Time-lapse-konfokalbildning av migrerande neuroner i organotypisk skivkultur av embryonalt mushinne

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Detta protokoll tillhandahåller instruktioner för direkt observation av radiellt migrerande kortikala neuroner. I uteroelektrering , organotypisk skivkultur och tidsförlust konfokal bildbehandling kombineras för att direkt och dynamiskt studera effekterna av överuttryck eller nedreglering av gener av intresse för migrerande neuroner och att analysera deras differentiering under utveckling.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (125), e55886, doi:10.3791/55886 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

I utero elektroporation är ett snabbt och kraftfullt sätt att studera processen för radiell migrering i hjärnbarken för att utveckla musembryon. Det har hjälpt till att beskriva de olika stegen av radiell migration och karakterisera de molekylära mekanismerna som styr denna process. För att direkt och dynamiskt analysera migrerande neuroner måste de spåras över tiden. Detta protokoll beskriver ett arbetsflöde som kombinerar uteroelektroporation med organotypisk skivkultur och tidsförlust konfokal bildbehandling, vilket möjliggör en direkt undersökning och dynamisk analys av radiellt migrerande kortikala nervceller. Vidare är detaljerad karakterisering av migrerande neuroner, såsom migrationshastighet, hastighetsprofiler, samt radial orienteringsändringar möjliga. Metoden kan lätt anpassas för att utföra funktionella analyser av gener av intresse för radiellt migrerande kortikala neuroner genom förlust och förstärkning av funktion samt räddningsexperiment. Time-lapseAvbildning av migrerande neuroner är en toppmodern teknik som en gång etablerad är ett kraftfullt verktyg för att studera utvecklingen av hjärnbarken i musmodeller av neuronal migrationsstörningar.

Introduction

Neocortex är den huvudsakliga platsen för kognitiva, känslomässiga och sensorimotoriska funktioner. Den består av sex horisontella lager orienterade parallellt med hjärnans yta. Under utveckling ger progenitorceller i dorsaltelencephalonens sidovägg upphov till projiceringsneuroner som migrerar radiellt mot pialytan och förvärvar en lagstypsspecifik neuronal identitet. Efter att de har genererats i de ventrikulära / subventrikulära zonerna (VZ / SVZ) blir dessa neuroner övergående multipolära och saktar deras migrering. Efter en kort vistelse i mellansektionen (IZ) växlar de till en bipolär morfologi, fäster vid den radiella glialställningen och fortsätter radiellt orienterad migration i kortikalplattan (CP). När de når sin slutliga målprojektion avlägsnas neuroner från de radiella glialprocesserna och förvärvar lagsspecifik identitet. Mutationer i gener som påverkar olika steg av neuronal migration kan orsaka allvarlig kortikal missbildning, såsom lissencEphaly eller vit substans heterotopia 1 , 2 .

I utero elektroporation är en snabb och kraftfull teknik för att transfektera neurala stamceller i den utvecklande hjärnan av gnagareembryon 3 , 4 . Med denna teknik är det möjligt att knockdown och / eller överuttrycka gener av intresse för att studera sina funktioner för att utveckla neuroner. Denna metod har specifikt hjälpt till att beskriva de morfologiska detaljerna och karaktärisera de molekylära mekanismerna för processen med radiell migration 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Radiellt migrerande neuroner genomgår dynamiska förändringar i cellform, migrationshastighet och migrerande riktning, vilket kräver direkt och kontinuerlig observation över tiden. Organotypisk skivkultuRe och time-lapse konfokal avbildning av elektroporerade hjärnor möjliggör direkt observation av migrerande neuroner över tiden. Genom att använda detta kombinerade tillvägagångssätt är det möjligt att analysera olika egenskaper hos migrerande neuroner som inte kan undersökas i fasta vävnadssektioner av elektroporerade hjärnor.

Vi tillämpade nyligen tidsförlust konfokal bildbehandling av migrerande neuroner i skivkulturer av elektroporerade hjärnor för att studera rollen av transkriptionsfaktorn B-cell CLL / lymfom 11a (Bcl11a) under kortikal utveckling 10 . Bcl11a uttrycks i unga vandrande kortikala neuroner och vi använde en villkorad mutant Bcl11a allelen (Bcl11a flox) 11 för att studera dess funktioner. Elektroporation av Cre rekombinas tillsammans med grönt fluorescerande protein (GFP) i kortikala förfäder av Bcl11a flox / flox hjärnor gjorde det möjligt för oss att skapa en mosaikmutant situation där endast få celler muteras i enAnnars vildtypsbakgrund. På detta sätt var det möjligt att studera cell-autonoma funktioner av Bcl11a vid encellsnivå. Vi fann att Bcl11a-mutantneuroner visar reducerad hastighet, skift i deras hastighetsprofiler, liksom slumpmässiga orienteringsändringar under deras migrering 10 . I det beskrivna protokollet beskriver vi ett arbetsflöde för framgångsrik elektroporering och skivkulturspreparation 12 av mushår, såväl som tidsförlust konfokal bildbehandling av kortikala skivkulturer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla försöksförfaranden godkändes av djurskyddskommittén (Regierungspräsidium Tübingen) och genomfördes enligt tysk djurskyddslagen och EU-direktiv 2010/63 / EU.

1. I Utero Electroporation

  1. Mikroinjektionsnålar
    1. Dra ut borosilikatglaskapillärer (yttre diameter: 1,0 mm, innerdiameter: 0,58 mm, längd: 100 mm) i mikroinjektionsnålar med hjälp av en mikropipettdragare med en lådfilament (2,5 mm x 2,5 mm) och följande program: Värme: 540, PULL : 125, VELOCITY: 20, och DELAY: 140. Bestäm värmevärdet för varje enskilt filament genom att utföra ett RAMP-test (värmevärde: RAMP + 25).
    2. Stångnålar i en vinkel på 38 ° och mellanliggande till hög varvtal med mikrogrinder för att få en spetsstorlek på 20 till 30 μm för injektion vid embryonal dag (E) 13,5 eller yngre och 30 till 40 μm för injektion vid äldre embryoniskastadier. För förvaring, fixa nålar i en låda eller petriskål med modelleringslera för att förhindra skador på spetsarna.
  2. Plasmid DNA-lösning
    1. Förbered plasmid-DNA-konstruktion innehållande fluorescerande reporterprotein ( t.ex. GFP) med användning av ett endotoxinfritt maxi-preparatpaket enligt tillverkarens instruktioner.
    2. Späd plasmid-DNA-lösningen till en slutlig koncentration av 1-2 μg / μl i endotoxinfri Tris-EDTA-buffert innehållande Fast Green vid en slutlig koncentration av 0,01%. Aliquot-lösning och lagra vid -20 ° C.
  3. Bakteriostatisk natriumkloridlösning
    1. Förbered bakteriostatisk natriumkloridlösning genom att tillsätta bensylalkohol till en slutlig koncentration av 0,9% till isotonisk 0,9% natriumkloridlösning. Steril filterlösning omedelbart före användning.
  4. Carprofen Injection Solution
    1. Beredning av carprofen injektionslösning avTillsätter karprofen till en slutlig koncentration av 0,5 mg / ml till steril isotonisk 0,9% natriumkloridlösning. Förvara vid 4 ° C i upp till 28 dagar.
  5. Narkos, DNA-injektion och elektroporation
    1. Väg en E14.5 timed-gravid mus och placera den i en transparent bedövningsmedelskammare ansluten till en förångare och mättad med 5% isofluran. När djuret är medvetslöst, överför det till en bedövningsmask som är fäst på en 37 ° C värmeplatta och håll den bedövad med 1,8-2,2% isofluran.
      Anm .: Utvärdera utvecklingen av kirurgisk anestesi genom förlust av svansniv och pedalreflexer (tånklämning).
    2. För analgesi injicera 100 μl karprofen injektionslösning per 10 mg muskroppsvikt (5 mg / kg kroppsvikt) subkutant. Vrid musen med den nedåt och försiktigt täcka ögonen med petroleumjelly för att förhindra att de torkar.
    3. Sprid försiktigt ut extremiteterna och fixa demTill uppvärmningsplattan med kirurgisk tejp. Sterilisera buken med 70% etanol följt av jodlösning (7,5 mg / ml) med användning av cellulosapabbar. Upprepa denna procedur tre gånger för att säkerställa korrekt desinfektion.
    4. Täck över buken med sterilt gasbind, där ett snitt har klippts för att spara ett fält (diameter: 2 - 2,5 cm) för bukhålen. Fuktar gasbindningen med bakteriostatisk natriumkloridlösning.
      Varning: Undersök utvecklingen av kirurgisk anestesi genom förlust av pedalreflexen.
    5. Med hjälp av Micro Adson Forceps (serrated, längd: 12 cm) och fin sax (vinklad till sida, längd: 9 cm) skär huden cirka 1,5 cm längs mitten av buken. Klipp den underliggande muskeln längs linjen alba.
    6. Ta bort ett livmoderhorn med ringpincett (längd: 9 cm, ytterdiameter: 3 mm, innerdiameter: 2,2 mm) och lägg den försiktigt på den fuktiga gasbindan.
      Varning: Håll livmoderhornet med ringpincett bara mellan embryonerna anD stör inte moderkaken eller några försörjningsfartyg. Håll livmodern fuktig hela tiden med bakteriostatisk natriumkloridlösning.
    7. Placera försiktigt ett embryo med ringpincett och lokalisera lateral ventrikel, som presenterar som en halvmåneformad skugga parallell med sagittal sinus. Injektionsstället ligger ungefär i mitten av en linje mellan det pigmenterade ögat och sammanfogningen av bihålor, där sagittal sinus grenar sig till två tvärgående bihålor. Tryck in mikroinjektionsnålen genom livmodern och in i lateral ventrikel.
      Obs! Om nödvändigt kan injektionsdjupet korrigeras genom att nålen sugs tillbaka.
    8. Injicera 1 till 2 μl DNA-lösning i sidoventilen med en mikroinjektor, som drivs med en fotpedal, med följande inställningar: 25 psi, 10 till 20 ms per puls och 5 till 10 pulser. Framgångsrik injektion kan övervakas med den färgade DNA-lösningen, vilken ska fylla ventrikulärsystemet.
    9. Placera pincett-typ elektroder (3 mm diameter för E13.5 eller yngre och 5 mm diameter för E14.5 eller äldre) på så sätt att den positiva terminalen ligger på samma sida som den injicerade ventrikeln och den "negativa" Terminalen ligger på motsatt sida av den injicerade ventrikeln under öron av embryonets huvud.
    10. Fukta elektroporeringsstället med några droppar bakteriostatisk natriumkloridlösning och använd 5 elströmspulser (35 V för E13.5 eller yngre och 40 V för E14.5 eller äldre) med 50 ms varaktighet med 950 ms mellanrum.
      Obs! Strömmar på 60 till 90 mA är vanligtvis tillräckliga för framgångsrik elektroporation. Lägre strömmar kommer inte effektivt att transfektera neuroner, medan högre strömmar kan leda till embryonal död.
    11. Upprepa proceduren (se steg 1.5.7 till 1.5.10.) För varje embryo i livmoderhornet och lägg det försiktigt in i bukhålan.
    12. Ta bort livmoderhornet från andra sidan och upprepa procEdur beskriven i steg 1.5.7. Till 1,5.11.
    13. Stäng bukhålan genom att suturera muskelskiktet innan du suturerar huden med Micro Adson Forceps, Mathieu Needle Holder (volframkarbid, längd: 14 cm) och icke-absorberande kirurgisk sutur (3/8 cirkel, 13 mm, avsmalnande punkt).
      Varning: Var försiktig så att du inte fånga livmodern eller andra organ under suturen.
    14. Desinficera huden sutur med jodlösning (7,5 mg / ml) och försiktigt avlägsna periokulärt överskott av petroleumgel genom att använda cellulosapabbar. Placera musen under en infraröd lampa tills den vaknar. Övervak ​​musen noga under de närmaste två dagarna. Upprepa analgesi-behandlingen som beskrivs i steg 1.5.2 efter 12 till 24 timmar.

2. Organotypisk Slice Culture

  1. Laminin Stock Solution
    1. Lös 1 mg lyofiliserat laminin i sterilt vatten för att erhålla en 1 mg / ml laminin stamlösning. Förbered 50 μl alikvoter aNd butik vid -80 ° C.
  2. Poly-L-Lysin Stock Solution
    1. Lös 50 mg poly-L-lysin i sterilt vatten för att erhålla en 1 mg / ml poly-L-lysin stamlösning. Framställ 0,5 ml alikvoter och förvara vid -20 ° C.
  3. Komplett Hank Balanced Salt Solution (Complete HBSS)
    1. Förbered fullständig HBSS genom att kombinera 50 ml 10x HBSS-lösning, 1,25 ml 1 M HEPES-buffert (pH 7,4), 15 ml 1 M D-glukoslösning, 5 ml 100 mM kalciumkloridlösning, 5 ml 100 mM magnesiumsulfat Lösning och 2 ml 1 M natriumvätekarbonatlösning. Tillsätt sterilt vatten upp till 0,5 liter sterilt filter och förvara vid 4 ° C.
  4. Slice Culture Medium
    1. Kombinera 35 ml Basal Medium Eagle (BME), 12,9 ml komplett HBSS (se avsnitt 2.3.1), 1,35 ml 1 M D-glukos, 0,25 ml 200 mM L-glutamin och 0,5 ml penicillin-streptomycin till Erhålla 50 ml skivodlingmedium. Sterilt filter och tillsätt hästserum till en slutlig koncentration av 5%. Förvara vid 4 ° C i upp till 4 veckor.
  5. Agaroslösning med låg smältpunkt (LMP)
    1. Förbered 3% LMP-agaroslösning genom att lösa 1,5 g LMP-agaros i 50 ml fullständigt HBSS genom uppvärmning i en mikrovågsugn i 1 till 2 min vid mellankraft.
      Obs! Övervaka värmen försiktigt för att förhindra överflöde under kokning.
    2. Placera lösningen i ett vattenbad vid 38 ° C tills det är färdigt att använda. Förvara vid 4 ° C och återanvänd en gång.
  6. Beläggning av membraninsatser
    1. Lägg till en alikvot av lamininlagerlösning (cf Steg 2.1.1.) Och en alikvot av poly-L-lysin-stamlösning (cf Steg 2.2.1) till 6 ml sterilt vatten för att erhålla beläggningslösning (tillräckligt för 6 insatser) .
    2. Placera membraninsatser i en 6-brunnsplatta innehållande 2 ml sterilt vatten i botten av varje brunn. Tillsätt 1 ml beläggningslösning(Se steg 2.6.1) ovanpå varje membran och inkubera över natten vid 37 ° C och 5% koldioxidatmosfär.
      Obs! Använd endast insatser med optiskt tydliga membran, såsom polytetrafluoretylen (PTFE) membran.
    3. Tvätta membran tre gånger med 1 ml sterilt vatten och torka. Använd belagda membran samma dag eller lagra i en ren 6-brunnsplatta vid 4 ° C i upp till fyra veckor.
  7. Hjärndissektion och inbäddning
    1. Två dagar efter elektroporation placerar musen i en transparent kammare ansluten till en förångare och mättad med 5% isofluran. När djuret är medvetslöst, avlägsna det från kammaren och offra det genom cervikal dislokation.
    2. Ta bort livmodern som innehåller embryon och placera den i en 10 cm petriskål med iskall komplett HBSS.
      Obs! Från och med denna tid behåll alla lösningar, embryon och hjärnor på is.
    3. Använd ett stereomikroskop, fint tippade tångar (rakt,11 cm) och ett par Vannas Tübingen Vårsaxar (vinklat upp, längd: 9,5 cm) för att separera varje embryo från livmodern och överföra det till en annan petriskål som innehåller iskall komplett HBSS.
    4. Gör ett snitt på nivån av hjärnstammen och skär längs sagittala mittlinjen. Skala bort huden och brosket som täcker hjärnan. Därefter avskurna hjärnstammen strax bakom hemisfärerna och ta bort hjärnan från skallen. Överför hjärnan med en mikroskedspatel (185 mm x 5 mm) till en 12-brunnsplatta innehållande iskall komplett HBSS. Samla alla hjärnor från kullen i 12-brunnsplattan.
    5. Använd ett fluorescerande stereomikroskop för att skärma hjärnorna i 12-brunnsplattan för fluorescens-ljusstyrka såväl som storleken på den elektroporerade regionen. Välj 2 till 4 hjärnor med ljusa fluorescerande signaler i presumptiv somatosensory cortex för vidare behandling.
    6. Häll 3% LMP-agaroslösning hållen vid 38 ° C i avlägsnande engångsinbäddningsform. AvtagbarE-hjärnan från 12-brunnsplattan med en mikroskedspatel och dränera försiktigt överskott av HBSS runt hjärnan med fint tissuepapper.
    7. Placera hjärnan försiktigt i agaroslösningen, tryck den på botten av formen och försiktigt justera positionen med en 20-gauge nål. För koronala sektioner, orientera hjärnan med olfaktoriska glödlampor som pekar uppåt. Håll formen på is tills agaroslösningen stelnar och fortsätt med att sneda hjärnan.
  8. Vibratomavsnitt och skivkultur
    1. Ta bort agarosblocket från formen och placera det på locket på en steril petriskål. Torka bort överskott av agaros med ett rent rakblad som lämnar ca 2 till 3 mm under olfaktoriska glödlampor och 1 mm agaros på andra sidor. Fixa det trimmade agarosblocket med olfaktoriska glödlampor som pekar nedåt till ett provsteg med användning av cyanoakrylatlim.
      Anm .: Sterilisera instrument och utrustning med 70% etanolL före snittning.
    2. Överför provsteget till skivkammaren i ett vibrerande bladmikrotom innehållande iskallt komplett HBSS och placera hjärnan med sin dorsala sida mot bladet. Skär 250 μm tjocka hjärnskivor innehållande det elektroporerade området med en låg till måttlig amplitud på 0,9 mm och en mycket långsam snitthastighet på 0,09-0,12 mm / s. Vanligtvis erhålls 4 till 6 skivor med ljus fluorescerande signal från varje framgångsrikt elektroporerad hjärna.
    3. Med en böjd mikroskedspatel och fint tippade tångar, överför försiktigt hjärnskivorna med den omgivande agarosen till en 6-brunnskiva med iskall komplett HBSS.
      Varning: Var försiktig så att du inte skadar hjärnvävnaden genom att bara röra agarosfälgen runt sektionerna med tången under överföringen.
    4. Bearbeta alla valda hjärnor som beskrivs i steg 2.8.1. Till 2.8.3.
    5. Fuktar membraninsatserna med 100 | il av fullständig HBSS innan du placerar hjärnans slSkar på membranen för att underlätta positionering av skivorna. Upp till 5 skivor kan placeras på 1 membraninsats.
    6. Överför skivorna försiktigt till membranen med en böjd mikroskedspatel och fint tippade tångar. Dra försiktigt en skiva på spateln genom att bara vidröra agarosfälgen med tången och tryck försiktigt skivan från spateln på membranet. Placera skivan med tang och fortsätt att överföra de resterande skivorna. Ta bort överskott av fullständigt HBSS med pipett.
      Obs! Överla inte skivorna med varandra.
    7. Med hjälp av tångar placeras membraninsatserna med skivorna i en 6-brunnsplatta innehållande 1,8 ml skivodlingsmedium (cf Steg 2.4.1.) Och inkuberas vid 37 ° C och 5% koldioxidatmosfär tills tidsfördröjning avbildning.

3. Time-Lapse Imaging

  1. Microscope Setup
    1. Sätt en klimakammare placerad på scenen av enInverterat konfokalmikroskop till 37 ° C och 5% koldioxidatmosfär. Använd en hybriddetektor för att minska laserintensiteten och förbättra cellens livskraft. För detaljerad analys, använd ett extra långt arbetsdistans 40X torrt mål med en numerisk bländare på 0,6 eller högre.
      Obs! Alla komponenter i mikroskopet måste förvärmas till 37 ° C i 2-3 timmar före bildbehandling för att ge ett stabilt fokus under bildbehandling.
  2. Slice Imaging
    1. Välj en hjärnskiva för avbildning från 6-brunnsplattan som innehåller membraninsatserna med hjälp av ett inverterat fluorescensmikroskop.
      Varning: Undvik långvarig exponeringstid för ultraviolett ljus eftersom detta kan orsaka cellulär fotodamage.
      Obs! Välj en skiva med ljusa enkla neuroner i den övre SVZ som migrerar radiellt mot skivans yta. Fina fluorescerande processer av radiella glialceller som spänner över hela CP indikerar ett intakt radialt glialställ som användsD genom att radiellt migrera kortikala nervceller.
    2. Överför membraninsatsen med skivan, som valdes för tidsfördröjning av bildskärm, i en glasskål med 50 mm diameter innehållande 2 ml skivodlingsmedium med hjälp av pincett. Placera disken i klimatkammaren i konfokalmikroskopet.
    3. Ställ upplösningen till 512 med 512 pixlar och öka skanningshastigheten från 400 Hz till 700 Hz för att öka bildhastigheten från ca 1,4 till cirka 2,5 bilder per sekund. Använd inte mer än två gånger medelvärdet. Definiera en z-stack genom det elektroporerade området (vanligtvis 400-100 μm) med en stegstorlek på 1,5 μm. Sammantaget möjliggör dessa inställningar en tillräcklig upplösning och ljusstyrka på bilden samtidigt som fotodamaget är lågt under förvärvet. Starta time-lapse-serien genom att ta en z-stack varje 30 min.
      Obs: Lång exponering av skivan till laserljuset kommer att inducera fotodamage som minskar cellernas livskraft. Justera expOsurstid till laserljus i enlighet därmed.
    4. Analysera time-lapse-serien med hjälp av ImageJ-programvaran (https://imagej.nih.gov/iij/) eller motsvarande.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tidigare har vi visat att genetisk deletion av Bcl11a genom uteroelektroporation försvårar radiell migrering av senfödda övre skiktprojektionsneuroner 10 . Elektroporation av en DNA-plasmidvektor innehållande Cre-IRES-GFP effektivt borttaget Bcllla i betingade Bcl11a flox / flox- hjärnor 11 . När vi analyserade E14.5 elektroporerade hjärnor tre dagar efter elektroporationen hade de flesta kontrollneuroner migrerade in i CP, medan många Bcl11a-mutantneuroner stallades längs migrationsvägen i IZ och VZ / SVZ. Dessutom fann vi en ökning av antalet multipolära celler på bekostnad av bipolära celler specifikt i IZ vid Bcllla- deletion som föreslår defekter vid polarisation 10 .

Att analysera migra direkt och dynamisktTory-beteendet hos Bcl11a- mutanta neuroner använde vi tidsförlust konfokal avbildning av migrerande neuroner i organotypisk skivkultur framställd av elektroporerade hjärnor. Översikt time-lapse-serien med ett 10X-objekt med en numerisk bländare på 0,4 bekräftade våra resultat, att Bcl11a-mutantprojektionsneuroner har defekter i radiell migrering. Inom 36 timmar hade många kontrollneuroner migrerat in i CP, medan endast få Bcl11a-mutantneuroner hade lämnat IZ och migrerade in i CP. Intressant tycktes det tyckas att många Bcl11a- mutanta neuroner inte migrerade direkt mot hjärnans pialyta, men saktade migrering och vände tangentiellt eller till och med tillbaka mot ventrikeln (Film 1). För att ytterligare analysera dessa fynd genererade vi time-lapse-serier vid högre förstoring med ett 40x-objekt med en numerisk bländare på 0,6. Våra data visar att Bcl11a-mutantneuroner misslyckades att effektivt polarisera och fortsätta radiellt orienterad migratJon i CP. Inom 12 h misslyckades många Bcl11a-mutantneuroner från att växla från en multipolär till en bipolär morfologi och projicerade istället och drog in många processer i omgivningen (Film 2, Figur 1A ).

Dessutom spårade vi migrationsvägarna för enskilda neuroner i olika tidsförloppsserier och använde dessa för att beräkna specifika parametrar för migrerande neuroner. Vi fann att Bcl11a-mutantneuroner repetitivt genomgår faser med flera timmars varaktighet med minskad migrationshastighet och slumpmässiga orienteringsändringar (Film 3, Figur 1B , röda pilhuvuden). I synnerhet skiftades hastighetsprofilen för Bcl11a-mutantneuroner från högre hastighet (25 pm / h) mot lägre hastighet (5 | im / h) i jämförelse med kontrollneuroner ( Figur 1C ). I linje med detta, den totala migrationshastigheten för Bcl11En mutant neuron reducerades signifikant från 10,34 ± 0,34 μm / h i kontroller till 6 ± 0,54 μm / h (p = 2,4889E-05) ( Figur 1D ). Slutligen ökade avvikelsen från riktad migrering mot hjärnans pialyta avsevärt från 17,15 ± 2,13 ° i kontroll till 40,16 ± 4,42 ° i Bcl11a-mutantneuroner (p = 0,0002) ( Figur 1E ). Tillsammans visar dessa resultat att tidsförlust konfokal avbildning av GFP elektroporerade neuroner i organotypisk skivkultur är en värdefull metod att studera molekylära mekanismer som styr processen för neuronal migration.

Film 1
Film 1: Migration av GFP-märkt kontroll i jämförelse med Bcl11a Mutant Neurons i korta skivor. Bcl11a flox / flox hjärnor valdes elektroporerade vidE14.5 med en plasmidvektor innehållande IRES-GFP (A) eller Cre-IRES-GFP (B) och skivkulturer framställdes vid E16.5. VZ / SVZ; Ventrikulära / subventrikulära zoner; IZ, mellanzon; CP, kortikalplatta. Skalstång = 100 μm. Filmen består av 108 ramar med en hastighet av 5 bilder / s. Reprinted från Wiegreffe et al. 10 med tillstånd från Elsevier. Vänligen klicka här för att se den här videon. (Högerklicka för att ladda ner.)

Film 2
Film 2: Polarisering av en GFP-märkt kontroll i jämförelse med Bcl11a Mutant Neurons i kortiska skivor. Bcllla flox / flox- hjärnor elektroporerades vid E14.5 med en plasmidvektor innehållande IRES-GFP (A) eller Cre-IRES-GFP (B) och skivkulturer Framställdes vid E16.5. Skala bar = 10 μm. Filmen består av 25 bilder med en hastighet av 5 bilder / s. Reprinted från Wiegreffe et al. 10 med tillstånd från Elsevier. Vänligen klicka här för att se den här videon. (Högerklicka för att ladda ner.)

Film 3
Film 3: Animerade spår med 1 timmars intervallupplösning av representativ kontroll och Bcl11a Mutant Neurons. Spår av migrerande neuroner erhölls från tid-lapse-serien av E16.5-skivkulturer av Bcl11a-flox / flox- hjärnor som elektroporerades vid E14.5 med en plasmidvektor innehållande IRES-GFP ( A ) eller Cre-IRES-GFP ( B ) . Skala bar = 20 μm. Reprinted från Wiegreffe et al.> 10 med tillstånd från Elsevier. Vänligen klicka här för att se den här videon. (Högerklicka för att ladda ner.)

Figur 1
Figur 1: Migreringsbeteende av Bcl11a- mutant övre lager -kortikala neuroner.
( A ) Representativa bilder av migrerande GFP-positiva neuroner i E16.5-skivkulturer från Bcl11a-flox / flox- hjärnor elektroporerade vid E14.5 med antingen Cre-IRES-GFP eller en kontrollvektor över en total bildningsperiod på 12 timmar. ( B ) Representativa spår med 1 timmars intervallupplösning av migrerande GFP-positiva neuroner i E16.5-skivkulturer från Bcl11a-flox / flox- hjärnor elektroporerade vid E14.5 med Cre-IRES-GFP eller en kontrollvektor över totala avbildningsperioder avUpp till 22 timmar. Bcl11a-mutantneuroner genomgår ofta repetitiva faser med minskad migrationshastighet och slumpmässigt ändrad orientering (markerad med röda pilhuvud). ( C ) Hastighetsprofiler beräknade från spår av migrerande neuroner som visas i B. ( DE ) Kvantifiering av hastighet ( D ) och avvikelsesvinkel från radiell orientering ( E ) hos migrerande GFP-positiva neuroner i E16.5 skivkulturer från Bcl11a flox / flox Hjärnor elektroporerade vid E14.5 med Cre-IRES-GFP eller en kontrollvektor (n = 15). Medel ± sem; Studentens t-test; *** p <0,001. Skala bar = 10 μm. Reprinted från Wiegreffe et al. 10 med tillstånd från Elsevier. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Radiell migrering är en nyckelprocess i utvecklingen av neocortex. Mutationer i gener som påverkar olika steg i denna process kan orsaka allvarliga kortikala missbildningar, inklusive lissensfali och vit substans heterotopi 1 , 2 . Vi visade nyligen att Bcl11a, som uttrycks i unga migrerande kortikala projektionsneuroner, spelar en roll i radiell migration. Vi använde tidsförlust konfokal avbildning av migrerande neuroner i akuta kortikala skivor av elektroporerade hjärnor för att direkt demonstrera att genetisk deletion av Bcl11a i migrerande neuroner orsakar polarisations- och migrationsdefekter. Time-lapse-serien användes för att spåra migrationsvägar för enskilda neuroner och beräkna specifika parametrar för migrerande neuroner, inklusive hastighetsprofiler, genomsnittlig migrationshastighet och migrationsriktning 10 .

Detta protokoll beskriver en viktig metod när man studerar molekylenR mekanismer vid radiell migrering. Genom att använda kort hårnål RNA eller DNA-expressionsplasmider kan nästan vilken gen av intresse som helst slås ned eller överuttryckt. Det är ett kraftfullt sätt att kombinera elektroporation med Cre-LoxP-systemet. Transfektion av hjärnor av villkorliga mutanta ("floxed") möss med Cre rekombinas genererar en mosaikmutantsituation och möjliggör selektiv analys av enkla mutanta neuroner som omges av vildtypsceller. På detta sätt kan cellautonoma molekylära mekanismer i migrerande neuroner undersökas. Även funktionella räddningsexperiment utförs enkelt. Förberedelse av tidsfördröjningsserie av elektroporerade hjärnskivor möjliggör dynamisk analys av migrerande beteende hos enskilda migrerande neuroner, vilket ger mycket mer information än vad som kan erhållas från fasta hjärnavsnitt. I utero elektroporation 3 , 4 kräver initial träning men - en gång mästare - är aSnabb och okomplicerad teknik för att reproducerbart transfektera neuroner i hjärnbarken in vivo . I det protokoll som beskrivs här användes vi i uteroelektroporation vid E14.5, när senfödda övre lager neokortiska projektionsneuroner föds. För studier av tidigt född djupskiktsprojektion måste neuroner i uteroelektroporation utföras på tidigare utvecklingsstadium ( dvs E12.5) 13 . I princip kan protokollet också användas för att studera migrering av andra neuronala subpopulationer i hjärnan som kan transfekteras med elektroporering, inklusive migrering av interneuroner 14 och cerebellära granulceller 15 .

Det skivkulturprotokoll som vi beskriver var anpassat från Polleux och Gosh 12 och tidigare har vi använt det för ex- elektroporation 16 , 17 till stuDy hippocampal utveckling. Viktigast är att hjärnskivorna måste hanteras med försiktighet under hela förfarandet för att bibehålla sin livskraft. Vi använder ett inverterat mikroskop och optisk kvalitet glas botten diskar för att bilda skivkulturen vilar på en cellodlingsinsats. Denna konfiguration är väldigt lätt att installera och möjliggör sterila förhållanden, eftersom objektivet aldrig kommer i kontakt med skivkulturen eller mediet. Men långa arbetsdistansmål (> 2 mm) med en tillräckligt hög numerisk bländare (0,6 eller högre) krävs. Andra studier har placerat hjärnskivan direkt på glasbotten och använt en kollagenmatris 18 , 19 för att fixera skivan på plats, vilket gör det möjligt att använda mål med ett kortare fri arbetsavstånd. Användning av cellodlingsinsatser ger emellertid lätt hantering, reproducerbara resultat och gör det möjligt för forskaren att bilda skivorna 1 till 2 dagar efter förberedelsen utan koMpromising livskraften i hjärnskivan (data ej visad). En annan viktig fråga är att skada skivorna med laserljus. Vi har använt en mycket känslig hybriddetektor, vilket gjorde det möjligt för oss att minska laserns effekt till ett minimum samtidigt som vi fick tillräckligt med fluorescerande signaler för tidsfördröjning. Användning av multiphoton-bildbehandling skulle ytterligare minska fotodamage och möjliggöra en djupare vävnadspenetration såväl som effektivare ljusdetektering jämfört med konventionell konfokalmikroskopi.

Trots att det är användbart att studera neuronal migration, har protokollet begränsningar och kan inte helt bevara situationen för migrerande neuroner i den intakta hjärnan. Extracellulär matris, de adhesiva intercellulära kontakterna och vaskulaturen inom migrationsområdet kan dynamiskt påverka radiellt migrerande neuroner 20 , 21 . Specifikt beror övre lagerneuroner på långsträckta radiella glialprocesser förDeras migrering 22 . För framgångsrik bildbehandling är det därför viktigt att välja hjärnskivor med GFP-elektroporerade radiella glialceller som utökar sina processer genom hela kortikala bredden. "Skarpa skivor", där det radiella glialstället har avskurits innan de når hjärnans bakre yta, bör kasseras från ytterligare analys. Ibland kan celldöd inträffa vid hjärnskivans luftyta, vilket begränsar bildförvärv till djupare region inom provet. Elektroporerade neuroner i odlade hjärnskivor kan migrera mindre effektivt jämfört med elektroporerade neuroner in vivo , vilket kan orsakas av otillräcklig återhämtning från beredning. Detta kräver analyser av flera skivkulturer för både experimentella och kontrollsituationer och kritisk tolkning av representativa dataset. I vissa fall kan de förolämpningar som är förknippade med uteroelektroporation orsaka embryonisk död eller strukturell förändringJoner i hjärnan, inklusive förstorade ventriklar, asymmetriskt tunnad cortex eller en glialärbildning som härrör från DNA-injektion. I dessa fall ska provet kasseras från ytterligare analys.

Medan hjärnskivor från embryonala givare överlever väl på membraninsatser 23 , är analyser begränsade till tidiga utvecklingshändelser, inklusive neuronal migration, och vi har inte använt den för att studera senare händelser, såsom dendritutveckling eller synaptogenes. Sammanfattningsvis tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för att direkt och dynamiskt studera neuronal migration av elektroporerade neuroner i skivkulturer, som lätt kan anpassas för att analysera funktioner av gener som är involverade i neurodevelopmentala störningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att avslöja.

Acknowledgements

Vi tackar Jacqueline Andratschke, Elena Werle, Sachi Takenaka och Matthias Toberer för utmärkt tekniskt bistånd, liksom Victor Tarabykin för användbara diskussioner. Detta arbete stöddes av ett bidrag från Deutsche Forschungsgemeinschaft till SB (BR-2215).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
isoflurane Abbott Laboratories  506949 Forene
6-well plate Corning 351146
12-well plate Corning 351143
non-absorbable surgical suture Ethicon K890H 3/8 circle, 13 mm, taper point
Micro Adson Forceps Fine Science Tools 11018-12 serrated, length: 12 cm
fine scissors Fine Science Tools 14063-09 angled to side, length: 9 cm
Mathieu Needle Holder Fine Science Tools 12510-14 tungsten carbide, length: 14 cm
fine tipped forceps Fine Science Tools 11370-40 straight, 11 cm
Vannas Tübingen Spring Scissors Fine Science Tools 15005-08 angled up, 9.5 cm
ring forceps Fine Science Tools 11103-09 OD: 3mm, ID, 2.2 mm, length: 9 cm
HBSS (10X) Gibco 14180046
L-Glutamine Gibco 25030081
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140122
horse serum Gibco 26050088
BME Gibco 41010026
borosilicate glass capillaries Harvard Apparatus 30-0016 1.0 OD x 0.58 ID x 100 L mm
anesthsesia system Harvard Apparaus 72-6471
anesthetizing chamber Harvard Apparaus 34-0460
fluosorber filter canister Harvard Apparaus 34-0415
low melting point agarose Invitrogen 16520100
vibrating blade microtome Leica VT1200 S
fluorescence stereo microscope Leica M205 FA
stereo microscope Leica M125
inverted fluorescence tissue culture microscope Leica DM IL LED
confocal laser scanning microscope Leica TCS SP5II
hybrid detector Leica HyD
objective, 40x/0.60 NA Leica 11506201
microscope temperature control system Life Imaging Services Cube, Brick & Box
cell culture insert Millipore PICM0RG50
microgrinder Narishige EG-45 use 38° angle for beveling
microinjector Parker Hannifin  052-0500-900 Picospritzer III
carprofen Pfizer Animal Health NDC 61106-8507 Rimadyl
emdedding mold Polysciences 18986-1
endotoxin-free plasmid maxi kit Qiagen 12362
fast green Sigma F7252
laminin Sigma L2020
poly-L-lysine Sigma P5899
HEPES Sigma H4034
D-glucose Sigma G6152
calcium chloride Sigma C7902
magensium sulfate Sigma M2643
sodium bicarbonate Sigma S6297
square wave electroporator Sonidel CUY21EDIT
tweezers with 5 mm platinum disk electrodes Sonidel CUY650P5
micropipette puller Sutter Instrument P-97
box filament Sutter Instrument FB255B 2.5 mm x 2.5 mm
micro-spoon spatula VWR 231-0191 185 mm x 5 mm
glass bottom dish, 50 mm World Precision Instruments FD5040-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Evsyukova, I., Plestant, C., Anton, E. S. Integrative mechanisms of oriented neuronal migration in the developing brain. Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 299-353 (2013).
  2. Kwan, K. Y., Sestan, N., Anton, E. S. Transcriptional co-regulation of neuronal migration and laminar identity in the neocortex. Development. 139, (9), 1535-1546 (2012).
  3. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, (1), 237-246 (2001).
  4. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, (4), 865-872 (2001).
  5. LoTurco, J. J., Bai, J. The multipolar stage and disruptions in neuronal migration. Trends Neurosci. 29, (7), 407-413 (2006).
  6. Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7, (2), 136-144 (2004).
  7. Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 23, (31), 9996-10001 (2003).
  8. Pacary, E., et al. Proneural transcription factors regulate different steps of cortical neuron migration through Rnd-mediated inhibition of RhoA signaling. Neuron. 69, (6), 1069-1084 (2011).
  9. Tabata, H., Nagata, K. Decoding the molecular mechanisms of neuronal migration using in utero electroporation. Medical Molecular Morphology. 49, (2), 63-75 (2016).
  10. Wiegreffe, C., et al. Bcl11a (Ctip1) Controls Migration of Cortical Projection Neurons through Regulation of Sema3c. Neuron. 87, (2), 311-325 (2015).
  11. John, A., et al. Bcl11a is required for neuronal morphogenesis and sensory circuit formation in dorsal spinal cord development. Development. 139, (10), 1831-1841 (2012).
  12. Polleux, F., Ghosh, A. The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development. Sci STKE. (136), pl9 (2002).
  13. Greig, L. C., Woodworth, M. B., Galazo, M. J., Padmanabhan, H., Macklis, J. D. Molecular logic of neocortical projection neuron specification, development and diversity. Nat Rev Neurosci. 14, (11), 755-769 (2013).
  14. De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. Subtype-selective electroporation of cortical interneurons. J Vis Exp. (90), e51518 (2014).
  15. Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. J Vis Exp. (85), (2014).
  16. Venkataramanappa, S., Simon, R., Britsch, S. Ex utero electroporation and organotypic slice culture of mouse hippocampal tissue. J Vis Exp. (97), (2015).
  17. Simon, R., et al. A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis. EMBO J. 31, (13), 2922-2936 (2012).
  18. Youn, Y. H., Pramparo, T., Hirotsune, S., Wynshaw-Boris, A. Distinct dose-dependent cortical neuronal migration and neurite extension defects in Lis1 and Ndel1 mutant mice. J Neurosci. 29, (49), 15520-15530 (2009).
  19. Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O., Pearlman, A. L. Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex. Nat Neurosci. 4, (2), 143-150 (2001).
  20. Higginbotham, H., Yokota, Y., Anton, E. S. Strategies for analyzing neuronal progenitor development and neuronal migration in the developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 21, (7), 1465-1474 (2011).
  21. Stubbs, D., et al. Neurovascular congruence during cerebral cortical development. Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i32-i41 (2009).
  22. Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. Trekking across the brain: the journey of neuronal migration. Cell. 128, (1), 29-43 (2007).
  23. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics