Analisi della specificità degli anticorpi istonici con microarray di peptide

Published 8/01/2017
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Biochemistry

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Summary

Questo manoscritto descrive i metodi per applicare la tecnologia del microarray peptide alla profilazione di specificità degli anticorpi che riconoscono gli istoni e le loro modificazioni post-traslazionali.

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Cornett, E. M., Dickson, B. M., Rothbart, S. B. Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays. J. Vis. Exp. (126), e55912, doi:10.3791/55912 (2017).

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Abstract

Le modificazioni post-traduzionali (PTMs) sulle proteine ​​dell'istone sono ampiamente studiate per i loro ruoli nella regolazione della struttura cromatica e dell'espressione genica. La produzione di massa e la distribuzione di anticorpi specifici ai PTM istonici ha facilitato notevolmente la ricerca su questi segni. Poiché gli anticorpi PTM dell'istone sono reagenti chiave per molte applicazioni di biochimica cromatica, è necessaria un'analisi rigorosa della specificità degli anticorpi per un'accurata interpretazione dei dati e un progresso continuo nel campo. Questo protocollo descrive una pipeline integrata per la progettazione, la fabbricazione e l'uso di microarray peptidi per la profilazione della specificità degli anticorpi istoni. Gli aspetti di progettazione e analisi di questa procedura sono facilitati da ArrayNinja, un pacchetto software open source e interattivo che abbiamo recentemente sviluppato per semplificare la personalizzazione dei formati di stampa con microarray. Questa pipeline è stata utilizzata per la visualizzazione di un gran numero di anticorpi anti-PTM di istone commercialmente disponibili e ampiamente utilizzatiE i dati generati da questi esperimenti sono liberamente disponibili tramite un database di specificità anticorpo istante in linea e in espansione. Al di là degli istoni, la metodologia generale descritta qui può essere applicata ampiamente all'analisi degli anticorpi PTM-specifici.

Introduction

Il DNA genomico è imballato elegantemente all'interno del nucleo delle cellule eucariotiche con proteine ​​dell'istone per formare la cromatina. La subunità ripetizione della cromatina è il nucleosoma, che consiste di 147 coppie di basi di DNA avvolto attorno ad un nucleo octameric di proteine istoni H2A, - H2B, H3, H4 e 1. La cromatinica è ampiamente organizzata in euchromatin pienamente ricoperti e domini eterocromatina strettamente confezionati. Il grado di compattazione della cromatina regola la misura in cui i macchinari di proteine ​​possono accedere al DNA sottostante per eseguire processi fondamentali del DNA come la replica, la trascrizione e la riparazione.

I regolatori chiave dell'accessibilità del genoma nel contesto della cromatina sono PTM sui nodi non strutturati e nuclei delle proteine ​​istone 2 , 3 . Histon PTMs funziona direttamente influenzando la struttura della cromatina 4 e indirettamenteH l'assunzione di proteine ​​di lettura e dei loro complessi macromolecolari associati con attività di ricostruzione cromatica, enzimatica e di ponteggi 5 . Studi sulla funzione istone PTM negli ultimi due decenni suggeriscono in maniera massiccia che questi segni svolgono ruoli chiave nel regolare il destino cellulare, lo sviluppo organico e l'iniziazione / progressione delle malattie. Alimentata dai progressi della tecnologia proteomica basata sulla spettrometria di massa, sono stati scoperti più di 20 PTM istonici unici su più di 80 residui istoniali distinti 6 . Notevolmente, queste modifiche spesso si verificano in combinazioni e coerenti con l'ipotesi del codice istone, numerosi studi suggeriscono che le proteine ​​del lettore sono destinate a regioni discrete di cromatina attraverso il riconoscimento di combinazioni specifiche di istone PTMs 7 , 8 , 9 . Una sfida fondamentale in avanti sarà attribuire funzioni al grGrazie alla lista degli istoni PTMs e per determinare come combinazioni specifiche di PTM istoni orchestrino le funzioni dinamiche associate alla cromatina.

Gli anticorpi sono i reagenti lynchpin per la rilevazione di PTM istonico. In quanto tale, più di 1.000 anticorpi specifici PTM-istone sono stati commercialmente sviluppati per l'uso nella ricerca biochimica cromatina. Con il rapido sviluppo di high-throughput tecnologia di sequenziamento del DNA, questi reagenti sono stati ampiamente utilizzati dai singoli ricercatori e epigenomics grandi "calendario" iniziative (ad esempio, codificare e progetto), in ChIP-seq (cromatina immunoprecipitazione accoppiato con sequenziamento di prossima generazione ) Per generare mappe spaziali ad alta risoluzione della distribuzione istone PTM a livello genomico 10 , 11 . Tuttavia, recenti studi hanno dimostrato che la specificità degli anticorpi PTM dell'istone può essere altamente variabile e che questi reagenti presentano Proprietà avorabili come il riconoscimento epitopico fuori bersaglio, forte influenza positiva e negativa da parte dei PTM vicini e difficoltà a discriminare l'ordine di modifica su un determinato residuo ( ad esempio mono-, di- o tri-metililossina) 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Pertanto, è necessario un controllo rigoroso della qualità dei reagenti anticorpo specifico PTM-istone per interpretare con precisione i dati generati con questi reagenti preziosi.

La tecnologia Microarray consente di interrogare simultaneamente migliaia di interazioni macromolecolari in un formato ad alta produttività, riproducibile e miniaturizzato. Per questo motivo, sono state create diverse piattaforme di microarray per analizzare il DNA proteico 19 ,"> 20, proteine-proteine 21 e proteine-peptide interazioni 22. In effetti, i microarray di peptide dell'istone sono emerse come una piattaforma di scoperta informativa per la ricerca di biochimica cromatica, consentendo una profilazione ad alta velocità degli scrittori, cancellatori e lettori di istone PTMs 15 , 23 , 24 e anche per l'analisi della specificità degli anticorpi degli istoni 17 , 25. Oltre alla loro applicazione nella ricerca di cromatina e epigenetica, gli array di peptone istonico hanno potenziale utilità come test diagnostico / prognostico per il lupus eritematoso sistemico e altre malattie autoimmuni, Gli anticorpi cromatici vengono generati 26 , 27 .

Qui descriviamo una pipeline integrata che abbiamo sviluppato per la progettazione, la fabbricazione e la queMicroarrays di peptide istone per generare profili di specificità per gli anticorpi che riconoscono gli istoni e le loro PTM. Il gasdotto è facilitata da ArrayNinja, un open-source, un'applicazione software interattivo che abbiamo recentemente sviluppato, che integra le fasi di progettazione e di analisi di esperimenti di microarray 28. ArrayNinja funziona meglio in Google Chrome. In breve, viene utilizzata una stampante microarray a contatto robotizzato per depositare una biblioteca di peptidi istoni coniugati biotina in posizioni definite su vetrini a microscopio vetrato con streptavidina. Le matrici possono quindi essere utilizzate in un modo conciso e in parallelo di test per interrogare le interazioni con gli anticorpi-epitopi ( Figura 1 ). La biblioteca del peptide è costituita da centinaia di peptidi sintetici unici che ospitano PTM (acetilazione lisina, metilazione lisina / arginina e fosforilazione serina / treonina) da soli e in combinazioni pertinenti in gran parte derivate da set di dati proteomici. Metodi per la sintesi e la convalida dei peptidi Sono dettagliate altrove 23 . I dati generati dagli sforzi di screening degli anticorpi PTH istantanei in corso utilizzando questa piattaforma di array sono archiviati in una risorsa web pubblica, il database di specificità degli anticorpi Histone (www.histoneantibodies.com). In particolare, i microarray di peptide istone fabbricati con variazioni di questo protocollo sono stati ampiamente utilizzati per caratterizzare l'attività dei domini di lettore di istone PTM 8 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 e più recentemente all'istone del profilo PTM scrittore e attività gomma 24 .

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Figura 1: Disposizione del fumetto della procedura stepwise per la screening degli anticorpi su un microarray di peptide dell'istone. I peptidi biotinilati di istone che ospitano modifiche post-traslazionali definite (cerchi rossi e blu) sono stampati con biotina-fluoresceina sul vetro rivestito con streptavidina. Le interazioni positive sono visualizzate come fluorescenza rossa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Protocol

1. Installazione e esecuzione di ArrayNinja

  1. Scaricare e installare Oracle Virtual Box da www.virtualbox.org.
  2. Scaricare e decomprimere la macchina virtuale ArrayNinja (VM) da http://research.vai.org/Tools/arrayninja.
  3. Aprire Virtual Box e aggiungere l'ArrayNinja VM facendo clic su "Machine", "Aggiungi" e selezionando arrayninja.vbox dalla cartella in cui è stato salvato ArrayNinja VM.
  4. Avviare ArrayNinja selezionandolo all'interno di Virtual Box e facendo clic sulla freccia verde 'start'.
  5. Virtual Box apre una nuova finestra e visualizza un messaggio che consente di accedere alla VM navigando il browser web a localhost: 2080.60; NOTA: Una versione containerizzata di ArrayNinja è disponibile anche tramite hub.docker.com/r/bradley.dickson/arrayninja/

2. Progettazione del layout di scorrimento dell'albero e della piastrina di origine

  1. Sotto l'intestazione "Pianificare un layout di diapositive" nell'interfaccia ArrayNinja, fare clic sul collegamento corrispondente alla stampante microarray utilizzata.
    NOTA: ArrayNinja è stato programmato per simulare il movimento robotico di due stampanti microarray comunemente usate (vedere tabella1). La compatibilità con gli altri array può essere configurata su richiesta.
  2. Fai clic all'interno della finestra di dialogo 'Carica piastra', digita "vuoto" e fai clic su "entra". Vedere la Figura 2 per uno screenshot del modulo di progettazione ArrayNinja.
  3. Regolare il diametro del punto a 275 μm e la spaziatura a 375 μm. Regolare le impostazioni rimanenti (Plate Blocks / riga piastra, Righe totali, replica, caratteristiche in y, Super array, SuperA fudge, vedere la Figura 2 ) per personalizzare come le funzioni appaiono sulla diapositiva microarray.
    NOTA: Il diametro del punto è determinato dalla dimensione del perno microarray. Poiché queste impostazioni sono regolate, la diapositiva dei cartoni animati verrà aggiornata in tempo reale. Utilizza questo cartone per visualizzare l'anteprima di come ogni impostazione sta modificando il layout di diapositive finale.
  4. Dopo aver completato il layout delle funzioni sulla diapositiva, toccare sopra ogni funzione unica e immettere l'identificatore delle funzionalità nella finestra di dialogo a comparsa.
    NOTA: Gli identificatori delle funzioni possono essere costituiti da numeri, lettere o combinazioni. Ciò è richiesto solo per funzioni uniche e una finestra di dialogo non verrà visualizzata quando vengono selezionati i replicati.
  5. Dopo che tutte le funzionalità uniche sono state assegnate un identificatore, fai clic su "popolare". Inserisci un nome per il layout della diapositiva e fai clic su "stampa la tua piastra" per salvare. Viene aperta una nuova pagina che visualizza il numero di piastre di origine da 384 pozzetti necessarie per realizzare il disegno scelto e una tabella che traccia la posizione fisica di ciascuna funzionalità da caricare nella piastra di origine.
    NOTA: Ricorda questo nome, in quanto verrà utilizzato per richiamare questo disegno quando si analizza i dati di microarray (vedere la sezione 6.2). Cliccando su "stampa la tua piastra" salva la disposizione all'interno di ArrayNinja.

figura 2
Figura 2: Modulo di progettazione ArrayNinja. Un colpo di schermo del Il modulo di progettazione ArrayNinja è mostrato nella linea punteggiata. Il pannello di controllo (in alto) mostra tutti i parametri che possono essere modificati sulla stampante microarray. Quando questi parametri vengono regolati, l'immagine del fumetto del layout di diapositive (in basso a sinistra) viene aggiornata in tempo reale. Dopo aver impostato il layout, l'utente può sfiorare singoli punti per immettere identificatori di funzionalità univoche. ArrayNinja costruisce da questo utente una mappa della posizione di ciascuna funzione nella piastra (i) di origine (in basso a destra) necessaria per realizzare un layout di diapositiva specificato di microarray. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Microarrays Fabricating

  1. Preparazione della Source Plate
    1. Utilizzare la mappa generata con ArrayNinja nella sezione 2.5 per creare le piastre della sorgente a 384 pozzetti.
      NOTA: Descrizioni dettagliate dei peptidi interrogati su questa piattaforma possono essere trovati altroveS = "xref"> 17.
    2. Depurare 1 - 2 μL di ciascuna caratteristica ( ad esempio , peptone biotinilato di istone) nel pozzetto corretto delle piastre di fonte di 384 pozzetti.
      NOTA: I peptidi biotinilati di istone sono tipicamente depositati da soluzioni di stock di 200-400 μM, che equivale a 10 a 25 volte l'eccesso molare di peptide ai siti di legame di streptavidina in un unico punto di matrice. Questo viene calcolato utilizzando l'equazione:
      Equazione
      Dove V è il volume erogato da un perno, [ P ] è la concentrazione della caratteristica stampata, N A è il numero di Avogadro e S è la superficie di un punto. C è la copertura della diapositiva, espressa come numero di molecole di streptavidina per area unitaria moltiplicata per tre (il numero medio di siti di legame streptavidici disponibili). V e C sono ottenuti dai rispettivi produttori. Altre caratteristiche possonoRichiedono diverse concentrazioni a seconda della dimensione della biomolecola in cui l'affollamento può essere una preoccupazione. Una gamma di concentrazioni di stampa per ogni nuovo tipo di caratteristica deve essere testata empiricamente per determinare la concentrazione ottimale di stampa.
    3. Diluire ogni caratteristica 10 volte con tampone di stampa 1x integrato con 1% di albumina bovina del siero (BSA). Spingere la targhetta (s) a 500 xg per 2 min a temperatura ambiente.
      NOTA: L'inclusione di biotina (5 μg / μL) con etichettatura fluoresceina nel tampone di stampa è raccomandata come un controllo di macchia e come aiuto visivo per facilitare l'allineamento corretto dell'array durante l'analisi (vedere la figura 4 ).
  2. Protocollo di stampa ( Figura 3A - B ).
    1. Preparare l'allineamento svuotando il contenitore della raccolta e riempendo il contenitore della soluzione di lavaggio e il contenitore dell'umidificatore con acqua distillata sterile.
    2. Immettere i parametri uSed per progettare la diapositiva in ArrayNinja (sezione 2 e figura 2 ) nel programma di controllo della stampante microarray.
    3. Utilizzando il programma di controllo della stampante microarray, impostare la procedura di lavaggio per una lavata da 1 s con una sola immersione. Impostare le impostazioni di post-wash per rimettere nuovamente i pin 5 volte dopo ogni lavaggio. Impostare l'umidità al 60%.
      NOTA: La configurazione ottimale del lavaggio può variare a seconda della stampante microarray utilizzata. La configurazione ottimale del dipinto a pin di lavaggio può variare a seconda della stampante microarray utilizzata.
    4. Inserire le diapositive funzionalizzate ( ad es . Vetro rivestito con streptavidina) nelle piastre del substrato e posizionare tutte le piastre nell'elevatore a piastra. Inserire la piastra (s) nella piastra (i) e collocare nell'elevatore della piastra di sorgente.
    5. Fare clic su "stampa". Monitorare il processo di stampa per alcuni cicli di deposizione delle funzioni per assicurare che tutte le impostazioni di lavaggio e immer- sione siano corrette. Al termine della stampa, rimuoviLe piastre del substrato dall'allegato.
      NOTA: quando le operazioni di stampa di grandi dimensioni vietano di completare i passaggi di blocco entro un giorno, le diapositive stampate possono essere incubate in una camera umidificata a 4 ° C durante la notte. Incubare le diapositive accanto ad un piccolo bicchiere d'acqua all'interno di una scatola di cartone sigillata con involucro in plastica.
    6. Bloccare le diapositive con blocco di blocco per 30 minuti a temperatura ambiente con miscelazione.
    7. Lavare le diapositive 2 x 10 min a temperatura ambiente in soluzione salina fosfata (PBS), pH 7,6 con miscelazione. Asciugare le diapositive ruotando in una centrifuga a microarray per 30 s a temperatura ambiente.
      NOTA: Per l'elaborazione di un gran numero di diapositive contemporaneamente, è possibile utilizzare una camera di lavaggio a scorrimento a microscopio ad alta capacità, consentendo la lavatura di 50 diapositive in parallelo.
    8. Per le diapositive progettate per essere partizionate con cera, procedere alla sezione 4.1. Per tutti gli altri disegni, conservare le diapositive a 4 ° C protette dalla luce e dall'umidità.
      NOTA: Peptidi stampati di istone biotinilatiSono stabili per almeno 6 mesi quando vengono memorizzati in questo modo.

4. Partizione delle diapositive Microarray

  1. Penna cera idrofoba ( figura 3C )
    1. Applicare la cera intorno alle aree che contengono caratteristiche utilizzando una penna a cera. Lasciare asciugare la cera per 5 minuti prima di procedere alla sezione 5.
      NOTA: dopo il blocco, i punti array possono essere molto difficili da visualizzare per occhio. Il disegno a scorrimento da ArrayNinja può essere stampato in scala e utilizzato come guida per l'applicazione della cera.
  2. Guarnizione in silicone ( Figura 3D )
    1. Sbucciate la pellicola trasparente sul retro della guarnizione di matrice e posizionate il lato adesivo sullo scivolo microarray.
    2. Tenere la guarnizione in posizione per 5 s prima di procedere alla sezione 5.
  3. Stampa di cera ( Figura 3E )
    1. Per le diapositive progettate per essere suddivise in cera, stampare una diapositiva di prova su vetro normale utilizzando il 10% BSA. Utilizzare questa diapositiva di prova per ottimizzare le guide dell'impronta della cera o le impostazioni dell'array per assicurare che tutte le funzioni saranno all'interno delle camere della muffa.
    2. Riscaldare l'impregnatrice a cera di microarray a 85 ° C finché tutta la cera non sia completamente fusa, circa 30 min.
    3. Inserire la diapositiva con il lato stampato rivolto verso il basso e spingere la diapositiva fino alla guida destra dell'etichettatrice microarray. Tirare la leva per portare lo stampo in contatto con la superficie dello scivolo. Tenere per 2 s.
      NOTA: il tempo di attesa può essere modificato per ottenere lo spessore ottimale del bordo della cera.
    4. Rimuovere rapidamente la diapositiva e ispezionare visivamente i bordi della cera per assicurare che tutti i pozzetti siano chiusi e che i bordi non siano così grossi che penetrano nei punti. Conservare le diapositive a 4 ° C protette da umidità e luce.
      NOTA: il tempo di attesa può essere aumentato o diminuito per ottenere bordi più spessi o più sottili.

"Figura Figura 3: Fabbricazione microarray. (A) Fabbricazione di microarray di peptide dell'istone su vetrini con microscopio rivestito con streptavidina utilizzando una stampante a microarray di contatto. (B) Microarray fabbricate con 3 subarray di una griglia di 48 x 48 delle caratteristiche del peptide. Separazione di (C) 3 subarray con una penna di cera idrofobica, (D) 2 subarray con un adesivo in silicone e (E) 48 subarray con impronta di cera. Tutti i microarray mostrati sono fabbricati con diapositive a microscopio da 25 x 75 mm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

5. Ibridizzazione di un anticorpo di Histon PTM con un microarray di peptide

  1. Preparare il tampone di ibridazione (PBS, pH 7,6, 5% BSA, 0,1% Tween-20).
  2. Equilibrare la diapositiva nel buffer di ibridazioneUtilizzando un recipiente di ibridazione. Completamente coprire tutta la diapositiva nel tampone di ibridazione e incubare per 30 minuti a 4 ° C su un agitatore orbitale a bassa velocità.
  3. Preparare una soluzione contenente anticorpo PTM istone diluito in tampone di ibridazione.
    NOTA: Nei dati di esempio, sia l'anticorpo # 1 che l'anticorpo # 2 di istone sono stati diluiti 1: 1.000 in tampone di ibridazione. Si consiglia come campo di partenza una gamma di diluizione simile a quella utilizzata per immunoblotting
  4. Incubare l'array con la soluzione anticorpale per 1 h a 4 ° C. Rimuovere la soluzione anticorpale e lavare l'array 3 volte per 5 min a 4 ° C con PBS freddo, pH 7,6.
  5. Preparare una diluizione 1: 5000 - 1: 10.000 di anticorpo secondario coniugato con fluorescenza colorante nel tampone di ibridazione.
  6. Incubare l'array con soluzione anticorpale secondaria per 30 min a 4 ° C protetta dalla luce. Rimuovere la soluzione anticorpale secondaria e lavare il vetrino microarray 3 volte per 5 min a 4 ° C con PBS, pH 7,6. TuffoIl microarray in un tubo conico da 50 mL contenente 0,1 x PBS, pH 7,6 per rimuovere il sale in eccesso a temperatura ambiente. Asciugare la diapositiva in una centrifuga a microarray a temperatura ambiente.
  7. Scansiona la diapositiva con uno scanner microarray a una risoluzione di 25 μm o superiore, seguendo il protocollo di scansione consigliato dal produttore dello scanner di microarray.
    NOTA: se è presente un indicatore di biotina con fluoresceina, analizzare sia il canale verde (es: 488 nm, em: 509 nm) sia il canale corrispondente all'anticorpo secondario coniugato fluorescente colorato, tipicamente rosso (es: 635 nm, em 677 nm). L'obiettivo della scansione è quello di ottenere file .tif di singolo canale che possono essere fusi in un unico file png (come descritto nella sezione 6.1).

6. Analisi dei dati Microarray utilizzando ArrayNinja

  1. Preparazione di un'immagine unita di microarray
    NOTA: L'obiettivo di questa sezione è quello di creare un file di immagine .png che unisce i due file .tif di singolo canale (ottenuto nella sezione 5). QuestoÈ l'unico formato di immagine compatibile con il modulo di analisi di ArrayNinja. Le seguenti istruzioni rappresentano un modo possibile per ottenere un file di immagine unito. Tuttavia, sono disponibili altre soluzioni ( ad esempio , l'ImageJ freeware).
    1. Dalla riga di comando in un terminale di bash di un computer con il freeware ImageMagick installato, passare alla cartella che contiene i file .tif di singolo canale e copiare / incollare i passaggi seguenti, colpendo "entrare" tra ogni passaggio (6.1.4-6.1 0,7).
      NOTA: I nomi dei file in lettere maiuscole ( ad esempio , RED_CHANNEL) dovrebbero essere sostituiti con il nome del file delle diapositive microarray.
    2. Se necessario, invertire prima le immagini usando il comando 'convert INPUT.tif -negate OUTPUT.tif'. Ciò è necessario se lo scanner salva i file .tif con il segnale in bianco e nero in background.
      1. Convertire -depth 16 RED_CHANNEL.TIF -clone 0 -channel GB -valuta il set 0 -delete 0 out.png 2> error.file.
      2. convProfondità 16 CONTROL_CHANNEL.TIF -clone 0 -canale RB -valuta il set 0 -delete 0 outa.png 2> error.file.
      3. Convertire -depth 16 CONTROL_CHANNEL.TIF -clone 0 -canale RG -valuta il set 0 -delete 0 outB.png 2> error.file.
      4. Convertire fuori.png outa.png outB.png -set color space RGV -combine merged.png.
        NOTA: Un file denominato "merged.png" verrà salvato nella stessa cartella dei file .tif originali.
  2. Quantificare i dati utilizzando ArrayNinja
    1. Apri ArrayNinja e fai clic sul collegamento appropriato della stampante microarray sotto "Per quantificare le immagini con una nota piastra di origine". Digitare il nome del disegno di diapositio salvato (punto 2.5) nella finestra di dialogo "piastra di carico" e fare clic su "entra". Vedere la Figura 4 per uno screenshot del modulo di analisi ArrayNinja.
    2. Fai clic su "Scegli il file" e vai a e seleziona il file 'merged.png' creato nella sezione 6.1. L'immaginario fusoE caricherà così come una griglia per il layout della diapositiva.
    3. Utilizzare i cursori nella parte inferiore del pannello di controllo ArrayNinja per regolare il contrasto, la luminosità e il punto medio.
      NOTA: Queste regolazioni sono solo a scopo di visualizzazione e non hanno alcun impatto sulla quantificazione.
    4. Selezionare "risoluzione" e inserire il valore corrispondente alla risoluzione dell'immagine acquisita. Utilizza il "margine" e "il margine superiore" per spostare la griglia in allineamento con i punti dell'array. Regolare come necessario per ottenere la griglia più strettamente allineata su ogni punto possibile.
    5. Fai clic su "Spot Seek" e attendi che il pulsante torni al colore grigio originale.
      NOTA: questo può essere ripetuto più volte per centrare i cerchi di griglia su singoli punti. La funzione Seek rilassa la griglia verso ogni punto per ottimizzare l'allineamento.
    6. Modificare il valore "Super Arrays" a "1" per elaborare singolarmente ciascun pannello di array secondario (se lo si desidera). Se si utilizza un 4X 12 layout di diapositiva a cera ( Figura 3E ), utilizzare i comandi "iPin" "jPin" e "subA" per disattivare le funzionalità per analizzare qualsiasi combinazione desiderata di 4 x 12 pozzetti. Ad esempio, per analizzare i pozzetti in alto a sinistra e in alto a destra come replicati l'uno all'altro, digitare "1 4" in iPin, "1 1" in jPin e "1 4" in subA. Premere Invio'.
    7. Spostare il mouse su singoli punti per visualizzare l'identità di quella funzionalità.
    8. Fai clic su "Toggle zoom" per esaminare le funzionalità più attentamente. Selezionare i punti di riferimento di sfondo premendo il tasto 'R' mentre il mouse è sopra un punto. I punti di riferimento verranno evidenziati in arancione.
      NOTA: nella modalità "zoom ingrandita", nell'angolo superiore destro viene visualizzata un'immagine ingrandita della funzione che il mouse ha superato. Una discussione dettagliata sulle funzionalità aggiuntive di correzione dello sfondo in ArrayNinja è discussa altrove 28 .
    9. Spostare i punti (con una morfologia spot o un detriti molto diversi che potrebbero influenzare la quantificazione accurata) premendo il tasto "A" mentre si aziona il mouse sui punti interessati. I punti inattivati ​​diventeranno bianchi.
    10. Fai clic su "popolazione" seguito da "Invia" per quantificare i punti.
      NOTA: una nuova scheda si apre e visualizza un grafico a barre di dati normalizzato alla media spot più luminosa. Una tabella sotto il grafico a barre contiene sia i valori di dati normalizzati che quelli raw. Questa tabella può essere copiata in un foglio di calcolo per archiviare e analizzare ulteriormente.

Figura 4
Figura 4: Modulo di analisi ArrayNinja. Viene visualizzato un colpo di schermo del modulo di analisi ArrayNinja. Il pannello di controllo (in alto a sinistra) mostra tutti i parametri che possono essere regolati per visualizzare l'array, trovare macchie e allineare una grigliaImmagine di matrice. Spostando il mouse su una funzione mostra una vista ingrandita (in alto a destra) e visualizza un popup che contiene le informazioni di identificazione associate a quella funzionalità (in basso). I punti di riferimento selezionati per la correzione dello sfondo sono arancione. Le caratteristiche da escludere dall'analisi a valle sono bianche. ArrayNinja contiene una funzionalità di ricerca basata sul testo che evidenzia le caratteristiche di corrispondenza in giallo, come mostrato nell'esempio di H4K16. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Representative Results

Questo protocollo è stato utilizzato per progettare e realizzare una piattaforma microarray peptide per l'analisi della specificità degli anticorpi PTM. L'array richiede una libreria di più di 300 funzionalità peptide uniche (20-40 residui di lunghezza) che rappresentano molte delle combinazioni note di PTM trovate sulle proteine ​​di istone del nucleo e delle varianti 38 . Questa pipeline è stata un cavallo di lavoro per lo screening di molti anticorpi PTM istantaneamente ampiamente usati e commercialmente disponibili, e tutti i set di dati disponibili sono disponibili sul Database di specificità degli anticorpi Histone (www.histoneantibodies.com). 17

La spina dorsale della nostra pipeline è l'ArrayNinja, un'applicazione software open source che abbiamo recentemente sviluppato, che integra le fasi di pianificazione e analisi del lavoro di microarray 28 . Il modulo di analisi ArrayNinja consente agli utenti di interagire in informaCon il loro file di immagine a matrice cruda. Le identità stampate vengono automaticamente integrate con l'immagine e queste identità possono essere rivelate spostando il cursore del mouse su un punto. Questa integrazione consente anche la rapida ricerca di funzionalità di interesse per nome e esclusione di funzionalità dall'analisi a valle. ArrayNinja fornisce anche opzioni per la correzione del rumore di fondo locale e non locale, nonché uno schema di correzione che si adatta alla morfologia spot. Dettagli completi di ArrayNinja e delle sue capacità si possono trovare altrove 28 .

ArrayNinja calcola le intensità del segnale per ciascuna caratteristica del peptide e aggrega quelle intensità in medie con errori basati sull'identità della funzione. Sono restituite le medie del segnale grezze e normalizzate, dove la costante di normalizzazione è determinata dalla media più brillante. Le intensità del segnale per ciascun peptide possono essere utilizzate per confrontare l'affinità relativa Dell'anticorpo tra le caratteristiche sul microarray. Qui mostriamo set di dati rappresentativi per due anticorpi profilati con questa pipeline, evidenziando le proprietà di riconoscimento epitopico che dovrebbero essere considerate quando si interpreta i risultati ottenuti con questi reagenti ( Figura 5 ).

Il riconoscimento fuori bersaglio è una preoccupazione per tutti gli anticorpi e le comuni proprietà in epitopi che circondano i residui dell'istone modificabili rendono questa una sfida particolare per gli anticorpi di istone PTM. Infatti, un anticorpo sollevato per riconoscere la lisina tri-metilata 9 sull'istone H3 (H3K9me3) lega i peptidi trimetilati a H3K18, H3K27 e la lisina 20 sull'istone H4 (H4K20me3) pure o meglio di H3K9me3 ( Figura 5A ). La sequenza che circonda H3K9 (ARKS) è conservata con H3K27 e la reattività reattiva degli anticorpi PTM istone e regolatori di cromatina che legano e modifica questi siti è stata osservata altroveSs = "xref"> 15 , 39 , 40 , 41 . Un'altra proprietà di riconoscimento fuori bersaglio comune per gli anticorpi di metil-lisina è un'incapacità di discriminare l'ordine metilico. Ciò è esemplificato dai risultati ottenuti con un anticorpo H3K4me3, che attraversa i peptidi H3K4me2 e H3K4me1 ( figura 5B ). La distinzione tra ordine metilico è importante, poiché studi hanno dimostrato che H3K4me3, H3K4me2 e H3K4me1 sono distribuiti in modo diverso nel genoma e probabilmente funzionano in modi diversi 42 , 43 . Ad esempio, H3K4me3 si trova nei siti di inizio della trascrizione dei geni più trascritti attivamente, mentre gli enhancer attivi sono comunemente contrassegnati da H3K4me1 44 .

Oltre al riconoscimento off-target, influenza positiva e negativaE dai PTM vicini è una proprietà comunemente osservata degli anticorpi istoni. L'anticorpo H3K9me3 mostrato nella Figura 5A è influenzato positivamente dai gruppi acetilici sui residui lisci vicini. Infatti, l'ultima analisi di spettrometria di massa mostra che i gruppi acetilici, in particolare H3K14ac, spesso co-verificano con H3K9me3 38 . L'anticorpo H3K4me3 mostrato nella figura 5B è influenzato negativamente dalla fosforilazione vicina alla treonina 6 (H3T6p). H3T6p è noto per avere sia un impatto positivo e negativo sul riconoscimento di H3K4me3 da proteine ​​di lettura, e questo può servire come un meccanismo dinamico per regolare l'assunzione di fattori di cromatina specifici 15 , 45 .

Figura 5
Figura 5: Analisi degli anticorpi sui microarray di peptide. Analisi di anticorpi (A) H3K9me3 (anticorpo # 1) e (B) H3K4me3 (anticorpo # 2) sui microarray peptidici. Linee / barre verdi indicano il peptide che ospita solo il target PTM destinato. Le righe / barre grigie indicano peptidi la cui intensità di segnale non è significativamente diversa (p> 0,05) dalla linea verde / bar, calcolata utilizzando un ANOVA a senso unico confrontando l'intensità relativa media di tutti i peptidi verso il peptide bersaglio. Le righe / barre rosse e blu indicano segnale che è significativamente diminuito o aumentato (p <0,05) dalla linea verde / bar rispettivamente. Le linee / barre arancioni indicano i peptidi fuori bersaglio. I dati vengono visualizzati come (a sinistra) un'illustrazione visiva della complessità PTM sui peptidi che attraversano le regioni N-terminali delle code H3 e H4, dove la larghezza di ciascuna linea corrisponde all'intensità relativa misurata per quella funzionalità del peptide e (a destra) i grafici a barre Visualizzando le medie di intensità del segnale relative ± SEM da 6 singoli punti di misuraSu microarray. Tutti i peptidi inclusi in questa analisi sono 20 aminoacidi di lunghezza corrispondenti ad entrambi gli aminoacidi H3 dell'istone 1-20 o 15-34 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

L'affidabilità degli anticorpi nelle applicazioni di ricerca biomedica è fondamentale 46 , 47 . Ciò è particolarmente vero nella biochimica cromatica data la posizione degli anticorpi come strumenti chiave per la maggior parte delle tecniche sviluppate per caratterizzare l'abbondanza e la distribuzione di PTM istoniche. Il protocollo qui presentato illustra una pipeline ottimizzata per la progettazione, la fabbricazione e l'uso di microarray peptidi per analizzare la specificità degli anticorpi PTM. Questa pipeline è stata utilizzata per la visualizzazione di un numero elevato di anticorpi PTM di istone commercialmente disponibili e ampiamente utilizzati e i dati generati da questi esperimenti sono liberamente disponibili attraverso un database di specificità antitumorale in linea e in espansione (www.histoneantibodies.com) 17 .

Apparentemente dal lavoro di noi e degli altri sono casi frequenti di comportamenti anticoncorrenziali PTM sfavorevoli che possono complicare l'interpretazioneIon dei dati generati con questi reagenti 12 , 15 , 17 . Sono pertanto garantite misure di controllo della qualità più rigorose e complete delle aziende anticorpi. Gli esperimenti sperimentali e i leader del consorzio epigenomi ( ad esempio , ENCODE, BLUEPRINT) devono anche mostrare rigore nella propria valutazione degli anticorpi PTM istoniali quando si sceglie un reagente per il loro studio. Inoltre, gli sforzi per ridurre al minimo la variabilità batch-to-batch, standardizzare l'uso di reagenti di affinità altamente convalidati in tutte le piattaforme di mappatura epigenomi e sviluppare strumenti alternativi di affinità sono tutti elementi che possono essere utilizzati per risolvere questo problema di ricerca.

I microarray hanno un certo numero di vantaggi rispetto ai test micropiastri ( ad es. , ELISA) che li rendono particolarmente utili per la caratterizzazione della specificità degli anticorpi PTM. Microarrays consentono l'analisi parallela e competitiva di migliaia di singoli peptide-Interazioni anticorpi con un consumo minimo di materiale. Nel protocollo qui descritto, 700 picomoli di ciascuna caratteristica peptidica sono sufficienti per produrre 100 diapositive microarray. Inoltre, l'analisi degli anticorpi può essere completata usando meno di 1 μg di anticorpi, ei formati di array personalizzati consentono di verificare in parallelo molti anticorpi e varie diluizioni degli anticorpi.

La progettazione di layout personalizzati sulle microarray può essere un compito laborioso. Inoltre, ogni nuovo disegno di microarray richiede la creazione di un nuovo modello di analisi. Abbiamo trovato questo essere proibitivo per realizzare la piena utilità della tecnologia microarray. Questo ha motivato il nostro sviluppo di ArrayNinja, un open-source applicazione interattiva del software che si integra perfettamente gli aspetti di progettazione e analisi di esperimenti di microarray 28. Il modulo di progettazione di ArrayNinja consente all'utente di progettare interattivamente una diapositiva per adattarsi al layout richiesto per un esperimento. ArrayNinja virtSpiega in modo preciso il movimento robotico della stampante e lo traduce nel layout della piastra di origine per un determinato disegno a scorrimento ( Figura 2 ). La creazione di formati di array personalizzati è ora una pratica veloce e di routine. Un'altra caratteristica fondamentale di ArrayNinja è la connessione tra le fasi di progettazione e analisi del lavoro di microarray. Con le impostazioni definite dall'utente dal modulo di progettazione, ArrayNinja sovrappone una griglia interattiva su un'immagine microarray acquisita, consentendo all'utente di spostarsi su qualsiasi funzione per rivelare la propria identità o cercare funzioni di interesse ( Figura 4 ).

Vanno da notare diversi punti critici di questa pipeline. Innanzitutto, durante la progettazione del layout di stampa, occorre tener conto di includere abbastanza spot replicati al fine di ottenere un significato nella raccolta dei dati. Inoltre, per tenere conto della variabilità pin-to-pin, ogni funzione deve essere depositata da almeno due diversi pin. Infine, forse il passo più critico è il generatore fisicoIone della piastra sorgente. L'utilizzo efficace dei microarray ad alta densità descritto in questo protocollo si basa sulla capacità di mappare l'identità di ciascuna funzionalità nella loro posizione fisica nella diapositiva finale. Questo compito di mappatura non è banale, ma ArrayNinja facilita notevolmente questo passaggio fornendo una mappa piatta. Ogni deviazione di questa mappa durante la creazione delle targhette di origine comporterà conclusioni non corrette durante l'analisi.

È importante considerare i limiti di utilizzo di microarray per l'analisi della specificità degli anticorpi. Mentre le proprietà degli anticorpi PTM anti-bersaglio catturate nell'array sono state dimostrate per essere tradotte in approcci sperimentali con condizioni simili di ibridazione ( es . Immunoblot) 17 , 18 , in che misura la profilazione a base di matrice di specificità degli anticorpi si traduce in protocolli ChIP è suggestiva 14 , 17 ma waEsprime una valutazione più critica.

Le variazioni a questa pipeline sono state precedentemente descritte per l'analisi di lettori, scrittori e cancellatori di istone 23 , 24 . La modifica di questa piattaforma per utilità oltre la ricerca epigenetica potrebbe essere facilmente adattata a qualsiasi libreria di interesse stampabile. È inoltre possibile che materiali più complessi di peptidi possano essere usati per costruire microarray per la ricerca biochimica cromatica. Ad esempio, i nucleosomi ricombinanti che presentano varie PTM vengono ora generati in modo rutinato nell'ambiente di laboratorio 48 e la profilazione della specificità degli anticorpi PTM dell'istone nel contesto di questa subunità cromatina fisiologicamente rilevante sarà una zona emozionante di studio futuro.

Un approccio alternativo ampiamente usato al protocollo qui descritto utilizza la tecnologia SPOT array, dove centinaia di peptidi vengono direttamente sintetizzati su una cellulaPerde il supporto della membrana 49 . La membrana stessa può quindi essere utilizzata per applicazioni di microarray 50 . La tecnologia SPOT è vantaggiosa dal punto di vista della complessità della libreria e del costo di sintesi. Tuttavia, la purezza dei peptidi sintetizzati usando il metodo SPOT è stata riportata a variare e le misure di controllo e purificazione di qualità comune per la sintesi di peptide a fase solida ( es. , HPLC e spettrometria di massa) non vengono eseguite in modo ordinario 50 , 51 . Inoltre, la presentazione del peptide su nitrocellulosa non è uniforme e può proteggere epitopi. In particolare, entrambi i tipi di piattaforme a matrice di peptide istone sono commercialmente disponibili per gli utenti che non hanno accesso alle attrezzature specializzate necessarie per sintetizzare i peptidi e costruire matrici.

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Disclosures

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto in parte da Van Andel Research Institute e da una borsa di studio degli Istituti Nazionali di Sanità (CA181343) a SBR

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Printing Buffer ArrayIt PPB
BSA Omnipure 2390
Streptavidin-coated glass microscope slides Greiner Bio-one 439003-25
polypropylene 384 well plate Greiner Bio-one 784201
Biotin-fluorescein Sigma 53608
contact microarray printer Aushon 2470 Aushon 2470 Microarray Printer
contact microarray printer Gene Machines OmniGrid 100 OmniGrid Microarray Printer
PBS Invitrogen 14190
Blocking Buffer ArrayIt SBB
Hydrophobic wax pen Vector Labs H-4000 ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen
Silicon Gasket Grace Bio-labs 622511
Hybridization Vessel Thermo Scientific 267061 or similar vessel
Fluorescent-dye conjugated secondary antibody Life Technologies A-21244 Alexa Fluor 647 (anti-rabbit)
Fluorescent-dye conjugated secondary antibody Life Technologies A-21235 Alexa Fluor 647 (anti-mouse)
Wax Imprinter ArrayIt MSI48
Tween-20 Omnipure 9490
Microarray Scanner Innopsys InnoScan 1100AL or equivalent microarray scanner
EipTitan Histone Peptide Microarray Epicypher 112001
AbSurance Pro Histone Peptide Microarray Millipore 16668
MODified Histone Peptide Array Active Motif 13001
Histone Code Peptide Microarrays JPT His_MA_01
Wax Royal Oak GulfWax for wax imprinter
Humidified Microarray Slide Hybridization Chamber VWR 97000-284
High throughput microscope slide washing chamber ArrayIt HTW
Microscope slide centrifuge VWR 93000-204
Antibody 1 Abcam 8898
Antibody 2 Millipore 07-473
Biotinylated histone peptide EpiCypher 12-0001 Example peptide. Similar peptides with various modifications are available from several commercial sources.
ImageMagick https://www.imagemagick.org/script/index.php
ArrayNinja https://rothbartlab.vai.org/tools/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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