الفلورة الكمية لقياس عالمية مترجمة ترجمة

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

هذه المخطوطة وصف أسلوب لتصور وتحديد الأحداث الترجمة المترجمة في المقصورات سوبسيلولار. يتطلب نظام تصوير [كنفوكل] أساسية والمواد الكاشفة النهج المقترح في هذه المخطوطة وهي سريعة وفعالة من حيث التكلفة.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Bergeman, J., Huot, M. É. Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation. J. Vis. Exp. (126), e55909, doi:10.3791/55909 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الآليات التي تنظم الترجمة مرناً وتشارك في مختلف العمليات البيولوجية، مثل جرثومة خط التنمية وتمايز الخلايا وأورجانوجينيسيس، وكذلك في العديد من الأمراض. وقد أظهرت العديد من المنشورات مقنع أن آليات محددة تنظم أحكام الترجمة مرناً. زيادة الاهتمام بتنظيم تعبير البروتينات المستحثة بالترجمة أدى إلى استحداث طرق جديدة لدراسة ومتابعة حيثياته البروتين التوليف في سيلولو. ومع ذلك، معظم هذه الأساليب معقدة ويجعلها مكلفة وكثيراً ما يحد من عدد أهداف مرناً التي يمكن دراستها. وتقترح هذه المخطوطة أسلوب الذي يتطلب فقط الكواشف الأساسية ونظام تصوير الأسفار [كنفوكل] قياس ووضع تصور للتغيرات التي تحدث في أي خط الخلية تحت ظروف مختلفة في الترجمة مرناً. واستخدمت هذا الأسلوب مؤخرا لإظهار الترجمة المترجمة في الهياكل سوبسيلولار الخلايا ملتصقة على مدى فترة قصيرة من الوقت، مما يتيح إمكانية تصور الترجمة حيثياته لفترة قصيرة من خلال مجموعة متنوعة من البيولوجية العمليات أو التحقق من صحة التغييرات في النشاط متعدية الجنسيات في الاستجابة للمحفزات محددة.

Introduction

تنظيم الترجمة بمختلف الوظائف الخلوية ودفعت العديد من فرق البحث لتطوير أدوات جديدة وأساليب لتحديد التعريب سوبسيلولار الترجمة مرناً وتنظم البروتين التوليف1،2 ،،من34. تسمح هذه التطورات التكنولوجية الحديثة لتحسين فهم الآليات التي تنطوي على أوبريجولاتيون الترجمة أو قمع مرناس محددة خلال العمليات البيولوجية، مثل تنمية الخلايا العصبية والمخدرات واستجابة وورم خبيث5 6، ،،من78. ومع ذلك، تتطلب معظم هذه الطرق مكلفة أو الخطرة والمواد الكيميائية ومعدات معينة قد لا تكون متاحة لمعظم المختبرات. على هذا النحو، قد وضعت طريقة فعالة من حيث التكلفة للسماح للتقييم السريع للأحداث الترجمة للتحايل على وجه التحديد هذه القضايا المحتملة. هذا الأسلوب يكشف التحويرات متعدية الحادة التي تحدث أثناء العمليات الخلوية المحددة ويسمح أيضا لإضفاء الطابع المحلي على الترجمة باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل].

واستخدمت الأساليب الموصوفة هنا لرصد الترجمة المترجمة داخل مقصورات سوبسيلولار تسمى الشروع في نشر مراكز (SIC)5. سيكس هي عابرة الهياكل الموجودة في خلايا المصنف التي يتم ترجمتها على رأس المجمعات التصاق الوليدة. رغم سايكس ومجمعات التصاق متميزة، ترتبط ارتباطاً وثيقا مصائرهم. وفي الواقع، معروفة سايكس تختفي تدريجيا عند نضوج التصاق المحورية المعقدة إلى موقع التصاق خلال المرحلة الأولية للالتصاق. وجدنا أن الجيش الملكي النيبالي ملزم البروتينات المعروفة للسيطرة على وجه التحديد مرناً الترجمة (مثلاً، Sam68، فمرب، و G3BP1) وبوليادينيلاتيد وقد أثري الكشف داخل هذه الهياكل5. باستخدام الأساليب الموضحة هنا، أظهرنا أن تنظيم مرناً SIC المرتبطة بمثابة الترجمة السماح بتفتيش المصنف الخلايا توطيد التصاق الخلية. ويمكن اعتبار هذا الأسلوب، استناداً إلى التأسيس بوروميسين، صيغة معدلة للاستشعار السطحية للمقايسة الترجمة (غروب الشمس). وضعت أصلاً لقياس معدلات توليف البروتين العالمية باستخدام الأحماض الأمينية مسماة غير إشعاعيا، بوروميسيليشن البروتين يوفر طريقة فعالة لتصور حيثياته البروتين التوليف9. يعتمد هذا الأسلوب على السلوك الجوهرية من بوروميسين، مضاد كتل الترجمة عن طريق إنهاء سلسلة سابقة لأوانها في الريبوسوم10. وفي الواقع، بوروميسين يماثل هيكلياً تيروسيل-الحمض الريبي النووي النقال، يسمح لإدماجها في سلاسل ببتيد عبر تشكيل السندات ببتيد التمطيط. بيد بوروميسين ملزم لسلسلة ببتيد متزايد يمنع سندات ببتيد جديدة يجري تشكيلها بالقادم أمينواسيل-الحمض الريبي النووي النقال، منذ بوروميسين سندات غير هيدروليسابل أميد بدلاً من السندات إستر هيدروليسابل وجدت في ترنس. وهكذا يؤدي إدماج بوروميسين في التمطيط البروتينية في إصدار سابق لأوانه عديدة بوروميسيلاتيد مبتوراً البروتينية المقابلة لترجمتها بنشاط مرناً9،11،12 .

باستخدام هذا الأسلوب، كان من الممكن لتقييم الترجمة النشطة خلال وقت قصير أرملة (مثلاً 5 دقائق) خلال الالتصاق الخلوي استخدام جسم محددة موجهة ضد بوروميسين في الخلايا التي استكملت بالمضادات الحيوية لفترات 5-دقيقة في نقاط زمنية مختلفة خلال عملية التصاق الخلية5. دقة هذا الفحص يعتمد على أجسام مضادة محددة للغاية الموجهة ضد مجموعة بوروميسيلاتيد. ويوفر اكتشاف ببتيد بوروميسيلاتيد إيممونوفلوريسسينت إعادة تقسيم سوبسيلولار عامة مرناً المترجمة حديثا، التي يمكن قياسها كمياً بدقة كبيرة باستخدام نظم التصوير [كنفوكل] أيضا.

ومن ثم، يقدم هذا الأسلوب خيار المناسب لعدد كبير من المختبرات التي تدرس آليات تنظيمية متعدية الجنسيات المشاركة في العمليات مثل تحبيب العصبية6،،من1314، 15ومورفوجين مرناً التعريب والترجمة خلال التنمية16،17. وأيضا مناسب تماما لدراسة الترجمة المترجمة أو المجزأة أثناء الأحداث البيولوجية السريعة، مثل الهجرة الخلية أو الالتصاق أو الغزو، أو لمجرد تقييم العلاج بالعقاقير التي قد تسبب التغييرات متعدية5، 7 , 18-وعموما، يسمح هذا الأسلوب لتصور الأحداث الترجمة المترجمة أو التي تسيطر عليها بطريقة سريعة ودقيقة وفعالة من حيث التكلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-"تحديد شروط بوروميسيليشن"

ملاحظة: هذا الأسلوب توضح هذه المقالة الطريقة المستخدمة لتقييم الترجمة المترجمة خلال عملية التصاق الخلايا لجنة نهر الميكونج--5 5. كما يمكن أن يتم بوروميسيليشن في أي خلية، من المهم تحسين شروط بوروميسيليشن خطوط خلية معينة لاستخدامها، لأن شروط المعاملة ليست متطابقة لكل خط الخلية من حيث تركيز بوروميسين والمطلوب وقت الحضانة. لإظهار كيفية تعريف هذه الشروط، يعاملون ثلاثة خطوط الخلايا مثال (أي، هيلا، لجنة نهر الميكونج--5، وهوه-7) مع زيادة تركيزات بوروميسين لاحتضان مختلف الأوقات ( الشكل 1).

أرقام متطابقة
  1. تنمو من الخلايا في صفيحة 24-جيدا في 0.5 مل من المناسب استكمال الثقافة المتوسطة ح 16 قبل الاختبار. البذور 30,000 لجنة نهر الميكونج-5 خلايا أو خلايا هيلا 50,000 50,000 هوة-7 خلايا كل بئر. تأكد لتجنب تجاوز التقاء 60-70% (الشكل 1A).
  2. -6 إعداد الأنابيب مع 1.5 مل من خلية كاملة الثقافة المتوسطة مع زيادة تركيزات بوروميسين (0، 5، 10، 15، 20، و 30 ميكروغرام/مل). قبل الحارة في 37 درجة مئوية.
  3. لكل تركيز بوروميسين المتوسطة (أعد الخطوة 1.2)، نقل 0.5 مل من كل أنبوب إلى 6 أنابيب جديدة وإضافة سيكلوهيكسيميدي بتركيز 50 ميكروغرام/مل نهائي لجميع الأنابيب الجديدة 6. قبل الحارة في 37 درجة مئوية.
  4. تغيير
  5. المتوسطة مع 0.5 مل من إكمال الثقافة المتوسطة (الصف 1 و 2). بالنسبة للصف الثالث، إضافة 0.5 مل متوسطة ثقافة كاملة وتستكمل مع 50 ميكروغرام/مل من سيكلوهيكسيميدي ( الشكل 1B).
    ملاحظة: تم إنشاء معاملة سيكلوهيكسيميدي كأفضل لمراقبة سلبية للبروتين بوروميسيليشن نظراً لقدرته على منع استطالة الترجمة. لأنه يتطلب إدماج بوروميسين استطالة الترجمة، سيكلوهيكسيميدي في المعاملة يؤدي إلى فقدان بوروميسيلاتيد البروتين إشارات 5 ، 18-
  6. احتضانها لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية (5% CO 2)-
  7. إضافة 0.5 مل الوسط بوروميسين إعدادها في الخطوة 1.2 للصف الثاني للحصول على تركيزات نهائية من 0 و 2.5، 5، 7.5، 10 و 15 ميكروغرام/مل، على التوالي، في أعمدة أ، ب، ج، د، هاء وواو. في الوقت نفسه، إضافة 0.5 مل بوروميسين إلى سيكلوهيكسيميدي تكمل المتوسطة (الخطوة 1.3) في الصف الثالث ( الشكل 1).
  8. احتضانها لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية (5% CO 2)-
  9. إضافة 0.5 مل الوسط بوروميسين إعدادها في الخطوة 1.2 للصف الأول للحصول على تركيزات نهائية من 0.0 و 2.5، 5، 7.5، 10 و 15 ميكروغرام/مل ( الشكل 1).
  10. احتضانها لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية (5% CO 2)-
  11. يغسل كل من الصفوف 1 إلى 3 مع 1 مل من المثلج 1 X مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) 5 دقائق بعد الإضافة من بوروميسين إلى الآبار للصف الأول (يغسل مرتين). إضافة ميليلتر 75 من المخزن المؤقت X Laemmli 1 (4% الصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS)، 4% 2-mercaptoethanol، 0.120 HCl تريس م الأس الهيدروجيني 6.8، والغليسيرول 0.004% بروموفينول الأزرق، و 10 في المائة) للحصول على كامل الخلية ليساتيس لكل شرط.
  12. تشغيل 10% الحزب الديمقراطي الصربي-polyacrylamide هلام التفريد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) باستخدام 1/3 عينات المعدة لتقييم إدماج بوروميسين.
    1. تحديد مستوى إدماج بوروميسين بتحليل لطخة غربية لاستخدام جسم مضاد بوروميسين المضادة (د 10 12) المخفف بنسبة 1:25,000 في جسم الابتدائي الحضانة المخزن المؤقت (2% ألبومين المصل البقري (BSA)) 430 ملم كلوريد الصوديوم، 10 مم تريس الأس الهيدروجيني 7.4 و 0.01 ٪ أزيد الصوديوم).
      ملاحظة: تظهر الصور التمثيلية المقابلة لمقتطفات خط خلية مختلفة كما هو موضح في الخطوة 1 كأمثلة في الشكل 2-

2. في سيلولو مترجمة "ترجمة التصور"

ملاحظة: استخدمت الأسلوب الموصوفة هنا لتقييم الترجمة المترجمة داخل سايكس في لجنة نهر الميكونج-5 الخلايا أثناء عملية الالتصاق 5. على الرغم من أن لجنة نهر الميكونج-5 خلايا تستخدم هنا، يمكن استخدام خطوط الخلايا الأخرى بنفس المنهجية الموضحة في الخطوة 2، 1-

  1. خلية إعداد-
    1. 5 MRC فصل الخلايا باستخدام 0.25% التربسين/2.21 ملم حمض الإيثيلين (يدتا) في هانك ' s حل متوازن الملح (حبس). بيليه الخلايا بالطرد المركزي (5 دقائق في 200 س ز) في أنبوب 15 مل مخروطية أجهزة الطرد مركزي، وتعليق عليها في دولبيكو ' s التعديل النسر المتوسطة (دميم) وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) في 40,000 خلايا/مل بعد فرز الأصوات بدائرة عد.
    2. احتضان خلايا معلقة في 37 درجة مئوية تحت دوران لطيف باستخدام المدورة أنبوب لمدة 20 دقيقة للحفاظ عليها في التعليق.
      ملاحظة: هذه الخطوة الحاسمة للسماح للانفصال الكامل من المجمعات التصاق المحورية.
    3. مل 2 لوحة علقت لجنة نهر الميكونج-5 خلايا (40,000 خلايا/مل) في اثنين 35 ملم الزجاج-أسفل الأطباق. استخدام الطبق أسفل الزجاج 35 ملم الأولى للانزيم بوروميسيليشن (راجع الخطوة 2.1.5) واستخدام الثاني كعنصر تحكم سلبية (راجع الخطوة 2.1.6)-
    4. إبقاء الخلايا في 37 درجة مئوية (5% CO 2) لمدة 55 دقيقة للسماح للالتصاق الخلوي وتشكيل SIC.
    5. بوروميسين إضافة إلى المتوسطة في الأطباق أسفل الزجاج 35 ملم (مقايسة) استخدام تركيز المعرفة مسبقاً في قسم 1. استخدام لعلاج الخلايا لجنة نهر الميكونج--5، 10 ميكروغرام/مل بوروميسين لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية (5% CO 2)-
    6. كعنصر سلبي، إضافة سيكلوهيكسيميدي إلى الطبق 35 ملم الزجاج-السفلي الثاني 40 دقيقة بعد زرع الخلايا إلى ما قبل تعاملهم مع 50 ميكروغرام/مل سيكلوهيكسيميدي ( الشكل 2). ثم إضافة 15 دقيقة بعد إضافة سيكلوهيكسيميدي، بوروميسين إلى متوسط استخدام في نفس الوقت تركيز والحضانة كما هو الحال في الخطوة 2.1.5 (مثلاً، استخدام 10 ميكروغرام/مل من بوروميسين لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية (5% CO 2) للجنة نهر الميكونج-5)-
    7. يغسل كل لوحة مرتين مع 2 مل من المثلج 1 X برنامج تلفزيوني وإصلاح الخلايا مع 1 مل من 4% فورمالدهايد (مخففة في برنامج تلفزيوني X 1) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
      تنبيه: بارافورمالدهيد يجب أن يقتصر استخدامها في غطاء كيميائية.
  2. إيمونوستينينج.
    1. بعد التثبيت بارافورمالدهيد، يغسل ثلاث مرات مع 2 مل من 1 X PBS واحتضانها في 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني-تريتونكس-100 (0.5 في المائة) لمدة 20 دقيقة في RT الخلايا بيرميبيليزي-
    2. لمنع جسم غير محدد ملزم، كتلة العينة مع 500 ميليلتر PBS – جيش صرب البوسنة (1%) لمدة 20 دقيقة في الرايت
    3. تغسل ثلاث مرات مع 2 مل من برنامج تلفزيوني-Tween20 (0.1%)، واحتضان مع 300 ميليلتر من 1:12,500 بوروميسين المضادة الأجسام المضادة (د 10 12) المخفف في برنامج تلفزيوني X 1 ح 1 في الرايت
    4. أغسل 3 مرات مع 2 مل من برنامج تلفزيوني-Tween20 (0.1%)، واحتضان مع 300 ميليلتر من الماوس المضادة مترافق مفتش إلى فلوروفوري (هنا، 488 نانومتر) المخفف في برنامج تلفزيوني لتصور البروتينية بوروميسيلاتيد ومع فالويدين مترافق إلى فلوروفوري آخر (هنا، 555 نانومتر) أن تصور واكتين. احتضانها ح 1 في الرايت
    5. يغسل ثلاث مرات مع 2 مل من برنامج تلفزيوني-Tween20 (0.1%)، وثم احتضانها لمدة 5 دقائق في RT في 300 ميليلتر من برنامج تلفزيوني-Tween20 (0.1%) وتستكمل مع 1 ميكروغرام/مل 4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI)-
    6. يغسل ثلاث مرات مع 2 مل من برنامج تلفزيوني-Tween20 (0.1%)، ويغسل مع 2 مل من 1 X PBS. منع الخلايا من التجفيف بحفظ العينة في 2 مل 1 X برنامج تلفزيوني أثناء الحصول على الصور-

3. الحصول على الصور إيممونوفلوريسسينت

ملاحظة: المنهجية التالية التي يمكن استخدامها مع أي نظام التصوير المتاحة تجارياً [كنفوكل].

إعدادات
  1. تحديد المناسبة لكل فلوروفوري لزيادة النطاق الديناميكي للقياس الكمي-
    ملاحظة: الممثل الكمي يمكن يمكن الحصول عليها إلا إذا تجنب التشبع بكسل ويتم ضبط عتبة إشارة بشكل صحيح. يمكن أن تكون هذه الإعدادات الحصول على تحقيقها عن طريق تعديل قوة الليزر، الجهد العالي (HV)، بعناية، والإزاحة. عامل
    1. ضبط التكبير/التصغير (5 X) وعدد وحدات البكسل (512 × 512) لتحسين حجم بكسل-
      ملاحظة: هذا ينبغي أن يكون على الأقل 2.3-مرات أصغر من الدقة البصرية، ووفقا لنظرية نايكست.
    2. تقلل من سرعة المسح الضوئي (12.5-20 المايكروثانيه بيكسل) واستخدم في المتوسط (2-3 مرات) لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء طبقاً للإعدادات المذكورة أعلاه-
  2. يدوياً تحديد المناسبة أعلى وأسفل الطائرات التركيز على طول محور "ع" مع حجم الخطوة المثلى (0.4 ميكرومتر في شريحة).
    ملاحظة: يتم تحديد الطائرة حجم الخطوة القرار المحوري مقسوماً على 2، 3، وفقا لنظرية نايكست. عادة، تكون الطبقات 20-25 اللازمة لتغطية عمق الخلية بأكملها من الخلايا ملتصقة.
  3. الحصول على صورة [كنفوكل] من خلية واحدة كاملة مع 60 X Apo خطة نفط غمر هدفا (1.42 الفتحة العددية)-

4. تحديد حجم الصورة إيمونوفلوريسسينت

  1. التصميم لتخصيب.
    1. فتح صورة المقابلة لطبقة z-الطائرة من الفائدة من ملف البيانات خلية المكتسبة باستخدام برنامج إيماجيج (مجانية متاحة في http://fiji.sc)-
    2. رسم خط باستخدام أداة خط الرسم (شريط الأدوات → على التوالي) عبر مناطق الخلية حيث يتم رغبت القياس الكمي. تعديل عرض الخط بالنقر المزدوج فوق " على التوالي؛ " سوف بلغ متوسط قيم الكثافة من خلال عرض السطر (تعيين الساعة 8 في الشكل 3).
      ملاحظة: خط أرق من المفضل تجنب تداخل الإشارات من هياكل مختلفة-
    3. بعد أن يتم تعيين بشكل صحيح في السطر، الشخصية كثافة إشارة على طول محور العزم (شريط القوائم → تحليل → ارسم الشخصية)-
      ملاحظة: سيتم فتح نافذة جديدة يظهر ملف تعريف المقابلة لشدة الإشارة لكل بكسل للقناة المحددة (محددة fluorophore) على طول الخط للمقطع z-الطائرة المحدد.
      1. تكرار هذه العملية لكل قناة المقابلة fluorophore المستخدمة (أي، واحد التحديد الكمي ل 488، واحد 568، وواحدة ل 405)-
        ملاحظة: قيمة كثافة إشارة سوف دائماً يكون أمرت بعد اتجاه خط مرسومة.
    4. للحصول على قيم الرمادي تحجيم العددية لكل بكسل للشخصية المقابلة كوانتيفيكاتيونس طبقة z-الطائرة المحدد، قم بنسخ البيانات الشخصية (شريط القوائم في إطار الصورة → نسخة) ولصقها في أي برنامج جدول بيانات.
    5. 4.1.1-4.1.4
    6. تكرار الخطوات لكل قسم z-الطائرة من الصورة [كنفوكل] المكتسبة وكل قناة حيث المطلوب هو التحديد الكمي-
      ملاحظة: يمكن تجميع التحديد الكمي لطبقات z-طائرة مختلفة للحصول على تقييم عام لإثراء الإشارات الخاصة بحساب قيمة المبلغ لكل بكسل على طول الخط لكل طبقة z-الطائرة. هذا النوع من تجميع يتحقق إلا إذا كان الخط الذي رسمته متطابقة لكل طبقة z-الطائرة المدرجة في القيم الوسطية.
    7. كأسلوب بديل لتحديد مقدار كامل الخلية من قنوات مختلفة مع عدد كبير من الطبقات، استخدام الماكرو تسمى ستاكبروفيليداتا (انظر الملف التكميلي)-
      ملاحظة: هذا الماكرو يمكن الوصول إليها بحرية في https://imagej.nih.gov/ij/macros/StackProfileData.txt ويمكن أن تستخدم على النحو التالي:
      1. لصق الماكرو إلى ملف نصي وحفظ عليه.
      2. فتح ملف الصورة الذي يحتوي على كافة الطبقات [كنفوكل] من الخلية.
      3. رسم خط، كما هو موضح في الخطوة 4.1.2، فتح نافذة جديدة لاستيراد الماكرو (شريط القوائم → الإضافات → وحدات الماكرو → تشغيل) واختر الملف النصي المحفوظ مسبقاً المقابلة إلى الماكرو ستاكبروفيليداتا ثم انقر " فتح. "
        ملاحظة: بعد استيراد الماكرو، نافذة جديدة تسمى " نتائج " سيتم فتح وكل التقدير الكمي على طول محور العزم سيتم سرد لكل طبقة z-الطائرة وقناة موجودة في ملفات الصورة.
      4. نسخ البيانات لكل قناة (شريط القوائم → تحرير → نسخة) للحصول على تمثيل رسومي الشخصية المقابلة كوانتيفيكاتيونس إشارة. لصقها في أي برنامج جدول بيانات. حساب قيمة المبلغ لكل قناة لكل بكسل على طول الخط لكل طبقة z-الطائرة. استخدام هذه القيم لإنشاء تمثيل رسومي مماثلة لتلك المعروضة في الشكل 3-
  2. التحديد الكمي للإشارات في مكان مخصص منطقة الخلوية أو وحدة التخزين-
    1. فتح ملف الصورة باستخدام برنامج إيماجيج-
    2. رسم مجالاً للدلالة على مجال الاهتمام باستخدام الدالة شكل هندسي (شريط الأدوات → " المستطيل، " " البيضاوي، " أو " المضلع ")-
      ملاحظة: سيتم تحديد قيمة القياس الكمي للمنطقة المقابلة للنموذج مرسومة.
    3. ضبط مستوى العتبة لتجنب أي إشارة خلفية (شريط القوائم → "ضبط الصورة" → العتبة)؛ سوف تظهر نافذة جديدة لتمثيل كثافة بكسل في نموذج الرسم البياني. قم بتغيير القيم تضمين/استبعاد البيكسلات في التحديد الكمي باستخدام شريط التمرير. حدد عتبة أن يلغي الحمراء بكسل خارج الخلية، كما سلط الضوء على اللون الأحمر بكسل ستدرج في التحديد الكمي-
    4. تعريف معلمات القياس لقياس الإشارات بكسل داخل المنطقة المحددة، دون إشارة خلفية (شريط القوائم → تحليل → تعيين قياسات)، وتأكد من التحقق من " الحد الأقصى لعتبة " " "كثافة المتكاملة" " مربعات-
    5. قياس القيم الكمية للمنطقة المحددة (شريط القوائم → تحليل → التدبير).
      ملاحظة: ستقدم إشارة كثافة الكمي في نافذة جديدة تحت " إينتدين " الهوية، الذي يمثل نتاج قيم رمادي متوسط وعدد وحدات البكسل داخل المنطقة المحددة.
    6. رسم
    7. منطقة التي تضم الخلية بأكملها باستخدام شكل هندسي (شريط الأدوات → " المستطيل، " " البيضاوي، " أو " المضلع ") والمضي قدما في خطوات 4.2.3-4.2.5 للحصول على قيمة المقابلة للإشارة الإجمالية. حساب نسبة الإشارة داخل المنطقة المحددة عبر إشارة كاملة للحصول على النسبة المئوية للإشارة ضمن مجال الاهتمام.
    8. كرر الخطوات 4.2.2-4.2.6 للحصول على التقدير الكمي لحجم الخلية لكل طائرة z
    9. . التكيف مع شكل هندسي حسب الحاجة.
    10. نسخ/لصق البيانات التي تم الحصول عليها من " نتائج " windows لكل طبقة z-الطائرة إلى جدول بيانات لتصوير رسومي والعثور على قيمة متوسط.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لدقة مراقبة أحداث الترجمة باستخدام إدراج بوروميسين، من الأهمية بمكان لتحديد الظروف المثلى لكل خط الخلية لأنه يظهر كل بوروميسين مختلفة إدماج حركية (الشكل 1)9،11 ،،من1218. ومن ثم، للتحقق من صحة إدراج بوروميسين، من الضروري التعامل مع خط الخلية المطلوب مع مجموعة موحدة من التركيزات المتزايدة بوروميسين (1.0 و 2.5، 5.0، 7.5، 10.0 و 15.0 ميكروغرام/مل) لفترات مختلفة من الوقت (دقيقة 5 و 10). تقييم الترجمة المترجمة أو استجابة مبكرة للعلاج من تعاطي المخدرات، فترة حضانة أقصر المفضل (مثلاً، أقل من 5 دقائق)، كما أنه يسمح للتقييم المباشر للأحداث متعدية الجنسيات التي أعقبت مباشرة علاج محدد. ومن الناحية المثالية، ينبغي أن تكون قابلة للكشف بسهولة إشارة بوروميسين لكن ينبغي أيضا تجنب نقطة التشبع (الشكل 2). كما هو مبين في الشكل 2 (لوحات اليسار)، بتركيز بوروميسين مقبول 7.5 10.0 ميكروغرام/مل 5 لجنة نهر الميكونج والحلة، بينما يقترح 5.0 7.5 ميكروغرام/مل من بوروميسين هوة-7. تحسين المعلمات التجريبية بالغ الأهمية نظراً لأن الهدف من هذا الأسلوب هو لا تمنع تماما جميع استطالة متعدية الجنسيات في لحظة بدء بل الوسم سينثيتيزيد ببتيد سلاسل حديثا أثناء الترجمة للكشف عن حدة الاختلافات في الترجمة. هذه المرحلة الأولية في البروتوكول لا ينبغي توافر بوروميسين المهملة، مفرطاً ووقت المعالجة الموسعة سوف يتسبب في عواقب غير مرغوب فيها الرئيسية. كما لاحظت في الشكل 2 (حق الألواح)، سوف تولد الخلايا المعالجة لمدة 10 دقيقة مع تركيز عالية بوروميسين معظمها أصغر بوروميسيلاتيد البروتينية (مثلاً، هوة-7, 7.5 ميكروغرام/مل أو أكثر لمدة 10 دقائق). وسوف منتشر البروتينية أصغر هذه أكثر سرعة في الخلية، والتي قد تتداخل مع دقة تقييم التعريب سوبسيلولار. ثمة مشكلة أخرى أن proteolysis زيادة تحدث عند العلاج بوروميسين المفرط19. ولوحظ في لجنة نهر الميكونج-5 والحلة الخلايا يعالج من 10 دقيقة، مما أظهر إشارة انخفاض كثافة حضور 10 أو 15 ميكروغرام/مل من بوروميسين هذه النتيجة. كل من هذه الظواهر مضللة إذا كان إدراج بوروميسين يقيمها الفلورة لأنه يمنع زيادة نشر التصور الدقيق من ترجمة التعريب، بينما يقلل التدهور الناجم عن بوروميسين إلى حد كبير الكشف عن حساسية. يتم تجنب هذه الآثار غير المرغوب فيها بسهولة بتحديد أفضل الظروف التجريبية، بشكل صحيح كما هو موضح في القسم 1 من البروتوكول.

بينما تصور إدماج بوروميسين، من المهم أيضا لتنفيذ الضوابط المناسبة. كما هو موضح في الشكل 3 ألف، يمكن حظر إدراج بوروميسين كفاءة بإضافة 50 ميكروغرام/مل سيكلوهيكسيميدي، مركب معروفة لتمنع الترجمة الاستطالة20 ومن ثم إدراج بوروميسين. ويبين الشكل 3B، مما يدل على أن العلاج سيكلوهيكسيميدي كفاءة منع معظم الإشارة المقابلة لإدماج بوروميسين في ملتصقة لجنة نهر الميكونج-5 خلايا هذا السلوك. وفي الواقع، بينما يمكن تصور الببتيدات بوروميسيلاتيد في الخلايا تعامل مع بوروميسين فقط، تم الكشف عن إشارة ضعيفة في الخلايا التي تعامل أيضا مع سيكلوهيكسيميدي تحت ظروف المصبوغة مطابقة. وبدلاً من ذلك، آخر المضادات الحيوية (أنيسوميسين) يمكن أن تستخدم أيضا كعنصر سلبي، كما أنه لديه القدرة على منع النشاط ترانسفيراز بيبتيديل5 ولقد ثبت أن تكون فعالة مثل سيكلوهيكسيميدي في عرقلة إدماج بوروميسين5 ،18

وبعد الحصول على الصور إيمونوفلوريسسينت، فمن الممكن لتقييم التعريب العام من بوروميسيلاتيد البروتينية تناظر حديثا سينثيتيزيد البروتينات (الشكل 4). يتم تحديد طبقات الصورة في أعماق مختلفة داخل خلايا ملتصقة، السماح بكثافة إشارة في مقصورات سوبسيلولار تقييم في الطائرات خلية مختلفة. على هذا النحو، فمن الممكن للمقارنة بين رد فعل بوروميسيليشن مترجمة في الجزء السفلي من الخلية (الشكل 4 أ)، في منتصف الخلية (الشكل 4 باء)، أو الجزء العلوي من الخلية (الشكل 4). يقع قليلاً فوق هياكل التصاق الوليدة وماتوراتينج، ولوحظت سايكس معظمها في وسط الخلية. كما هو متوقع، يتم الكشف عن بوروميسيليشن الشديد في سايكس، مما يدل على أن الترجمة مرناً معزولة لهذه الهياكل سوبسيلولار. وكما ذكر سابقا، فمن الممكن مقارنة كثافة إشارة على طول محور المطلوب. هذه المقارنة غير ممكنة إلا إذا كان لا تقم بتضمين الصور المكتسبة مشبعة بكسل، التي تظهر باللون الأحمر في صورة درجات الرمادي (الأفرقة الثانية من الأعلى) الحصول عليها باستخدام المجهر تشغيل البرمجيات. يمكن استيراد هذه الصور إلى البرنامج إيماجيج للقياس الكمي وتحليل كثافة بكسل طول محور معين. تحديد حجم بكسل يمكن أن تمثل بيانيا (الفريق الأوسط) لتوضيح كثافة بكسل نسبي في مواقف معينة على طول المحور. إلقاء نظرة فاحصة على الإدراج في لوحات العلوي يبين حدود SIC-أكتين (باللون الأحمر) وإشارة خضراء داخل الهيكل الذي يتوافق مع الأحداث ترجمة نشطة للغاية، التي هي أثري داخل هذه الهياكل (القسم السفلي). على الرغم من أن هذا الأسلوب الكمي ليس أفضل طريقة لتحديد النسبة المئوية الدقيقة لمجموع الترجمة التي تحدث في هذه الهياكل، وهو بصريا الزاخر بالمعلومات عن طريق السماح للتقييم السريع لكثافة إشارة وهو تقريب جيد توزيع الإشارات في جميع أنحاء الخلية.

للحصول على توزيع كمية للإشارة في جميع أنحاء الخلية كلها، يجب استخدام أسلوب آخر. كما هو موضح في الشكل 5، هو إحدى الخطوات الرئيسية للدلالة على مجالات الاهتمام التي تحتاج إلى القياس الكمي لكل طائرة z يؤلف ملفات الصور [كنفوكل]. يمكن تحقيق هذه المهمة باستخدام أداة رسم مختلفة الموجودة في إيماجيج. باستخدام هذا الأسلوب، من الممكن تحديد مجال واحد أو مجالات متعددة، التي يمكن ثم مقارنة، وطرح، أو حتى تحويلها برمجياً. الصعوبات الرئيسية: (ط) إيجاد ظروف التصوير المثلى التي تجنب التشبع بكسل والإشارات الخلفية، التي قد تشوه قيمة الكمية من الإشارات التي تم الحصول عليها، و (الثاني) إنشاء المعايرة المثلى من العتبة في إيماجيج. وعلى افتراض أن كل من هذه الشروط الأمثل، هذا الأسلوب الكمي استنساخه بدرجة عالية بينما لا تزال تبقى سهلة لتنفيذ. قبل الحصول على الصور، من المهم أيضا تحديد حدود السفلي والعلوي من z-طائرات الخلية المختارة للقياس الكمي بعناية. وفي الحالة المعروضة في الشكل 4، يناظر القسم السفلي القرار الحد الأقصى للهدف، والتي غالباً ما تشمل تلويث fluorescence زائل، التي يمكن أن تقلل نسبة إشارة الهيئة SIC/خلية. وكما ذكر سابقا، سايكس وتشارك في تشكيل موقع التصاق والنضج؛ ولذلك، تقع هياكل SIC قليلاً أعلاه حديثا تشكيل مجمعات الالتصاق، الذي يستبعد fluorescence زائل من الطبقات الأسفل. وهكذا، إشارة بوروميسيليشن SIC زمنياً بالكاد مرئية في الأجزاء السفلية، بينما يمكننا أن وضوح obsتؤدي في الجزء الأوسط، شرح زيادة نسبة الجسم SIC/خلية إشارة في منطقة المتوسط مقارنة بالطائرات السفلي أو العلوي.

Figure 1
الشكل 1. التمثيل التجريبي بوروميسين العلاج الأمثل هو موضح في القسم 1.
(أ)
تمثيل 24-جيدا للخلايا التي تبذر في التجربة (الخطوة 1، 1). (ب) التمثيل التخطيطي للخطوة 1.4 يبين التغيير المتوسطة في الصفوف 1 و 2 لوحة 24-جيدا، وإضافة سيكلوهيكسيميدي (التايوانية) لكل بئر من الصف الثالث لتركيز نهائي من 50 ميكروغرام/مل. (ج) التمثيل التخطيطي لمعاملة بوروميسين في الصفوف الثانية والثالثة (خطوة 1.6) 15 دقيقة بعد الخطوة 1، 4. (د) التمثيل التخطيطي لمعاملة بوروميسين في الصف الأول (الخطوة 1.8) 5 دقائق بعد الخطوة 1، 6. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الرقم 2. تحديد الشروط المثلى لإدماج بوروميسين.
استخراج تحليل لطخة غربية لكامل الخلية من (أ)لجنة نهر الميكونج--5، المحتضنة هوة-7 (ب) ، (ج) هيلا خلايا، ومع تزايد تركيزات بوروميسين (0 و 2.5، 5، 7.5، 10 و 15 ميكروغرام/مل) لمدة 5 دقائق (لوحات اليسار) أو 10 دقيقة (يمين لوحات). تم اكتشاف الببتيدات بوروميسيلاتيد استخدام جسم مضاد ضد بوروميسين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3. تثبيط بوروميسيليشن باستخدام cycloheximide.
(أ)
لطخة غربية يظهر تأثير سيكلوهيكسيميدي على الإنزيم بوروميسيليشن 5-مين. إدراج الكفاءة في لجنة نهر الميكونج--5، هوة-7، وخلايا هيلا عقب موك (PBS 1 X) أو العلاج سيكلوهيكسيميدي. (ب) صورة [كنفوكل] يظهر تأثير سيكلوهيكسيميدي على إدماج بوروميسين. لجنة نهر الميكونج-5 خلايا تم قبل التعامل مع برنامج تلفزيوني (صورية) أو سيكلوهيكسيميدي لمدة 15 دقيقة وثم تستكمل مع 10 ميكروغرام/مل بوروميسين + برنامج تلفزيوني 1 X (اللوحة اليمنى) أو تم الكشف عن 10 ميكروغرام/مل من بوروميسين + 50 ميكروغرام/مل من سيكلوهيكسيميدي (اللوحة اليمنى) للبروتينات بوروميسيلاتيد 5 كحد أدنى استخدام جسم مضاد ضد بوروميسين (أخضر). واو-أكتين تم الكشف عن استخدام فالويدين (أحمر)، وكانت ملطخة النواة DAPI (أزرق). إدراج في الحق تناظر تكبير 2.5 x من مربع أبيض. أشرطة = 10 ميكرومترات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4. التحديد الكمي للنشاط متعدية الجنسيات في سايكس في ملتصقة لجنة نهر الميكونج-5 خلايا.
(أ-ج)
صورة [كنفوكل] الممثل ملتصقة لجنة نهر الميكونج-5 الخلايا تعامل مع 10 ميكروغرام/مل بوروميسين لمدة 5 دقائق. تتوافق مع الصور المعروضة أسفل (A)والأوسط (ب)، وأجزاء (ج) العلوي من الخلية. تظهر لوحات العلوي البروتينات بوروميسيلاتيد الكشف عن استخدام جسم مضاد ضد بوروميسين (أخضر). واو-أكتين تم الكشف عن استخدام فالويدين (أحمر)، وكانت ملطخة النواة DAPI (أزرق). إدراج في الحق تناظر تكبير 2 x من مربع أبيض. أشرطة = 10 ميكرومترات. لوحات الأوسط إظهار غياب مشبعة بكسل، الذي سيكون قد أبرزت باللون الأحمر. لوحات أقل إظهار تمثيل رسومي لإثراء البروتين بوروميسيلاتيد في زنزانة MRC 5 ملتصقة بمقارنة كثافة إشارة بوروميسين (الأخضر)، واكتين (أحمر)، وأشار إلى DAPI (أزرق) على طول محور الخلية بالسهم الأبيض. (د-و) تتوافق مع الصور المعروضة 4.4 × إدراج التكبير من سايكس الواردة في (أ-ج). التقدير الكمي ويبين الحدود SIC (قمم حمراء: أكتين)، فضلا عن الترجمة المترجمة داخل سايكس (الأخضر قمم: بوروميسين) في أدنى (د)، الأوسط (ه)، والمناطق (و) العلوي من الخلية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5. كامل الخلية إشارة التحديد الكمي للبروتينات بوروميسيلاتيد في الخلايا ملتصقة من لجنة نهر الميكونج-5.
(أ)
تحديد الإشارة داخل مناطق مختلفة من الطبقة السفلي z-الطائرة من خلية ملتصقة بلجنة نهر الميكونج-5. (اللوحة اليمنى) تحديد منطقة (ط) تغطي مجموع الخلية للحصول على قيمة كمية المقابلة لمجموع الإشارات الخلوية لهذه الطبقة z-الطائرة. (لوحة الأوسط) اختيار منطقة الخلوية المقابلة للنواة والجزء هيولى لا يتضمن سيك (ثانيا). (اللوحة اليمنى) التصور للمنطقة المقابلة سيكس (الثالث) بطرح القيمة التي تم الحصول عليها من المجال الثاني من القيمة التي تم الحصول عليها في الخلية كلها (منطقة أنا). أشرطة = 10 ميكرومترات. (ب) القيم الكمية بكسل لكل منطقة يتم المسرودة في الجدول للصورة التي تصور اختيار منطقة في (أ)، متبوعاً برسم يظهر النسبة (%) من الإشارات التي وجدت في سايكس- (ج) تحديد الإشارة داخل مناطق مختلفة من طبقة z-الطائرة منتصف خلية MRC 5 ملتصقة. (اللوحة اليمنى) تحديد المنطقة (ط) تغطي مجموع الخلية للحصول على قيمة كمية المقابلة لمجموع الإشارات الخلوية لهذه الطبقة z-الطائرة. (لوحة الأوسط) اختيار منطقة الخلية المقابلة للنواة والجزء هيولى لا يتضمن سيك (ثانيا). (اللوحة اليمنى) التصور للمنطقة المقابلة سيكس (الثالث) بطرح القيمة التي تم الحصول عليها للمجال الثاني من القيمة التي تم الحصول عليها في الخلية كلها (منطقة أنا). (د) قيم بكسل الكمي لكل منطقة يتم المسرودة في الجدول للصورة التي تصور اختيار منطقة في (ج)، متبوعاً برسم يظهر النسبة (%) من الإشارات وجدت في سيكس. (ه) تحديد الإشارة داخل مناطق مختلفة من الطبقة العليا z-الطائرة من خلية ملتصقة بلجنة نهر الميكونج-5. (اللوحة اليمنى) تحديد المنطقة (ط) تغطي مجموع الخلية للحصول على قيمة كمية المقابلة لإشارة خلية الإجمالي لهذه الطبقة z-الطائرة. (الفريق الأوسط) تحديد منطقة الخلية المقابلة للنواة والجزء هيولى لا يتضمن سايكس (ثانيا). (اللوحة اليمنى) التصور للمنطقة المقابلة سايكس (الثالث) بطرح القيمة التي تم الحصول عليها للمجال الثاني من القيمة التي تم الحصول عليها في الخلية كلها (منطقة أنا). (و) قيم بكسل الكمي لكل منطقة هي المسرودة في الجدول للصورة التي تصور اختيار منطقة في (ه)، متبوعاً برسم يظهر النسبة (%) من الإشارات وجدت في سايكس- (ز) قيم القياس الكمي لكافة الطبقات z-الطائرة من الخلية المعروضة أعلاه، بما في ذلك واحدة المحسوبة لطائرات z في A (z = 1)، ج (z = 9)، والإلكترونية (z = 19)، التي يتم تمييز باللون الأحمر في الجدول. (ح) تمثيل رسومي للنسبة المئوية للإشارات الموجودة في سايكس في جميع أنحاء حجم الخلية بأكملها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وأتاحت التطورات التكنولوجية الحديثة لفهم أفضل لآليات المشاركة في upregulation متعدية الجنسيات أو قمع مرناس محددة في العمليات البيولوجية، مثل تنمية الخلايا العصبية والمخدرات واستجابة وورم خبيث. منهجية فعالة من حيث التكلفة الموضحة هنا يسمح لترجمة الأحداث تصور في الخلايا لدراسة كيف البروتينات الحمض النووي الريبي ملزمة تنظم عمليات المنتشر، مثل التصاق الخلوية، والهجرة، والغزو.

على الرغم من أن قد وضعت أساليب عديدة لتقييم الترجمة البروتين حيثياته ، أنهم جميعا مشاركة نفس الاستراتيجية، التي تتضمن ببتيد الونجاتينج تعديل للأحماض الأمينية الموسومة مجموعة قابلة للاكتشاف. وأول هذه الأساليب تعتمد على 35إدماج راديولابيليد S ارجينين البروتين المترجمة حديثا. استخدام الأحماض الأمينية راديولابيليد على الرغم من أنها تتسم بالكفاءة لمقارنة المعدلات العامة للترجمة تحت شروط معينة، يجعل هذا الأسلوب غير جذاب لمعظم فرق البحث. ومن ثم تطوير الرواية أساليب استخدام تسميات غير المشعة، مثل غروب الشمس، فانقر فوق، أو نهج خدعة، تتيح فرصاً جديدة لتقييم ومراقبة في فيفو الأحداث الترجمة. على الرغم من أن بارعة، معظم هذه الأساليب تسمح فقط لتقييم الأحداث الترجمة بعد العلاج من تعاطي المخدرات أو الأحداث الخلوية محددة كدنا خارجية محددة باستخدام بناء محددة الأهداف، الحد من التجارب إلى الأهداف المحددة بالفعل . وهذا صحيح لخدعة النهج4، الذي يسمح لتنظيم متعدية لهدف واحد مناشئ أعرب مرناً تقييم. على الرغم من أنه يسمح للتحقق تفعيل متعدية الجنسيات مرناس الذاتية، هو وقت الحضانة الحد الأدنى الأسلوب "فانقر فوق" إدراج اها على الأقل 1 ح13، الذي يعتبر الأكثر حدة ترجمة آليات لفترة طويلة جداً.

بينما تنوعاً للغاية وسهلة لإعداد، يتطلب الأسلوب الموصوفة هنا اتباع الخطوات الحاسمة في المرحلة الأولى من البروتوكول. خطوط الخلايا مختلفة كما هو موضح في نتائج تمثيلية، سيكون لها حركية إدماج بوروميسين المختلفة، التي قد تكون مجرد نتيجة لمعدل التمثيل الغذائي لكل خط الخلية، كما يبدو أن الحال بالنسبة للحركة الثورية الكونغولية-5 خلايا5،21. في الواقع، عدم تحويل الخلايا ليست التكاثري، كالحلة، وذلك، أقل متانة من التجديد الشامل البروتين في الخلايا المحولة. ينبغي أن يؤخذ هذا في الاعتبار عند استخدام البروتوكول. وبناء على ذلك، الجزء الأول من البروتوكول حاسمة بالنسبة لبقية الأسلوب. بعناية تحديد تركيز بوروميسين ومدة حضانة المرض سيسمح بإجراء تقييم أفضل للترجمة التي تحدث أثناء التجربة. كما هو مذكور أعلاه، المعاملة مع كمية زائدة من بوروميسين يزيد من نسبة البروتينية بوروميسيلاتيد الصغيرة ويبدو أن تحفز بروتيوليسيس، التي يمكن أن تؤدي بسهولة إلى إساءة تفسير عادة حدوث الأحداث متعدية19 . وكقاعدة عامة، أطول فترة الحضانة، بوروميسين أقل مطلوب، بينما يتطلب فترة حضانة أقصر تركيز بوروميسين أعلى. أن التركيز يمكن تكييفها لقيود تجريبية خاصة.

الأساليب المقدمة هنا هي القدرة على التكيف ويمكن بسهولة تعديل وفقا للمعاملة التي تطبق أو البيولوجية عملية درس. إدراج بوروميسين يسمح للتقييم السريع للتغيرات في حركية الترجمة خلال فترة قصيرة من الوقت، بينما يوفر الأسلوب الكمي الصور الزاخر من الأحداث الخلوية. على الرغم من أن قوي، هذه الأساليب والقيود التي يجب النظر فيها. بوروميسين ستدمج في البروتينات المركبة حديثا من جميع مرناس التي تترجم بنشاط. ولهذا السبب، بوروميسيليشن الأسلوب الموصوفة هنا قد لا تكون مناسبة لدراسة أهداف محددة (أي، واحد مرناس)، ولكن مثالي للحصول على لمحة عامة عن النشاط متعدية الجنسيات داخل خلية مفردة أو عدد سكان خلية. وكما ذكر أعلاه، بوروميسين المفرط العوائق الرئيسية، وجرعات بوروميسين وأوقات العلاج ينبغي تحديدها بدقة، كما هو مقترح في البروتوكول. وفي الواقع، كما هو مبين في الشكل 2، سيؤدي إلى توافر بوروميسين المفرطة في تشكيل أصغر البروتينية بوروميسيلاتيد أنه منتشر أكثر سرعة في الخلية، مما يؤدي إلى بيانات غير دقيقة ومسلم سوبسيلولار. بالإضافة إلى ذلك، المعروف بروتيوليسيس زيادة تحدث بعد بوروميسين المفرطة العلاج19، هو تأثير الذي قد يؤدي إلى فقدان كامل لإشارة.

على الرغم من أن غير محددة كما أنها فوق أو أساليب الخديعة، النهج المقترح هنا هو الوصول للغاية ويسمح للتقييم السريع للتغيرات العامة في حركية الترجمة. حتى إذا كانت أساليب أخرى أكثر ملاءمة لتطبيقات محددة، يمكن إجراء فحوصات إدماج بوروميسين كعنصر تكميلي. وفي الواقع، إذا التجربة يحتاج إلى إظهار أن هدفا محدداً مرناً هو الوحيد الذي يؤثر في حالة معينة، من الضروري أن تبين أن هذا ليس الناجم عن زيادة عامة في الترجمة. على هذا النحو، إدراج بوروميسين السلبية يمكن أن تقدم أدلة لهذه القضية. وعلاوة على ذلك، هذا الأسلوب مناسب تماما لمراقبة التغيرات العامة في أسعار الترجمة. ومن ثم، يمكن استخدامه لإظهار إليه قمع لترجمة، كما في حالة الإجهاد الحبيبية تشكيل9، أو للتحقق من صحة إذا كان يتم حظر المعاملة سيكلوهيكسيميدي المستخدمة في المرحلة الأولية لوجود المعقدة متعدية كفاءة استطالة22. من المهم أيضا أن نذكر أنه، على الرغم من أن أساليب القياس الكمي هو موضح في المقاطع 2.3 و 2.4 تتعلق بتجارب مع التركيز على تلطيخ بوروميسين، يمكن تطبيقها على أي نوع من تلطيخ مجزأة باستخدام أنواع مختلفة من فلوروفوريس. والواقع أن هذه الأساليب الكمي يمكن استخدامها لقياس توزيع الخلوية جزيء أو بروتين وحتى يمكن التحقق من صحة الترجمة من المستهدف في حجرة سوبسيلولار محددة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

ونحن نشكر الدكتور رشيد المزروعي (جامعة لافال، كيبيك، كندا) لقراءة نقدية من المخطوطة. ونحن نشكر "وحدة التصوير الخلية" التابعة لمركز البحوث الخاصة بالمساعدة التقنية. هوت م. É. هو أحد علماء البحوث 1 جونيور دي فوندز بحوث دو كيبيك والصحة (فرق-S). هذا العمل كان يدعمها "المعاهد الكندية للبحوث الصحية" (منح عدد استوفوا، 286437 اجتماع الأطراف أن É م. هوت).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM wisent 319-005-CL
Trypsine wisent 325-043 EL
FBS Thermo Fisher Scientific 12483020
Puroycin antibody 12D10 EMD millipore MABE343 western blot dilution 1:25,000
Immunofluoresence dilution 1:10,000
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody cell signaling technology 7076 western blot dilution 1:8,000
Western Lightning Plus-ECL Perkin Elmer NEL104001EA
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate) cell signaling technology 4408 immunofluoresecence dilution 1:400
CF568 Phalloidin biotium 00044 immunofluoresecence dilution 1:400
Cyclohexmide Sigma C1988-1G 50µg/ml final concentration
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306 final concentration 1µg/ml
Puromycin bio-Basic PJ593 2.5µg/ml to 10µg/ml
Ibidi µ-Dish 35 mm, high, ibiTreat Ibidi 81156
MRC-5 cells ATCC CCL-171
HeLa cells ATCC CCL-2
Huh-7 cells from Dr. Mazroui (Université Laval)
Fv1000 olympus confocal imaging system
Fiji software http://fiji.sc
PBS (Phosphate BuffeRed Saline) bio-Basic PD8117
Formaldehyde 37% Solution bio-Basic C5300-1
Triton X-100 bio-Basic TB0198
BSA Fisher Bioreagents BP9702-100
Tween20 Fisher Bioreagents BP337-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. Dynamics of Translation of Single mRNA Molecules In Vivo. Cell. 165, 976-989 (2016).
  2. Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352, 1425-1429 (2016).
  3. Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. H. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 352, 1430-1435 (2016).
  4. Halstead, J. M., et al. TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals. Methods Enzymol. 572, 123-157 (2016).
  5. Bergeman, J., Caillier, A., Houle, F., Gagne, L. M., Huot, M. E. Localized translation regulates cell adhesion and transendothelial migration. J Cell Sci. 129, 4105-4117 (2016).
  6. El Fatimy, R., et al. Tracking the Fragile X Mental Retardation Protein in a Highly Ordered Neuronal RiboNucleoParticles Population: A Link between Stalled Polyribosomes and RNA Granules. PLoS Genet. 12, e1006192 (2016).
  7. Adjibade, P., et al. Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells. Oncotarget. 6, 43927-43943 (2015).
  8. Paronetto, M. P., et al. Sam68 regulates translation of target mRNAs in male germ cells, necessary for mouse spermatogenesis. J Cell Biol. 185, 235-249 (2009).
  9. Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. S. U. nS. E. T. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nat Methods. 6, 275-277 (2009).
  10. Azzam, M. E., Algranati, I. D. Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 70, 3866-3869 (1973).
  11. Goodman, C. A., Hornberger, T. A. Measuring protein synthesis with SUnSET: a valid alternative to traditional techniques. Exerc Sport Sci Rev. 41, 107-115 (2013).
  12. David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. J Cell Biol. 197, 45-57 (2012).
  13. Fallini, C., Bassell, G. J., Rossoll, W. Spinal muscular atrophy: the role of SMN in axonal mRNA regulation. Brain Res. 1462, 81-92 (2012).
  14. Costa-Mattioli, M., et al. Translational control of hippocampal synaptic plasticity and memory by the eIF2alpha kinase GCN2. Nature. 436, 1166-1173 (2005).
  15. Costa-Mattioli, M., Sossin, W. S., Klann, E., Sonenberg, N. Translational control of long-lasting synaptic plasticity and memory. Neuron. 61, 10-26 (2009).
  16. Du, T. G., Schmid, M., Jansen, R. P. Why cells move messages: the biological functions of mRNA localization. Semin Cell Dev Biol. 18, 171-177 (2007).
  17. Ephrussi, A., St Johnston, D. Seeing is believing: the bicoid morphogen gradient matures. Cell. 116, 143-152 (2004).
  18. Mardakheh, F. K., et al. Global Analysis of mRNA, Translation, and Protein Localization: Local Translation Is a Key Regulator of Cell Protrusions. Dev Cell. 35, 344-357 (2015).
  19. Lacsina, J. R., et al. Premature translational termination products are rapidly degraded substrates for MHC class I presentation. PLoS One. 7, e51968 (2012).
  20. Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).
  21. Jacobs, J. P., Jones, C. M., Baille, J. P. Characteristics of a human diploid cell designated MRC-5. Nature. 227, 168-170 (1970).
  22. Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J Vis Exp. (87), (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics