Protokoll för HER2 fiska med en icke-cross-länkar, Formalin-fri vävnad fixativ att kombinera fördelarna med kryo-bevarande och Formalin fixering

Cancer Research
 

Summary

Fluorescens in situ hybridisering (FISH) krävs ofta i kombination med histopatologi och molekylär diagnostik för val av terapi i personlig medicin. En ny icke-cross-länkar, formalin-fri vävnad fixativ som tillåter hög kvalitet morphologic, molekylär och fisk analyser från samma prov genom tillsats av en efter fixering steg innan fisken läggs fram.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Loibner, M., Oberauner-Wappis, L., Viertler, C., Groelz, D., Zatloukal, K. Protocol for HER2 FISH Using a Non-cross-linking, Formalin-free Tissue Fixative to Combine Advantages of Cryo-preservation and Formalin Fixation. J. Vis. Exp. (130), e55885, doi:10.3791/55885 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Morphologic bedömning av formalin-fast, paraffin-inbäddat (FFPE) vävnadsprover har varit guldmyntfoten för cancerdiagnostik i årtionden på grund av dess utmärkta bevarande av morfologi. Personlig medicin ger alltmer individuellt anpassade och riktade terapier för kännetecknas enskilda sjukdomar som aktiveras av kombinerade morfologiska och molekylära analytiska tekniker och diagnostik. Prestanda av morfologiska och molekylära analyser från det samma FFPE-provet är utmanande på grund av de negativa effekterna av formalin på grund av kemisk modifiering och cross-linking av nukleinsyror och proteiner. En icke-cross-länkar, formalin-fri vävnad fixativ utvecklats nyligen att uppfylla både kraven, dvs., att bevara morfologi som FFPE och biomolekyler som cryo-bevarande. Eftersom fisk krävs ofta i kombination med histopatologi och molekylär diagnostik, testade vi tillämpligheten av fisk protokoll på vävnader som behandlats med denna nya fixativ. Vi hittade den formalin efter fixeringen av histologiska sektioner av icke-cross-länka, formalin-fri och paraffin-inbäddat (NCFPE) bröst cancer vävnad genererat likvärdiga resultat som de med FFPE-vävnad i human epidermal tillväxtfaktor receptor 2 (HER2) FISK analys. Det här protokollet beskriver hur en fisk assay ursprungligen utvecklats och validerats för FFPE-vävnad kan användas för NCFPE vävnader av en enkel efter fixering steg av histologiska sektioner.

Introduction

Personlig medicin är alltmer beroende av flera parametrar tester där morfologiska och molekylära vävnad analyser. Formalin fixering av vävnader som den gyllene standarden ger utmärkt morphologic kvalitet1,2. Dock stör formalin-inducerad kemisk modifiering och cross-linking av proteiner och nukleinsyror3,4,5 negativt molekylär analys6. Dessa molekylära ändringar begränsa kvalitet nukleinsyror och proteiner och kan resultera i gen sekvens artefakter7 eller känselnedsättning av polymeras-kedjereaktion (PCR)-baserade analyser8. Även om stora ansträngningar har vidtagits för att optimera molekylära tester för FFPE-vävnad, är cryo-bevarande av vävnader i allmänna överlägsen formalin fixering, vilket gör det nödvändigt att dela upp vävnadsprover för olika bevarande förfaranden. För att undvika behovet av cryo-bevarande för molekylära analyser, en icke-cross-länka, formalin-fri fixativ, PAXgene vävnad utvecklades. Kommersiellt tillgängliga systemet består av en fixering och en stabilisering lösning innehållande olika alkoholer, ättiksyra och en löslig organisk förening. Korrekt bevarande av nukleinsyror, proteiner (phospo) och morfologi visades i flera studier6,9,10,11,12,13.

Ett visst program i cancerdiagnostiken är fisk att upptäcka ett omfattande sortiment av kromosomala förändringar, såsom flyttningar, submikroskopiska strykningar och kompletteringar 14. Till exempel tjugo procent av invasiv bröstcancer tumörer Visa förstärkning av human epidermal tillväxtfaktor receptor 2 (HER2) genen15,16,17, som är associerad med dålig prognos18 ,19. Fastställande av HER2 överuttryck och förstärkning status i bröstcancer av fisk behövs att välja patienter för behandling med anti-HER2-regi och är en följeslagare diagnostiska som anges av Federal Drug Association (FDA) (http://www.fda.gov/ MedicalDevices/ProductsandMedicalProcedures/InVitroDiagnostics/ucm301431.htm)17. För att möjliggöra en bred tillämpning av fiskbaserade följeslagare diagnostik inom vård och omsorg, analyser utvecklades och godkänd för FFPE vävnader.

I en tidigare studie visade vi att NCFPE vävnader inte kan användas för FISH-analyser som har godkänts för FFPE-vävnad. Men uppnått tester tid rad olika inlägg fixering förfaranden av NCFPE vävnader med 4% buffrad formaldehyd visade att bokföra fixering gånger på 18 h eller längre av NCFPE vävnadssnitt likvärdiga resultat som de med FFPE vävnader14.

I denna studie vi tillhandahålla ett detaljerat protokoll och Visa effekterna av icke-cross-länkar, formalin-fri vävnad fixering och 24 h 4% buffrad formaldehyd efter fixering vid sektioner används för HER2 FISH och RNA kvalitet från samma primära vävnad preparatet.

Figure 1
Figur 1: diagrammet visar stegen för fluorescens i situ hybridisering (FISH) och RNA analys av formalinbeständiga paraffin inbäddade (FFPE) och icke-cross-länkar, formalin-gratis fast paraffin inbäddat (NCFPE) vävnader. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Protocol

Studien har godkänts av den etiska kommittén av medicinska universitetet i Graz (referens nummer 20-066), Österrike. Vävnadsprover erhölls från två fall av kirurgiskt avlägsnande primär invasiv bröstcancer efter patienterna hade gett skriftligt informerat samtycke.

1. vävnad fixering

Obs: Vävnad fixering är utförs antingen med standard buffrad formalin lösning (Mikael), definierat som 10% formalin lösning innehållande en massfraktion 3,7% (motsvarande en volymandel på 4%) formaldehyd buffrad till pH 6,8 till pH 7,2 enligt CEN/TS 16827-1: 2015 eller icke-cross-länkar, formalin-fri vävnad fixering systemet (även benämnd som den alternativa fixering lösningen nedan) bestående av ett fixativ och en stabilisator lösning vid rumstemperatur (RT).

  1. Skär bröstet cancer vävnadsprover med en steril skalpell i två halvor varje 4 mm tjock för att säkerställa adekvat vävnad kvantitet. Använd en maximal storlek 4 x 15 x 15 mm för NCFPE eller Mikael vävnad fixering.
  2. Placera varje halva av tumör preparatet i en kassett som standard vävnad och dränka det i Mikaels eller alternativa fixering lösningen för 24 h med en volym per volym förhållande (v/v) av 4 delar fixativ och en del vävnad (4 mL/1 g vävnad (helst 10 mL/1 g)).
  3. Överföra de alternativt-fasta proverna i stabilisator lösning för 2-72 h genom att öppna behållaren, vrida vävnad kassett med 180° och dränka den.
  4. Placera de vävnad kassetterna med Mikaels-fasta prover i 250 mL 70% etanol i 30 min på RT att ta bort kvarvarande Mikaels.
    Obs: Detta steg är viktigt att undvika Mikaels kontamination av icke-cross-länka fixativ-behandlade prover i automatiserade vävnader processorn, vilket skulle förstöra de välgörande egenskaperna hos icke-cross-länka fixativ för bevarandet av biomolekyler.
    FÖRSIKTIGHET: Mikael är en farlig lösning, orsakar hudirritation, allvarliga ögonskador, kan orsaka allergisk hudreaktion, misstänks orsaka genetiska defekter, kan orsaka cancer, irritation i luftvägarna, dåsighet och orsakar skador på organ. Den alternativa fixativ är giftigt vid inandning, hudkontakt och förtäring, Irriterar ögon och hud, risk för mycket allvarliga bestående hälsoskador vid inandning, hudkontakt och förtäring. Inandning och fysisk kontakt bör undvikas för båda fixering lösningar. Bär lämpliga skyddskläder, handskar och ögon-och ansiktsskydd. Arbeta i dragskåp.
  5. Gå vidare till vävnad behandling, inbäddning och vävnad snittning (avsnitt 2 och 3).

2. vävnad behandling och inbäddning

  1. Utföra stegvis uttorkning av vävnad kassetter med fasta vävnadsproverna i 70% (2 x 15 min), 80% (30 min), 90% (60 min) och 99% (2 x 60 min) etanol, följt av xylen (2 x 60 min). Sedan infiltrera med paraffin i en automatiserad vävnadsprocessor (4 x 45 min).
  2. Med pincett, placera uttorkad och paraffin-infiltrerade proverna (alternativt och Mikaels-fast) i metall formar.
  3. Bädda in proverna i 5-10 mL smält paraffin (stelningspunkten 56-58 ° C) med ett paraffin inbäddning instrument.
  4. Placera formarna på en svalkande tallrik vid-5 ° C under 30 minuter.
  5. Återställa paraffin-inbäddat vävnad block från formarna.
  6. Lagra de resulterande block (alternativt-fast, paraffin-inbäddat (NCFPE) och Mikael-fast paraffin-inbäddat (FFPE)) i mörker vid 4 ° C fram till användning.

3. vävnad snittning och skjut förberedelser för fisken

Obs: FFPE sektioner används direkt för fisk, medan bilder med NCFPE avsnitt korrigeras efter i Mikaels för 24 h innan fisk förfarande.

  1. Infoga en engångsbruk blad i mikrotomen och justera mikrotomen till 10 µm.
  2. Ta det första blocket från kyla plattan och infoga det i instrumentet.
  3. Trimma blocket tills en jämn yta uppnås. Rengöra mikrotom med en borste och justera den till 3 µm. Kassera de första 2-3 sektioner.
  4. Skär 3 µm sektioner av NCFPE och FFPE-block och placera dem i ett kallt vattenbad (ultrarent vatten).
    Obs: För att få bättre fotografier utan överlappande atomkärnor, här, bilder av 2 µm sektioner istället för 3-5 µm som rekommenderas i tillverkarens instruktioner visas.
  5. Plocka upp varje flytande avsnitt med en fin pensel och en nål på ett bestruket objektglas för vidhäftning av avsnitten vävnad.
  6. Störta denna bild i ett varmt (40 ° C) vatten bad och låt avsnittet sträcka helt.
  7. Sätt i avsnittet tillbaka in i bilden genom att försiktigt dra i bilden ur vattnet och undvika rynkor.
  8. Låt alla sektioner torka vid rumstemperatur för 1 h.
  9. Värm i bilderna vid 70 ° C i 30 min i en inkubator smälta paraffinet.
  10. Lägg bilderna horisontellt i ett glas färgning burk.
  11. Rehydrera avsnitten stegvis på RT i färgning burkar fyllda med 250 mL vardera av följande vätskor: 100% xylen 2 x 15 min, 96% etanol 2 x 15 min, 90% etanol 2 min, 80% etanol 2 min, 70% etanol 2 min, 50% etanol 2 min , och destillerat vatten 2 x 10 min.
    FÖRSIKTIGHET: Utför avparaffinering och rehydrering steg i ett dragskåp, andas inte giftiga volatilized lösningsmedel.
    Obs: Beroende på sektioner och vävnad, kan det vara nödvändigt att testa olika inkubationstider i förväg.

4. efter fixering av NCFPE exemplar

  1. Utföra efter fixering av NCFPE bilder genom att sätta dem i en ny färgning burk fylld med Mikaels för 24 h vid RT. plats burken i dragskåp under 24 h efter fixering steg.
  2. Ta bort överflödigt Mikaels genom tvättning med fosfat buffrad koksaltlösning (3 x 10 min) och destillerat vatten (2 x 10 min).

5. fluorescens i situ hybridisering (FISH)

Obs: Här fiska utförs med hjälp av kommersiellt tillgängliga HER2/CEN17 tvåfärgad sonden Kit enligt tillverkarens anvisningar. Tillåt inte avsnitten vävnad att torka under hybridisering och tvätt steg. Låt inte de DNA sond och 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) DNA motfärg lösningar att utsättas för ljus under en längre period. Utför dessa steg i mörkret med hjälp av ljustäta behållare. Beroende på ålder och fixering steg av provmaterialet, öka eller minska denaturering och tvätta temperaturerna för att erhålla bättre hybridisering resultat.

  1. Placera en färgning burk innehållande 250 mL värme förbehandling lösning citronsyra i 98 ° C vattenbad.
  2. Placera den återfuktad FFPE och efter fasta NCFPE glider in i burken och inkubera i 15 min.
Använd inte fler än sex bilder per färgning burk.
  • Tvätta objektglasen i destillerat vatten för 3 min på RT i en ny färgning jar.
  • För proteolys, placera glasen i en kontrollerad temperatur hybridisering system vid 37 ° C.
    1. Applicera omedelbart, the-ready-to-use pepsinlösning (2mg/ml) droppvis (~ 30 µl per droppe) till vävnaden avsnitt tills det är helt täckt. Inkubera under 9 minuter vid 37 ° C i hybridisering systemet.
      Obs: Rekommenderas en inkubationstid av 5-15 min. Den optimala tidpunkten för proteolys bör fastställas i förväg.
    2. Placera glasen i en burk innehållande tvättbuffert SSC och inkubera i 5 min.
    3. Skölj objektglasen i destillerat vatten för 1 min på RT.
    4. Utföra uttorkning av avsnitten i de följande graderade alkoholerna: 50%, 70%, 90% och 100% vardera för 1 min. luft torka avsnitten.
    5. För hybridisering, pipett 10 µL av HER2/CEN17 sond på de torkade vävnadssnitt, täcka varje prov med ett täckglas och försegla det med gummi cement.
      Obs: rekommenderas 10 µL av sonden per 22 x 22 mm vävnad område. En skonsam uppvärmning på sonden gör pipettering processen enklare. Undvik bubblor och lång exponering av sonden till ljuset.
    6. Co denature sond och preparatet DNA i hybridisering systemet vid 75 ° C i 10 min.
    7. Ställa in systemet för hybridisering till 37 ° C och hybridisera över natten.
    8. Ta försiktigt bort gummi cement med pincett för efter hybridisering och detektion.
    9. Inkubera bilder i en färgning burk innehållande 37 ° C före värmde 1 x Tvättbuffert A för 5 min. ta bort coverslips.
    10. Tvätta de bilder som använder pre värmde 1 x wash buffer A två gånger för 5 min vid 37 ° C.
    11. Torka glasen i 70%, 90% och 100% etanol, 1 min varje.
    12. Torka proverna i luften och ljuskänsligt.
    13. För färgning, applicera 30 µL DAPI-lösning till området hybridiserade att undvika bubblor. Täcka avsnitten med ett täckglas.
    14. Inkubera i 15 min skyddas från ljus.
    15. Ta försiktigt bort överflödig DAPI-lösning genom att försiktigt trycka bilden mellan filtrerpapper.
    16. Lagra bilderna vid 2-8 ° C i mörker i upp till 2 veckor fram till utvärderingen av konfokalmikroskopi.
  • 6. confocal imaging och scanning av fisk diabilder

    1. Utföra confocal imaging och scanning av bilder på en confocal digital scanner utrustade med en 40 x / 1,2 NA objektiva, quad band filter (DAPI/FITC/TRITC/Cy5) och en 5.5Mpx, 16 bit, kyls vetenskapliga kompletterande metal oxide semiconductor (CMOS) kamera.
    2. Förvärva bilderna med filter för grön (excitation: 503 nm, emission: 528 nm) och orange (excitation: 547 nm, emission: 572 nm) kanaler.

    7. tolkning

    Obs: Sonden HER2/CEN17 är en blandning av en röd fluorokrom-märkt CEN17 sond specifika för regionen alfa satellit centromeric av kromosom 17 (D17Z1) och en grön fluorokrom-märkt HER2 sond specifik för HER2-genen (sondens läge 17q12). Tumör prover med ett HER2:CEN17 baserat på ≤2, 0 per kärna gjorde som vanligt, medan de med en HER2:CEN17 baserat på ≥2, 0 poängsätts som förstärkt17.

    1. Utföra kvalitetsanalys av bilder med öppen källkod CaseViewer 2.120.
      1. Utvärdera minst 20 celler som finns i två olika regioner av invasiva komponenten av cancer som definieras av en patolog. Inkludera klart urskiljbara väl distribuerade kärnor i området räknande. Exkludera från räknar vävnad regioner vid gränsen och infällt eller pressade områden.

    8. RNA kvalitet

    1. RNA-extraktion
      1. Se till att alla instrument och verktyg RNAse gratis. Använda en RNAse-bort lösning.
      2. Skär 10-20 sektioner (5 µm tjock) av NCFPE eller FFPE prover med en mikrotom efter protokollet tills steg 3,8.
      3. Extrahera RNA från NCFPE exempel med RNA isolering kit (se tabell av material). Extrahera RNA från FFPE prover med ett FFPE RNA isolering kit.
        Obs: Utvinning av RNA från icke-cross-länka fixativ kräver en isolering metod anpassas metoden fixering. Använd inte någon annan RNA isolering metod (t.ex. Trizol, RNeasy FFPE, etc. för NCFPE exemplar).
      4. Fastställa RNA-koncentrationen och renheten med en spektrofotometer. Förhållandet mellan absorbansen vid 260 nm och 280 nm (A260/280) bör vara ~ 2.0.
      5. Lagra den isolerade RNA vid-70 ° C tills vidare analys.
    2. Utföra en glyceraldehyd 3-fosfat dehydrogenas (GAPDH) realtid omvänd Transkription PCR med grundfärg för att generera amplikoner olika längder8,9.
      1. Använd ett cDNA omvänd Transkription kit enligt tillverkarens instruktioner för cDNA syntes. Använd 500 ng RNA av varje prov. Lagra cDNA vid-20 ° C tills vidare användning.
      2. Förbered PCR huvudmixen enligt tillverkarens instruktioner.
      3. Pipettera PCR huvudmixen i exemplar i en 384-väl reaktion tallrik. Lägga till 4 µL av 1:16 efter utspädning cDNA (PCR-mall). Utför PCR enligt tillverkarens instruktioner.
        Obs: För mänskliga GAPDH, följande grundfärger användes: GAPDH framåt: 5´-CCACATCGCTCAGACACCAT-3´; GAPDH omvänd: 71 bp 5´-ACCAGGCGCCCAATACG-3´, 153 bp 5´-GTAAACCATGTAGTTGAGGTC-3´, 200 bp 5´-TTGACGGTGCCATGGAATTT-3´, 277 bp 5´-ACTTGATTTTGGAGGGATCT-3´, 323 bp 5´-AAGACGCCAGTGGACTCCA-3´ och 530 bp 5´-ACGATACCAAAGTTGTCATG-3´.
      4. Analysera resultatet med hjälp av en programvara som gäller för PCR-maskinen. Ospecifik produkter måste uteslutas baserat på smältande kurva analys21.

    Representative Results

    FISK HER2 bestämning:

    HER2-fisk signal stödnivåerna från FFPE och NCFPE är liknande (figur 2). Båda fallen i de flesta celler visar ett klart överskott av grön signal (vägledande av den förstärkta HER2 genen locus) jämfört med den röd signalen (CEN17 Referensgenen). Fallet visar därför en amplifierad HER2-genen, vilket innebär att denna patient förväntas svara på trastuzumab, en anti-HER2 riktad terapi. FFPE exemplaret fungerade som positiv kontroll. De signaler som observerats i icke-neoplastiska celler (både i FFPE och NCFPE) fungera som intern referens och negativ kontroll för HER2 genen förstärkning. För varje analys-serien, bör minst ett avsnitt med kända gen förstärkning status användas som positiv kontroll för hybridisering reaktionen.

    RNA kvalitet:

    Motsvarande FFPE och NCFPE prover från två olika fall visar skillnader i RNA kvalitet genom att anställa realtid omvänd Transkription PCR. Resultaten visar olika förstärkning effektivitetsvinster för olika amplikon längder (dvs 71 bp, 153 bp, 200 bp, 275 bp, 323 bp) för GAPDH mRNA. Alla Ct (cykel tröskel) värden som erhålls från FFPE prover var högre än de från NCFPE. Denna skillnad visar den lägre PCR-amplificability mRNA isolerade från FFPE-vävnad, vilket tyder på en mer uttalad kemisk modifiering. Dessutom är de högre Ct-värdena för lång jämfört med kort amplikoner en indikator för mRNA fragmentering. Som jämförelse visar Ct värde sluttningarna av olika amplikon längderna mer uttalad mRNA fragmentering i FFPE än NCFPE vävnader (figur 3).

    Figure 2
    Figur 2: representativa resultat av HER2 fisk för motsvarande formalinbeständiga paraffin inbäddade (FFPE) och icke-cross-länkar, formalin-gratis fast paraffin inbäddat (NCFPE) vävnadssnitt. Motsvarande prover från samma FFPE (A) och NCFPE (B) vävnader visas. I motsats till normala interphase celler (C), där två gröna (HER2) och två röda (CEN17) signaler förväntas, celler med amplifierad HER2 genen locus representerar flera kopior av gröna signaler (HER2) (D). HER2 förstärkning status var identisk i både FFPE och avsnitten efter fasta NCFPE (A, B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figure 3
    Figur 3: resultat av en realtid omvänd Transkription PCR-analys används för RNA kvalitetskontroll. Y-axeln: Ct (cykel tröskel) värden av genen GAPDH visas för olika amplikon längder (71 bp, 153 bp, 200 bp, 275 bp, 323 bp) på x-axeln. mRNA isolerades från FFPE och NCFPE av två olika bröst cancer vävnadsprover bearbetas i parallella och transkriberas till cDNA för PCR. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Discussion

    Resultaten visar två viktiga resultat. Först är en enkel 24 h Mikaels efter fixering steg i avsnitt klippt från NCFPE vävnader tillräckliga för att uppnå likvärdiga resultat som de med FFPE i fisk analyser med hjälp av FISH-analyser som godkänts för FFPE vävnader (se även referens14). Detta protokoll har fördelen av att använda fisk analyser ursprungligen utvecklade och godkända för FFPE utan behov av omfattande förnyelse (t.ex. genom att optimera före hybridisering villkoren för icke-kors-länkade vävnad). FISK protokollet kan användas precis som beskrivs i tillverkarens instruktioner.

    Mindre ändringar från tillverkarens anvisningar i detta protokoll (t.ex. vävnad avsnitt diameter och inkubation perioder på avparaffinering stegen) resultat från tidigare anpassningar, vilket uttryckligen rekommenderas av tillverkaren på grund av användningen av olika vävnadstyper och fixering metoder.

    Steget efter fixering är avgörande eftersom det kräver en kemisk reaktion tid 18-24 h, som utökar analys tid genom en dag men tillåter samma dagliga arbetsflöde som utvecklats för FFPE vävnader (figur 1). Mikaels rapporteras att penetrera vävnad i genomsnitt 1 mm per timme22 till 5 mm i 2 h beroende på den vävnad typ23,24. Observationen att endast längre efter fixering perioder av mer än 18 h kunde ändra egenskaperna för NCFPE till FFPE sektioner, indikerar att inte genomträngningen av fixeringsvätskan men den kemiska reaktion tid är avgörande för att uppnå de önskade resultaten1 ,14.

    För det andra kan den återstående NCFPE vävnad som inte används för efter fixering användas för ytterligare molekylära analyser som biomolekyler är väl bevarade. Detta visades av realtid omvänd Transkription PCR (figur 3). Analysen är mer känslig och specifik än elektroferogram-derived RIN värdet (RNA integritet nummer) när det gäller RNA kvalitet (dvs. kemisk modifiering och fragmentering) för mRNA isolerade från paraffin-inbäddat vävnader8. Kvalitetskontrollen var begränsad i denna studie till realtids-PCR eftersom oberoende grupper har visat att förutom RNA, DNA och proteiner isolerade från NCFPE kvalitet är bättre än från FFPE vävnader 8,9, 13.

    Protokollet presenteras följer, i tillämpliga fall (t.ex. Mikaels recept, fixering villkor, RNA kvalitetskontroll, validering), kraven i de tekniska specifikationerna för CEN för pre analytiska förfaranden för in vitro - diagnostik (IVD), som har nyligen släppts av Europeiska kommittén för standardisering (CEN) (t.ex. CEN/TS 16827-1: 2015 för RNA-isolering från FFPE-vävnad som hänvisar till standarden ISO 15189).

    Metoden är begränsad till denna specifika fixativ. Även om bra bevarandet av biomolekyler och morfologi använder icke-cross-länkar, formalin-fri fixeringsvätskan har presenterats i flera studier, används det främst i forskning men inte i rutinmässiga medicinska tillämpningar. En anledning är att ersätta guldmyntfoten Mikaels fixering av en annan fixativ skulle kräva en mängd valideringsstudier som inte alla protokoll optimerad för FFPE material kan användas för material fast med icke-cross-länka fixativ. Andra vävnad fixering metoder inte har testats för denna fisk-protokollet.

    Den enkla efter fixering steg som beskrivs i detta manuskript har fördelen med att använda IVD godkända analyser både för FFPE och NCFPE vävnader.

    Disclosures

    D.G. är anställd av Qiagen och har lager alternativ eller bond innehav i bolagets pensionsplan. Uppgifterna i detta manuskript finns PAXgene vävnad systemet, som har utvecklats i en gemensam ansträngning av Qiagen och PreAnalytiX. QIAGEN är industriell partner för offentligt finansierade Christian Doppler laboratoriet för Biospecimen forskning och biobanker teknik. Alla författarna har någon intressekonflikt och inga konkurrerande ekonomiska intressen.

    Acknowledgments

    Vi tackar laget av laboratoriet för molekylär patologi vid Institutet för patologi medicinska universitetet Graz för sin kompetens och stöd. Dessutom tackar vi Iris Kufferath och Daniela Pabst för tekniskt bistånd, Bernadette Rieger och Sylvia Eidenhammer för bearbetning av fall som HER2 och Kinga Szurian (patolog) samt Tamas Regényi (3DHISTEC). Vi tackar Penelope Kungl för korrekturläsning manuskriptet. Detta arbete har fått ekonomiskt stöd av Christian Doppler forskningsfonden, den österrikiska federala ministeriet för vetenskap, forskning och ekonomi och nationella Stiftelsen för forskning, teknik och utveckling.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    SAV LP GmbH, Flintsbach a. I., Germany www.sav-lp.de FN-200L-4-1 Tissue fixative
    Simport Plastic Ltd., Beloeil, Canada www.simport.com M-498 Safekeeping device providing labelling, fixation and paraffin embedding for tissue samples.
    Qiagen GmbH, Hilden Germany www.qiagen.com 765112 For collection, fixation, and stabilization of tissue samples: 10 Prefilled Reagent Containers, containing PAXgene Tissue FIX and PAXgene Tissue STABILIZER.
    ThermoFisher Scientific www.thermofisher.com 813150 Processing of biological specimens from chemical fixation to paraffin infiltration
    Merck Millipore, Munich, Germany www.analytics-shop.com/de/hersteller/millipore.html MC1009834000 Dehydration of tissue samples
    VWR Chemicals, Darmstadt, Germany https://at.vwr.com 10293EP Dehydration of tissue samples
    ACM Herba Chemosan Apotheker AG, Vienna, Austria www.herba-chemosan.at 2549662 32 Paraffin used in a tissue processing device
    Leica Mikrosysteme Handels GmbH, Vienna, Austria www.LeicaBiosystems.com 39602004 Paraffin embedding medium
    Sanova Diagnostik, Vienna, Austria www.sanova.at 5229 Paraffin embedding instrument for tissues for histology
    Histocom Medizintechnik Vertriebs GmbH, Wiener Neudorf, Austria www.histocom.info M 910010 This device is used for especially sophisticated paraffin sectioning techniques in biology and medicine. Only skilled or specially trained personnel must operate the microtome, i.e. clamping the specimen, trimming, sectioning and taking off the sections from the instrument.
    Dako Denmark A/S, Glostrup, Denmark www.chem.agilent.com K802021-2 Coated glass slides, intended for mounting formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections.
    Qiagen GmbH, Hilden Germany www.qiagen.com 73504 For purification of total RNA from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections
    Qiagen GmbH, Hilden Germany www.qiagen.com 765134 For purification of total RNA from PAXgene-fixed, paraffin-embedded tissue sections
    ZytoVision GmbH, Bremerhaven, Germany www.zytovision.com Z-2015-200 For the detection of ERBB2 (a.k.a HER2) gene amplification frequently observed in solid malignant neoplasms e.g. breast cancer samples.
    3DHISTEC, Budapest, Hungary www.3dhistech.com Digital device for scanning tissue slides equipped with a 40x/1.2 NA objective, Quad band filters (DAPI/FITC/TRITC/Cy5) filters and a 5.5Mpx, 16 bit, cooled scientific CMOS (Complementary Metal Oxide Semiconductor) camera.
    ThermoFisher Scientific www.thermofisher.com 4368814 The High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit contains all components necessary for the quantitative conversion of up to 2 µg of total RNA to single-stranded cDNA in a single 20 µL reaction.
    ThermoFisher Scientific www.thermofisher.com 4367659 PCR Master Mix containing polymerase, nucleotides and SYBR Green for PCR and quanitification of amplicons.
    ThermoFisher Scientific, Wilmington, DE www.thermofisher.com Ser. Nr. F239 Spectrophotometer for nucleic acid quantification.
    QuantStudio 7 Flex Real-time PCR System www.thermofisher.com 4485701 PCR machine,
    Vysis/Abbott Laboratories. Abbott Park, Illinois, U.S.A www.molecular.abbott/us/en/products/instrumentation/thermobrite#order e.g. (ThermoBrite) 07J91-020 Temperature controlled slide processing system for in-situ denaturation/hybridization procedures.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, R. P. Formaldehyde fixation. J. Histochem.Cytochem. 33, (8), 845-853 (1985).
    2. Oosterhuis, J. W., Coebergh, J. W., van Veen, E. B. Tumour banks: well-guarded treasures in the interest of patients. Nat. Rev. Cancer. 3, (1), 73-77 (2003).
    3. Masuda, N., Ohnishi, T., Kawamoto, S., Monden, M., Okubo, K. Analysis of chemical modification of RNA from formalin-fixed samples and optimization of molecular biology applications for such samples. Nucleic Acids Res. 27, (22), 4436-4443 (1999).
    4. Metz, B., Kersten, G. F., Hoogerhout, P., Brugghe, H. F., Timmermans, H. A., de Jong, A., et al. Identification of formaldehyde-induced modifications in proteins: reactionswith model peptides. J. Biol. Chem. 279, (8), 6235-6243 (2003).
    5. Evers, D. L., Fowler, C. B., Cunningham, B. R., Mason, J. T., O'Leary, T. J. The effect of formaldehyde fixation on RNA: optimization of formaldehyde adduct removal. J.Mol. Diagn. 13, (3), 282-288 (2011).
    6. Groelz, D., Sobin, L., Branton, P., Compton, C., Wyrich, R., Rainen, L. Non-formalin fixative versus formalin-fixed tissue: A comparison of histology and RNA quality. Exp. Mol. Pathol. 94, (1), 188-194 (2013).
    7. Do, H., Dobrovic, A. Sequence artifacts in DNA from formalin-fixed tissues: causes and strategies for minimization. Clin. Chem. 61, 64-71 (2015).
    8. Kashofer, K., Viertler, C., Pichler, M., Zatloukal, K. Quality Control of RNA Preservation and Extraction from Paraffin-Embedded Tissue: Implications for RT-PCR and Microarray Analysis. PloS One. 8, (7), e70714 (2013).
    9. Viertler, C., Groelz, D., Gündisch, S., Kashofer, K., Reischauer, B., Riegman, P. H., et al. A new technology for stabilization of biomolecules in tissues for combined histological and molecular analyses. J. Mol. Diagn. 14, (5), 458-466 (2012).
    10. Gundisch, S., Slotta-Huspenina, J., Verderio, P., Maura, C., Ciniselli, S. P., Schott, S., et al. Evaluation of colon cancer histomorphology: A comparison between formalin and PAXgene tissue fixation by an international ring trial. Virchows Arch. 465, (5), 509-519 (2014).
    11. Ergin, B., Meding, S., Langer, R., Kap, M., Viertler, C., Schott, C., et al. Proteomic analysis of PAXgene-fixed tissues. J. Proteome Res. 9, (10), 5188-5196 (2010).
    12. Kap, M., Smedts, F., Oosterhuis, W., Winther, R., Christensen, N., Reischauer, B., et al. Histological Assessment of PAXgene Tissue Fixation and Stabilization Reagents. PLoS ONE. 6, (11), e27704 (2011).
    13. Mathieson, W., Marcon, N., Antunes, L., Ashford, D. A., Betsou, F., Frasquilho, S. G., et al. A Critical Evaluation of the PAXgene Tissue Fixation System: Morphology, Immunohistochemistry, Molecular Biology, and Proteomics. Am J Clin Pathol. 146, 25-40 (2016).
    14. Oberauner-Wappis, L., Loibner, M., Viertler, C., Groelz, D., Wyrich, R., Zatloukal, K. Protocol for HER2 FISH determination on PAXgene-fixed and paraffin-embedded tissue in breast cancer. Int J. Exp. Path. 97, (2), 202-206 (2016).
    15. Pauletti, G., Godolphin, W., Press, M. F., Slamon, D. J. Detection and quantitation ofHER-2/neu gene amplification in human breast cancer archival material using fluorescence in situ hybridization. Oncogene. 13, (1), 63-72 (1996).
    16. Owens, M. A., Horten, B. C., Da Silva, M. M. HER2 amplification ratios by fluorescence in situ hybridization and correlation with immunohistochemistry in a cohort of 6556 breast cancer tissues. Clin.Breast Cancer. 5, (1), 63-69 (2004).
    17. Wolff, A. C., Hammond, M. E., Schwartz, J. N., Hagerty, K. L., Allred, D. C., Cote, R. J., et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer. Arch Pathol Lab Med. 131, (1), 18-43 (2007).
    18. Press, M. F., Bernstein, L., Thomas, P. A., Meisner, L. F., Zhou, J. Y., Ma, Y., et al. HER-2/neu gene amplification characterized by fluorescence in situ hybridization: poor prognosis in node-negative breast carcinomas. J. Clin. Oncol. 15, (8), 2894-2904 (1997).
    19. Yamauchi, H., Stearns, V., Hayes, D. F. When is a tumor marker ready for prime time? A case study of c-erbB-2 as a predictive factor in breast cancer. J. Clin. Oncol. 19, (8), 2334-2356 (2001).
    20. Paulik, R., Micsik, T., Kiszler, G., Kaszál, P., Székely, J., Paulik, N., Várhalmi, E., Prémusz, V., Krenács, T., Molnár, B. An optimized image analysis algorithm for detecting nuclear signals in digital whole slides for histopathology. Cytometry A. (2017).
    21. Applied Biosystems. QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software. Publication Number 4489822 (2013).
    22. NCCLS. Quality Assurance for Immunocytochemistry. Wayne. (1999).
    23. Baker, J. R. Principles of Biological Microtechnique. London: Methuen. Reprinted 1970, with corrections (1958).
    24. Hewitt, S. M., Lewis, F., Cao, Y., Conrad, R. C., Cronin, M., Danenberg, K. D., et al. Tissue handling and specimen preparation in surgical pathology: issues concerning the recovery of nucleic acids from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Arch Pathol. Lab Med. 132, (12), 1929-1935 (2008).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics