छवियों के गुणवत्ता विश्लेषण प्रदर्शन ।
      1. एक पैथोलॉजिस्ट द्वारा परिभाषित के रूप में कार्सिनोमा के इनवेसिव घटक के दो विभिन्न क्षेत्रों में स्थित हैं कि कम से कम 20 कोशिकाओं का मूल्यांकन करें । मतगणना क्षेत्र में स्पष्ट रूप से विशिष्ठ अच्छी तरह से वितरित नाभिक शामिल करें । सीमा पर ऊतक क्षेत्रों की गिनती और मुकर या निचोड़ा क्षेत्रों से बाहर निकलें ।

    8. आरएनए गुणवत्ता

    1. आरएनए निष्कर्षण
      1. सुनिश्चित करें कि सभी उपकरणों और उपकरणों RNAse मुक्त कर रहे हैं । एक RNAse-हटाने समाधान का उपयोग करें ।
      2. ३.८ कदम तक प्रोटोकॉल के बाद एक microtome का उपयोग कर NCFPE या FFPE नमूनों की 10 से 20 वर्गों (5 µm मोटी) में कटौती ।
      3. आरएनए अलगाव किट का उपयोग कर NCFPE नमूनों से आरएनए निकालें (सामग्री की तालिका देखें). एक FFPE आरएनए अलगाव किट का उपयोग करके FFPE नमूनों से आरएनए निकालें.
        नोट: गैर-क्रॉस-लिंकिंग fixatives से आरएनए के निष्कर्षण को निर्धारण पद्धति के लिए अनुकूलित एक आइसोलेशन पद्धति की आवश्यकता होती है. किसी भी अन्य आरएनए अलगाव विधि (जैसे Trizol, RNeasy FFPE, आदि NCFPE नमूना के लिए) का उपयोग न करें ।
      4. एक spectrophotometer का उपयोग कर आरएनए एकाग्रता और पवित्रता का निर्धारण । २६० एनएम और २८० एनएम (A260/280) पर अवशोषक का अनुपात ~ २.० होना चाहिए ।
      5. -७० डिग्री सेल्सियस पर अलग आरएनए की दुकान आगे विश्लेषण तक ।
    2. प्रदर्शन एक glyceraldehyde 3 फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (GAPDH) वास्तविक समय रिवर्स प्रतिलेखन पीसीआर प्राइमरों का उपयोग करने के लिए अलग लंबाई8,9के amplicons उत्पंन करते हैं ।
      1. निर्माता ´ एस सीडीएनए संश्लेषण के लिए निर्देश के अनुसार एक सीडीएनए रिवर्स प्रतिलेखन किट का प्रयोग करें । प्रत्येक नमूने के ५०० एनजी आरएनए का उपयोग करें । अधिक उपयोग तक-20 डिग्री सेल्सियस पर सीडीएनए स्टोर ।
      2. निर्माता ´ एस के निर्देश अनुसार पीसीआर मास्टर मिक्स तैयार करें ।
      3. पिपेट ने triplicates में पीसीआर मास्टर मिक्स को ३८४-well रिएक्शन प्लेट में । 1:16 पतला सीडीएनए (पीसीआर टेम्पलेट) के 4 µ एल जोड़ें । निर्माता ´ एस के निर्देशों के अनुसार पीसीआर का प्रदर्शन करें ।
        नोट: मानव GAPDH के लिए निम्नलिखित प्राइमरों का इस्तेमाल किया गया: GAPDH फॉरवर्ड: 5 ´-CCACATCGCTCAGACACCAT-3 ´; GAPDH रिवर्स: ७१ बीपी 5 ´-ACCAGGCGCCCAATACG-3 ´, १५३ बीपी 5 ´-GTAAACCATGTAGTTGAGGTC-3 ´, २०० बीपी 5 ´-TTGACGGTGCCATGGAATTT-3 ´, २७७ बीपी 5 ´-ACTTGATTTTGGAGGGATCT-3 ´, ३२३ बीपी 5 ´-AAGACGCCAGTGGACTCCA-3 ´, और ५३० बीपी 5 ´-ACGATACCAAAGTTGTCATG-3 ´ ।
      4. एक पीसीआर मशीन पर लागू सॉफ्टवेयर का उपयोग कर परिणामों का विश्लेषण । विशिष्ट उत्पादों को वक्र विश्लेषण21को पिघलने के आधार पर शामिल नहीं किया जाना चाहिए ।

    Representative Results

    मत्स्य HER2 निर्धारण:

    HER2-मछली संकेत FFPE और NCFPE से तीव्रता (चित्रा 2) समान हैं । अधिकांश कोशिकाओं में दोनों मामलों में लाल सिग्नल (CEN17 संदर्भ जीन) की तुलना में ग्रीन सिग्नल (प्रवर्धित HER2 जीन लोकस का संकेत) की एक स्पष्ट अधिकता दिखाई देती है. इसलिए, मामले से पता चलता है एक प्रवर्धित HER2 जीन है, जिसका अर्थ है कि इस मरीज को trastuzumab, एक विरोधी HER2 लक्षित चिकित्सा का जवाब की उंमीद है । FFPE नमूना सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य किया । संकेत गैर में मनाया नवोत्पादित कोशिकाओं (दोनों FFPE और NCFPE में) आंतरिक संदर्भ और HER2 जीन प्रवर्धन के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करते हैं । हर विश्लेषण श्रृंखला के लिए, ज्ञात जीन प्रवर्धन की स्थिति के साथ कम से एक अनुभाग संकरण प्रतिक्रिया के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।

    आरएनए गुणवत्ता:

    इसी FFPE और दो अलग मामलों से NCFPE नमूने वास्तविक समय रिवर्स प्रतिलेखन पीसीआर को रोजगार के द्वारा आरएनए गुणवत्ता में मतभेद दिखा । विभिन्न amplicon लंबाई के लिए विभिन्न प्रवर्धन क्षमता दिखाने के परिणाम प्राप्त (यानी, ७१ बीपी, १५३ बीपी, २०० बीपी, २७५ बीपी, ३२३ बीपी) GAPDH mRNA की. सभी सीटी (चक्र थ्रेसहोल्ड) FFPE नमूनों से प्राप्त मूल्यों NCFPE से उन लोगों से अधिक थे. यह अंतर FFPE ऊतकों से अलग mRNA के निचले पीसीआर amplificability को दर्शाता है, एक अधिक स्पष्ट रासायनिक संशोधन का सुझाव । इसके अलावा, लंबे समय के लिए कम amplicons की तुलना में उच्च सीटी मूल्यों mRNA विखंडन के लिए एक संकेतक हैं । इसकी तुलना में, विभिन्न amplicon लंबाई की सीटी मान ढलानों NCFPE ऊतकों की तुलना में FFPE में अधिक स्पष्ट mRNA विखंडन दिखाता है (चित्रा 3).

    Figure 2
    चित्रा 2: HER2 मछली के प्रतिनिधि परिणाम इसी formalin फिक्स्ड आयल एंबेडेड (FFPE) और गैर-पार से जोड़ने, formalin मुक्त फिक्स्ड आयल एंबेडेड (NCFPE) ऊतक वर्गों । इसी FFPE (ए) और NCFPE (बी) के ऊतकों से इसी नमूने दिखाए जाते हैं. इसके विपरीत सामान्य परस्पर निवृति कोशिकाओं (सी), जहाँ दो हरे (HER2) और दो लाल (CEN17) संकेतों की अपेक्षा की जाती है, प्रवर्धित HER2 जीन लोकस के साथ कोशिकाएँ हरित संकेतों की अनेक प्रतियां (HER2) (डी) का प्रतिनिधित्व करती हैं. HER2 प्रवर्धन की स्थिति दोनों FFPE में समरूप थी और पोस्ट-फिक्स्ड NCFPE सेक्शन (A, B). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 3
    चित्र 3: एक वास्तविक समय रिवर्स प्रतिलेखन पीसीआर परख के परिणाम आरएनए गुणवत्ता नियंत्रण के लिए इस्तेमाल किया । Y-अक्ष: सीटी (साइकिल थ्रेसहोल्ड) GAPDH जीन के मूल्यों अलग amplicon लंबाई (७१ बीपी, १५३ बीपी, २०० बीपी, २७५ बीपी, ३२३ बीपी) के लिए X-अक्ष पर दिखाए जाते हैं । mRNA FFPE और दो अलग स्तन कैंसर ऊतक समानांतर में संसाधित नमूनों की NCFPE से अलग किया गया था और पीसीआर के लिए सीडीएनए को लिखित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Discussion

    परिणाम दो प्रमुख निष्कर्षों को प्रदर्शित करता है । सबसे पहले, एक साधारण 24 ज SBFS NCFPE ऊतकों से कटौती वर्गों के बाद निर्धारण कदम मछली विश्लेषण में FFPE के साथ उन लोगों के लिए समकक्ष परिणाम प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है मछली FFPE ऊतकों के लिए अनुमोदित परख का उपयोग कर (भी संदर्भ देखें14) । इस प्रोटोकॉल मछली परख मूल रूप से विकसित और व्यापक पुनर्मान्यीकरण के लिए की आवश्यकता के बिना FFPE के लिए मंजूरी दे दी का उपयोग करने का लाभ है (जैसे, गैर के लिए पूर्व संकरण शर्तों-पार से जुड़े ऊतक के अनुकूलन द्वारा) । मछली प्रोटोकॉल बिल्कुल निर्माता के निर्देशों में वर्णित के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

    निर्माता ´ s निर्देश से मामूली संशोधन इस प्रोटोकॉल में वर्णित (जैसे ऊतक अनुभाग व्यास और deparaffinization चरणों में गर्मी की अवधि) पिछले रूपांतरों, जो स्पष्ट रूप से निर्माता द्वारा सिफारिश की है से परिणाम विभिन्न ऊतक प्रकार और निर्धारण विधियों के उपयोग के कारण.

    पोस्ट-निर्धारण कदम महत्वपूर्ण है क्योंकि यह 18-24 एच के एक रासायनिक प्रतिक्रिया समय की आवश्यकता है, जो एक दिन के द्वारा विश्लेषण समय प्रदान करता है, लेकिन एक ही दैनिक कार्यप्रवाह FFPE ऊतकों के लिए विकसित के रूप में (चित्रा 1) की अनुमति देता है । SBFS 1 मिमी प्रति घंटे22 से 5 मिमी में ऊतक के प्रकार23,24के आधार पर 2 एच के लिए एक औसत दर से ऊतक घुसना करने के लिए सूचित है । निरीक्षण है कि केवल लंबे समय से अधिक 18 से अधिक की अवधि के बाद निर्धारण FFPE वर्गों के लिए NCFPE के गुणों को बदल सकता है, इंगित करता है कि नहीं, निर्धारण की पैठ लेकिन रासायनिक प्रतिक्रिया समय वांछित परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है1 ,14.

    दूसरा, शेष NCFPE ऊतक है कि पद के निर्धारण के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाता है और आणविक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में अधिक से अधिक अणुओं अच्छी तरह से संरक्षित हैं । इस वास्तविक समय रिवर्स प्रतिलेखन पीसीआर (चित्रा 3) द्वारा प्रदर्शन किया गया । परख electropherogram से अधिक संवेदनशील और विशिष्ट है (आरएनए अखंडता संख्या) आरएनए गुणवत्ता के संबंध में (यानी, रासायनिक संशोधन और विखंडन) आयल-एंबेडेड ऊतकों से पृथक mRNA के लिए8। गुणवत्ता नियंत्रण वास्तविक समय पीसीआर के लिए इस अध्ययन में प्रतिबंधित किया गया था के बाद से स्वतंत्र समूहों से पता चला है कि आरएनए के अलावा, डीएनए और NCFPE से अलग प्रोटीन की गुणवत्ता है कि FFPE ऊतकों से बेहतर है 8,9, 13.

    इस प्रकार प्रस्तुत प्रोटोकॉल, जहां लागू (जैसे, SBFS नुस्खा, निर्धारण की स्थिति, आरएनए गुणवत्ता नियंत्रण, सत्यापन), पूर्व विश्लेषणात्मक प्रक्रियाओं के लिए केंद्र तकनीकी विनिर्देशों की आवश्यकताओं के लिए इन -विट्रो निदान (IVD), जो हाल ही में मानकीकरण (केंद्र) की यूरोपीय समिति द्वारा जारी किया गया है (के लिए केंद्र/टीएस 16827-1:2015 आरएनए-FFPE ऊतकों जो आईएसओ १५१८९ मानक को संदर्भित करता है से अलगाव के लिए) ।

    विधि इस विशिष्ट निर्धारण तक सीमित है । हालांकि गैर-पार-जोड़ने, formalin-मुक्त निर्धारण का उपयोग करने वाले जैव अणुओं और आकृति विज्ञान का अच्छा संरक्षण कई अध्ययनों में प्रस्तुत किया गया है, यह मुख्य रूप से अनुसंधान में नहीं बल्कि नियमित चिकित्सा अनुप्रयोगों में प्रयोग किया जाता है । एक कारण यह है कि एक और निर्धारण द्वारा सोने के मानक SBFS निर्धारण की जगह नहीं सभी FFPE सामग्री के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल के रूप में मांयता के अध्ययन की एक किस्म की आवश्यकता होगी गैर के साथ तय सामग्री-पार-fixatives जोड़ने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । अंय ऊतक निर्धारण विधियों इस मछली प्रोटोकॉल के लिए परीक्षण नहीं किया गया ।

    साधारण पद-निर्धारण इस पांडुलिपि में वर्णित कदम FFPE और NCFPE ऊतकों के लिए दोनों IVD अनुमोदित परख का उपयोग करने का लाभ है ।

    Disclosures

    D.G. Qiagen द्वारा कार्यरत है और कंपनी के पेंशन योजना में स्टॉक विकल्प या बांड होल्डिंग्स है । इस पांडुलिपि में प्रस्तुत आंकड़ों में PAXgene टिशू सिस्टम का उल्लेख है, जिसे Qiagen और PreAnalytiX द्वारा एक संयुक्त प्रयास में विकसित किया गया है । Qiagen के औद्योगिक भागीदार है सार्वजनिक रूप से वित्त पोषित क्रिश्चियन डॉपलर प्रयोगशाला के लिए अनुसंधान और बैंकिंग प्रौद्योगिकी । सभी लेखकों के हित का कोई संघर्ष नहीं है और कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की ।

    Acknowledgments

    हम अपनी विशेषज्ञता और समर्थन के लिए चिकित्सा विश्वविद्यालय चराई की विकृति के संस्थान में आणविक विकृति के लिए प्रयोगशाला की टीम को धंयवाद । इसके अलावा, हम Rieger Eidenhammer (पैथोलॉजिस्ट) और तमस HER2 (Kinga) की प्रोसेसिंग के लिए तकनीकी सहायता, Bernadette Szurian और सिल्विया Regényi के लिए आइरिस Kufferath और डैनिएला Pabst को धन्यवाद देते हैं । हम पांडुलिपि की अशुद्धि जांच के लिए पेनेलोप Kungl धंयवाद । यह काम किया गया है वित्तीय क्रिश्चियन डॉपलर अनुसंधान कोष, ऑस्ट्रिया के संघीय विज्ञान, अनुसंधान और अर्थव्यवस्था और राष्ट्रीय अनुसंधान, प्रौद्योगिकी और विकास के लिए फाउंडेशन के मंत्रालय द्वारा समर्थित है ।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    SAV LP GmbH, Flintsbach a. I., Germany www.sav-lp.de FN-200L-4-1 Tissue fixative
    Simport Plastic Ltd., Beloeil, Canada www.simport.com M-498 Safekeeping device providing labelling, fixation and paraffin embedding for tissue samples.
    Qiagen GmbH, Hilden Germany www.qiagen.com 765112 For collection, fixation, and stabilization of tissue samples: 10 Prefilled Reagent Containers, containing PAXgene Tissue FIX and PAXgene Tissue STABILIZER.
    ThermoFisher Scientific www.thermofisher.com 813150 Processing of biological specimens from chemical fixation to paraffin infiltration
    Merck Millipore, Munich, Germany www.analytics-shop.com/de/hersteller/millipore.html MC1009834000 Dehydration of tissue samples
    VWR Chemicals, Darmstadt, Germany https://at.vwr.com 10293EP Dehydration of tissue samples
    ACM Herba Chemosan Apotheker AG, Vienna, Austria www.herba-chemosan.at 2549662 32 Paraffin used in a tissue processing device
    Leica Mikrosysteme Handels GmbH, Vienna, Austria www.LeicaBiosystems.com 39602004 Paraffin embedding medium
    Sanova Diagnostik, Vienna, Austria www.sanova.at 5229 Paraffin embedding instrument for tissues for histology
    Histocom Medizintechnik Vertriebs GmbH, Wiener Neudorf, Austria www.histocom.info M 910010 This device is used for especially sophisticated paraffin sectioning techniques in biology and medicine. Only skilled or specially trained personnel must operate the microtome, i.e. clamping the specimen, trimming, sectioning and taking off the sections from the instrument.
    Dako Denmark A/S, Glostrup, Denmark www.chem.agilent.com K802021-2 Coated glass slides, intended for mounting formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections.
    Qiagen GmbH, Hilden Germany www.qiagen.com 73504 For purification of total RNA from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections
    Qiagen GmbH, Hilden Germany www.qiagen.com 765134 For purification of total RNA from PAXgene-fixed, paraffin-embedded tissue sections
    ZytoVision GmbH, Bremerhaven, Germany www.zytovision.com Z-2015-200 For the detection of ERBB2 (a.k.a HER2) gene amplification frequently observed in solid malignant neoplasms e.g. breast cancer samples.
    3DHISTEC, Budapest, Hungary www.3dhistech.com Digital device for scanning tissue slides equipped with a 40x/1.2 NA objective, Quad band filters (DAPI/FITC/TRITC/Cy5) filters and a 5.5Mpx, 16 bit, cooled scientific CMOS (Complementary Metal Oxide Semiconductor) camera.
    ThermoFisher Scientific www.thermofisher.com 4368814 The High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit contains all components necessary for the quantitative conversion of up to 2 µg of total RNA to single-stranded cDNA in a single 20 µL reaction.
    ThermoFisher Scientific www.thermofisher.com 4367659 PCR Master Mix containing polymerase, nucleotides and SYBR Green for PCR and quanitification of amplicons.
    ThermoFisher Scientific, Wilmington, DE www.thermofisher.com Ser. Nr. F239 Spectrophotometer for nucleic acid quantification.
    QuantStudio 7 Flex Real-time PCR System www.thermofisher.com 4485701 PCR machine,
    Vysis/Abbott Laboratories. Abbott Park, Illinois, U.S.A www.molecular.abbott/us/en/products/instrumentation/thermobrite#order e.g. (ThermoBrite) 07J91-020 Temperature controlled slide processing system for in-situ denaturation/hybridization procedures.

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    References

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