Time-lapse Confocal Imaging van Migreren Neuronen in Organotypische Slice Cultuur van Embryonale Muishersenen Met behulp van

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Dit protocol geeft instructies voor directe observatie van radiaal migrerende corticale neuronen. Bij utero- elektroporatie, organotypische snijcultuur en tijdverlopen confocal beeldvorming worden gecombineerd om de effecten van overexpressie of downregulatie van genen die geïnteresseerd zijn in migrerende neuronen direct en dynamisch te bestuderen en hun differentiatie tijdens de ontwikkeling te analyseren.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (125), e55886, doi:10.3791/55886 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

In utero electroporation is een snelle en krachtige aanpak om het proces van radiale migratie in de hersencortex van het ontwikkelen van muisembryo's te bestuderen. Het heeft geholpen om de verschillende stappen van radiale migratie te beschrijven en de moleculaire mechanismen die dit proces beheersen, te karakteriseren. Om migrerende neuronen direct en dynamisch te analyseren, moeten ze in de loop der tijd worden opgespoord. Dit protocol beschrijft een workflow die combineren in utero- elektroporatie met organotypische snijcultuur en tijdverloop confocal beeldvorming, waarmee een direct onderzoek en dynamische analyse van radiaal migrerende corticale neuronen mogelijk is. Bovendien is gedetailleerde karakterisering van migrerende neuronen, zoals migratiesnelheid, snelprofielen, alsmede radiale oriëntatieveranderingen, mogelijk. De methode kan gemakkelijk worden aangepast om functionele analyses van genen van belang in radiaal migrerende corticale neuronen uit te voeren door verlies en winst van functie, alsmede reddingsexperimenten. Time-lapseBeeldvorming van migrerende neuronen is een state-of-the-art techniek die ooit opgericht is een krachtig instrument om de ontwikkeling van de hersencortex in muismodellen van neuronale migratiestoornissen te bestuderen.

Introduction

De neocortex is de belangrijkste site van cognitieve, emotionele en sensorimotorische functies. Het bestaat uit zes horizontale lagen die parallel zijn aan het oppervlak van de hersenen. Tijdens de ontwikkeling geven stamcellen in de laterale wand van de dorsale telencephalon aanleiding tot projectie-neuronen die radiaal migreren naar het paleoppervlak en een lagertype-specifieke neuronale identiteit verwerven. Na het ontstaan ​​in de ventriculaire / subventriculaire zones (VZ / SVZ) worden deze neuronen transient multipolair en vertragen hun migratie. Na een kort verblijf in de intermediaire zone (IZ) veranderen ze naar een bipolaire morfologie, bevestigen aan het radiale gliale steiger en gaan radiaal georiënteerde migratie in de corticale plaat (CP). Bij het bereiken van hun uiteindelijke doelprojectie ontlopen neuronen van de radiale gliale processen en verwerven ze lagenspecifieke identiteit. Mutaties in genen die verschillende stappen van neuronale migratie beïnvloeden, kunnen ernstige corticale misvorming veroorzaken, zoals lissencEphalie of witte stof heterotopia 1 , 2 .

In utero electroporation is een snelle en krachtige techniek om neurale voorloper cellen te transfecteren in de ontwikkelende hersenen van knaagdier embryo's 3 , 4 . Met deze techniek is het mogelijk om genen van belang te knockdown en / of overexpresseren om hun functies te bestuderen bij het ontwikkelen van neuronen. Deze methode heeft specifiek geholpen om de morfologische details te beschrijven en de moleculaire mechanismen van het radiale migratieproces 5 , 6 , 7 , 8 , 9 te karakteriseren. Radiaal migrerende neuronen ondergaan dynamische veranderingen in celvorm, migratiesnelheid, en migrerende richting, die over de tijd directe en continue observatie vereisen. Organotypische plakcultusRe- en time-lapse confocal beeldvorming van elektroporate hersenen maken het mogelijk om migrerende neuronen direct in de gaten te houden. Met behulp van deze gecombineerde aanpak is het mogelijk om verschillende kenmerken van migrerende neuronen te analyseren die niet in vaste weefselsecties van elektroporate hersenen kunnen worden onderzocht.

We hebben onlangs confocale beeldvorming van migrerende neuronen toegepast in snijculturen van elektroporeerde hersenen, om de rol van de transcriptiefactor B-cel CLL / lymfoom 11a (Bcl11a) tijdens de corticale ontwikkeling 10 te bestuderen. Bcl11a wordt uitgedrukt in jonge migrerende corticale neuronen en we gebruikten een conditional mutant Bcl11a allele ( Bcl11a flox ) 11 om zijn functies te bestuderen. Elektroporatie van Cre recombinase samen met groen fluorescerend eiwit (GFP) in corticale stamvaten van Bcl11a flox / flox hersenen liet ons een mozaïekmutante situatie creëren, waarbij slechts enkele cellen gemuteerd zijn in eenAnders wildtype achtergrond. Op deze manier was het mogelijk om cel-autonome functies van Bcl11a op het enkele celniveau te bestuderen. We vonden dat Bcl11a mutante neuronen een verminderde snelheid laten zien, hun snelheidsprofielen veranderen, evenals willekeurige oriëntatieveranderingen tijdens hun migratie 10 . In het geschetste protocol beschrijven wij een workflow voor succesvolle elektroporatie en slice cultuurvoorbereiding 12 van muishersenen, evenals conflicterende confocal imaging van corticale slice culturen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door het Animal Welfare Committee (Regierungspräsidium Tübingen) en uitgevoerd volgens de Duitse dierenwelzijnswet en de EU-richtlijn 2010/63 / EU.

1. In Utero Electroporation

  1. Microinjectie Naalden
    1. Draai borosilicate glazen capillairen (buitenste diameter: 1,0 mm, binnendiameter: 0,58 mm, lengte: 100 mm) in microinjectienaalden met behulp van een micropipettractor met een doosfilament (2,5 mm x 2,5 mm) en het volgende programma: HEAT: 540, PULL : 125, VELOCITY: 20, en DELAY: 140. Bepaal de HEAT-waarde voor elk afzonderlijk filament door een RAMP-test uit te voeren (HEAT-waarde: RAMP + 25).
    2. Bevelnaalden in een hoek van 38 ° en tussenliggende tot hoge omwentelingssnelheid met een microgrinder om een ​​tipgrootte van 20 tot 30 μm te verkrijgen voor injectie op embryonale dag (E) 13,5 of jonger en 30 tot 40 μm voor injectie bij oudere embryonalefasen. Voor het opslaan, doe de naalden in een doos of petrischaal met modelleerklep om schade aan de tips te voorkomen.
  2. Plasmide DNA-oplossing
    1. Bereid het plasmide-DNA-construct dat fluorescerend reporterproteïne ( bijv. GFP) bevat, met gebruik van een endotoxinevrije maxi-bereidingskit volgens de instructies van de fabrikant.
    2. Verdun plasmide-DNA-oplossing tot een eindconcentratie van 1 - 2 μg / μl in endotoxinevrije Tris-EDTA-buffer die Fast Green bij een uiteindelijke concentratie van 0,01% bevat. Aliquot oplossing en opslaan bij -20 ° C.
  3. Bacteriostatische Sodium Chloride Oplossing
    1. Bereid de bacteriostatische natriumchlorideoplossing door benzylalcohol toe te voegen aan een uiteindelijke concentratie van 0,9% aan isotonische 0,9% natriumchloride oplossing. Steriele filteroplossing direct voor gebruik.
  4. Carprofen injectie oplossing
    1. Bereid de carprofen injectie oplossing voorCarprofen toevoegt aan een uiteindelijke concentratie van 0,5 mg / ml aan steriele isotonische 0,9% natriumchloride oplossing. Bewaar bij 4 ° C gedurende maximaal 28 dagen.
  5. Anesthesie, DNA-injectie en Elektroporatie
    1. Weeg een E14.5 timed-pregnant muis en plaats het in een doorzichtige verdovingskamer die verbonden is met een verdamper en verzadigd is met 5% isofluraan. Wanneer het dier bewusteloos is, breng het over naar een verdovingsmasker dat is bevestigd aan een warmteplaat van 37 ° C en verdoof het met 1,8-2,2% isofluraan.
      Opmerking: Bepaal de ontwikkeling van de chirurgische verdoving door verlies van staartknijp en pedaalreflexen (teenknijp).
    2. Voor analgesie injecteer 100 μL carprofen injectie oplossing per 10 mg muis lichaamsgewicht (5 mg / kg lichaamsgewicht) subcutaan. Draai de muis met de rug naar beneden en bedek de ogen zorgvuldig met petroleumjelly om te voorkomen dat ze drogen.
    3. Verdeel de ledematen voorzichtig uit en fixeer zeNaar de verwarmingsplaat met chirurgische tape. Steriliseer de buik met 70% ethanol gevolgd door een jodiumoplossing (7,5 mg / ml) met behulp van cellulose swabs. Herhaal deze procedure drie keer om te zorgen voor een goede desinfectie.
    4. Bedek de buik met steriel gaas, waarin een snede is gesneden om een ​​veld (diameter: 2 - 2,5 cm) voor de buikspleet te sparen. Bevestig het gaas met bacteriostatische natriumchloride oplossing.
      Let op: Herzien de ontwikkeling van de chirurgische verdoving door het verlies van het pedaalreflex.
    5. Met behulp van Micro Adson Forceps (serrated, lengte: 12 cm) en fijne schaar (hoek aan zijde, lengte: 9 cm) snijd je de huid ongeveer 1,5 cm langs de middellijn van de buik. Snijd de onderliggende spier langs de linea alba.
    6. Verwijder een baarmoederhoorn met ringpincet (lengte: 9 cm, buitendiameter: 3 mm, binnendiameter: 2,2 mm) en plaats het zachtjes op het bevochtigde gaas.
      Voorzichtigheid: Houd de baarmoederhoorn alleen met ringpincen tussen de embryo's anD versteur de placentas of geen voedingsschepen. Houd de baarmoeder te allen tijde vochtig met bacteriostatische natriumchlorideoplossing.
    7. Plaats een embryo voorzichtig met ringpincet en plaats de laterale ventrikel, die als een halve maanvormige schaduw voordoet parallel aan de sagittale sinus. De injectieplaats ligt ongeveer in het midden van een lijn tussen het gepigmenteerde oog en de samenloop van sinussen, waar de sagittale sinus tot twee dwarse sinussen grenst. Duw de microinjectie naald door de baarmoederwand en in de laterale ventrikel.
      Opmerking: Indien nodig kan de diepte van de injectie gecorrigeerd worden door de naald terug te trekken.
    8. Spuit 1 tot 2 μL DNA-oplossing in de laterale ventrikel met een microinjector, die met een voetpedaal wordt bediend, met de volgende instellingen: 25 psi, 10 tot 20 ms per puls en 5 tot 10 pulsen. Succesvolle injectie kan worden gecontroleerd door de gekleurde DNA-oplossing, die het ventriculaire systeem moet vullen.
    9. Plaats tweezers-type elektroden (3 mm diameter voor E13.5 of jonger en 5 mm diameter voor E14.5 of ouder) op zodanige wijze dat de 'positieve' aansluiting op dezelfde zijde ligt als de geïnjecteerde ventrikel en de 'negatieve' Terminal is aan de andere kant van de ingespoten ventrikel onder het oor van het hoofd van het embryo.
    10. Vocht de elektroporatieplaats met een paar druppels bacteriostatische natriumchlorideoplossing aan en gebruik 5 elektrische stroomimpulsen (35 V voor E13.5 of jonger en 40 V voor E14.5 of ouder) met een duur van 50 ms met intervallen van 950 ms.
      Opmerking: Stromen van 60 tot 90 mA zijn meestal voldoende voor succesvolle elektroporatie. Lagere stromen zullen de neuronen niet efficiënt transfecteren, terwijl hogere stromen tot embryonale dood kunnen leiden.
    11. Herhaal de procedure (zie stap 1.5.7 tot en met 1.5.10.) Voor elk embryo van de baarmoederhoorn en plaats het zachtjes terug in de buikholte.
    12. Verwijder de baarmoederhoorn van de andere kant en herhaal de procEdure beschreven in stap 1.5.7. Tot 1.5.11.
    13. Sluit de buikholte door de spierlaag te suturen voordat u de huid met behulp van Micro Adson Forceps, Mathieu Naaldhouder (wolfraamcarbide, lengte: 14 cm) en niet-absorbeerbare chirurgische hechting (3/8 cirkel, 13 mm, taps punt) helpt.
      Let op: Wees voorzichtig om de baarmoeder of andere organen tijdens de hechting niet vast te leggen.
    14. Desinfecteer de huidverhitting met de jodiumoplossing (7,5 mg / ml) zorgvuldig en verwijder het perioculaire overmaat petroleumjessje met behulp van cellulose swabs voorzichtig. Plaats de muis onder een infraroodlamp totdat het wakker wordt. Volg de muis nauwkeurig de komende twee dagen. Herhaal de analgesische behandeling zoals beschreven in stap 1.5.2 na 12 tot 24 uur.

2. Organotypische Slice Culture

  1. Laminin Stock Solution
    1. Los 1 mg gevriesdroogde laminine op in steriel water om een ​​1 mg / ml laminine voorraadoplossing te verkrijgen. Bereid 50 μl alikvoten aNd winkel bij -80 ° C.
  2. Poly-L-lysine voorraadoplossing
    1. Los 50 mg poly-L-lysine op in steriel water om een ​​1 mg / ml poly-L-lysine voorraadoplossing te verkrijgen. Bereid 0,5 ml porties op en houd deze bij -20 ° C op.
  3. Complete Hank's Balanced Salt Solution (Complete HBSS)
    1. Bereid complete HBSS voor door 50 ml 10x HBSS oplossing, 1,25 ml 1 M HEPES buffer (pH 7,4), 15 ml 1 M D-glucose oplossing, 5 ml 100 mM calciumchloride oplossing, 5 ml 100 mM magnesiumsulfaat Oplossing en 2 ml 1 M natriumwaterstofcarbonaatoplossing. Voeg steriel water op tot 0,5 L, steriel filter, en sla bij 4 ° C op.
  4. Slice Culture Medium
    1. Combineer 35 ml Basal Medium Eagle (BME), 12,9 ml volledige HBSS (zie sectie 2.3.1.), 1,35 ml 1 M D-glucose, 0,25 ml 200 mM L-glutamine en 0,5 ml penicilline streptomycine tot 50 ml snijcultuur verkrijgenmedium. Steriel filter en voeg parserum toe tot een uiteindelijke concentratie van 5%. Bewaar bij 4 ° C gedurende maximaal 4 weken.
  5. Laag Smeltpunt (LMP) Agarose Oplossing
    1. Bereid 3% LMP-agaroseoplossing door 1,5 g LMP-agarose in 50 ml volledige HBSS op te lossen door 1 tot 2 minuten in een magnetron te verwarmen bij tussenvermogen.
      Opmerking: Bewaar de hitte zorgvuldig om overloop te voorkomen tijdens het koken.
    2. Plaats de oplossing in een waterbad bij 38 ° C tot het klaar is voor gebruik. Bewaar bij 4 ° C en herhaal eens.
  6. Coating van membraaninzetstukken
    1. Voeg één aliquot van laminine voorraadoplossing toe (cf stap 2.1.1.) En één aliquot van poly-L-lysine voorraadoplossing (zie stap 2.2.1.) Tot 6 ml steriel water om een ​​coatingoplossing te verkrijgen (voldoende voor 6 inserts) .
    2. Plaats membraaninzetten in een 6-putjesplaat die 2 ml steriel water in de bodem van elke put bevat. Voeg 1 ml coatingoplossing toe(Zie stap 2.6.1.) Bovenop elk membraan en incubeer overnacht bij 37 ° C en 5% kooldioxide atmosfeer.
      Opmerking: Gebruik alleen inserts met optisch heldere membranen, zoals polytetrafluorethyleen (PTFE) membraan.
    3. Was de membranen driemaal met 1 ml steriel water en droog. Gebruik de gecoate membranen op dezelfde dag of op een schone plaat met 6 putjes bij 4 ° C gedurende maximaal vier weken.
  7. Hersensectie en inbedding
    1. Twee dagen na de elektroporatie plaats de muis in een transparante kamer die is verbonden met een verdamper en verzadigd met 5% isofluraan. Als het dier onbewust is, verwijder het het uit de kamer en offer het door cervicale ontwrichting.
    2. Verwijder de baarmoeder die de embryo's bevat en plaats het in een 10 cm Petri-schotel met ijskoude complete HBSS.
      Opmerking: houd vanaf dit punt alle oplossingen, embryo's en hersenen op ijs.
    3. Gebruik een stereomicroscoop, fijne tippen (recht,11 cm) en een paar Vannas Tübingen Spring Scissors (omhoog omhoog, lengte: 9,5 cm) om elk embryo van de baarmoeder af te scheiden en over te brengen naar een andere petrischaal met ijskoude complete HBSS.
    4. Maak een snede op het niveau van de hersenstam en snijd langs de sagittale middenlijn. Verwijder de huid en kraakbeen over de hersenen. Knip de hersenstamper direct achter de hemisferen af ​​en verwijder de hersenen van de schedel. Breng de hersenen over met een microsleepspatel (185 mm x 5 mm) op een 12-putjesplaat met ijskoud complete HBSS. Verzamel alle hersenen uit het rommel in de 12-putjesplaat.
    5. Gebruik een fluorescerende stereomicroscoop om de hersenen in de 12-putsplaten te screenen voor fluorescentiehelderheid evenals de grootte van het elektroporiseerde gebied. Selecteer 2 tot 4 hersenen met fel fluorescerende signalen in de vermoedelijke somatosensorische cortex voor verdere verwerking.
    6. Giet 3% LMP-agarose-oplossing die bij 38 ° C wordt gehouden in de wegwerpbeschermingsbeschermer. afneemE-hersenen uit de 12-putjesplaat met een microsleepspatel en zorg ervoor dat overtollig gehele HBSS om de hersenen wordt afgedekt met fijn tissuepapier.
    7. Plaats de hersenen zachtjes in de agarose-oplossing, duw het naar de bodem van de mal en pas de positie zorgvuldig aan met behulp van een 20-gaas naald. Voor coronale afdelingen, geef de hersenen aan met de olfactorische bollen naar boven gericht. Houd de mal op ijs totdat de agarose-oplossing is verstevigd en doorgaan met het doorsneden van de hersenen.
  8. Vibratome Sectie en Slice Culture
    1. Verwijder het agarose blok uit de vorm en plaats het op de deksel van een steriele petrischaal. Vermijd overmatige agarose met een schoon razorblad dat ongeveer 2 tot 3 mm onder de olfactorische bollen en 1 mm agarose aan de andere zijden achterlaat. Bevestig het geperforeerde agarose blok met de olfactorische bollen naar beneden naar een monsterstadium met behulp van cyanoacrylaatlijm.
      Opmerking: Instrumenten en apparatuur steriliseren met 70% ethanoIk voor afsnijden.
    2. Breng het specimen stadium naar de snijkamer van een vibrerende mesmikrotoom die ijskoud volledige HBSS bevat en plaats de hersen met zijn dorsale kant naar het mes. Snijd 250 μm dikke schijfjes die het elektroporate gebied bevatten met een lage tot matige amplitude van 0,9 mm en een zeer langzame snijsnelheid van 0,09-0,12 mm / s. Meestal worden 4 tot 6 segmenten met helder fluorescent signaal verkregen uit elke succesvolle elektroporate hersen.
    3. Met een gebogen microsleepspatel en fijne tipped tang, verplaats de hersenschijfjes zorgvuldig met de omliggende agarose naar een 6-putjesplaten die ijskoude complete HBSS bevatten.
      Let op: Wees voorzichtig om het hersenweefsel niet te beschadigen door alleen de agarose velg rond de secties aan te raken met de tang tijdens de overdracht.
    4. Verwerk alle geselecteerde hersenen zoals beschreven in stappen 2.8.1. Tot 2.8.3.
    5. Vochtig de membraan inserts met 100 μL complete HBSS voordat u de hersenen slWijst op de membranen om de positionering van de plakjes te vergemakkelijken. Er kunnen maximaal 5 plakjes op 1 membraan inzet geplaatst worden.
    6. Zet de plakjes zorgvuldig over op de membranen door middel van een gebogen microsleepspatel en fijne tippen. Zet een plakje voorzichtig op de spatel door alleen de agarose velg aan te raken met de tang en druk het plakje voorzichtig van de spatel op het membraan. Plaats het plakje met behulp van tang en ga door met de resterende plakjes. Verwijder overmaat complete HBSS met een pipet.
      Opmerking: overlap de plakjes niet met elkaar.
    7. Plaats de membraaninzetten zorgvuldig met de plakjes in een 6-putjesplaat die 1,8 ml snijcultuurmedium bevat (cf stap 2.4.1.) En incubeer bij 37 ° C en 5% kooldioxide atmosfeer tot de vervaldatum in beeld brengen.

3. Time-Lapse Imaging

  1. Microscoop Setup
    1. Zet een klimaatkamer op het podium van eenOmgekeerde confocale microscoop naar 37 ° C en 5% kooldioxide atmosfeer. Gebruik een hybride detector om de laserintensiteit te verminderen en de levensvatbaarheid van de cellen te verbeteren. Voor gedetailleerde analyse gebruik een extra lange werkafstand 40X droge doelstelling met een numerieke diafragma van 0,6 of hoger.
      Opmerking: Alle componenten van de microscoop moeten gedurende 2 tot 3 uur voor 37 ° C worden verwarmd tot 37 ° C voor beeldvorming om tijdens de beeldvorming een stabiele focus te bieden.
  2. Slice Imaging
    1. Selecteer een breinschijf voor beeldvorming van de 6-putjesplaat die de membraaninzetten bevat met behulp van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop.
      Let op: Vermijd langdurige blootstellingstijd aan ultraviolet licht, omdat dit kan leiden tot cellulaire fotodamage.
      Opmerking: Selecteer een segment met lichte enkele neuronen in de bovenste SVZ die radiaal migreert naar het pale oppervlak van de plak. Fijne fluorescerende processen van radiale glialcellen die de gehele CP bedragen, duiden op een intacte radiale gliale steiger, die gebruikt wordtD door radicale migratie van corticale neuronen.
    2. Breng het membraaninzetstuk over met een schijfje, dat is geselecteerd voor time-lapse beeldvorming, in een 50 mm diameter glazen bodemschotel met 2 ml slice culture medium met behulp van pincet. Plaats de schotel in de klimaatkamer van de confocale microscoop.
    3. Stel de resolutie in op 512 bij 512 pixels en verhoog de scansnelheid van 400 Hz tot 700 Hz om de beeldsnelheid te verhogen van respectievelijk 1,4 tot ongeveer 2,5 beelden per seconde. Gebruik maximaal twee keer gemiddeld. Definieer een z-stapel door het elektroporiseerde gebied (meestal 400-100 μm) met een stapgrootte van 1,5 μm. Collectief, deze instellingen zorgen voor een voldoende resolutie en helderheid van het beeld, terwijl fotodamage laag blijft tijdens de acquisitie. Begin de time-lapse-serie door elke 30 minuten een z-stack te nemen.
      Opmerking: Langdurige blootstelling van het segment aan laserlicht zal fotodamage veroorzaken waardoor de levensvatbaarheid van de cellen wordt verminderd. Pas de expOsure tijd aan laserlicht dienovereenkomstig.
    4. Analyseer time-lapse-serie met behulp van ImageJ-software (https://imagej.nih.gov/iij/) of gelijkwaardig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Voorheen hebben we aangetoond dat genetische deletie van Bcl11a door middel van utero elektroporatie de radiale migratie van late geboren bovenlaagse projectie neuronen 10 verstoort. Elektroporatie van een DNA - plasmidvector die Cre-IRES-GFP bevat efficiënt verwijderd Bcl11a in conditional Bcl11a flox / flox brains 11 . Bij het analyseren van E14.5 elektroporate hersenen drie dagen na de elektroporatie, waren de meeste controle neuronen in de CP gemigreerd, terwijl veel Bcl11a mutante neuronen langs de migrerende route in de IZ en VZ / SVZ stonden. Bovendien vonden we een toename van het aantal multipolaire cellen ten koste van bipolaire cellen, specifiek in het IZ bij Bcl11a- deletie, die fouten vertoonden bij polarisatie 10 .

Migra direct en dynamisch analyserenTory-gedrag van Bcl11a- mutante neuronen gebruiken we confocale beeldvorming van migrerende neuronen in de organotypische plakcultuur die is bereid uit elektroporateerde hersenen. Overzicht time-lapse serie met een 10X objectief met een numerieke diafragma van 0,4 bevestigde onze resultaten, dat Bcl11a mutante projectie neuronen defecten hebben in radiale migratie. Binnen 36 uur hadden veel controle-neuronen in de CP gemigreerd, terwijl slechts enkele Bcl11a- mutante neuronen de IZ verlieten en in de CP migreerden. Interessant lijkt het dat veel Bcl11a mutante neuronen niet direct naar het pale oppervlak van de hersenen migreren, maar de migratie vertragen en tangentiaal of zelfs terug naar de ventrikel draaien (Film 1). Om deze bevindingen verder te analyseren, genereren we time-lapse-series bij een hogere vergroting met een 40x objectief met een numerieke diafragma van 0,6. Onze gegevens tonen aan dat Bcl11a mutante neuronen niet efficiënt polariseren en radiaal georiënteerde migraten doorgaanIon in de CP. Binnen 12 uur verscheurden veel Bcl11a mutante neuronen niet van een multipolaire naar een bipolaire morfologie en proberen ze veel processen in de omgevingsomgeving (Movie 2, Figuur 1A ).

Verder traceerden we de migratiepaden van individuele neuronen in verschillende time-lapse-series en gebruikten deze om specifieke parameters van migrerende neuronen te berekenen. We vonden dat Bcl11a mutante neuronen repetitief fasen van een paar uur duur ondergaan met verminderde migratie snelheid en willekeurige oriëntatie veranderingen (Film 3, Figuur 1B , rode pijlpunten). In het bijzonder werd het snelheidsprofiel van Bcl11a- mutante neuronen verschoven van hogere snelheid (25 μm / u) naar lagere snelheid (5 μm / u) in vergelijking met controle-neuronen ( Figuur 1C ). In lijn hiermee wordt de totale migratie snelheid van Bcl11Een mutante neuron was significant verminderd van 10,34 ± 0,34 μm / h in controles tot 6 ± 0,54 μm / h (p = 2,4889E-05) ( Figuur 1D ). Tenslotte is de afwijking van gerichte migratie naar het paleoppervlak van de hersenen significant verhoogd van 17,15 ± 2,13 ° in de controle tot 40,16 ± 4,42 ° in Bcl11a- mutante neuronen (p = 0,0002) ( Figuur 1E ). Samen tonen deze resultaten aan dat confocal imaging van GFP electroporated neurons in organotypische segmentencultuur een waardevolle methode is om moleculaire mechanismen te bestuderen die het proces van neuronale migratie beheersen.

Film 1
Film 1: Migratie van GFP Labeled Control in vergelijking met Bcl11a Mutant Neurons in Cortical Slices. Bcl11a flox / flox hersenen werden electroporated bijE14.5 met een plasmidevector die IRES-GFP (A) of Cre-IRES-GFP (B) en snijculturen bevatte werden bereid bij E16.5. VZ / SVZ; Ventriculaire / subventriculaire zones; IZ, intermediaire zone; CP, corticale plaat. Schaalbalk = 100 μm. De film bestaat uit 108 frames met een snelheid van 5 frames / s. Reprinted van Wiegreffe et al. 10 met toestemming van Elsevier. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

Film 2
Film 2: Polarisatie van een GFP-labeled Control in vergelijking met Bcl11a Mutant Neuronen in Cortical Slices. Bcl11a flox / flox hersenen werden geëproporeerd bij E14.5 met een plasmide vector die IRES-GFP (A) of Cre-IRES-GFP (B) en snijculturen bevatte Werden bereid op E16.5. Schaalbalk = 10 μm. De film bestaat uit 25 frames met een snelheid van 5 frames / s. Reprinted van Wiegreffe et al. 10 met toestemming van Elsevier. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

Film 3
Film 3: Geanimeerde Sporen met 1 uur Intervalresolutie van representatieve controle en Bcl11a Mutant Neurons. Sporen van migrerende neuronen werden verkregen uit tijdloper reeks E16.5 snijculturen van Bcl11a flox / flox hersenen die werden geëproporiseerd bij E14.5 met een plasmide vector die IRES-GFP ( A ) of Cre-IRES-GFP ( B ) . Schaalbalk = 20 μm. Reprinted van Wiegreffe et al.> 10 met toestemming van Elsevier. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

Figuur 1
Figuur 1: Migratie Gedrag van Bcl11a Mutant Bovenlaagse Cortische Neuronen.
( A ) Representatieve afbeeldingen van migrerende GFP-positieve neuronen in E16.5-snijculturen van Bcl11a- flox / flox- hersenen die op E14.5 geëproporeerd werden met Cre-IRES-GFP of een controle vector over een totale beeldperiode van 12 uur. ( B ) Representatieve sporen met 1 uur intervalresolutie van migrerende GFP-positieve neuronen in E16.5-snijculturen uit Bcl11a- flox / flox- hersenen die op E14.5 met Cre-IRES-GFP of een controle vector worden gecoördineerd over de totale beeldvormingsperiodes vanTot 22 uur. Bcl11a mutante neuronen ondergaan vaak herhalende fasen van verminderde migratie snelheid en willekeurig veranderde oriëntatie (gemarkeerd met rode pijlpunten). ( C ) Snelheids profielen berekend uit sporen van migrerende neuronen, zoals getoond in B. ( DE ) Kwantificering van snelheid ( D ) en afwijkingshoek van radiale oriëntatie ( E ) van migrerende GFP positieve neuronen in E16.5 snijculturen van Bcl11a flox / flox Hersenen die op E14.5 geëmoporeerd zijn met Cre-IRES-GFP of een controle vector (n = 15). Gemiddelde ± sem; Student t-test; *** p <0.001. Schaalbalk = 10 μm. Reprinted van Wiegreffe et al. 10 met toestemming van Elsevier. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Radiale migratie is een sleutelproces in de ontwikkeling van neocortex. Mutaties in genen die verschillende stappen van dit proces beïnvloeden, kunnen ernstige corticale misvormingen veroorzaken, waaronder lissencephalie en white matter heterotopia 1 , 2 . We hebben onlangs aangetoond dat Bcl11a, die uitgedrukt wordt in jonge migrerende corticale projectie-neuronen, een rol speelt in radiale migratie. Wij gebruiken confocal beeldvorming van migrerende neuronen in acute corticale schijfjes van elektroporeerde hersenen, om direct te demonstreren dat genetische deletie van Bcl11a bij migrerende neuronen polarisatie en migratie defecten veroorzaakt. Time-lapse-series werden gebruikt om migratiepaden van individuele neuronen te traceren en specifieke parameters van migrerende neuronen te berekenen, waaronder snelheidsprofielen, gemiddelde migratieresultaten en migratierichting 10 .

Dit protocol beschrijft een belangrijke aanpak bij het bestuderen van molecuulR mechanismen bij radiale migratie. Door gebruik te maken van korte haarspeld RNA of DNA expressie plasmiden, kan bijna elk gen van belang worden gesloopt of overexpresseerd, respectievelijk. Het is een krachtige aanpak om elektroporatie te combineren met het Cre-LoxP systeem. Transfectie van hersenen van conditional mutant ("floxed") muizen met Cre recombinase genereert een mosaïsche mutant situatie en laat selectieve analyse van single mutant neuronen die omringd worden door wild-type cellen. Op deze manier kunnen cel-autonome moleculaire mechanismen in migrerende neuronen worden onderzocht. Ook functionele reddingsexperimenten worden gemakkelijk uitgevoerd. Het voorbereiden van time-lapse serie elektroporate hersenplakken maakt het mogelijk om migrerend gedrag van single migrerende neuronen dynamisch te analyseren, wat veel meer informatie biedt dan bij vaste hersensecties kan worden verkregen. Bij utero electroporation vereist 3 , 4 initiële training maar - eenmaal beheerd - is aSnelle en eenvoudige techniek om neuronen van de cerebrale cortex in vivo reproduceerbaar te transfecteren. In het protocol dat hier wordt beschreven, hebben we gebruik gemaakt van utero electroporation bij E14.5, wanneer geboren bovenste laag neocortische projectie neuronen geboren worden. Voor de studie van vroeg-geboren dieplaagprojectie moeten neuronen in utero electroporation worden uitgevoerd op eerdere ontwikkelingsfase ( dwz E12.5) 13 . In principe kan het protocol ook worden gebruikt om migratie van andere neuronale subpopulaties in de hersenen te bestuderen die met elektroporatie kunnen worden getransfecteerd, inclusief migratie van interneuronen 14 en cerebellaire korrelcellen 15 .

Het snijcultuurprotocol dat we beschrijven is aangepast aan Polleux en Gosh 12 en eerder hebben we het gebruikt voor ex- electroporation 16 , 17 om te studerenDy hippocampale ontwikkeling. Belangrijker nog, de hersenschijfjes moeten zorgvuldig gehanteerd worden om de levensvatbaarheid ervan te handhaven. We maken gebruik van een omgekeerde microscoop en glasbakken van optische kwaliteit om de plakcultuur die op een celcultuurinzet staat te bekijken. Deze configuratie is erg makkelijk op te stellen en staat steriele omstandigheden toe, omdat het doel nooit in contact komt met de plakcultuur of het medium. Echter, lange werkafstandsdoelstellingen (> 2 mm) met een voldoende hoge numerieke diafragma (0,6 of hoger) zijn vereist. Andere studies hebben de hersenschijf direct op de glazen bodem geplaatst en een collageenmatrix 18 , 19 gebruikt om de slice op zijn plaats te maken, waardoor het gebruik van doelstellingen mogelijk is met een kortere vrije werkafstand. Echter, het gebruik van celkweekinzetten zorgt voor makkelijke verwerking, reproduceerbare resultaten, en stelt de onderzoeker in staat om de plakjes 1 tot 2 dagen na hun voorbereiding zonder coMpromising levensvatbaarheid van de hersenschijf (gegevens niet getoond). Een ander kritisch probleem betreft het schade aan de snijden door laserlicht. We hebben een zeer gevoelige hybride detector gebruikt, waardoor we de laservermogen tot een minimum kunnen verminderen, terwijl we nog steeds voldoende fluorescente signalen verkrijgen voor tijdladingbeelden. Het gebruik van multiphoton-beeldvorming zou de fotodamage verder verminderen en zou leiden tot een dieper weefselpenetratie, evenals efficiëntere lichtdetectie in vergelijking met conventionele confocale microscopie.

Ondanks zijn bruikbaarheid om neuronale migratie te bestuderen, heeft het protocol beperkingen en kan de situatie van migrerende neuronen in de intakte hersenen niet volledig behouden worden. Extracellulaire matrix, de lijmintercellulaire contacten en de vasculatuur in de migrerende zone kunnen dynamisch invloed hebben op radiaal migrerende neuronen 20 , 21 . Specifiek zijn de bovenlaagse neuronen afhankelijk van langwerpige radiale gliale processen voorHun migratie 22 . Voor succesvolle beeldvorming is het daarom belangrijk om hersenschijfjes te selecteren met GFP elektroporateerde radiale glialcellen die hun processen uitbreiden door de hele corticale breedte. 'Oblique slices', waarin het radiale glial steiger is afgesneden voordat het pale oppervlak van de hersenen bereikt wordt, moet verwijderd worden van verdere analyse. Soms kan de celdood optreden bij het luchtoppervlak van de hersenschijf, waardoor de opname van een beeld naar een dieper gebied binnen het monster beperkt wordt. Elektroporateerde neuronen in gekweekte breinschijfjes kunnen minder efficiënt migreren in vergelijking met electroporeerde neuronen in vivo , die kan worden veroorzaakt door onvoldoende herstel van de bereiding. Dit vereist analyses van multiple slice culturen voor zowel experimentele als controlesituaties, en kritische interpretatie van representatieve datasets. In sommige gevallen de beledigingen geassocieerd met in utero elektroporatie kan embryonale sterfte of structurele alterat veroorzakenIonen van de hersenen, met inbegrip van vergrote ventrikels, asymmetrisch verdunde cortex, of een gliale littekenvorming als gevolg van DNA-injectie. In die gevallen moet het monster worden verwijderd uit verdere analyse.

Terwijl hersenschijfjes van embryonale donoren goed overleven op membraan inserts 23 , zijn analyses beperkt tot vroege ontwikkelingsgebeurtenissen, waaronder neuronale migratie, en we hebben het niet gebruikt om latere gebeurtenissen te bestuderen, zoals dendrietontwikkeling of synaptogenese. Samengevat geven we een gedetailleerd protocol voor het direct en dynamisch bestuderen van neuronale migratie van elektroporate neuronen in segmentkulturen, die gemakkelijk kunnen worden aangepast om functies van genen die betrokken zijn bij neurodevelopmentale aandoeningen te analyseren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

We danken Jacqueline Andratschke, Elena Werle, Sachi Takenaka en Matthias Toberer voor uitstekende technische bijstand, evenals Victor Tarabykin voor nuttige discussies. Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​van de Deutsche Forschungsgemeinschaft aan SB (BR-2215).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
isoflurane Abbott Laboratories  506949 Forene
6-well plate Corning 351146
12-well plate Corning 351143
non-absorbable surgical suture Ethicon K890H 3/8 circle, 13 mm, taper point
Micro Adson Forceps Fine Science Tools 11018-12 serrated, length: 12 cm
fine scissors Fine Science Tools 14063-09 angled to side, length: 9 cm
Mathieu Needle Holder Fine Science Tools 12510-14 tungsten carbide, length: 14 cm
fine tipped forceps Fine Science Tools 11370-40 straight, 11 cm
Vannas Tübingen Spring Scissors Fine Science Tools 15005-08 angled up, 9.5 cm
ring forceps Fine Science Tools 11103-09 OD: 3mm, ID, 2.2 mm, length: 9 cm
HBSS (10X) Gibco 14180046
L-Glutamine Gibco 25030081
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140122
horse serum Gibco 26050088
BME Gibco 41010026
borosilicate glass capillaries Harvard Apparatus 30-0016 1.0 OD x 0.58 ID x 100 L mm
anesthsesia system Harvard Apparaus 72-6471
anesthetizing chamber Harvard Apparaus 34-0460
fluosorber filter canister Harvard Apparaus 34-0415
low melting point agarose Invitrogen 16520100
vibrating blade microtome Leica VT1200 S
fluorescence stereo microscope Leica M205 FA
stereo microscope Leica M125
inverted fluorescence tissue culture microscope Leica DM IL LED
confocal laser scanning microscope Leica TCS SP5II
hybrid detector Leica HyD
objective, 40x/0.60 NA Leica 11506201
microscope temperature control system Life Imaging Services Cube, Brick & Box
cell culture insert Millipore PICM0RG50
microgrinder Narishige EG-45 use 38° angle for beveling
microinjector Parker Hannifin  052-0500-900 Picospritzer III
carprofen Pfizer Animal Health NDC 61106-8507 Rimadyl
emdedding mold Polysciences 18986-1
endotoxin-free plasmid maxi kit Qiagen 12362
fast green Sigma F7252
laminin Sigma L2020
poly-L-lysine Sigma P5899
HEPES Sigma H4034
D-glucose Sigma G6152
calcium chloride Sigma C7902
magensium sulfate Sigma M2643
sodium bicarbonate Sigma S6297
square wave electroporator Sonidel CUY21EDIT
tweezers with 5 mm platinum disk electrodes Sonidel CUY650P5
micropipette puller Sutter Instrument P-97
box filament Sutter Instrument FB255B 2.5 mm x 2.5 mm
micro-spoon spatula VWR 231-0191 185 mm x 5 mm
glass bottom dish, 50 mm World Precision Instruments FD5040-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Evsyukova, I., Plestant, C., Anton, E. S. Integrative mechanisms of oriented neuronal migration in the developing brain. Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 299-353 (2013).
  2. Kwan, K. Y., Sestan, N., Anton, E. S. Transcriptional co-regulation of neuronal migration and laminar identity in the neocortex. Development. 139, (9), 1535-1546 (2012).
  3. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, (1), 237-246 (2001).
  4. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, (4), 865-872 (2001).
  5. LoTurco, J. J., Bai, J. The multipolar stage and disruptions in neuronal migration. Trends Neurosci. 29, (7), 407-413 (2006).
  6. Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7, (2), 136-144 (2004).
  7. Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 23, (31), 9996-10001 (2003).
  8. Pacary, E., et al. Proneural transcription factors regulate different steps of cortical neuron migration through Rnd-mediated inhibition of RhoA signaling. Neuron. 69, (6), 1069-1084 (2011).
  9. Tabata, H., Nagata, K. Decoding the molecular mechanisms of neuronal migration using in utero electroporation. Medical Molecular Morphology. 49, (2), 63-75 (2016).
  10. Wiegreffe, C., et al. Bcl11a (Ctip1) Controls Migration of Cortical Projection Neurons through Regulation of Sema3c. Neuron. 87, (2), 311-325 (2015).
  11. John, A., et al. Bcl11a is required for neuronal morphogenesis and sensory circuit formation in dorsal spinal cord development. Development. 139, (10), 1831-1841 (2012).
  12. Polleux, F., Ghosh, A. The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development. Sci STKE. (136), pl9 (2002).
  13. Greig, L. C., Woodworth, M. B., Galazo, M. J., Padmanabhan, H., Macklis, J. D. Molecular logic of neocortical projection neuron specification, development and diversity. Nat Rev Neurosci. 14, (11), 755-769 (2013).
  14. De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. Subtype-selective electroporation of cortical interneurons. J Vis Exp. (90), e51518 (2014).
  15. Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. J Vis Exp. (85), (2014).
  16. Venkataramanappa, S., Simon, R., Britsch, S. Ex utero electroporation and organotypic slice culture of mouse hippocampal tissue. J Vis Exp. (97), (2015).
  17. Simon, R., et al. A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis. EMBO J. 31, (13), 2922-2936 (2012).
  18. Youn, Y. H., Pramparo, T., Hirotsune, S., Wynshaw-Boris, A. Distinct dose-dependent cortical neuronal migration and neurite extension defects in Lis1 and Ndel1 mutant mice. J Neurosci. 29, (49), 15520-15530 (2009).
  19. Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O., Pearlman, A. L. Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex. Nat Neurosci. 4, (2), 143-150 (2001).
  20. Higginbotham, H., Yokota, Y., Anton, E. S. Strategies for analyzing neuronal progenitor development and neuronal migration in the developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 21, (7), 1465-1474 (2011).
  21. Stubbs, D., et al. Neurovascular congruence during cerebral cortical development. Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i32-i41 (2009).
  22. Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. Trekking across the brain: the journey of neuronal migration. Cell. 128, (1), 29-43 (2007).
  23. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics