Immunofluorescence כמותי מודדים הגלובלי לשפות אחרות תרגום

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

כתב יד זה מתאר שיטה כדי להמחיש ולכמת תרגום לשפות אחרות אירועים בתאים subcellular. הגישה המוצעת כתב יד זה דורש מערכת הדמיה קונאפוקלית בסיסית, ריאגנטים, והוא מהיר וחסכוני.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Bergeman, J., Huot, M. É. Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation. J. Vis. Exp. (126), e55909, doi:10.3791/55909 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

מנגנוני ויסות ה-mRNA תרגום מעורבים תהליכים ביולוגיים שונים, כגון פיתוח קו נבט, תאית התמיינות organogenesis, כמו גם מחלות מרובות. פרסומים רבים הראו בצורה משכנעת למנגנונים הספציפיים לווסת בחוזקה mRNA תרגום. עניין גדל בוויסות הנוצרות על-ידי תרגום של ביטוי חלבון הובילה בפיתוח שיטות רומן ללמוד ולעקוב אחרי דה נובו חלבון סינתזה ב- cellulo. עם זאת, רוב השיטות האלה הם מורכבים, הפיכתם יקר, לעיתים קרובות הגבלת מספר מטרות mRNA שניתן ללמוד. כתב יד זה מציעה שיטה הדורשת רק בסיסי ריאגנטים, מערכת הדמיה פלורסצנטיות קונאפוקלית כדי למדוד והמחש את השינויים בתרגום mRNA המתרחשים בכל שורת התאים בתנאים שונים. לאחרונה להשתמש בשיטה זו כדי להציג תרגום לשפות אחרות המבנים subcellular של תאים חסיד על פני תקופה קצרה של זמן, ולכן מציע את האפשרות להמחיש תרגום דה נובו לתקופה קצרה במהלך מגוון ביולוגי תהליכים או של אימות שינויים בפעילות translational בתגובה לגירויים מסוימים.

Introduction

התקנון של תרגום על ידי תאיים שונים יש בקשה רבים צוותי המחקר לפתח כלים חדשים, שיטות לקביעת ההתאמה subcellular של mRNA תרגום וחלבון מוסדר סינתזה1,2 ,3,4. ההתקדמות הטכנולוגית האחרונות אלה מאפשרים הבנה משופרת של המנגנונים הקשורים קולטנים upregulation תרגום או הדיכוי של mRNAs ספציפי במהלך תהליכים ביולוגיים, כגון פיתוח עצביים, סמים התגובה גרורות5 ,-6,-7,-8. עם זאת, רוב השיטות האלה דורשים יקר או מסוכנים ריאגנטים וציוד ספציפי כי לא יכול להיות זמין ברוב מעבדות. ככזה, פותחה שיטה חסכונית כדי לאפשר ההערכה המהירה של תרגום אירועים לעקוף באופן ספציפי אלה בעיות פוטנציאליות. שיטה זו מזהה חריפה האפנון translational להתרחש במהלך תהליכים תאיים ספציפיים, מאפשר גם עבור ההתאמה של תרגום באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

השיטות המתוארות כאן שימשו כדי לפקח על תרגום לשפות אחרות בתוך תאי subcellular שנקרא חניכה מתפשטת מרכזי (SIC)5. SICs הם מבנים ארעיים נמצאו בתאים הזריעה מותאמים על מתחמי אדהזיה המתהווה. למרות SICs, מתחמי אדהזיה ברורים, וגורלם הדוק. אכן, SICs ידועים להיעלם בהדרגה עם ההבשלה מורכבים אדהזיה מוקד לתוך אתר אדהזיה בשלב הראשוני של הידבקות. מצאנו כי RNA מחייב חלבונים ידוע בקרה ספציפית על תרגום ה-mRNA (למשל, Sam68, FMRP, ו G3BP1) ומבנים polyadenylated RNAs היו מועשר בתוך אלה5. שימוש בשיטות המתוארות כאן, הראינו כי ברגולציה של mRNA SIC-הקשורים תרגום משמש מחסום ומאפשר נזרע תאים כדי לאחד אדהזיה תא. שיטה זו, המבוססת על תאגיד puromycin, יכול להיחשב גירסה מותאמת של חישת משטח תרגום assay (שקיעה). פותח במקור כדי למדוד את המחירים סינתזת חלבון העולמי באמצעות של חומצת אמינו שאינן radioactively שכותרתו, חלבון puromycilation מציע דרך יעילה כדי להמחיש סינתזה של חלבון דה נובו 9. שיטה זו מתבססת על ההתנהגות מהותי של puromycin, אנטיביוטיקה החוסמת תרגום דרך שרשרת מוקדמת סיום ריבוזום10. אכן, puromycin הוא מקביל מבחינה מבנית tyrosyl-tRNA, המאפשר השתלבות מתארך פפטיד שרשראות דרך היווצרות של קשר פפטידי. לעומת זאת, מחייב puromycin שרשרת פפטיד גדל מונעת של קשר פפטידי חדשה נוצרת עם הבא aminoacyl-tRNA, מאז puromycin יש קשר אמיד hydrolysable במקום הקשר אסתר hydrolysable נמצאו ב- tRNAs. לפיכך, שילוב של puromycin לתוך מתארך polypeptides תוצאות במהדורה מוקדמת של polypeptides puromycilated קטום רבים המתאימים מתורגם באופן פעיל mRNA9,11,12 .

באמצעות שיטה זו, ניתן היה להעריך פעיל תרגום בתוך אלמנה זמן קצר (למשל, 5 דקות) במהלך אדהזיה הסלולר באמצעות של נוגדנים ספציפיים נגד puromycin על תאים היו בתוספת האנטיביוטיקה לתקופות 5-מין בנקודות זמן שונות במהלך תהליך אדהזיה5תאים. הדיוק של שיטת זו מסתמכת על נוגדנים ספציפיים מאוד נגד את moiety puromycilated. זיהוי immunofluorescent מפוליפפטיד puromycilated מספק של repartition subcellular הכללי של mRNA שתורגם, אשר גם ניתן לכמת בדיוק רב באמצעות מערכות הדמיה קונפוקלי.

לכן, השיטה מציעה אופציה רלוונטית עבור מספר רב של מעבדות לימוד מנגנוני הרגולציה translational המעורבים בתהליכים כגון פרור עצביים6,13,14, 15, מורפוגן mRNA לוקליזציה ותרגום במהלך פיתוח16,17. זה גם מתאים במיוחד לימודי תרגום לשפות אחרות או ממודר במהלך מהיר אירועים ביולוגיים כגון נדידת תאים, הדבקות או חדירה או להעריך פשוט טיפולים בסמים עלול לגרום שינויים translational5, 7 , 18. בסך הכל, שיטה זו מאפשרת עבור הפריט החזותי של אירועים תרגום לשפות אחרות או מבוקר בצורה מהירה, מדויקת וחסכונית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. נחישות של תנאים Puromycilation

הערה: טכניקה זו מתאר את השיטה להערכת תרגום לשפות אחרות במהלך תהליך 5 אדהזיה תא MRC-5. כפי puromycilation יכול להיעשות בתא כלשהו, חשוב למטב את התנאים puromycilation עבור שורות תאים מסוים לשמש, כי התנאים הטיפול אינם זהים עבור כל קו תא מבחינת הריכוז puromycin, את הרצוי זמן הדגירה. כדי להראות כמה תנאים אלה מוגדרים, שלוש שורות תאים דוגמה (קרי, הלה, MRC-5 ו- 7-מה) טופלו עם הגדלת ריכוזי puromycin לזמנים שונים דגירה ( איור 1).

מספרים זהים
  1. הגידול של תאים בצלחת 24-ובכן ב- 0.5 מ ל המתאים להשלים תרבות בינוני h 16 לפני המבחן. זרע 30,000 MRC-5 תאים, התאים הלה 50,000 או 50,000 תאים מה-7 לכל טוב. הקפד להימנע מחריגה 60-70% הנהרות (איור 1 א').
  2. הכן 6 צינורות עם mL 1.5 תא שלם של תרבות בינוני עם הגדלת ריכוזים של puromycin (0, 5, 10, 15, 20, ו 30 µg/mL). חם מראש ב 37 º C
  3. עבור כל ריכוז של puromycin בינוני (שלב מוכן ב- 1.2), העברת 0.5 מ של כל צינור לתוך צינורות חדשים 6 ולהוסיף cycloheximide-ריכוז הסופי של µg 50/mL כל 6 צינורות חדשים. חם מראש ב 37 º C
  4. לשנות את המדיום עם 0.5 מ של תרבות שלמה בינוני (שורה 1 ו- 2). השורה השלישית, הוסיפו 0.5 מיליליטר בינוני תרבות מלאה בתוספת 50 µg/mL של cycloheximide ( איור 1B).
    הערה: טיפול Cycloheximide הוקם של הפקד שלילי הטוב ביותר עבור puromycilation חלבון בשל יכולתו לחסום את התארכות תרגום. כי puromycin התאגדות דורש תרגום התארכות, טיפול cycloheximide מוביל לאובדן של puromycilated חלבון אותות 5 , 18-
  5. תקופת דגירה של 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס (5% CO 2).
  6. להוסיף 0.5 מ"ל של המדיום puromycin מוכן בשלב 1.2 על השורה השניה כדי לקבל ריכוזים הסופי של 0, 2.5, 5, 7.5, 10 ו- 15 µg/mL, בהתאמה, בעמודות A, B, C, D, E ו- F. במקביל, להוסיף 0.5 מ של puromycin בתוספת cycloheximide המדיום (שלב 1.3) בשורה השלישית ( איור 1C).
  7. תקופת דגירה של 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס (5% CO 2).
  8. להוסיף 0.5 מ"ל של המדיום puromycin מוכן בשלב 1.2 לשורה הראשונה כדי לקבל ריכוזים הסופי של 0.0, 2.5, 5, 7.5, 10 ו- 15 µg/mL ( איור 1C).
  9. תקופת דגירה של 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס (5% CO 2).
  10. לרחוץ כל אחד מן שורות 1-3 עם 1 מ"ל של קרח 1 X באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) 5 דקות לאחר התוספת של puromycin כדי בארות של השורה הראשונה (לשטוף פעמיים). להוסיף µL 75 מאגר X Laemmli 1 (4% נתרן גופרתי dodecyl (מרחביות), 4% מרקפטואתנול, M HCl טריס 0.120 pH 6.8, גליצרול bromophenol כחול, ו-10% 0.004%) כדי להשיג כל-תא lysates עבור כל תנאי.
  11. לרוץ 10% מרחביות-לזיהוי בג'ל (מרחביות-עמוד) באמצעות 1/3 של הדגימות מוכן כדי להעריך puromycin ההתאגדות.
    1. לקבוע רמת התאגדות puromycin על ידי ניתוח תספיג באמצעות נוגדן אנטי puromycin (12 יח 10) מדולל ביחס של ערים ב מאגר הדגירה נוגדן ראשוני (2% שור אלבומין (BSA)), 430 מ מ NaCl, 10 מ מ טריס pH 7.4 ו- 0.01% אזיד הנתרן).
      הערה: להחליפן בתמונות המתאים תמציות קו תא שונים שנעשו כפי שמתואר בשלב 1 מוצגות כדוגמאות באיור 2.

2. ב- Cellulo לשפות אחרות תרגום חזותי

הערה: בטכניקה המתוארת כאן שימש להערכת תרגום לשפות אחרות בתוך SICs בתאים MRC-5 במהלך תהליך אדהזיה 5. למרות MRC-5 תאים משמשים כאן, שורות תאים אחרים ניתן להשתמש עם המתודולוגיה באותו שמתואר בשלב 2.1.

  1. תא הכנה-
    1. ניתוק MRC-5 תאים באמצעות 0.25% טריפסין/2.21 מ מ ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) בהאנק ' s מאוזנת פתרון מלח (HBSS). גלולה התאים על ידי צנטריפוגה (5 דקות ב- 200 x גרם) בשפופרת צנטרפוגה חרוט 15-mL ו להשעות אותם ב- Dulbecco ' s השתנה נשר בינוני (DMEM) בתוספת 10% עוברית שור סרום (FBS)-תאים למ"ל 40,000 לאחר ספירת עם חדר הספירה.
    2. דגירה התאים על תנאי ב 37 ° C תחת סיבוב עדין באמצעות מסובב שפופרת של כעשרים דקות כדי לשמור אותם ההשעיה.
      הערה: שלב זה הוא קריטי כדי לאפשר הדיסוציאציה מלאה של מתחמי אדהזיה מוקד.
    3. צלחת 2 מ"ל של תאים MRC-5 על תנאי (40,000 תאים/mL) בשתי מנות 35 מ מ זכוכית-התחתון. המנה 35 מ מ זכוכית המדרגה הראשונה לשימוש וזמינותו puromycilation (ראה שלב 2.1.5) ולהשתמש השני כפקד שלילי (ראה שלב 2.1.6).
    4. לשמור את התאים ב 37 מעלות צלזיוס (5% CO 2) במשך 55 דקות לאפשר אדהזיה סלולרית ויצירת SIC.
    5. Puromycin הוסף למדיום מנות 35 מ מ זכוכית-התחתון (assay) באמצעות ריכוז שהוגדרה קודם לכן בסעיף 1. כדי להתייחס MRC-5 תאים, השתמש puromycin µg/mL 10 עבור 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס (5% CO 2).
    6. כפקד שלילי, להוסיף cycloheximide למנה 35 מ מ זכוכית המדרגה השניה 40 דקות לאחר זריעה התאים להתייחס אליהם מראש עם µg/mL 50 cycloheximide ( איור 2B). לאחר מכן, 15 דקות לאחר cycloheximide תוספת, להוסיף puromycin המדיום באמצעות ריכוז, דגירה זמנית כמו שלב 2.1.5 (למשל, שימוש 10 µg/mL של puromycin עבור 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס (5% CO 2) MRC-5).
    7. לרחוץ כל צלחת פעמיים עם 2 מ של קרח 1 X PBS ולתקן את התאים עם 1 מ"ל של 4% פורמלדהיד (מדולל ב- 1 X PBS) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
      התראה: Paraformaldehyde יש להשתמש אך ורק ברדס כימי.
  2. Immunostaining.
    1. בעקבות קיבוע paraformaldehyde, לשטוף שלוש פעמים עם 2 מ ל 1 X PBS, תקופת דגירה של 500 µL של PBS-TritonX-100 (0.5%) של 20 דקות ב RT כדי permeabilize את התאים.
    2. כדי למנוע מחייב נוגדן ספציפי, לחסום את הדגימה עם 500 µL PBS – BSA (1%) במשך 20 דקות ב- RT.
    3. שלוש פעמים עם 2 מ של PBS-Tween20 (0.1%) וקונטה דגירה עם 300 µL של 1:12,500 אנטי-puromycin נוגדנים (12 יח 10) מדולל ב- PBS X 1 על 1 h RT.
    4. 3 פעמים עם 2 מ של PBS-Tween20 (0.1%) וקונטה דגירה עם 300 µL של העכבר אנטי איג מצומדת כדי fluorophore (כאן, 488 ננומטר) מדולל ב- PBS לדמיין puromycilated polypeptides ועם phalloidin מצומדת כדי fluorophore אחרת (כאן, 555 ננומטר) כדי להמחיש F-אקטין. תקופת דגירה של 1 h RT.
    5. ואז תקופת דגירה של 5 דקות ב RT ב- 300 µL של PBS-Tween20 (0.1%) בתוספת µg 1/4 מ"ל וקונטה שלוש פעמים עם 2 מ של PBS-Tween20 (0.1%) ', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי).
    6. לרחוץ שלוש פעמים עם 2 מ של PBS-Tween20 (0.1%), ולאחר מכן לשטוף עם 2 מ ל 1 X PBS. למנוע את התאים מתייבשים על ידי שמירה המדגם על 2 מ ל 1 X PBS במהלך ייבוא תמונות.

3. ייבוא תמונות immunofluorescent

הערה: המתודולוגיה הבאים ניתן להשתמש עם כל מערכת הדמיה זמינים מסחרית קונפוקלי.

  1. המתאים לקבוע הגדרות עבור כל fluorophore להגדיל את הטווח הדינמי על כימות.
    הערה: נציג כימות יכולה להיות מושגת רק אם רוויה פיקסל הוא נמנע הסף אות מכוונן כראוי. הגדרות אלה יכולות להיות על-ידי התאמת בקפידה את עוצמת הלייזר, מתח גבוה (HV), לקבל, היסט...
    1. התאם הזום גורם (5 X), מספר הפיקסלים (512 x 512) כדי למטב את גודל פיקסל.
      הערה: זה צריך להיות לפחות 2.3 - פעמים קטנים יותר לרזולוציה אופטית, על-פי משפט נייקוויסט.
    2. להקטין את מהירות סריקה (12.5-20 µs לפיקסל), להשתמש בממוצע (2 - 3 פעמים) כדי לשפר את יחס אות לרעש בהתאם להגדרות הנ ל.
  2. באופן ידני לקבוע העליון המתאים והתחתונים מטוסים מוקד לאורך ציר z עם גודל צעד אופטימלית (0.4 מיקרומטר פרוסה).
    הערה: המטוס גודל צעד נקבעת לפי הרזולוציה צירית מחולק 2.3, בהתאם משפט נייקויסט המוכלל. בדרך כלל, 20-25 שכבות נחוצים לכסות את כל התא עומק תאים חסיד.
  3. לרכוש תמונה קונאפוקלית של תא יחיד כולו עם 60 X לתכנן Apo שמן טבילה יעד (מפתח נומרי 1.42 ג ' יגה).

4. כימות תמונה immunofluorescent

  1. נחישות העשרה.
    1. לפתוח תמונה המתאימה בשכבת מטוס ה-z עניין מקובץ הנתונים רכשה תא באמצעות התוכנה ImageJ (freeware לרשותכם http://fiji.sc).
    2. לצייר קו באמצעות הכלי קו ציור (סרגל הכלים → ישר) דרך האזורים של התא שבו רצוי כמת. לשנות את רוחב הקו על-ידי לחיצה כפולה על " שכיבה על הגב " ערכי העוצמה ייכללו בממוצע דרך רוחב הקו (מוגדר ב-8 באיור 3).
      הערה: קו דק יותר הוא העדיף להימנע אות חפיפה של מבנים שונים.
    3. אחרי הקו מוגדר כראוי, פרופיל הצפיפות אות לאורך הציר נחוש (שורת התפריטים → ניתוח → פרופיל מגרש).
      הערה: חלון חדש יפתח המציגה פרופיל התואם עוצמת האות לכל פיקסל של הערוץ שנבחר (fluorophore ספציפי) לאורך הקו עבור המקטע שנבחר מטוס ה-z.
      1. חזור על התהליך לכל ערוץ התואם fluorophore בשימוש (קרי, כימות אחד עבור 488, אחד עבור 568 ואחד 405).
        הערה: הערך עוצמת האות תמיד תידרש בעקבות הכיוון של הקו מצוירות.
    4. כדי להשיג את הערכים מספריים בגווני אפור לכל פיקסל של הפרופיל התואם quantifications של השכבה שנבחרה מטוס ה-z, העתק את נתוני הפרופיל (שורת תפריטים בחלון התמונה → עותק) והדבקתו בתוכנה בכל גיליון אלקטרוני-
    5. 4.1.1-4.1.4
    6. חזור על שלבים עבור כל מקטע מטוס ה-z של התמונה קונאפוקלית רכשה ו כל ערוץ שבו רצוי כמת.
      הערה: יכול להיות איחדו כימות של שכבות שונות של מטוס ה-z כדי לקבל הערכה כללית של העשרת מיוחד של האות על-ידי חישוב הערך סכום של כל פיקסל לאורך הקו עבור כל שכבת מטוס ה-z. סוג זה של איגוד תושג רק קו שצויר הינו זהה עבור כל שכבת מטוס ה-z כללו את הערכים רשע.
    7. כאמצעי חלופי עבור כל תא כימות של ערוצים שונים עם מספר רב של שכבות, להשתמש במאקרו שנקרא StackprofileData (ראה קובץ משלים).
      הערה: פקודת מאקרו זו נגישה בחופשיות-https://imagej.nih.gov/ij/macros/StackProfileData.txt והוא יכול לשמש כדלקמן:
      1. להדביק את המאקרו לתוך קובץ טקסט ולשמור את זה
      2. לפתוח את קובץ התמונה הכוללת את כל השכבות קונאפוקלית של התא.
      3. לצייר קו, כמתואר בשלב 4.1.2, לפתוח חלון חדש לייבא את המאקרו (שורת התפריטים → תוספים → מאקרו → להפעיל), בחר את קובץ הטקסט שנשמר התואם המאקרו StackprofileData ולחץ " פתוח. "
        הערה: בעקבות מאקרו היבוא, חלון חדש בשם " תוצאות " יפתח, כל כימות לאורך הציר נחוש יפורטו עבור כל שכבת מטוס ה-z של ערוץ נוכח קובצי התמונה.
      4. להעתיק את הנתונים לכל ערוץ (שורת התפריטים → לערוך → Copy) כדי לקבל ייצוג גרפי הפרופיל התואם quantifications אות. להדביק אותם בכל תוכנת הגיליון האלקטרוני. לחשב את ערך סכום של כל ערוץ לכל פיקסל לאורך הקו עבור כל שכבת מטוס ה-z. השתמש בערכים אלה כדי ליצור ייצוג גרפי הדומה לזה המוצג באיור 3.
  2. כימות של האות באזור המיועד הסלולר או נפח.
    1. לפתוח את קובץ התמונה בתוכנה ImageJ.
    2. לצייר על שטח לציון אזור עניין באמצעות הפונקציה צורה גיאומטרית (סרגל הכלים → " מלבן, " " סגלגלות, " או " מצולע ").
      הערה: הערך כימות ייקבעו על האזור המתאים בטופס מצוירות.
    3. להתאים את רמת הסף כדי למנוע כל אות רקע (שורת התפריטים → להתאים את התמונה → סף); יופיע חלון חדש כדי לייצג את עוצמות פיקסל בטופס היסטוגרמה. לשנות את הערכים לכלול/לא לכלול פיקסלים כימות בעזרת המחוון ' '. בחר סף המונע אדום פיקסלים מחוץ לתא, כמו פיקסלים המסומנים באדום ייכלל כימות.
    4. להגדיר את הפרמטרים מדידה לכמת את האות פיקסל בתוך האזור הנבחר, ללא רקע אות (שורת התפריטים → ניתוח → להגדיר מידות), הקפד לבדוק " הגבלה על הסף " ו " צפיפות משולב " תיבות.
    5. למדוד כמותית הערכים עבור האזור שנבחר (שורת התפריטים → ניתוח → מדידה).
      הערה: כימות עוצמת האות יוצגו בחלון חדש תחת " IntDen " זיהוי, אשר מייצג את המוצר של ערכי אפור רשע לבין מספר הפיקסלים בתוך האזור הנבחר.
    6. לצייר אזור הכולל את התא כולו באמצעות צורה גיאומטרית (סרגל הכלים → " מלבן, " " סגלגלות, " או " מצולע ") ולהמשיך עם 4.2.3-4.2.5 צעדים כדי להשיג ערך התואם לאות הכולל. לחשב את היחס של האות בתוך האזור הנבחר מעל האות כל להשיג את האחוזים של האות בתוך אזור עניין.
    7. חוזר 4.2.2-4.2.6 צעדים כדי להשיג כימות של תא האחסון עבור כל מטוס ה-z. להתאים את הצורה הגיאומטרית כנדרש.
    8. העתק/הדבק הנתונים המתקבלים " תוצאות " של windows עבור כל שכבת מטוס ה-z לתוך גיליון אלקטרוני לקבלת תיאור גרפי וכדי למצוא ערך רשע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

להבחין במדויק באירועים תרגום באמצעות התאגדות puromycin, זה קריטי כדי לקבוע את התנאים אופטימליים עבור כל קו תא כי כל מראה שונה puromycin התאגדות קינטיקה (איור 1)9,11 12, ,18. מכאן, כדי לאמת puromycin התאגדות, זה צורך להתייחס לקו התא הרצוי עם קשת מתוקננת של ריכוז puromycin (1.0 2.5, 5.0, 7.5, 10.0, 15.0 µg/mL) לתקופות שונות (5 ו- 10 דקות). כדי להעריך תרגום לשפות אחרות או מענה בתחילת הטיפול בתרופה, זמן הדגירה קצר יותר הוא מועדף (למשל, פחות מ- 5 דקות), שכן היא מאפשרת על הערכה ישירה של האירועים translational ישירות בעקבות טיפול מסוים. באופן אידיאלי, האות puromycin צריך להיות בקלות לזיהוי, אך כדאי גם להימנע נקודת רוויה (איור 2). כפי שהיא מתוארת באיור 2 (לוחות שמאלה), ריכוז puromycin מקובל הוא 7.5-10.0 µg/mL עבור MRC-5 והלה, ואילו 5.0-7.5 µg/mL של puromycin הוא הציע עבור מה-7. אופטימיזציה של הפרמטרים נסיוני חיוני כי המטרה של שיטה זו היא לא לגמרי לעכב כל התארכות translational ברגע של חניכה אלא כדי לתייג לאחרונה synthetized מפוליפפטיד שרשראות במהלך התרגום כדי לזהות חריפה וריאציות בתרגום. זה השלב הראשוני בפרוטוקול לא צריך להיות puromycin מוזנח, כמו יתר זמינות, זמן טיפול מורחבת יגרום לתוצאות לא רצויות הגדולות. כפי שנצפתה איור 2 (לוחות נכון), תאים שטופלו במשך 10 דקות עם ריכוז puromycin גבוה יפיק בעיקר קטנים יותר puromycilated polypeptides (למשל, מה-7, µg 7.5/mL או יותר 10 דקות). Polypeptides קטנים אלה מפוזר במהירות רבה יותר בתוך התא, אשר עשויים להפריע במדויק הערכת לוקליזציה subcellular. בעיה נוספת היא proteolysis מוגברת זו מתרחשת בעת טיפול מופרז puromycin19. תוצאה זו נצפתה בתאים MRC-5 והלה התייחס למשך 10 דקות, אשר הראו את עוצמת האות ירידה בנוכחות µg 10 או 15/mL של puromycin. שתי התופעות הללו הם מטעה אם puromycin התאגדות מוערך על ידי immunofluorescence כי פיזור מוגבר מונעת את הדמיה מדויקת של תרגום ולוקליזציה, ואילו puromycin-induced השפלה מקטין באופן משמעותי איתור רגישות. השלכות בלתי רצויות אלה הם נמנעו בקלות על-ידי הגדרת כראוי תנאים אופטימליים ניסיוני, כמתואר בסעיף 1 של פרוטוקול.

בעודכם מדמיינים puromycin התאגדות, חשוב גם לבצע המתאימות. כפי שמוצג באיור 3A, התאגדות puromycin ניתן לחסום ביעילות על ידי התוספת של 50 µg/mL cycloheximide, תרכובת ידוע לעכב תרגום התארכות20 ובכך puromycin ההתאגדות. אופן פעולה זה מוצג באיור 3B, אשר מראה כי טיפול cycloheximide למנוע ביעילות מרבית של האות המתאים puromycin התאגדות בתאים MRC-5 חסיד. ואכן, בעוד puromycilated פפטידים, ניתן לאבחן תאים שטופלו puromycin בלבד, האות חלש מזוהה תאים שטופלו גם cycloheximide בתנאים זהים מוכתמים. לחלופין, אנטיביוטיקה נוספת (anisomycin) יכול לשמש גם כפקד שלילי, יש את היכולת לחסום peptidyl טרנספראז פעילות5 , והוא הוכח להיות יעיל כמו cycloheximide-חסימת ההתאגדות puromycin5 ,18

בעקבות רכישת התמונה immunofluorescent, זה אפשרי להעריך לוקליזציה כללי של polypeptides puromycilated המתאים שזה עתה synthetized חלבונים (איור 4). השכבות בתמונה נבחרים בעומקים שונים בתוך התאים חסיד, המאפשר את עוצמת האות בתאים subcellular לפנות לבדיקה במישורים שונים בתא. לכן, זה אפשרי להשוות את התגובה puromycilation לשפות אחרות בחלק התחתון של התא (איור 4A), באמצע של התא (איור 4B), או החלק העליון של התא (איור 4C). ממוקם מעט מעל מבנים אדהזיה המתהווה, maturating, SICs הם נצפו בעיקר במרכז התא. כצפוי, puromycilation אינטנסיבי מתגלה SICs, רומז תרגום mRNA הוא מבודד את המבנים subcellular האלה. כפי שהוזכר קודם לכן, זה אפשרי להשוות את עוצמת האות בציר הרצוי. השוואה זו הינו אפשרי רק אם התמונות רכשה אינם כוללים פיקסלים רוויים, אשר מופיעים האדום בתמונה בגווני אפור (שני לוחות מלמעלה) שהושג באמצעות המיקרוסקופ הפעלת התוכנה. תמונות אלה ניתן לייבא לתוך התוכנה ImageJ כמת וניתוח של עוצמת פיקסל לאורך ציר ייעודי. כימות פיקסל ניתן לייצג בצורה גרפית (לוח האמצעי) כדי להמחיש את עוצמת פיקסל יחסית ב דרונים לאורך הציר. מבט מקרוב על הוספה הפאנלים העליון מראה SIC-אקטין גבולות (באדום) אות ירוק בתוך המבנה המתאים לאירועים תרגום פעיל ביותר, אשר הם מועשרים בתוך מבנים אלה (בחלק התחתון). למרות ששיטה זו כימות אינה הדרך הטובה ביותר כדי לקבוע את האחוז המדויק של הכולל תרגום המתרחשים המבנים הללו, זהו חזותית אינפורמטיבי על-ידי מתן להערכה מהירה של עוצמת האות והוא הערכה טובה של אות הפצה ברחבי התא.

כדי לקבל בהתפלגות כמותית של האות ברחבי התא כולו, יש להשתמש בשיטה אחרת. כמוצג באיור5, אחד השלבים המפתח הוא לציון את תחומי עניין שצריך ניתן לכמת כל z-מטוס להלחין את קובצי התמונה קונפוקלי. משימה זו יכולה להיות מושגת באמצעות כלי ציור שונים נמצאו ב- ImageJ. באמצעות שיטה זו, זה אפשרי לכמת או אזור בודד או אזורים מרובים, שניתן ואז בהשוואה, יופחת, או אפילו הידור. הקשיים העיקריים הם: (i) מצאו תנאים אופטימליים ההדמיה להימנע פיקסל רוויה ושידור רקע, אשר עלול לסלף את ערך כמותי של האות שהושג, ו (ii) להקים את כיול אופטימלית של הסף ב ImageJ. בהנחה כי שני התנאים הללו הם אופטימליים, שיטה זו כימות היא מאוד לשחזור תוך שנותרו קל לביצוע. לפני ייבוא תמונות, חשוב גם לקביעת הגבולות העליון והתחתון של z-המטוסים של התא שנבחר עבור כימות בקפידה. במקרה המוצג באיור4, המקטע התחתון מקביל מגבלת רזולוציה של המטרה, אשר לעיתים קרובות כולל מזהמות זריחה evanescent, אשר יכול להפחית את יחס אות הגוף תא SIC. כאמור, SICs מעורבים אדהזיה האתר היווצרות ועם בגרות; לכן, מבנים SIC ממוקמים מעט מעל לאחרונה ויוצרים מתחמי אדהזיה, אשר אינו כולל זריחה evanescent מהשכבות התחתון ביותר. כך, האות puromycilation SIC-מחויב הוא בקושי נראה בסעיפים התחתון, ואילו אנחנו יכולים בבירור observe זה החלק האמצעי, שמסביר את היחס מוגברת של הגוף SIC תא אות באזור האמצעי בהשוואה למישור התחתון או העליון.

Figure 1
איור 1. ייצוג ניסויי אופטימיזציה טיפול puromycin המתוארות בסעיף 1.
(א)
24-ובכן ייצוג של התאים להיות נזרע על הניסוי (שלב 1.1). (B) ייצוג סכמטי של שלב 1.4 מציג את השינוי בינוני שורות 1 ו 2 של צלחת 24-. ובכן, על התוספת של cycloheximide (CHX) על כל טוב של השורה השלישית על ריכוז סופי של 50 µg/mL. (ג) ייצוג סכמטי של הטיפול puromycin השורות השני והשלישי (שלב 1.6) 15 דקות לאחר שלב 1.4. (ד) ייצוג סכמטי של הטיפול puromycin בשורה הראשונה (שלב 1.8) 5 דקות לאחר שלב 1.6. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
באיור 2. קביעת תנאים אופטימליים התאגדות puromycin.
תספיג חלבון ניתוח של התא כולו לחלץ מ- MRC-5 (א), (B) מה-7, ו- (ג) הלה תאים, מודגרות עם הגדלת ריכוזים של puromycin (0, 2.5, 5, 7.5, 10 ו- 15 µg/mL) לתקופה של 5 דקות (לוחות שמאלה) או 10 דקות (מימין לוחות). Puromycilated פפטידים אותרו באמצעות נוגדן נגד puromycin. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3. עיכוב של puromycilation באמצעות cycloheximide.
(א)
תספיג שמראה את השפעת cycloheximide על וזמינותו 5-מין puromycilation. התאגדות יעילות MRC-5, 7-מה ותאים הלה בעקבות מעושה (PBS 1 X) או טיפול cycloheximide. (B) קונאפוקלית תמונה שמראה את השפעת cycloheximide על puromycin ההתאגדות. MRC-5 תאים היו טרום טיפול עם PBS (מעושה) או cycloheximide למשך 15 דקות, ואז בתוספת 10 µg/mL puromycin + PBS 1 X (פאנל שמאלי) או 10 µg/mL של puromycin + µg/mL 50 של cycloheximide (לוח נכון) 5 דק Puromycilated חלבונים אותרו באמצעות נוגדן נגד puromycin (ירוק). F-אקטין זוהה באמצעות phalloidin (אדום), הגרעין הוכתם דאפי (כחול). מוסיף בצד הימין מקבילים 2.5 x הגדלה של תיבת לבן. הסורגים = 10 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
באיור 4. כימות של הפעילות translational SICs בתאים MRC-5 חסיד.
(A-C)
נציג תמונה קונאפוקלית של תאים MRC-5 חסיד מטופלים עם puromycin 10 µg/mL במשך 5 דקות. התמונות שהוצגו תואמים התחתון (א), האמצעי (B)ו (ג) העליון, חלקים לתא. הלוחות העליון להראות את החלבונים puromycilated אותר באמצעות נוגדן נגד puromycin (ירוק). F-אקטין זוהה באמצעות phalloidin (אדום), הגרעין הוכתם דאפי (כחול). מוסיף בצד הימין מקבילים 2 x הגדלה של תיבת לבן. הסורגים = 10 μm. הלוחות האמצעי להראות בהיעדר פיקסלים רוויים, אשר הודגשו בצבע אדום. הלוחות התחתון להציג ייצוג גרפי של העשרה חלבונית puromycilated תא MRC-5 חסיד על-ידי השוואת את עוצמת האות puromycin (ירוק), F-אקטין (אדום), דאפי (כחול) לאורך הציר תא שמציין החץ הלבן. (D-F) התמונות שהוצגו תואמים 4.4 x הגדלה הוספה של SICs המוצגים (A-C). כימות מראה הגבול SIC (פסגות אדום: אקטין), כמו גם תרגום לשפות אחרות בתוך SICs (ירוק פסגות: puromycin) הנמוך (D), באמצע (E), ואת האזורים (נ) העליון של התא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5. כמת שלם-קליטה של puromycilated חלבונים בתאים MRC-5 חסיד.
(א)
של האות בתוך אזורים שונים של השכבה התחתונה מטוס ה-z של חסיד MRC-5 תא בנחישות. (פאנל שמאלי) מבחר של האזור (I) מכסה את מכלול התא כדי לקבל ערך כמותי המתאים לאות סלולרי הכולל עבור שכבה זו מטוס ה-z. (התיכון לוח) הבחירה של האזור הסלולר התואם את הגרעין ואת החלק cytoplasmic שאינו כולל SIC (II). (לוח נכון) ויזואליזציה של האזור המתאים כדי SICs (III) על-ידי חיסור הערך המתקבל אזור II מהערך שהושג עבור התא כולו (אזור אני). הסורגים = 10 μm. (B) ערכי הפיקסלים כמותיים עבור כל אזור מפורטים בטבלה עבור התמונה המתארת את הבחירה אזור ב- (א), ואחריו גרף המציג את שיעור (%) של האות נמצא ב SICs. (ג) של האות בתוך אזורים שונים של השכבה מטוס ה-z אמצע של חסיד MRC-5 תא בנחישות. (פאנל שמאלי) מבחר של האזור (I) מכסה את מכלול התא כדי לקבל ערך כמותי המתאים לאות סלולרי הכולל עבור שכבה זו מטוס ה-z. (התיכון לוח) הבחירה של האזור התא המתאים לגרעין, החלק cytoplasmic שאינו כולל SIC (II). (לוח נכון) ויזואליזציה של האזור המתאים כדי SICs (III) על-ידי חיסור הערך שהתקבל עבור אזור II מהערך שהושג עבור התא כולו (אזור אני). (ד) ערכי הפיקסלים כמותיים עבור כל אזור מפורטים בטבלה עבור התמונה המתארת אזור בבחירה (ג), ואחריו גרף המציג את שיעור (%) של האות נמצא ב SICs. (ה) של האות בתוך אזורים שונים של השכבה העליונה של מטוס ה-z של חסיד MRC-5 תא בנחישות. (פאנל שמאלי) מבחר של האזור (I) מכסה את מכלול התא כדי לקבל ערך כמותי המתאים לאות בתא סכום עבור שכבה זו מטוס ה-z. (לוח התיכון) הבחירה של האזור התא המתאים לגרעין, החלק cytoplasmic שאינו כולל SICs (II). (לוח נכון) ויזואליזציה של האזור המתאים כדי SICs (III) על-ידי חיסור הערך שהתקבל עבור אזור II מהערך שהושג עבור התא כולו (אזור אני). (נ) ערכי הפיקסלים כמותיים עבור כל אזור מפורטים בטבלה עבור התמונה המתארת אזור בבחירה (E), ואחריו גרף המציג את שיעור (%) של האות נמצא ב SICs. (ז) כמת ערכים עבור כל השכבות מטוס ה-z מהתא שהוצגו לעיל, כולל אחד מחושב עבור z-מטוסים שהוצגו ב- A (z = 1), ג (z = 9), ו- E (z = 19), אשר יסומנו באדום על השולחן. (H) ייצוג גרפי של האחוז של האות שנמצאו SICs בכל נפח התא כולו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ההתקדמות הטכנולוגית האחרונות איפשרו הבנה טובה יותר של המנגנונים המעורבים translational קולטנים upregulation או הדיכוי של mRNAs ספציפיים של תהליכים ביולוגיים, כגון פיתוח עצביים, סמים התגובה גרורות. המתודולוגיה חסכונית המתוארים כאן מאפשר תרגום אירועים, ניתן לאבחן בתאים כדי ללמוד כיצד RNA מחייב חלבונים להסדיר תהליכים גרורתי, כגון אדהזיה הסלולר, הגירה, הפלישה.

למרות פותחו שיטות רבות כדי להעריך תרגום החלבון דה נובו , וכולם חולקים את האסטרטגיה אותה, שבו מפוליפפטיד elongating משלבת ששונה חומצות אמינו המתויגת של moiety לזיהוי. הראשון של שיטות אלה מסתמך על 35S-radiolabeled ארגינין שהשתלבה החלבון שתורגם. למרות שהוא יעיל לצורך השוואת המחירים הכללית של תרגום תחת תנאים מסוימים, השימוש של חומצות אמינו radiolabeled הופך שיטה זו בעיניכם רוב צוותי המחקר. לפיכך, הפיתוח של הרומן שיטות שימוש בתוויות שאינו רדיואקטיבי, כגון שקיעה, לחץ על זה, או הגישה טריק, המוצעים הזדמנויות חדשות להעריך ולצפות ויוו תרגום אירועים. למרות גאוני, רוב השיטות האלה אפשר רק להערכה של תרגום אירועים בעקבות הטיפול בתרופה או אירועים ספציפיים הסלולר באמצעות cDNA אקסוגני ספציפיים לבנות של מטרות ספציפיות, הגבלת ניסויים למטרות כבר מזוהה . זה נכון עבור טריק הגישה4, המאפשר ויסות מטרה mRNA אחת exogenously ביטוי translational לפנות לבדיקה. למרות שהיא מתירה ןיבל הפעלת translational mRNAs אנדוגני, שיטת "לחץ-זה" זמן הדגירה מינימלי עבור AHA התאגדות היא לפחות 1 שעה13, אשר נחשב זמן רב מדי על מנגנונים תרגום החריף ביותר.

אמנם מאוד תכליתי קל להגדיר, השיטה המתוארת כאן דורש כי לשלבים הקריטיים להיות בעקבות בשלב הראשוני של הפרוטוקול. כפי שמוצג התוצאות נציג, שורות תאים שונים יהיו שונים puromycin התאגדות קינטיקה, אשר עשויה להיות פשוט קצב חילוף החומרים של כל קו תא, כפי שנראה המקרה MRC-5 תאים5,21. אכן, תאים שאינם טרנספורמציה אינם כמו proliferative כמו הלה, ועל כן, חידוש מסת חלבון פחות חזקים יותר בתאים טרנספורמציה. זה צריך לקחת בחשבון בעת שימוש בפרוטוקול. בהתאם לכך, החלק הראשון של הפרוטוקול הוא קריטי להמשך השיטה. בזהירות לקביעת הריכוז של puromycin ואת אורך הדגירה יאפשר הערכה טובה יותר של התרגום המתרחשים במהלך הניסוי. כפי שהוזכר לעיל, טיפול עם כמות מוגזמת של puromycin מגביר את היחס בין polypeptides puromycilated קטן ונראה לעורר proteolysis, אשר יכול בקלות להוביל פירוש מוטעה של בדרך כלל מתרחשים אירועים translational19 . כלל אצבע, ככל זמן הדגירה, puromycin פחות צורך, ואילו זמן דגירה קצר יותר דורש ריכוז גבוה יותר של puromycin. הריכוז/הזמן ניתן להתאים מגבלות ניסיוני מסוים.

השיטות המובאות כאן הן מאוד ולא ניתן לשנות בקלות את הטיפול מיושם או הביולוגי תהליך למד. Puromycin התאגדות מאפשרת להערכה מהירה של שינויים ב קינטיקה תרגום על פני תקופה קצרה של זמן, בעוד השיטה כימות מספק תמונות מאוד אינפורמטיבי של הסלולר אירועים. למרות עוצמה, שיטות אלה יש מגבלות כי יש לקחת בחשבון. Puromycin ישולבו לחלבונים לאחרונה מסונתז מן mRNAs כל זה מתורגמים באופן פעיל. מסיבה זו, שיטת puromycilation המתוארים כאן לא יהיה מתאים ללמוד מטרות מוגדרות (קרי, mRNAs יחיד), אך הוא אידיאלי כדי לקבל סקירה כללית של פעילות translational בתוך תא בודד או אוכלוסיה התא. כפי שהוזכר לעיל, puromycin מוגזמת יש החסרונות העיקריים, puromycin המינונים ושעות הטיפול צריך להיות בזהירות מוגדרת, כפי שהוצע בפרוטוקול. ואכן, כפי שמוצג באיור2, זמינות puromycin יתר יגרום היווצרות של polypeptides puromycilated קטנים להתפזר במהירות רבה יותר בתא, המוביל אל נתונים לא מדויקים לוקליזציה subcellular. בנוסף, ידוע proteolysis מוגברת יכולה להופיע לאחר טיפול puromycin מוגזמת19, אפקט זה עשויה לגרום לאובדן מוחלט של האות.

אמנם לא מדויקות ככל זה לחץ או שיטות העבודה, הגישה המוצעת כאן הוא ונגישות גבוהה ומאפשר להערכה מהירה של שינויים כלליים קינטיקה תרגום. גם אם בשיטות אחרות מותאמים עבור יישומים ספציפיים, ניתן לבצע מבחני ההתאגדות puromycin כפקד משלים. אכן, אם הניסוי צריך להראות כי מטרה mRNA ספציפי הוא היחיד מושפע תנאי מסוים, יש צורך להראות כי זה לא נגרם עקב עלייה כללית בתרגום. ככזה, התאגדות puromycin שלילי יכול לספק ראיות עבור אירוע זה. יתר על כן, שיטה זו היא מתאימה כדי התבוננות כללית שינויים בשערי תרגום. לכן, זה יכול לשמש כדי להציג מנגנון דיכוי תרגום, כמו במקרה של מתח גרגר היווצרות9, או כדי לאמת אם חוסם ביעילות הטיפול cycloheximide בשימוש בשלב הראשוני של fractionation מורכבים translational התארכות22. חשוב גם לציין כי למרות כימות בשיטות המתוארות בסעיפים 2.3 ו- 2.4 להתייחס ניסויים התמקדות puromycin מכתים, הם יכול לחול על כל סוג של צביעת ממודר באמצעות סוגים שונים של fluorophores. ואכן, השיטות כימות יכול לשמש כדי לכמת את התפלגות הסלולר של מולקולה או חלבון, אפילו יכול לבצע הלוקליזציה של מטרה בתא subcellular ספציפיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

אנו מודים ד ר ראשיד Mazroui (אוניברסיטת לאוול, קוויבק, קנדה) על קריאה ביקורתית של כתב היד. אנו מודים יחידת דימות תא של המרכז לחקר לסיוע טכני שלהם. Huot מé. הוא חוקר המחקר ג'וניור 1 דה Fonds du רשרש קוויבק-Santé (FRQ-S). עבודה זו נתמכה על ידי קנדי מוסדות של בריאות המחקר (להעניק מספר CIHR, מגב-286437 למ-É. Huot).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM wisent 319-005-CL
Trypsine wisent 325-043 EL
FBS Thermo Fisher Scientific 12483020
Puroycin antibody 12D10 EMD millipore MABE343 western blot dilution 1:25,000
Immunofluoresence dilution 1:10,000
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody cell signaling technology 7076 western blot dilution 1:8,000
Western Lightning Plus-ECL Perkin Elmer NEL104001EA
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate) cell signaling technology 4408 immunofluoresecence dilution 1:400
CF568 Phalloidin biotium 00044 immunofluoresecence dilution 1:400
Cyclohexmide Sigma C1988-1G 50µg/ml final concentration
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306 final concentration 1µg/ml
Puromycin bio-Basic PJ593 2.5µg/ml to 10µg/ml
Ibidi µ-Dish 35 mm, high, ibiTreat Ibidi 81156
MRC-5 cells ATCC CCL-171
HeLa cells ATCC CCL-2
Huh-7 cells from Dr. Mazroui (Université Laval)
Fv1000 olympus confocal imaging system
Fiji software http://fiji.sc
PBS (Phosphate BuffeRed Saline) bio-Basic PD8117
Formaldehyde 37% Solution bio-Basic C5300-1
Triton X-100 bio-Basic TB0198
BSA Fisher Bioreagents BP9702-100
Tween20 Fisher Bioreagents BP337-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. Dynamics of Translation of Single mRNA Molecules In Vivo. Cell. 165, 976-989 (2016).
  2. Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352, 1425-1429 (2016).
  3. Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. H. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 352, 1430-1435 (2016).
  4. Halstead, J. M., et al. TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals. Methods Enzymol. 572, 123-157 (2016).
  5. Bergeman, J., Caillier, A., Houle, F., Gagne, L. M., Huot, M. E. Localized translation regulates cell adhesion and transendothelial migration. J Cell Sci. 129, 4105-4117 (2016).
  6. El Fatimy, R., et al. Tracking the Fragile X Mental Retardation Protein in a Highly Ordered Neuronal RiboNucleoParticles Population: A Link between Stalled Polyribosomes and RNA Granules. PLoS Genet. 12, e1006192 (2016).
  7. Adjibade, P., et al. Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells. Oncotarget. 6, 43927-43943 (2015).
  8. Paronetto, M. P., et al. Sam68 regulates translation of target mRNAs in male germ cells, necessary for mouse spermatogenesis. J Cell Biol. 185, 235-249 (2009).
  9. Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. S. U. nS. E. T. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nat Methods. 6, 275-277 (2009).
  10. Azzam, M. E., Algranati, I. D. Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 70, 3866-3869 (1973).
  11. Goodman, C. A., Hornberger, T. A. Measuring protein synthesis with SUnSET: a valid alternative to traditional techniques. Exerc Sport Sci Rev. 41, 107-115 (2013).
  12. David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. J Cell Biol. 197, 45-57 (2012).
  13. Fallini, C., Bassell, G. J., Rossoll, W. Spinal muscular atrophy: the role of SMN in axonal mRNA regulation. Brain Res. 1462, 81-92 (2012).
  14. Costa-Mattioli, M., et al. Translational control of hippocampal synaptic plasticity and memory by the eIF2alpha kinase GCN2. Nature. 436, 1166-1173 (2005).
  15. Costa-Mattioli, M., Sossin, W. S., Klann, E., Sonenberg, N. Translational control of long-lasting synaptic plasticity and memory. Neuron. 61, 10-26 (2009).
  16. Du, T. G., Schmid, M., Jansen, R. P. Why cells move messages: the biological functions of mRNA localization. Semin Cell Dev Biol. 18, 171-177 (2007).
  17. Ephrussi, A., St Johnston, D. Seeing is believing: the bicoid morphogen gradient matures. Cell. 116, 143-152 (2004).
  18. Mardakheh, F. K., et al. Global Analysis of mRNA, Translation, and Protein Localization: Local Translation Is a Key Regulator of Cell Protrusions. Dev Cell. 35, 344-357 (2015).
  19. Lacsina, J. R., et al. Premature translational termination products are rapidly degraded substrates for MHC class I presentation. PLoS One. 7, e51968 (2012).
  20. Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).
  21. Jacobs, J. P., Jones, C. M., Baille, J. P. Characteristics of a human diploid cell designated MRC-5. Nature. 227, 168-170 (1970).
  22. Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J Vis Exp. (87), (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics