Analyse af histonantistofspecifikitet med peptidmikroarrays

Published 8/01/2017
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biochemistry

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Dette manuskript beskriver metoder til anvendelse af peptidmikraariteknologi til specificitetsprofilering af antistoffer, der genkender histoner og deres posttranslationelle modifikationer.

Cite this Article

Copy Citation

Cornett, E. M., Dickson, B. M., Rothbart, S. B. Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays. J. Vis. Exp. (126), e55912, doi:10.3791/55912 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Post-translationelle modifikationer (PTM'er) på histonproteiner studeres bredt for deres roller i regulering af kromatinstruktur og genekspression. Masseproduktionen og distributionen af ​​antistoffer, der er specifikke for histon-PTM'er, har i høj grad lettet forskningen på disse mærker. Da histon-PTM-antistoffer er nøglereagenser til mange kromatinbiokemiske applikationer, er streng analyse af antistofspecificitet nødvendig for nøjagtig datatolkning og fortsatte fremskridt på området. Denne protokol beskriver en integreret pipeline til design, fabrikation og anvendelse af peptidmikroarrays til profilering af specificiteten af ​​histonantistoffer. Design og analyse aspekter af denne procedure er lettet af ArrayNinja, en open source og interaktiv softwarepakke, vi for nylig udviklede for at strømline tilpasningen af ​​microarray printformater. Denne rørledning er blevet brugt til at screene et stort antal kommercielt tilgængelige og almindeligt anvendte histon PTM antibodiesS, og data genereret fra disse eksperimenter er frit tilgængelige via en online og udvidende Histone Antibody Specificity Database. Ud over histoner kan den generelle fremgangsmåde beskrevet heri anvendes bredt til analysen af ​​PTM-specifikke antistoffer.

Introduction

Genomisk DNA pakkes elegant inde i den eukaryote cellekerne med histonproteiner til dannelse af chromatin. Den gentagne underenhed af kromatin er nukleosomet, som består af 147 basepar af DNA viklet omkring en octamer kerne af histonproteiner - H2A, H2B, H3, og H4 1. Kromatin er bredt organiseret i løst pakket eukromatin og tæt pakket heterochromatin domæner. Graden af ​​chromatin-komprimering regulerer i hvilket omfang proteinindustrien kan få adgang til det underliggende DNA til at udføre grundlæggende DNA-templaterede processer som replikation, transkription og reparation.

Nøgleregulatorer for genometilgængelighed i forbindelse med chromatin er PTM'er på de ustrukturerede hale- og kerneområder af histonproteiner 2 , 3 . Histon-PTM'er virker direkte ved at påvirke strukturen af ​​chromatin 4 og indirekte througH rekruttering af læserproteiner og deres tilhørende makromolekylære komplekser, der har kromatin remodeling, enzymatisk og stilladsaktiviteter 5 . Undersøgelser af histon-PTM-funktion i løbet af de sidste to årtier tyder på overvejende, at disse mærker spiller nøglerolle i regulering af celleforebyggelse, organisationsudvikling og sygdomsinitiering / progression. Fueled af fremskridt i massespektrometri-baseret proteomteknologi er der fundet mere end 20 unikke histon-PTM'er på mere end 80 forskellige histonrester 6 . Navnlig forekommer disse modifikationer ofte i kombinationer og i overensstemmelse med "histonkode" -hypotesen, viser talrige undersøgelser, at læserproteiner er målrettet mod diskrete regioner af chromatin ved genkendelse af specifikke kombinationer af histon-PTM'er 7 , 8 , 9 . En vigtig udfordring fremadrettet vil være at tildele funktioner til grSkyldige liste over histon-PTM'er og at bestemme, hvordan specifikke kombinationer af histon-PTM'er orkestrerer de dynamiske funktioner, der er forbundet med chromatin.

Antistoffer er lynchpinreagenser til påvisning af histon-PTM'er. Som sådan er mere end 1000 histon-PTM-specifikke antistoffer blevet udviklet kommercielt til anvendelse i kromatinbiokemiforskning. Med den hurtige udvikling af DNA-sekventeringsteknologi med høj gennemstrømning anvendes disse reagenser i vid udstrækning af individuelle efterforskere og omfattende epigenomiske "køreplan" -initiativer ( f.eks . ENCODE og BLUEPRINT) i ChIP-seq (chromatinimmunpræcipitation kombineret med næste generations sekventering ) Rørledninger til at generere højopløselige rumlige kort af histon PTM-fordelingsgenet bredt 10 , 11 . Nylige undersøgelser har imidlertid vist, at specificiteten af ​​histon-PTM-antistoffer kan være meget variabel, og at disse reagenser udviser uegnede Dyrebare egenskaber som off-target-epitopgenkendelse, stærk positiv og negativ indflydelse fra nabo-PTM'er og vanskeligheder med at diskriminere modifikationsordren på en bestemt rest ( fx mono-, di- eller trimethyllysin) 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Derfor er streng kvalitetskontrol af histon PTM-specifikke antistofreagenser nødvendigt for nøjagtigt at fortolke data genereret med disse værdifulde reagenser.

Microarray-teknologien muliggør samtidig forespørgsel af tusindvis af makromolekylære interaktioner i et gennemgående, reproducerbart og miniaturiseret format. Af denne årsag er der blevet udviklet en række mikroarrayplatforme til analyse af protein-DNA 19 ,"> 20, proteinprotein 21 og proteinpeptid-interaktioner 22. Faktisk er histonpeptidmikroarrays fremkommet som en informativ opdagelsesplatform for chromatin biokemiforskning, der muliggør højprofilering af forfattere, viskelæder og læsere af histon PTM'er 15 , 23, 24, og også til analyse af histon antistofspecificitet 17, 25. Beyond deres anvendelse i kromatin og epigenetik forskning, histon peptidarrays har potentiel anvendelighed som en diagnostisk / prognostisk test for systemisk lupus erythematosus og andre autoimmune sygdomme, hvor anti- Chromatin autoantistoffer er dannet 26 , 27 .

Her beskriver vi en integreret rørledning, som vi har udviklet til design, fremstilling og køRying histone peptid microarrays at generere specificitet profiler for antistoffer, der genkender histoner og deres PTMs. Rørledningen understøttes af ArrayNinja, en open source, interaktiv software applikation, som vi for nylig udviklede, som integrerer design- og analysestadierne i microarray eksperimenter 28 . ArrayNinja virker bedst i Google Chrome. Kort fortalt anvendes en robotkontakt-mikroarray printer til at deponere et bibliotek af biotinkonjugerede histonpeptider i definerede positioner på streptavidin-coatede glasmikroskop dias. Arrays kan derefter anvendes i et konkurrencedygtigt og parallelt assayformat for at forhøre antistof-epitopinteraktioner ( Figur 1 ). Peptidbiblioteket består af hundredvis af unikke syntetiske peptider, der indeholder PTM'er (lysinacetylering, lysin / argininmethylering og serin / threoninphosphorylering) alene og i relevante kombinationer, der stort set er afledt af proteomiske datasæt. Metoder til peptidsyntese og validering Er beskrevet andetsteds 23 . Data genereret fra vores igangværende histone PTM antistof screening indsats udnytter denne array platform er arkiveret på en offentlig web ressource, Histone Antibody Specificity Database (www.histoneantibodies.com). Især er histonpeptidmikroarrays fremstillet med variationer af denne protokol også blevet anvendt i vid udstrækning for at karakterisere aktiviteten af ​​histon PTM-læserdomænerne 8 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 og mere for nylig til profilering af histon PTM forfatter og viskelæder 24 .

/files/ftp_upload/55912/55912fig1.jpg "/>
Figur 1: Tegneserieafbildning af den trinvise procedure til antistof screening på en histonpeptid-mikroarray. Biotinylerede histonpeptider med definerede posttranslationelle modifikationer (røde og blå cirkler) er trykt med biotin-fluorescein på streptavidin-belagt glas. Positive interaktioner visualiseres som rød fluorescens. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Installere og køre ArrayNinja

  1. Download og installer Oracle Virtual Box fra www.virtualbox.org.
  2. Download og komprimer ArrayNinja virtuelle maskine (VM) fra http://research.vai.org/Tools/arrayninja.
  3. Åbn Virtual Box og tilføj ArrayNinja VM ved at klikke på 'Maskine', 'Tilføj' og vælg arrayninja.vbox fra den mappe, hvor ArrayNinja VM blev gemt.
  4. Start ArrayNinja ved at vælge det inde i Virtual Box og klikke på den grønne "start" -pile.
  5. Virtual Box åbner et nyt vindue og viser en meddelelse om, at VM'en kan fås ved at navigere i webbrowseren til localhost: 2080.60; BEMÆRK: En containeriseret version af ArrayNinja er også tilgængelig via hub.docker.com/r/bradley.dickson/arrayninja/

2. Designing Array Slide og Source Plate Layout

  1. Under overskriften 'Planlæg et diaslayout' på ArrayNinja-grænsefladen skal du klikke på linket, der svarer til den mikroarray printer, der bruges.
    BEMÆRK: ArrayNinja er programmeret til at efterligne robotbevægelsen af ​​to almindeligt anvendte microarray-printere (se tabel1). Kompatibilitet med de andre arrayer kan konfigureres efter anmodning.
  2. Klik inde i dialogboksen 'Indlæs plade', skriv 'tom' og klik 'enter'. Se Figur 2 for et skærmbillede af ArrayNinja-designmodulet.
  3. Juster spotdiameteren til 275 μm og spotafstand til 375 μm. Juster de resterende indstillinger (Pladeblokke / plade række, Total pladderækker, replikater, funktioner i y, Super Arrays, SuperA fudge, se Figur 2 ) for at tilpasse, hvordan funktionerne vises på microarray-diaset.
    BEMÆRK: Spotdiameteren bestemmes af størrelsen af ​​microarray pin. Da disse indstillinger er justeret, opdateres tegnefiltret i realtid. Brug denne tegneserie til at se, hvordan hver indstilling ændrer det endelige diaslayout.
  4. Når layoutet af funktionerne på diaset er færdiggjort, skal du musen over hver unik funktion og indtaste funktionsidentifikatoren i pop op-dialogboksen.
    BEMÆRK: Funktionsidentifikatorer kan bestå af tal, bogstaver eller kombinationer. Dette er kun nødvendigt for unikke funktioner, og en dialogboks vises ikke, når replikater vælges.
  5. Når alle unikke funktioner er blevet tildelt en identifikator, skal du klikke på 'udfyld'. Indtast et navn til diaslayoutet og klik på 'Udskriv din plade' for at gemme. En ny side åbnes, der viser antallet af 384 brønde kildeplader, der er nødvendige for at fremstille det valgte diasdesign og en tabel, der kortlægger den fysiske placering af hvert enkelt element, der skal indlæses i kildepladen / -pladerne.
    BEMÆRK: Husk dette navn, da det bliver brugt til at tilbagekalde dette design, når du analyserer mikroarray data (se afsnit 6.2). Ved at klikke på 'print din plade' gemmes layoutet i ArrayNinja.

Figur 2
Figur 2: ArrayNinja Design Modul. Et skærmbillede af ArrayNinja design modul er vist i den stiplede linje. Kontrolpanelet (øverst) viser alle de parametre, der kan ændres på microarray printeren. Da disse parametre justeres, opdateres tegnefilmbilledet af diaslayoutet (nederst til venstre) i realtid. Når layoutet er indstillet, kan brugeren musere over individuelle pletter for at indtaste unikke funktionsidentifikatorer. ArrayNinja konstruktioner fra denne bruger indlæser et kort over placeringen af ​​hver funktion i kildepladen / -pladerne (nederst til højre), der er nødvendige for at fremstille et specificeret microarray slide layout. Klik her for at se en større version af denne figur.

3. Fremstilling af mikroarrays

  1. Forbereder kildepladen
    1. Brug kortet, der er genereret med ArrayNinja i afsnit 2.5, til at oprette 384-brønds kildeplade (r).
      BEMÆRK: Detaljerede beskrivelser af peptider forespurgt på denne platform kan findes andre stederS = "xref"> 17.
    2. Indsæt 1 - 2 μl af hver funktion ( fx biotinyleret histonpeptid) i den korrekte brønd på 384 brønde kildeplade (r).
      BEMÆRK: Biotinylerede histonpeptider aflejres typisk fra 200-400 μM stamopløsninger, som svarer til 10 til 25 gange molært overskud af peptid til streptavidinbindingssteder i et enkelt array-punkt. Dette beregnes ved hjælp af ligningen:
      ligning
      Hvor V er volumenet leveret af en pin, [ P ] er koncentrationen af ​​funktionen trykt, N A er Avogadros nummer, og S er overfladearealet af et punkt. C er dækningsdækningen udtrykt som antallet af streptavidinmolekyler pr. Arealareal multipliceret med tre (det gennemsnitlige antal tilgængelige streptavidinbindingssteder). V og C opnås af den respektive producent. Andre funktioner kanKræver forskellige koncentrationer afhængigt af størrelsen af ​​biomolekylet, hvor trængsel kan være en bekymring. En række trykkoncentrationer for hver ny type funktion skal testes empirisk for at bestemme den optimale udskrivningskoncentration.
    3. Fortyn hver funktion 10 gange med 1x trykbuffer suppleret med 1% bovint serumalbumin (BSA). Spinde kildepladen / -pladerne ved 500 xg i 2 minutter ved stuetemperatur.
      BEMÆRK: Inklusion af fluorescein-mærket biotin (5 μg / μl) i trykpufferen anbefales som en spottingskontrol og som et visuelt hjælpemiddel til at lette korrekt arrayjustering under analysen (se figur 4 ).
  2. Printprotokol ( Figur 3A - B ).
    1. Forbered arraderen ved at tømme beholderen til opsamling af affald og fylde beholderen med beholderen til beholderen og luftfugtigheden med sterilt destilleret vand.
    2. Indtast parametrene uSed til at designe diaset i ArrayNinja (sektion 2 og figur 2 ) i microarray printerstyringsprogrammet.
    3. Ved hjælp af microarray printerstyringsprogrammet indstilles vaskeproceduren til en 1 s vask med en nedsænkning. Indstil eftervaskeindstillingerne til at dæmpe tappene 5 gange efter hver vask. Indstil fugtigheden til 60%.
      BEMÆRK: Den optimale vaskekonfiguration kan variere afhængigt af den anvendte mikroarray printer. Den optimale postvaske-dip-dybdekonfiguration kan variere afhængigt af den anvendte mikroarray printer.
    4. Indsæt funktionaliserede dias ( fx streptavidin-belagt glas) i substratpladen og læg alle plader i pladen elevator. Indsæt kildepladen / -pladerne i pladeholderne og sæt dem ind i kildepladens elevator.
    5. Klik på 'print'. Overvåg udskrivningsprocessen for et par runder af funktionens aflejring for at sikre, at alle vaske- og dyppebetingelser er korrekte. Når udskrivningen er færdig, skal du fjerneSubstratpladen fra arrayet.
      BEMÆRK: Når store udskriftsprogrammer forbyder fuldførelse af blokeringstrin inden for en dag, kan trykte dias inkuberes i et befugtet kammer ved 4 ° C natten over. Inkubér diasene ved siden af ​​et lille bæger med vand inde i en papkasse forseglet med plastfolie.
    6. Blokér diaserne med blokeringsbuffer i 30 minutter ved stuetemperatur under blanding.
    7. Vask diaserne 2 x 10 minutter ved stuetemperatur i fosfatbufferet saltvand (PBS), pH 7,6 ved blanding. Tør gliderne ved at dreje i en mikroarray glidecentrifuge i 30 s ved stuetemperatur.
      BEMÆRK: For at behandle et stort antal dias på én gang kan der anvendes et højtryksmikroskop diasekammer, hvorved 50 dias kan vaskes parallelt.
    8. For dias designet til at blive opdelt i voks, fortsæt til afsnit 4.1. For alle andre mønstre opbevares glider ved 4 ° C beskyttet mod lys og fugt.
      BEMÆRK: Trykte biotinylerede histonpeptiderEr stabile i mindst 6 måneder, når de opbevares på denne måde.

4. Partitionering Microarray Slides

  1. Hydrofobe vokspen ( figur 3C )
    1. Påfør voks omkring de områder, der indeholder funktioner ved hjælp af en vokspen. Tillad voks at lufttørre i 5 minutter, før du fortsætter til afsnit 5.
      BEMÆRK: Efter blokering kan array-pletterne være meget vanskelige at visualisere ved øjet. Glidesignet fra ArrayNinja kan udskrives i skala og bruges som vejledning til påføring af voks.
  2. Silikone pakning ( Figur 3D )
    1. Skræll den klare film ud af pakningspakningens bagside og læg klæbemiddelsiden ned på microarray-glideren.
    2. Hold pakningen på plads i 5 s, før du fortsætter til afsnit 5.
  3. Voksaftryk ( figur 3E )
    1. For dias, der er designet til at blive opdelt i voks, skal du udskrive et testglas på almindeligt glas ved hjælp af 10% BSA. Brug dette testbillede til at optimere indstillingerne for voksimprinter eller arrayindstillinger for at sikre, at alle funktioner er inden for voksformkamrene.
    2. Varm mikroarray voksimprinter til 85 ° C, indtil al voksen er helt smeltet, ca. 30 min.
    3. Indsæt diaset med den udskrevne side nedad og skub skyderen helt til højre på microarray imprinteren. Træk håndtaget op for at bringe støbeformen i kontakt med glidens overflade. Hold i 2 s.
      BEMÆRK: Holdetiden kan ændres for at opnå optimal vokskanttykkelse.
    4. Fjern straks glideren og visuelt inspicere voksgrænserne for at sikre, at alle brønde er lukket, og at grænserne ikke er så tykke, at de går ind over pletterne. Opbevar glider ved 4 ° C beskyttet mod fugt og lys.
      BEMÆRK: Holdetiden kan øges eller formindskes for at opnå tykkere eller tyndere grænser.

"Figur Figur 3: Microarray Fabrication. (A) Histonpeptid-mikroarray-fremstilling på streptavidin-coatede mikroskopglas ved hjælp af en mikroarray-printer. (B) Microarrays fremstillet med 3 subarrays af et 48 x 48 gitter med peptidegenskaber. Adskillelse af (C) 3 subarrays med en hydrofob vokspenne, (D) 2 subarrays med et siliciumklæbemiddel og (E) 48 subarrays med et voksaftryk. Alle viste mikroarrays fremstilles ved hjælp af 25 x 75 mm mikroskopglas. Klik her for at se en større version af denne figur.

5. Hybridisering af et histon-PTM-antistof med en peptid-mikroarray

  1. Forbered hybridiseringsbuffer (PBS, pH 7,6, 5% BSA, 0,1% Tween-20).
  2. Equilibrere diaset i hybridiseringsbufferenVed anvendelse af et hybridiseringsbeholder. Helt dække hele diaset i hybridiseringspuffer og inkuber i 30 minutter ved 4 ° C på en omløbsrister ved lav hastighed.
  3. Forbered en opløsning indeholdende fortyndet histon PTM antistof i hybridiseringsbuffer.
    BEMÆRK: I eksempeldataene blev både histonantistof nr. 1 og antistof nr. 2 fortyndet 1: 1000 i hybridiseringsbuffer. Et fortyndingsområde svarende til det, der anvendes til immunblotting, anbefales som udgangspunkt.
  4. Inkubér arrayet med antistofopløsningen i 1 time ved 4 ° C. Fjern antistofopløsningen og vask arrayet 3 gange i 5 minutter ved 4 ° C med kold PBS, pH 7,6.
  5. Forbered en 1: 5000 - 1: 10.000 fortynding af fluorescerende farvestof-konjugeret sekundært antistof i hybridiseringsbuffer.
  6. Inkubér arrayet med sekundær antistofopløsning i 30 minutter ved 4 ° C beskyttet mod lys. Fjern den sekundære antistofopløsning og vask mikroarray glideren 3 gange i 5 minutter ved 4 ° C med PBS, pH 7,6. DipMikroarrayet i et 50 ml konisk rør indeholdende 0,1 x PBS, pH 7,6 for at fjerne overskydende salt ved stuetemperatur. Tør lysbildet i en mikroarray glidecentrifuge ved stuetemperatur.
  7. Scan diaset med en microarray-scanner med en opløsning på 25 μm eller derover, efter mikroarray scannerproducentens anbefalede scanningsprotokol.
    BEMÆRK: Hvis fluoresceinmærket biotinspor er til stede, scan både den grønne kanal (ex: 488 nm, em: 509 nm) og den kanal, der svarer til det fluorescerende farvestof-konjugerede sekundære antistof, typisk rødt (ex: 635 nm, em : 677 nm). Målet med scanning er at opnå single channel .tif-filer, som kan fusioneres i en enkelt .png-fil (som beskrevet i afsnit 6.1).

6. Analyse af Microarray Data ved anvendelse af ArrayNinja

  1. Forbereder et flettet microarray billede
    BEMÆRK: Målet med dette afsnit er at oprette en .png-billedfil, der fusionerer de to single-channel .tif-filer (opnået i afsnit 5). Det herEr det eneste billedformat kompatibelt med ArrayNinja analysemodulet. Følgende instruktioner repræsenterer en mulig måde at opnå en sammensmeltet billedfil på. Der findes dog andre løsninger ( f.eks . Freeware ImageJ).
    1. Fra kommandolinjen i en bash-terminal på en computer, hvor Freeware ImageMagick er installeret, skal du navigere til den mappe, der indeholder enkeltkanalens .tif-filer og kopiere / indsætte de følgende trin og trykke 'Enter' mellem hvert trin (6.1.4 - 6.1 .7).
      BEMÆRK: Filnavne i store bogstaver ( f.eks . RED_CHANNEL) skal erstattes med filnavnet på microarray diasbillederne.
    2. Om nødvendigt skal du først vende om billederne ved hjælp af kommandoen 'konverter INPUT.tif -negate OUTPUT.tif'. Dette kræves, hvis scanneren gemmer .tif-filer med signalet i hvid og baggrund i sort.
      1. Konvertere -depth 16 RED_CHANNEL.TIF -clone 0 -kanal GB -evaluere sæt 0 -delete 0 out.png 2> error.file.
      2. convEr-dybde 16 CONTROL_CHANNEL.TIF -clone 0 -kanal RB -evaluere sæt 0 -delete 0 outa.png 2> error.file.
      3. Konvertere -depth 16 CONTROL_CHANNEL.TIF -clone 0 -kanal RG -evaluere sæt 0 -delete 0 outB.png 2> error.file.
      4. Konvertere out.png outa.png outB.png -set colorspace RGV -combine merged.png.
        BEMÆRK: En fil ved navn 'merged.png' gemmes i samme mappe som de originale .tif-filer.
  2. Kvantificering af data ved hjælp af ArrayNinja
    1. Åbn ArrayNinja og klik på den relevante microarray printer link under "Sådan kvantificeres billeder, som har en kendt kildeplade." Indtast navnet på det gemte diasdesign (trin 2.5) i dialogboksen "lasteplade" og klik på "enter". Se Figur 4 for et skærmbillede af ArrayNinja analysemodulet.
    2. Klik på 'Vælg fil' og naviger til og vælg filen 'merged.png', der er oprettet i afsnit 6.1. Det fusionerede billedeE vil indlæse såvel som et gitter til dias layout.
    3. Brug skyderne nederst på ArrayNinja kontrolpanelet til at justere kontrast, lysstyrke og midtpunkt.
      BEMÆRK: Disse justeringer er kun til visualisering og har ingen indflydelse på kvantificering.
    4. Vælg "opløsning" og indtast den værdi, der svarer til opløsningen af ​​det scannede billede. Brug "marginsiden" og "margen øverst" for at flytte gitteret i overensstemmelse med pletterne på arrayet. Juster efter behov for at få nettet så tæt på hver punkt som muligt.
    5. Klik på 'Spot Seek', og vent indtil knappen vender tilbage til den oprindelige grå farve.
      BEMÆRK: Dette kan gentages flere gange for at centrere gittercirklerne på individuelle pletter. Seek-funktionen slæber ruten mod hvert sted for at finjustere justeringen.
    6. Skift "Super Arrays" -værdien til "1" for at oparbejde hver sub array panel individuelt (hvis ønsket). Hvis du bruger en 4X 12 wax imprint slide layout ( Figur 3E ), brug "iPin" "jPin" og "subA" kontrollerne for at slukke funktioner for at analysere enhver ønsket kombination af 4 x 12 brønde. For eksempel at analysere de øverste venstre og øverste højre brønde som replikater af hinanden, indtast "1 4" i iPin, "1 1" til jPin og "1 4" i subA. Tryk på 'Enter'.
    7. Hold musen over individuelle pletter for at se identiteten af ​​den pågældende funktion.
    8. Klik på 'Skift zoom' for at gennemgå funktionerne mere omhyggeligt. Vælg baggrunds referencepunkter ved at trykke på 'R' tasten, mens musen er over et punkt. Referencepunkter markeres i orange.
      BEMÆRK: I forstørrelseszoom-tilstand vises et forstørret billede af den funktion, som musen er over, i øverste højre hjørne. En detaljeret diskussion af yderligere baggrundskorrigeringsfunktioner i ArrayNinja diskuteres andetsteds 28 .
    9. Skift fra pletter (med meget varieret spotmorfologi eller snavs, der ville påvirke nøjagtig kvantificering) ved at trykke på 'A'-tasten mens du svinger musen over de berørte pletter. Inaktiverede pletter bliver hvide.
    10. Klik på 'Fyld' efterfulgt af 'Send' for at kvantificere pletterne.
      BEMÆRK: En ny fane åbnes og viser en stregdiagram over data normaliseret til det lyseste punktgennemsnit. En tabel under stregdiagrammet indeholder både normaliserede og rå data værdier. Denne tabel kan kopieres til et regneark til arkivering og yderligere analyse.

Figur 4
Figur 4: ArrayNinja Analysis Module. Et skærmbillede af ArrayNinja analysemodulet vises. Kontrolpanelet (øverst til venstre) viser alle de parametre, der kan justeres for at visualisere arrayet, finde pletter og justere et gitter overArray image. Ved at holde musen over en funktion vises en zoomet-in-visning (øverst til højre) og viser en popup, der indeholder identifikationsoplysningerne, der er knyttet til den pågældende funktion (nederst). Referencepunkter valgt til baggrundskorrektion er orange. Funktioner, der udelukkes fra downstream-analyser, er hvide. ArrayNinja indeholder en tekstbaseret søgefunktion, der fremhæver matchende funktioner i gul, som vist i eksemplet for H4K16. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokol er blevet anvendt til at designe og fremstille en peptid-mikroarrayplatform til analyse af histon-PTM-antistofspecificitet. Arrayet spørger om et bibliotek med mere end 300 unikke peptidfunktioner (20-40 rester i længden), der repræsenterer mange af de kendte kombinationer af PTM'er, der findes på kerne- og varianthistonproteiner 38 . Denne rørledning har været en arbejdshest for screeningen af ​​mange almindeligt anvendte og kommercielt tilgængelige histon PTM antistoffer, og fuldstændige datasæt er tilgængelige på Histone Antibody Specificity Database (www.histoneantibodies.com). 17

Rygraden i vores rørledning er ArrayNinja, et open source softwareprogram, som vi for nylig har udviklet, som integrerer planlægnings- og analysestadierne i microarray-arbejde 28 . ArrayNinja analysemodulet giver brugerne mulighed for at interagere i informaTive måder med deres rå array billedfil. De udskrevne funktioner identiteter integreres automatisk med billedet, og disse identiteter kan afsløres ved at holde musemarkøren over et punkt. Denne integration muliggør også hurtig søgning efter funktioner af interesse ved navn og udelukkelse af funktioner fra downstream analyse. ArrayNinja giver også muligheder for lokal og ikke-lokal baggrundsstøjkorrektion samt et korrektionsskema, som tilpasser sig til stedet morfologi. Fuldstændige detaljer om ArrayNinja og dets evner findes andre steder 28 .

ArrayNinja beregner signalintensiteter for hver peptidfunktion og aggregerer disse intensiteter i gennemsnit med fejl baseret på funktionidentitet. Rå og normaliserede signalværdier returneres, hvor normaliseringskonstanten bestemmes af det lyseste genstands gennemsnit. Signalintensiteterne for hvert peptid kan anvendes til at sammenligne den relative affinitet Af antistoffet blandt træk på microarray. Her viser vi repræsentative datasæt for to antistoffer profileret med denne rørledning, der fremhæver epitopgenkendelse egenskaber, der bør overvejes, når de tolker resultater opnået med disse reagenser ( figur 5 ).

Off-target-genkendelse er en bekymring for alle antistoffer, og commonaliteter i epitoper omkring modificerbare histonrester gør dette til en særlig udfordring for histon-PTM-antistoffer. Faktisk binder et antistof hævet for at genkende trimethyleret lysin 9 på histon H3 (H3K9me3) peptider trimethyleret ved H3K18, H3K27 og lysin 20 på histon H4 (H4K20me3) såvel som bedre end H3K9me3 ( Figur 5A ). Sekvensen omkring H3K9 (ARKS) konserveres med H3K27, og krydsreaktivitet af histon-PTM-antistoffer og chromatinregulatorer, som binder og modificerer disse steder, er blevet noteret andetstedsSs = "xref"> 15 , 39 , 40 , 41 . En anden observeret off-target-genkendelsesegenskab, der er fælles for methyl-lysinantistoffer, er en manglende evne til at diskriminere methylordre. Dette eksemplificeres af resultater opnået med et H3K4me3 antistof, som krydsreagerer med H3K4me2 og H3K4me1 peptider ( Figur 5B ). At skelne mellem methylordren er vigtig, da undersøgelser har vist, at H3K4me3, H3K4me2 og H3K4me1 er fordelt forskelligt på tværs af genomet og sandsynligvis fungerer på forskellige måder 42 , 43 . For eksempel er H3K4me3 placeret på transkriptionsstartstedene for de mest aktivt transkriberede gener, mens aktive forstærkere almindeligvis er markeret af H3K4me1 44 .

I tillæg til off-target-anerkendelse er positiv og negativ indflydelseE ved nabo-PTM'er er en almindelig observeret egenskab af histon-antistoffer. H3K9me3-antistoffet, der er vist i figur 5A, påvirkes positivt af acetylgrupper på nærliggende lysinrester. Faktisk viser nylig massespektrometrianalyse, at acetylgrupper, især H3K14ac, ofte forekommer med H3K9me3 38 . H3K4me3-antistoffet vist i figur 5B påvirkes negativt af nærliggende phosphorylering ved threonin 6 (H3T6p). H3T6p er kendt for at have både positiv og negativ indvirkning på genkendelsen af ​​H3K4me3 af læserproteiner, og dette kan fungere som en dynamisk mekanisme til regulering af rekruttering af specifikke kromatinfaktorer 15 , 45 .

Figur 5
Figur 5: Analyse af antistoffer på peptid-mikroarrays. Analyse af (A) H3K9me3 (Antistof nr. 1) og (B) H3K4me3 (Antistof nr. 2) antistoffer på peptidmikarrayser. Grønne linjer / barer indikerer peptidet, som kun indeholder den tilsigtede mål-PTM. Grå linjer / barer indikerer peptider, hvis signalintensitet ikke er signifikant forskellig (p> 0,05) fra den grønne linje / bar, beregnet ved hjælp af en envejs ANOVA, der sammenligner den gennemsnitlige relative intensitet af alle peptider til målpeptidet. Røde og blå linjer / barer indikerer signal, der er signifikant reduceret eller forøget (p <0,05) fra henholdsvis den grønne linje / bar. Orange linjer / stænger indikerer off-target peptider. Data vises som (venstre) en visuel illustration af PTM-kompleksitet på peptider, der spænder over N-terminale regioner i H3- og H4-halerne, hvor bredden af ​​hver linje svarer til den relative intensitet målt for den peptidfunktion og (højre) bargrafer Viser de relative signalintensitetsgennemsnit ± SEM fra 6 individuelle punktmålOm mikroarrays. Alle peptider, der indgår i denne analyse, er 20 aminosyrer i længden svarende til enten histon H3 aminosyrer 1 - 20 eller 15 - 34. Klik venligst her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Antistofens pålidelighed i biomedicinske forskningsapplikationer er afgørende 46 , 47 . Dette gælder især i kromatinbiokemi givet antistoffernes position som nøgleværktøjer til de fleste teknikker, der er udviklet til at karakterisere overfladen og fordelingen af ​​histon-PTM'er. Protokollen præsenterede her detaljer en optimeret pipeline til design, fabrikation og anvendelse af peptidmikroarrays for at analysere histon PTM antistofspecificitet. Denne rørledning er blevet anvendt til at screene et stort antal kommercielt tilgængelige og almindeligt anvendte histon-PTM-antistoffer, og data, der er genereret ud fra disse forsøg, er frit tilgængelige via en online og ekspanderende Histone Antibody Specificity Database (www.histoneantibodies.com) 17 .

Tilsyneladende fra vores og andres arbejde er hyppige forekomster af ugunstig histon PTM antistof adfærd, der kan komplicere fortolkningenIon af data frembragt med disse reagenser 12 , 15 , 17 . Mere stringente og omfattende kvalitetssikringsforanstaltninger fra antistofselskaber er derfor berettiget. Eksperimentelle og epigenomiske konsortieledere ( f.eks . ENCODE, BLUEPRINT) skal også vise rigor i deres egen vurdering af histon-PTM-antistoffer, når de vælger et reagens til deres undersøgelse. Derudover bestræber man på at minimere batch-to-batch-variabilitet, standardisere brugen af ​​højtvaliderede affinitetsreagenser på tværs af epigenom-kortlægningsplatforme, og udvikle alternative affinitetsværktøjer er alle handlinger, der kan håndtere dette forskningsproblem.

Mikroarrays har en række fordele i forhold til mikropladsbaserede analyser ( fx ELISA), som gør dem særligt nyttige til karakterisering af histon-PTM-antistofspecificitet. Microarrays muliggør parallel og konkurrencedygtig analyse af tusindvis af individuelle peptid-Antistofinteraktioner med minimalt materialeforbrug. I den her beskrevne protokol er 700 picomoler af hver peptidfunktion tilstrækkelig til at producere 100 mikroarray dias. Derudover kan antistofanalyser gennemføres under anvendelse af mindre end 1 μg antistof, og brugerdefinerede matrixformater gør det muligt at screene flere antistoffer og forskellige antistoffortyndinger parallelt.

Design af brugerdefinerede funktionslayouter på mikroarrays kan være en besværlig opgave. Derudover kræver hvert nyt microarray design udbygning af en ny analyse skabelon. Vi fandt dette for at være uoverkommeligt for at realisere den fulde nytte af microarray teknologi. Dette motiverede vores udvikling af ArrayNinja, en interaktiv, open source software applikation, der integreret design og analyse aspekter af microarray eksperimenter 28 problemfrit. Designmodulet i ArrayNinja giver brugeren mulighed for interaktivt at designe et dias, så det passer til det layout, der kræves til et eksperiment. ArrayNinja respekteredeUal kortlægger robotens bevægelse af printeren og oversætter dette til kildeskiltlayoutet for et givet lysdesign ( figur 2 ). Oprettelse af brugerdefinerede matrixformater er nu en hurtig og rutinemæssig praksis. Et andet centralt element i ArrayNinja er forbindelsen mellem design og analyse trin i microarray arbejde. Med brugerdefinerede indstillinger fra designmodulet overlapper ArrayNinja et interaktivt grid på et scannet microarray-billede, der giver brugeren mulighed for at musen over et hvilket som helst element for at afsløre sin identitet eller søge efter funktioner af interesse ( figur 4 ).

Flere kritiske trin i denne rørledning er værd at bemærke. For det første skal der tages hensyn til at inkludere tilstrækkelige replikpunkter for at opnå betydning ved dataindsamling under udformningen af ​​udskriftslayoutet. For at tage højde for pin-to-pin variabilitet skal hver funktion aflejres af mindst to forskellige stifter. Endelig er måske det mest kritiske trin den fysiske generatIon af kildepladen. Succesfuld brug af mikrodyserne med høj densitet beskrevet i denne protokol er afhængig af evnen til at kortlægge identiteten af ​​hver funktion til deres fysiske placering på det endelige objektglas. Denne kortlægningsopgave er ikke triviel, men ArrayNinja letter dette trin ved at give et pladekort. Eventuelle afvigelser til dette kort under oprettelsen af ​​kildepladerne vil føre til ukorrekte konklusioner under analysen.

Det er vigtigt at overveje begrænsningerne ved anvendelse af mikroarrays til analyse af antistofspecificitet. Selvom off-target-histon-PTM-antistofegenskaber erobret på arrayet, er blevet demonstreret at oversætte til eksperimentelle tilgange med lignende hybridiseringsbetingelser ( f.eks . Immunoblot) 17 , 18 , er det i hvilket omfang arraybaseret profilering af antistofspecificitet oversætter til ChIP-protokoller suggestiv 14 , 17 men waRrants mere kritisk evaluering.

Variationer i denne rørledning er tidligere blevet beskrevet til analyse af histon-læsere, forfattere og viskelæder 23 , 24 . Ændring af denne platform for hjælpeprogram ud over epigenetikforskning kunne let tilpasses til ethvert trykt bibliotek af interesse. Det er også muligt, at materiale, der er mere komplekst end peptider, kan anvendes til at konstruere mikroarrays til chromatin biokemiforskning. For eksempel genereres rekombinante nukleosomer, der udviser forskellige PTM'er, rutinemæssigt i laboratorieindstillingen 48, og profilering af specificiteten af ​​histon-PTM-antistoffer i forbindelse med denne fysiologisk relevante chromatinunderenhed vil være et spændende område for fremtidig undersøgelse.

En meget anvendt alternativ tilgang til protokollen beskrevet her anvender SPOT array-teknologi, hvor hundredvis af peptider syntetiseres direkte på en celluMister membranunderstøttelse 49 . Selve membranen kan derefter anvendes til mikroarray applikationer 50 . SPOT-teknologien er fordelagtig ud fra bibliotekets kompleksitet og synteseomkostninger. Renheden af ​​peptider syntetiseret ved anvendelse af SPOT-metoden er imidlertid rapporteret at variere, og kvalitetskontrol- og oprensningsforanstaltninger fælles for fastfase peptidsyntese ( fx HPLC og massespektrometri) udføres ikke rutinemæssigt 50 , 51 . Derudover er peptidpræsentationen på nitrocellulose ikke ensartet og kan beskytte epitoper. Især er begge typer histonpeptid array platforme tilgængelige kommercielt til brugere, der ikke har adgang til det specialudstyr, der er nødvendigt for at syntetisere peptider og fabricate arrays.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgements

Dette arbejde blev delvist støttet af Van Andel Research Institute og et forskningsbidrag fra National Institutes of Health (CA181343) til SBR

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Printing Buffer ArrayIt PPB
BSA Omnipure 2390
Streptavidin-coated glass microscope slides Greiner Bio-one 439003-25
polypropylene 384 well plate Greiner Bio-one 784201
Biotin-fluorescein Sigma 53608
contact microarray printer Aushon 2470 Aushon 2470 Microarray Printer
contact microarray printer Gene Machines OmniGrid 100 OmniGrid Microarray Printer
PBS Invitrogen 14190
Blocking Buffer ArrayIt SBB
Hydrophobic wax pen Vector Labs H-4000 ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen
Silicon Gasket Grace Bio-labs 622511
Hybridization Vessel Thermo Scientific 267061 or similar vessel
Fluorescent-dye conjugated secondary antibody Life Technologies A-21244 Alexa Fluor 647 (anti-rabbit)
Fluorescent-dye conjugated secondary antibody Life Technologies A-21235 Alexa Fluor 647 (anti-mouse)
Wax Imprinter ArrayIt MSI48
Tween-20 Omnipure 9490
Microarray Scanner Innopsys InnoScan 1100AL or equivalent microarray scanner
EipTitan Histone Peptide Microarray Epicypher 112001
AbSurance Pro Histone Peptide Microarray Millipore 16668
MODified Histone Peptide Array Active Motif 13001
Histone Code Peptide Microarrays JPT His_MA_01
Wax Royal Oak GulfWax for wax imprinter
Humidified Microarray Slide Hybridization Chamber VWR 97000-284
High throughput microscope slide washing chamber ArrayIt HTW
Microscope slide centrifuge VWR 93000-204
Antibody 1 Abcam 8898
Antibody 2 Millipore 07-473
Biotinylated histone peptide EpiCypher 12-0001 Example peptide. Similar peptides with various modifications are available from several commercial sources.
ImageMagick https://www.imagemagick.org/script/index.php
ArrayNinja https://rothbartlab.vai.org/tools/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van Steensel, B. Chromatin: constructing the big picture. EMBO J. 30, (10), 1885-1895 (2011).
  2. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, (4), 693-705 (2007).
  3. Rothbart, S. B., Strahl, B. D. Interpreting the language of histone and DNA modifications. Biochim Biophys Acta. 1839, (8), 627-643 (2014).
  4. Shogren-Knaak, M., Ishii, H., Sun, J. -M., Pazin, M. J., Davie, J. R., Peterson, C. L. Histone H4-K16 acetylation controls chromatin structure and protein interactions. Science. 311, (5762), 844-847 (2006).
  5. Musselman, C. A., Lalonde, M. -E., Côté, J., Kutateladze, T. G. Perceiving the epigenetic landscape through histone readers. Nat Struct Mol Biol. 19, (12), 1218-1227 (2012).
  6. Huang, H., Sabari, B. R., Garcia, B. A., Allis, C. D., Zhao, Y. SnapShot: Histone Modifications. Cell. 159, (2), 458 (2014).
  7. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403, (6765), 41-45 (2000).
  8. Rothbart, S. B., Krajewski, K., et al. Association of UHRF1 with methylated H3K9 directs the maintenance of DNA methylation. Nat Struct Mol Biol. 19, (11), 1155-1160 (2012).
  9. Wang, Z., Zang, C., et al. Combinatorial patterns of histone acetylations and methylations in the human genome. Nat Genet. 40, (7), 897-903 (2008).
  10. Stunnenberg, H. G., Hirst, M. International Human Epigenome Consortium. The International Human Epigenome Consortium: A Blueprint for Scientific Collaboration and Discovery. Cell. 167, (5), 1145-1149 (2016).
  11. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489, (7414), 57-74 (2012).
  12. Egelhofer, T. A., Minoda, A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18, (1), 91-93 (2011).
  13. Bock, I., Dhayalan, A., Kudithipudi, S., Brandt, O., Rathert, P., Jeltsch, A. Detailed specificity analysis of antibodies binding to modified histone tails with peptide arrays. Epigenetics. 6, (2), 256-263 (2011).
  14. Busby, M., Xue, C., et al. Systematic comparison of monoclonal versus polyclonal antibodies for mapping histone modifications by ChIP-seq. Epigenetics Chromatin. 9, 49 (2016).
  15. Fuchs, S. M., Krajewski, K., Baker, R. W., Miller, V. L., Strahl, B. D. Influence of combinatorial histone modifications on antibody and effector protein recognition. Curr Biol. 21, (1), 53-58 (2011).
  16. Kungulovski, G., Jeltsch, A. Quality of histone modification antibodies undermines chromatin biology research. F1000Research. 4, 1160 (2015).
  17. Rothbart, S. B., Dickson, B. M., et al. An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity. Mol Cell. 59, (3), 502-511 (2015).
  18. Rothbart, S. B., Lin, S., et al. Poly-acetylated chromatin signatures are preferred epitopes for site-specific histone H4 acetyl antibodies. Sci Rep. 2, 489 (2012).
  19. Berger, M. F., Bulyk, M. L. Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors. Nat Protoc. 4, (3), 393-411 (2009).
  20. Hu, S., Wan, J., et al. DNA methylation presents distinct binding sites for human transcription factors. eLife. 2, e00726 (2013).
  21. Moore, C. D., Ajala, O. Z., Zhu, H. Applications in high-content functional protein microarrays. Curr Opin Chem Biol. 30, 21-27 (2016).
  22. MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289, (5485), 1760-1763 (2000).
  23. Rothbart, S. B., Krajewski, K., Strahl, B. D., Fuchs, S. M. Peptide microarrays to interrogate the "histone code" . Methods Enzymol. 512, 107-135 (2012).
  24. Cornett, E. M., Dickson, B. M., et al. Substrate Specificity Profiling of Histone-Modifying Enzymes by Peptide Microarray. Methods Enzymol. 574, 31-52 (2016).
  25. Nady, N., Min, J., Kareta, M. S., Chédin, F., Arrowsmith, C. H. A SPOT on the chromatin landscape? Histone peptide arrays as a tool for epigenetic research. Trends Biochem Sci. 33, (7), 305-313 (2008).
  26. Dieker, J., Berden, J. H., et al. Autoantibodies against Modified Histone Peptides in SLE Patients Are Associated with Disease Activity and Lupus Nephritis. PLoS ONE. 11, (10), (2016).
  27. Price, J. V., Tangsombatvisit, S., et al. "On silico" peptide microarrays for high-resolution mapping of antibody epitopes and diverse protein-protein interactions. Nat Med. 18, (9), 1434-1440 (2012).
  28. Dickson, B. M., Cornett, E. M., Ramjan, Z., Rothbart, S. B. ArrayNinja: An Open Source Platform for Unified Planning and Analysis of Microarray Experiments. Methods Enzymol. 574, 53-77 (2016).
  29. Gatchalian, J., Fütterer, A., et al. Dido3 PHD modulates cell differentiation and division. Cell Rep. 4, (1), 148-158 (2013).
  30. Cai, L., Rothbart, S. B., et al. An H3K36 methylation-engaging Tudor motif of polycomb-like proteins mediates PRC2 complex targeting. Mol Cell. 49, (3), 571-582 (2013).
  31. Rothbart, S. B., Dickson, B. M., et al. Multivalent histone engagement by the linked tandem Tudor and PHD domains of UHRF1 is required for the epigenetic inheritance of DNA methylation. Genes Dev. 27, (11), 1288-1298 (2013).
  32. Ali, M., Rincón-Arano, H., et al. Molecular basis for chromatin binding and regulation of MLL5. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (28), 11296-11301 (2013).
  33. Kinkelin, K., Wozniak, G. G., Rothbart, S. B., Lidschreiber, M., Strahl, B. D., Cramer, P. Structures of RNA polymerase II complexes with Bye1, a chromatin-binding PHF3/DIDO homologue. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (38), 15277-15282 (2013).
  34. Klein, B. J., Piao, L., et al. The histone-H3K4-specific demethylase KDM5B binds to its substrate and product through distinct PHD fingers. Cell Rep. 6, (2), 325-335 (2014).
  35. Kim, H. -S., Mukhopadhyay, R., et al. Identification of a BET family bromodomain/casein kinase II/TAF-containing complex as a regulator of mitotic condensin function. Cell Rep. 6, (5), 892-905 (2014).
  36. Greer, E. L., Beese-Sims, S. E., et al. A histone methylation network regulates transgenerational epigenetic memory in C. elegans. Cell Rep. 7, (1), 113-126 (2014).
  37. Andrews, F. H., Tong, Q., et al. Multivalent Chromatin Engagement and Inter-domain Crosstalk Regulate MORC3 ATPase. Cell Rep. 16, (12), 3195-3207 (2016).
  38. Sidoli, S., Lin, S., Karch, K. R., Garcia, B. A. Bottom-Up and Middle-Down Proteomics Have Comparable Accuracies in Defining Histone Post-Translational Modification Relative Abundance and Stoichiometry. Anal Chem. 87, (6), 3129-3133 (2015).
  39. Tsukada, Y., Ishitani, T., Nakayama, K. I. KDM7 is a dual demethylase for histone H3 Lys 9 and Lys 27 and functions in brain development. Genes Dev. 24, (5), 432-437 (2010).
  40. Tachibana, M., Sugimoto, K., Fukushima, T., Shinkai, Y. Set domain-containing protein, G9a, is a novel lysine-preferring mammalian histone methyltransferase with hyperactivity and specific selectivity to lysines 9 and 27 of histone H3. J Biol Chem. 276, (27), 25309-25317 (2001).
  41. Wu, H., Chen, X., et al. Histone methyltransferase G9a contributes to H3K27 methylation in vivo. Cell Res. 21, (2), 365-367 (2011).
  42. Koch, C. M., Andrews, R. M., et al. The landscape of histone modifications across 1% of the human genome in five human cell lines. Genome Res. 17, (6), 691-707 (2007).
  43. Okitsu, C. Y., Hsieh, J. C. F., Hsieh, C. -L. Transcriptional Activity Affects the H3K4me3 Level and Distribution in the Coding Region. Mol Cell Biol. 30, (12), 2933-2946 (2010).
  44. Zentner, G. E., Tesar, P. J., Scacheri, P. C. Epigenetic signatures distinguish multiple classes of enhancers with distinct cellular functions. Genome Res. 21, (8), 1273-1283 (2011).
  45. Garske, A. L., Oliver, S. S., et al. Combinatorial profiling of chromatin binding modules reveals multisite discrimination. Nat Chem Biol. 6, (4), 283-290 (2010).
  46. Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature. 521, (7552), 274-276 (2015).
  47. Bradbury, A., Plückthun, A. Reproducibility: Standardize antibodies used in research. Nature. 518, (7537), 27-29 (2015).
  48. Nguyen, U. T. T., Bittova, L., et al. Accelerated chromatin biochemistry using DNA-barcoded nucleosome libraries. Nat Methods. 11, (8), 834-840 (2014).
  49. Frank, R. Spot-synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support. Tetrahedron. 48, (42), 9217-9232 (1992).
  50. Hilpert, K., Winkler, D. F. H., Hancock, R. E. W. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nat Protoc. 2, (6), 1333-1349 (2007).
  51. Kudithipudi, S., Kusevic, D., Weirich, S., Jeltsch, A. Specificity analysis of protein lysine methyltransferases using SPOT peptide arrays. J Vis Exp. (93), e52203 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats