半自动纵 Microcomputed Tomography-based 裸鼠骨质疏松症相关椎体骨折模型的定量结构分析

Bioengineering

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Summary

该协议的目的是产生一个裸鼠骨质疏松症相关的椎体压缩骨折模型, 可以纵向评价在体内使用半自动 microcomputed tomography-based 定量结构分析。

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Shapiro, G., Bez, M., Tawackoli, W., Gazit, Z., Gazit, D., Pelled, G. Semiautomated Longitudinal Microcomputed Tomography-based Quantitative Structural Analysis of a Nude Rat Osteoporosis-related Vertebral Fracture Model. J. Vis. Exp. (127), e55928, doi:10.3791/55928 (2017).

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Abstract

与骨质疏松相关的椎体压缩骨折 (OVCFs) 是一种常见的和临床未满足的需要随着世界人口年龄的增加而患病率。动物 OVCF 模型对转化组织工程策略的临床前发展至关重要。虽然目前有许多模型存在, 该协议描述了一个优化的方法, 诱导多高度重现性脊柱缺损在一个单一的裸鼠。本文还详细介绍了一种基于纵向半自动 microcomputed 断层扫描 (µCT) 的椎体缺损定量结构分析方法。简单地, 老鼠在术后多时间点被成像。1天扫描被重新定向到标准位置, 定义了标准的兴趣量。随后对每只老鼠的µCT 扫描自动登记到1天扫描, 因此, 同样的兴趣量被分析, 以评估新的骨骼形成。这种通用的方法可以适应各种其他模型, 纵向 imaging-based 分析可以受益于精确的3D 半自动对准。在一起, 本议定书描述了一个容易量化和容易重现的系统骨质疏松和骨骼研究。建议的协议需要4月来诱导裸卵巢大鼠和2.7 和 4 h 之间的骨质疏松症的产生, 图像, 并分析两个椎体缺损, 取决于组织大小和设备。

Introduction

全世界有超过2亿人患有骨质疏松症1。骨密度 (BMD) 和改变的骨微结构的潜在病理降低增加了骨脆性, 因此, 骨折的相对风险为2。骨质疏松症是如此普遍和有害健康, 世界卫生组织已确定它是一个重大的公共卫生问题。此外, 随着世界人口的老龄化, 骨质疏松症有望变得更加普遍。

骨质疏松性椎体压缩骨折是最常见的脆性骨折, 估计在美国每年超过75万。它们与显著的发病率和九倍高的死亡率3有关。在临床试验中, 目前可获得的手术干预, 如椎体成形术和成形, 被发现没有比假治疗更有效4,5, 只留下疼痛管理可供这些患者使用。由于目前的 OVCF 治疗是有限的, 所以必须开发一种能够复制紊乱的动物模型6,7,8。这种动物模型可以促进对目前治疗方法的研究和新疗法的发展, 将转化为临床实践。骨质疏松症已诱导和持续的模型动物通过管理的低饮食 (LCD) 与卵巢切除联合1,9,10,11,12,13,14,15. 为进一步模型骨质疏松与 OVCFs, 椎体骨缺损建立了免疫大鼠的骨骼损伤 16,17,18,19, 20,21,22,23,24。在这项工作中, 一个模型的免疫损伤大鼠骨质疏松症提出。这种新的模型可以用来评估细胞疗法涉及干细胞从各种来源和物种的修复有挑战性的骨折, 如 OVCFs。

骨显像是评价骨折和骨骼疾病的重要组成部分。为了准确评估结构骨的变化和再生策略, 开发了先进的成像方法25。其中, µCT 成像已经成为一种非侵入性的、易用的、廉价的提供高分辨率3D 图像的方法。µCT 成像在评估骨质疏松症患者方面优于其他模式, 因为它提供高分辨率的3D 骨微体系结构26 , 然后可以对其进行定量分析。后者可以用来比较治疗效果的建议治疗。事实上,在体内µCT 成像是一个金标准的脊椎缺损再生监测1,16,27。但是, 很少有出版物28293031使用了自动注册工具来最小化µCT 的用户依赖性、插值偏差和精度错误imaging-based 分析。最近, 我们是第一个使用注册程序, 以改善骨再生的标准化骨空洞的分析, 如本协议32中所述。

本文所描述的方法可以用来研究新的细胞治疗 OVCFs 的效果, 不受宿主 T 细胞的反应, 可能拒绝异种或同种异体细胞。通过卵巢切除 (卵巢) 和4月的液晶显示器, 诱导幼鼠骨质疏松。年轻的卵巢鼠, 结合 LCD, 我们可以达到一个低峰值骨量, 模仿绝经后骨质疏松, 导致不可逆转的骨质流失。这可以解释部分原因是, 在 LCD 和大约3月的年龄, 大鼠从骨骼模型过渡到重建腰椎椎体的阶段33, 从而增加了维持骨质疏松症的可能性时间.使用幼兽使这种模型更具成本效益, 因为它们成本更低。然而, 它是有限的内在不核算的生物变化的衰老动物。

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Protocol

所有动物实验都是根据由雪松-西奈医疗中心的机构动物保育和使用委员会 (IACUC) 批准的协议执行的 (3609 号议定书)。麻醉是为所有的成像和手术程序。所有动物都按照批准的 IACUC 协议安置.

注意: 该协议的实验设计如图 1 所示。购买六周大的老鼠与他们的卵巢手术切除和饲料他们的 LCD 包括0.01% 钙和0.77% 磷酸盐。经过4月的 LCD, 钻 critical-size 脊椎缺损在第四和第五腰椎椎体 (L4-L5)。术后, 在1和周 2, 4, 8, 和12在缺损建立后, 图像的老鼠。在1天扫描中定位缺陷边距, 重新定向到标准位置, 并定义圆柱体的兴趣 (VOI)。自动注册后续和 #181; CT 扫描 (, 2、4、8和 12) 每只老鼠的标准位置为相应的天1扫描定义。将天1预定义的 VOI 应用于已注册的扫描。评估 VOIs 的骨量密度和表观密度.

1. 骨质疏松症的诱导

  1. 将六周大的裸去势大鼠放在4月的 LCD 上, 由0.01% 钙和0.77% 磷酸酯组成.
  2. 切换回正常饮食.
    注意: 这些老鼠将被称为和 #34; 骨质疏松大鼠和 #34; 以后.

2。椎体缺损模型

注意: 时间是每只动物的 40-50 分钟.

  1. 在手术前使用所有手术工具.
  2. 在多次手术的情况下, 对所有手术工具进行消毒.
    1. 清洗工具并将其放置在 sonicator 的浴缸中5分钟. 将它们放在一个热珠杀菌器设置为250和 #176; C 为二十年代. 允许工具冷却5分钟
  3. 导致麻醉.
    1. 将骨质疏松的大鼠放在带有中央清理系统的麻醉机上的感应室中。用5% 氟烷100% 氧诱导麻醉, 通过鼻锥在 2-3% 异氟醚维持。用眼睛上的兽医药膏, 防止麻醉时的干燥.
    2. 采用脚趾夹紧刺激, 以确保有足够的麻醉平面。如果未注意到响应, 请启动该过程.
  4. 将麻醉大鼠置于热垫 (37 和 #176; C) 的背卧床上, 并使用磁固定器缩回系统 ( 图 2A ) 伸展四肢.
    注意: 由于麻醉大鼠无法调节体温, 加热垫的温度对防止体温过低很重要.
  5. 使用电动剃须刀剃须腹部区域。用 iodine-based 杀菌剂和葡萄糖酸氯己定 0.5%, 其次是70% 乙醇.
  6. 在开始手术前,
  7. 将卡洛芬 (5 毫克/千克体重 (BW), 皮下 (平方)) 注入大鼠.
  8. 使用无菌手术刀切割皮肤。开始切口 1 cm 在剑过程之下并且切开通过中线 (~ 5-8 cm) ( 图 2B ).
  9. 使用外科剪刀使膜通过式阿尔巴切口进入腹腔 ( 图 2C ).
  10. 使用器 ( 图 2D ) 公开腹腔.
  11. 将肠道转移到鼠的右侧, 以暴露腹主动脉和左肾 ( 图 2E )。在进行暴露前, 触腰椎脊柱。为了避免脱水, 使用无菌浸泡纱布和无菌盐水溶液包裹内脏.
  12. 使用 thermocautery 在层中暴露腰椎椎体的前部 L4-5, 并将其从周围的结缔组织和肌肉中分离出来 ( 图 2F -G )。 注意: 在解剖过程中, Thermocautery 应用于控制出血.
  13. 用无菌生理盐水浸透无菌棉签, 去除 L4 椎骨的血液和残余组织。使用无菌环钻 (直径约2毫米) 钻5毫米深的骨缺损, 在椎体外露前部的中心 (图 2 h I).
    注: 仅通过腹侧皮质和基础小梁骨, 施加最小压力进行钻孔;避免钻过背部皮层。请注意, 骨质疏松的大鼠椎骨非常脆弱。使用棉签清洁缺陷, 并施加压力, 以止血, 如果存在.
  14. 在 L5 椎骨上重复步骤2.11 以创建每只老鼠的总2缺陷 ( 图 2J ).
  15. 将肠道恢复到腹腔.
  16. 使用乔合成可吸收外科缝合线 (3-0 乔染色27和 #34; SH 锥) 以连续模式缝合膜 ( 图 2K ).
  17. 用4-0 单丝尼龙吸收缝合在一个简单中断的模式下关闭皮肤 ( 图 2L ).
  18. 应用100和 #181; 在皮肤缝合线上和它们之间的外用皮肤粘合剂的 L, 以确保完全关闭皮肤.
  19. 用温水 (37 和 #176; C) 林格铃声和 #39 的解决方案 (1 毫升/100 g BW, 平方), 以防止低温和脱水.
  20. 在手术前, 用丁丙诺啡 (0.5 毫克/千克体重, 平方) 向老鼠注射, 每 8-12 小时, 在需要时进行术后疼痛缓解.
  21. 在恢复足够的意识以维持胸骨卧床之前, 不要让动物无人看管。另外, 在完全恢复之前, 不要把已经经过外科手术的动物归还给其他动物.
  22. 在该动物在加热垫上恢复后, 将其返回到其笼子.
    注意: 将老鼠单独 ( 即, 在单独的笼子里), 以防止 rat-to-rat 的缝合和伤口的切割.
  23. 将食物浸泡在笼底的培养皿中, 在后几天内将其放入水中, 以帮助老鼠到达食品.
  24. 管理卡洛芬 (5 毫克/千克 BW, 平方) 24 h 后的疼痛缓解每24小时的需要.
  25. 去除皮肤缝合线, 而动物在2% 异氟醚麻醉下 10-14 天后.

3。MicroCT 扫描

注意: 时间是每只动物的 30-40 分钟.

  1. 在手术后的第二天, 将骨质疏松的大鼠放在与中央清理系统相连的麻醉机的感应室中。采用5% 氟烷100% 氧诱导麻醉, 通过鼻锥在 2-3% 异氟醚维持.
  2. 使用 活体扫描鼠体内的 和 #181; CT 扫描仪。重复扫描进行骨再生的纵向分析.
    注意: 请确保所有的动物都使用相同的设置进行扫描 ( 即, X 射线能量、扫描介质、强度、体素大小和图像分辨率) 和 similar 方向。例如: x 射线能量, 55 kVP;电流, 145 和 #181;体素大小, 35 和 #181;增量, 115 和 #181; m;和集成时间, 200 毫秒;与 PBS 的样品。请参阅 Bouxtein et al. 34 用于啮齿动物和 #181 的进一步解释和考虑; CT 扫描用于评估骨组织结构。理想情况下, 可用的最高扫描分辨率将用于所有扫描;然而, 高分辨率扫描需要更长的采集时间, 生成大量的数据集, 并使动物暴露在更多的电离辐射中。后者可能会产生不必要的影响, 包括减少骨折愈合。因此, 应仔细考虑额外数据和扫描时间之间的权衡.

4。椎体分离

注意: 计时是 20-30 min/每样.

  1. 对感兴趣的椎骨进行轮廓, 如图 3A -i.. 确保包括椎骨的所有部分, 同时排除属于相邻椎体的部分.
    1. 单击并 #34; #181; CT 评估程序和 #34; 从菜单中选择示例.
    2. 使用鼠标对每个切片进行轮廓.
    3. 使用 #34; Z 和 #34; bar 转到下一切片.
  2. 将轮廓椎骨保存为单独的文件 ( 图 3J -K ), 通过单击并 #34; 文件和 #34; #160; #8594; #34; 保存 GOBJ 和 #34; 每两片.

5. 纵向定量评估 VOI 的定义

注意: 以下步骤取决于扫描是从1天后的手术 (参考椎骨) 或从随后的时间点 (靶椎骨).

  1. 参考椎骨
    注意: 定时是 20-30 分钟每样品。
    1. 对于 Z 旋转, 从缺陷的中心 ( 图 4A -b ) 中使用 XY 切片测量边距的角度。
      1. 在 Z 平面上, 转到椎骨的区域, 其中的缺陷是最清晰的, 屏幕捕获椎骨.
      2. 在演示文稿软件中, 准备一个矩形形状的对象, 它将适合该缺陷.
      3. 旋转脊椎的图像, 使缺陷朝上, 缺陷边缘与矩形的两侧平行.
      4. 测量旋转角度 (右键单击图像和 #160; #8594; #34; 格式化图片和 #34; #160; #8594; #34; 大小和 #34;)
      5. 使用测量角度旋转椎骨 ( 图 4C )。
        1. 打开一个新的 DECterm 窗口 (#34; 会话管理器和 #34; #160; #8594; #34; 应用和 #34; #160; #8594; #34;D ecterm #34;).
        2. 运行和 #34; 彩光和 #34;:
        3. 彩光和 #62; turn3d
        4. -输入和 #62;
        5. -输出和 #62;
        6. -turnaxis_angles [0.000 90.000 90.000] 和 #62; 90 90 0
        7. -turnangle [0.000] 和 #62; 测量角度
        8. -img_interpol_option [1] 和 #62;
        对于 X 旋转的
    2. , 请使用缺陷中心的 YZ 切片 ( 图 4D E ) 测量边距的角度。使用测量的角度旋转椎骨 ( 图 4F )。
      1. 单击 #34; YZ 和 #34; #34; uCT 评估计划和 #34; 重复步骤 5.1. 1.1-5.1. 1.5. 2.
      2. 彩光和 #62; isq
      3. -aim_name [in] 和 #62;
      4. -isq_filename [default_file_name] 和 #62; 插入 isq 文件目录 ( 例如, 和 #34;D k0: [MICROCT。数据.加齐特.马克西姆 80. DAY1] Z2102970。ISQ 和 #34;)
      5. -pos [0 0 0] 和 #62;
      6. -dim [-1-1-1] 和 #62;
    3. 通过将 XY 平面更改为 "平面" 来翻转旋转的椎骨。
      1. 打开一个新的 DECterm 窗口 (#34; 会话管理器和 #34; #160; #8594; #34; 应用和 #34; #160; #8594; #34;D ecterm #34;).
      2. 运行和 #34; 彩光和 #34;:
      3. 彩光和 #62; 翻转
      4. -输入和 #62; 输出
      5. 输入 [输出] 和 #62; out2
      6. -new_xydir [yz] 和 #62;
    4. 定义 VOI。
      1. 通过选择 #34 中的圆形轮廓图标、uCT 评估程序和 #34 ( 图 6A ), 从缺陷中心绘制缺陷的圆形轮廓。复制该轮廓并将其粘贴到缺陷的所有切片 ( 图 6B ).
        注意: 由于所有缺陷都是使用相同的过程创建的, 所以分析了所有样本的相同数量的切片和随后的总音量 (TV).
  2. 目标椎骨.
    注意: 定时是 10-20 分钟每样品。
    1. 将目标和参考椎骨的 DICOM 文件加载到图像分析软件的主窗口中.
      注意: 要避免灰度值更改, 请在 "加载" 菜单中定义与原始 DICOM 文件相同的输出数据类型.
    2. 注册到参考椎骨。
      1. 启动和 #34; 3 维体素注册和 #34; 模块和输入参考椎骨作为和 #34; 基础体积和 #34; 靶椎作为和 #34; 匹配音量. #34; 单击和 #34; 注册和 #34; 注册椎骨 (图 5 ).
    3. 使用相同的数据类型保存已注册的文件并将其导入到 #181; CT 环境.
    4. 应用 VOI。
      1. 通过单击和 #34 对已注册的目标椎骨应用 VOI 定义的参考椎骨; uCT 评估程序和 #34; #160; #8594; #34; 文件和 #34; #8594; #34; 加载 GOBJ 和 #34; 并选择以前创建的 GOBJ。检查 VOI 和缺陷是否同心.

6。MicroCT 分析

注意: 每个示例的计时为 10-20 分钟.

  1. 使用 #181 发送用于评估的 VOI; CT 评估程序 ( 图 6 ).
    注意: 在分析所有 VOIs 时, 请确保使用相同的参数。确保阈值设置得足够高, 以便在最小的骨骼丢失时忽略背景噪音。如果使用显影生物材料, 可以使用一些策略来分析骨形成。如果生物材料和骨组织之间的密度有差异, 可以将生物材料分割成 35 , 36 。否则, 研究者可以定性地评价实验组之间骨形成的差异.

7。安乐死

  1. PPlace 在麻醉机的感应室中的骨质疏松大鼠。在100% 氧气中使用5% 异氟醚诱导麻醉.
  2. 通过鼻锥维持麻醉并执行安乐死通过切割胸腔产生双侧气胸 37 .

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Representative Results

使用这个协议, 你可以图像和量化的再生 n = 8 模型骨质疏松椎体缺损不同时间点。通过注册程序获得的解剖匹配, 可以在所有时间点对同一 VOI 进行分析。这导致了高度准确的纵向3D 计量分析, 即使原始缺陷的边缘不再是可识别的。我们使用五时间点 (天 1, 星期 2, 星期 4, 星期8和星期 12) 作为一个例子为骨骼再生的纵向评估 (图 7)。可通过对2D 剖面和3D 图像的定性评估 (如图 7A中所示) 和骨量 (BVD) 和质量 (AD) (图 7B) 的定量比较来评估再生。以下形态学指数可以确定为新形成的骨: (i) 电视, 包括骨和软组织体积 (电视, mm3);(二) 矿化组织的体积 (BV, 毫米3);(iii) 骨量密度 (BV/电视);和 (iv) 骨矿物质密度 (BMD, 镁羟基磷灰石每 cm3)。具体而言, 缺陷建立后2周观察到骨量的最小化 (骨体积密度增加 5%)。两周后, 与以后的时间点相比, 骨形成没有明显的差异。总的来说, 虽然有某种程度的骨形成, 其中峰值在大约10% 周 8, 它是最小的足以保持骨空随着时间的推移。

Figure 1
图 1: 协议设计概述了协议中的关键步骤。首先, 对四月低钙饮食 (LCD) 的卵巢切除裸鼠进行手术, 以创造标准的 critical-sized 缺陷, 在两个腰椎椎体。鼠在1和周 2, 4, 8, 和12术后的影像。1天扫描被重新定向到标准位置, 并使用缺陷边距定义了圆柱 VOI。随后对每只老鼠的µCT 扫描自动登记到为相应的1天扫描定义的标准位置。然后, 将1天预定义的 VOI 应用于已注册的扫描。骨体积密度和表观密度的 VOI 被用来评估新的骨形成。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 椎体缺损手术.阐述了脊柱缺损外科手术的关键环节。首先, 老鼠被放在一个加热垫 (a) 上。中线切口通过皮肤 (B), 然后式阿尔巴 (C) 暴露腹腔 (D)。肠被反射暴露后腹壁 (E), 腰椎被暴露使用 thermocautery (箭头, F-G)。第四的缺陷被钻孔 (H, 指向钻头的箭头;I, 指向缺陷的箭头) 和第五 (J, 指向缺陷的箭头) 腰椎椎体。最后, 对膜 (K) 和皮肤 (L) 进行了缝合。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 脊椎分离.在一个感兴趣的脊椎轮廓的关键步骤显示。(A-I)轮廓 (绿线) 代表2D 切片沿椎骨的长度轴显示。完整脊柱的3D 表示 (J) 可以与分离的椎骨 (K) 进行比较。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 参考椎体定位.有代表性的切片在两个平面上显示的脊椎前后旋转到一个标准的位置。首先, 使用具有代表性的 XY 切片 (a), 旋转缺陷所需的角度 (b, 绿色) (b, 红色正方形) 与 Y 轴平行 (b, 黄色) 被确定, 然后用于创建旋转的图像 (C).然后, 使用具有代表性的 YZ 切片 (D), 确定旋转缺陷 (e、红色正方形) 所需的角度 (e, 绿色), 使其与 Z 轴 (e, 黄色) 平行, 然后用于创建旋转的图像 (F).请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5: 目标椎体注册.在 (A-C) 和后 (D-E) 注册后, 在目标椎骨 (标记为绿色) 和参考椎骨 (以红色标记) 的三平面上有代表性的切片。注意黄色, 指示目标和参考椎骨之间的重叠, 以及在再生后指向绿骨的白色箭头, 表明骨骼的形成。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6: VOI 分析.有代表性的切片在两个平面的轮廓量的兴趣显示。圆形轮廓定位于缺陷的中心 (a)。在对所有的片材进行轮廓整形后, 可以在 XY 平面 (B) 中看到完整的缺陷体积。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 7
图 7: 椎体缺损再生的纵向分析.定性和定量代表性的骨再生分析结果显示。(a) 在各个时间点有代表性的椎体缺损在每个面板中描述为一个正面的3D 图像 (顶部面板), 在红色表示的空隙中形成骨, 矢状2D 图像 (中间板) 和轴向2D 图像 (底部面板)。对空洞中骨形成的定量分析进行了分析。骨体积密度 (B) 和表观密度 (C) 的计算和比较使用重复测量 two-way 方差分析与 Bonferroni 校正的多个比较。误差线代表 SEM. ** 和 #60; 0.0001。请单击她e 要查看这个数字的更大版本。

步骤 问题 可能的原因 解决
2。3 麻醉下的动物喘气 过量异氟醚 将异氟醚的浓度降低到动物身上。
动物对脚趾捏的反应 异氟醚提供不足 增加异氟醚的浓度。
2.7-2.12 大出血 血管损伤 用无菌棉签涂抹压力或烧灼止血。
动物呼吸困难 横膈膜被刺穿了 安乐的动物, 以防止窒息。
肠内容渗漏 胃肠道被刺穿 安乐的动物, 以防止进一步的并发症。在切割前将膜从底层的肠道中抬起, 防止它。
血液从钻井场中冒出来 血管被刺穿 使用无菌棉签, 直到出血停止。
动物在钻探过程中突然震动 钻得太深, 损伤了脊髓 安乐的动物, 以防止进一步的并发症。
骨缺损看起来不完整 钻得不够深 在缺陷内重新定位钻头, 并深化
2.15-2. 24 缝合断裂 缝线拉得太紧了 更换整个缝合线。如果经常发生断裂, 请使用较厚的缝合线。
动物从麻醉中恢复缓慢 动物体温过低 增加加热垫的温度或应用额外的热源 (如加热灯)。
缝合线打开 缝合线被放得很松, 或者动物做了剧烈的活动 重新应用缝合线, 并将 Dermabond 直接应用到缝合线和它们之间。
3 扫描图像显示分辨率低、噪音大或分散 扫描参数需要调整 调整扫描协议的参数。有关扫描的更多指南, 请参阅 Bouxsein et al.。
扫描的图像显示模糊 动物在扫描过程中移动 重新扫描动物。如果运动继续, 增加异氟醚浓度。
5 目标椎体的定位不成功 椎体分离未正确完成 Recontour 椎体: 确保包括脊椎的所有部分, 并排除任何相邻的结构。
椎骨定位的大差异 使用旋转和翻转 (步骤 29A) 将目标椎骨重新定位到与参考椎骨相同的方向。
分析不能正确识别骨骼结构 在注册模块中应用阈值以去除骨骼样本中的背景噪音。
注册椎骨不同 创建3d 图像的样品, 并匹配正确的椎骨横跨不同的时间点。
6 样品的总体积 (电视) 不同 使用了不同的切片数或不同的轮廓 确保始终使用相同的轮廓大小和相同数量的切片。
骨密度 (BMD) 值异常 microCT 的校准不足 校准 microCT 以校正羟基磷灰石标准

表 1: 疑难解答针对协议中的不同步骤提出了潜在的问题和解决方案。

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Discussion

骨质疏松是脊椎压迫性骨折的最常见原因, 脊柱的负荷增加, 导致椎体塌陷。然而, 在真正复制类似椎体塌陷的啮齿动物中, 几乎不可能产生损伤。相反, 研究人员在椎体中心创建一个圆柱形空洞以模拟 OVCFs16,17,18,19,20,21,24,38,39. 由于在文献中没有一致的缺陷大小, critical-sized 缺陷被定义为一个不自发愈合完全没有干预在3月内术后16,17

尽管将卵巢切除与 LCD 相结合以快速诱发骨质疏松的方法已在以前发表过1,13, 但我们是第一个显示, 将此方法应用于裸大鼠的结果是高效、快速和椎小梁骨体积和矿物质密度不可逆下降40。这是一种可再生的小动物模型, 它不受啮齿动物免疫系统的阻碍, 也不需要增加免疫抑制, 其他人则使用24

我们的手术协议产生了多个相同的严重腰椎缺损40。这导致了高度一致和容易地可比较和可计量的瑕疵横跨动物。我们认为, 使用这种方法产生的缺陷优于脊椎缺陷模型产生的尾椎骨1,19,41 , 因为老鼠的尾巴是受生物力学的力量, 是明显不同于那些涉及大鼠腰椎。

该协议中的关键步骤包括避免术体温过低, 并在对去卵巢裸鼠的脆弱椎骨进行 LCD 后的钻孔时要格外小心。在产生椎体缺损后, 它通过时间序列的在体内µCT 扫描在设定的时间点的纵向评估骨修复。维护相同的扫描设置至关重要。椎骨的轮廓, 并与其余的扫描分离。对所有的脊椎扫描和避免灰度值变化的相同的总体积的轮廓是至关重要的。一个商业上可利用的多图像配准算法, 便于提取的解剖学相应基线 VOIs 的所有后续时间点。最后, 对这些 VOIs 的骨量, 表观密度,进行了分析。使用相同的参数分析所有 VOIs 是至关重要的。这项技术提供了一个高度准确和直接的纵向3D µCT 分析, 不依赖于用户。

该方法可用于任何纵向骨缺损的再生分析。本文所使用的椎体缺损模型是一种方便的模型, 因为它的骨骼结构是独一无二的, 可以很容易地登记到相同的解剖位置。但是, 在相同的条件下, 任何骨骼再生都可以通过在纵向扫描中正确分离相同的兴趣骨来进行分析。必须将分离的骨样与相同的解剖特征。表 1中描述了这一潜在的问题和其他方面, 以及可能的原因和建议的解决方案。只有在标本中有相同的解剖特征时, 才会出现由登记程序获得的解剖匹配。注册将允许用户将第一次扫描的精确预定义 VOI 应用到所有剩余的时间点, 从而在一段时间内产生高度精确的3D 计量分析。骨体积密度和表观密度的 VOI 可用于评估新的骨形成。

虽然可能广泛适用, 但此处介绍的模型并非没有限制。裸裸鼠的使用可以被认为是一个限制, 因为它可能掩盖一些免疫介导的过程, 可能是再生的重要性。其次, 通过卵巢切除和 LCD 在年轻大鼠的结合, 建模骨质疏松症, 如以前发表的1,13, 是有限的能力, 以模仿老年患者人口的生物学。第三, OVCFs 是由一个外科手术模型, 作为唯一其他动物有骨质疏松相关的骨折是灵长类42。最后, 当大鼠腰椎是最有效的模型为人的腰椎-多数脊椎断裂开发-缺乏轴向重量轴承在啮齿目动物脊柱也是一个限制。

该协议是模块化的, 因此可以很容易地修改为研究员的需要。例如, 裸去卵巢大鼠可以用来研究其他骨质疏松相关的骨折。如果研究人员选择使用我们的方法来半自动骨再生分析, 它可以应用于任何骨折模型使用纵向结构成像, 不一定是微计算机断层扫描。此外, 还可以通过使用其他成像方式 (如磁共振成像) 同时收集更多信息。

本议定书中提出的 OVCF 模型可用于研究这种临床未满足的需要的新的治疗方法。此外, 我们的半自动分析方法可以成功地用于执行与用户无关的类似分析, 并提供比其他方法16更好的准确性。特别值得注意的是, 我们使用了商业上可用的可视化和分析软件, 可供任何研究员使用-支持其他成像方式的软件, 如磁共振成像和核成像。因此, 我们认为这种方法是高度可的, 并且仅受在体内成像功能和注册软件的可用性的限制。

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Disclosures

这项研究得到了加州再生医学研究所 (CIRM) (TR2-01780) 的资助。

Acknowledgments

这项研究得到了加利福尼亚再生医学研究所 (CIRM) (TR2-01780) 的资助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane MWI Animal Health, Pasadena, CA 501017
BetadineSolution MWI Animal Health, Pasadena, CA 4677
Chlorhexidine Gluconate 2% scrub MWI Animal Health, Pasadena, CA 510083
Isopropyl Alcohol 70%-quart MWI Animal Health, Pasadena, CA 501044
Carprofen MWI Animal Health, Pasadena, CA 26357
Buprenorphine 0.3 mg/mL MWI Animal Health, Pasadena, CA 56163
Ovariectomized Athymic nude rats Harlan Laboratories, Indianapolis, IN Hsd:RH-Foxn1 rnu
Low calcium food Newco Distributors, Inc., CA 1814948 (5AV8 AIN-93M w/low calcium)
Phosphate Buffered Saline Life Technologies Corporation 14190250
Dermabond J AND J ETHICON DHVM12
Anesthesia machine Patterson Scientific TEC 3EX
Slide Top Induction Chambers Patterson Scientific 78917833
ProStation Heated Workstation Patterson Scientific 78914731
Surgical drape HALYARD HEALTH INC 89101
Magnetic fixator retraction system Fine Science Tools, Inc., CA 18200-50
Dissecting Scissors, 10 cm, Curved, SS World Precision Instruments, FL 14394
Iris Scissors, 11.5 cm, 45 °Angle, Serrated, Sharp/Sharp World Precision Instruments, FL 503225
Forceps, no. 5 World Precision Instruments, FL 555048FT
Micro Mosquito Hemostatic Forceps World Precision Instruments, FL 503360
Sterile cotton gauze Medtronic, MINNEAPOLIS, MN 9024
Absorption Spears - Mounted/Sterile Fine Science Tools, CA 18105-01
Syringe, 1 mL TERUMO TERUMO MED SS-01T
Needle, 25 gauge BD MED SYS INJECTION SYS 305127
Laminar flow hood Baker SterilGARD e3-Class II Type A2 Biosafety Cabinet
Thermal Cautery Unit World Precision Instruments, FL 501292
Micro-Drill OmniDrill115/230V World Precision Instruments, FL 503598
Trephines for Micro Drill, 2 mm diameter Fine Science Tools, CA 18004-20
3-0 Vicryl undyed 27” SH taper J AND J ETHICON 1663G
4-0 Ethilon black 18” PC3 conventional cutting J AND J ETHICON 1954G
Conebeam in vivo microCT (vivaCT 40) Scanco Medical vivaCT 40
SCANCO Medical microCT systems software suite Scanco Medical vivaCT 40
Analyze software Biomedical Imaging, Mayo Clinic, Rochester, MN Analyze 12 Image analysis software
Veterenery eye ointment

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References

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