Parallelisierter längs Microcomputed Tomographie-basierten quantitativen Strukturanalyse von einem nackten Rattenmodell Osteoporose bedingte Wirbelfraktur

Bioengineering

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Summary

Das Ziel dieses Protokolls ist eine nackte im Zusammenhang mit Osteoporose vertebrale Kompression Bruch Rattenmodell zu generieren, die längs bewertet in Vivo mit einer parallelisierter Microcomputed Tomographie-basierten quantitativen Strukturanalyse werden können.

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Shapiro, G., Bez, M., Tawackoli, W., Gazit, Z., Gazit, D., Pelled, G. Semiautomated Longitudinal Microcomputed Tomography-based Quantitative Structural Analysis of a Nude Rat Osteoporosis-related Vertebral Fracture Model. J. Vis. Exp. (127), e55928, doi:10.3791/55928 (2017).

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Abstract

Im Zusammenhang mit Osteoporose vertebrale Kompressionsfrakturen (OVCFs) sind eine gemeinsame und klinisch ungedeckten Bedarf mit zunehmender Prävalenz als die Bevölkerung altert. OVCF Tiermodelle sind unerlässlich, um die präklinische Entwicklung von translational Tissue engineering Strategien. Während eine Reihe von Modellen derzeit vorhanden sind, beschreibt dieses Protokoll eine optimierte Methode zur Induktion von mehreren hoch reproduzierbare Wirbelkörper Mängel in eine einzige nackte Ratte. Eine neuartige längs parallelisierter Microcomputed Tomographie (µCT)-auf der Grundlage quantitative Strukturanalyse der Wirbelkörper Mängel ist auch detailliert. Kurz, wurden Ratten auf mehrere Zeit Punkte postoperative abgebildet. Tag 1-Scan wurde neu ausgerichtet, um eine standard-Position und einem Standardvolumen von Interesse war definiert. Nachfolgende µCT-Scans von jede Ratte wurden automatisch zum Tag 1 Scan registriert, so dass die gleiche Menge an Interesse anschließend analysiert wurde, um für neue Knochenbildung zu bewerten. Dieser vielseitige Ansatz kann zu einer Vielzahl anderer Modelle angepasst werden, wo Imaging-basierte Längsschnittanalyse von präzise 3D parallelisierter Ausrichtung profitieren könnten. Zusammen genommen, beschreibt dieses Protokoll ein leicht quantifizierbare und leicht reproduzierbare System für Osteoporose und Knochen. Das vorgeschlagene Protokoll dauert 4 Monate induzieren Osteoporose in nude ovariectomized Ratten und zwischen 2,7 und 4 h zu generieren, Bild und zwei Wirbelkörper Mängel je nach Gewebe Größe und Ausstattung zu analysieren.

Introduction

Mehr als 200 Millionen Menschen weltweit leiden an Osteoporose1. Die zugrunde liegenden pathologischen Abnahme der Knochendichte (BMD) und veränderten Knochen Mikroarchitektur zu erhöhen, Knochenbrüchigkeit und infolgedessen das relative Risiko von Frakturen2. Osteoporose ist so weit verbreitet und schädlich für die Gesundheit die WHO eine große Gesundheitsproblem definiert hat. Darüber, wie die Weltbevölkerung Alter erwartet wird, Osteoporose dürfte sogar noch häufiger geworden.

Osteoporotische Wirbelkörper-Kompressionsfrakturen sind die häufigsten Zerbrechlichkeit Frakturen, schätzungsweise mehr als 750.000 pro Jahr in den USA. Sie sind verbunden mit erheblicher Morbidität und so viel wie ein neun-Mal höhere Sterblichkeit3. In klinischen Studien derzeit verfügbaren chirurgische Eingriffe, wie z. B. Vertebroplastie und Kyphoplastie, erwiesen sich nicht wirksamer als ein Schein Behandlung4,5, diese Patienten nur Schmerztherapie zur Verfügung überlassen. Da aktuelle OVCF Behandlungen begrenzt sind, ist es unerlässlich, ein Tiermodell zu entwickeln, die die Störung6,7,8replizieren kann. Solchen Tiermodellen konnte erleichtern, die Untersuchung der aktuellen Behandlungsmethoden und der Entwicklung neuartiger Therapien, die in die klinische Praxis umsetzen wird. Osteoporose wurde induziert und nachhaltig in Tiermodellen durch die Gabe einer niedrigen Kalzium Ernährung (LCD) in Verbindung mit Ovariectomy1,9,10,11, 12 , 13 , 14 , 15. um den Knochenverlust verbunden mit OVCFs weiter zu modellieren, Wirbelkörper Knochendefekte entstanden im osteoporotischen immunkompetenten Ratten 16,17,18,19, 20,21,22,23,24. In dieser Arbeit wird ein Wirbelkörper defekt-Modell von immungeschwächten Ratten mit modellierten Osteoporose vorgestellt. Dieses neue Modell lässt sich beurteilen, zellbasierte Therapien mit Stammzellen aus verschiedenen Quellen und Arten für die Reparatur von anspruchsvollen Frakturen, wie z. B. OVCFs.

Knochen-Bildgebung ist ein wesentlicher Bestandteil der Bewertung von Frakturen und Knochenerkrankungen. Moderne bildgebende Verfahren wurden für die genaue Beurteilung der strukturellen Knochenveränderungen und Regeneration Strategien25entwickelt. Unter anderem entstanden µCT Bildgebung als eine nicht-invasive, einfach zu bedienende und kostengünstige Methode, die hochauflösende 3D Bilder liefert. µCT-Bildgebung hat mehrere Vorteile gegenüber anderen Modalitäten bei der Bewertung von Osteoporose-Patienten, da es bietet hochauflösende 3D Knochen Mikroarchitektur26 , das anschließend quantitativ analysiert werden können. Letzteres kann dann verwendet werden, um die therapeutische Wirkung der vorgeschlagenen Behandlungen zu vergleichen. In der Tat ist in Vivo µCT-Bildgebung ein Goldstandard für die Regeneration der Wirbelsäule defekt Überwachung1,16,27. Jedoch haben einige Publikationen28,29,30,31 eingesetzt automatisierte Registrierung Tools Benutzer-Abhängigkeit, Interpolation Voreingenommenheit und Präzision Fehler der µCT zu minimieren Imaging-basierte Analyse. Vor kurzem waren wir die ersten ein Registrierungsverfahren zu verwenden, um die Analyse der Knochenregeneration in einen standardisierten nichtig, Knochen zu verbessern, wie in diesem Protokoll32 erläutert.

Die hier beschriebene Methode kann verwendet werden, um die Wirkung von neuartiger Zelltherapien für OVCFs zu untersuchen, ungehindert vom Host T-Zell-Reaktionen, die xenogene oder allogene Zellen ablehnen könnte. Osteoporose ist bei jungen Ratten durch Ovariectomy (OVX) und 4 Monaten ein LCD induziert. Das junge Alter der OVX Ratten, kombiniert mit dem LCD erlaubt, um einen niedrigen maximalen Knochenmasse, postmenopausalen Osteoporose imitiert, indem Sie zu irreversiblen Knochenverlust führt zu erreichen. Dies lässt sich teilweise durch die Tatsache, dass, während der LCD-Anzeige auf ca. 3 Monate alt, die Ratten Übergang vom Knochen zur Umgestaltung Modellierung an den Lendenwirbeln33, wodurch die Wahrscheinlichkeit einer Aufrechterhaltung der Osteoporose über phase Zeit. Verwendung von jungen Tieren macht dieses Modell kostengünstiger, da sie weniger Kosten. Dennoch ist es begrenzt durch die biologischen Veränderungen im Altern Tier von Natur aus nicht entfallen.

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Protocol

alle Tierversuche wurden unter einem Protokoll genehmigt durch die institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) des Cedars-Sinai Medical Center (Protokoll Nr. 3609) durchgeführt. Anästhesie verabreicht wurde für alle bildgebenden und chirurgische Eingriffe. Alle Tiere wurden in Übereinstimmung mit genehmigten IACUC Protokolle untergebracht.

Hinweis: das experimentelle Design dieses Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt. Kaufen Sie sechs Wochen alte Ratten mit ihren Eierstöcken chirurgisch entfernt und füttern eine LCD, bestehend aus Kalzium und 0,77 % Phosphat 0,01 %. Bohren Sie nach einem Zeitraum von 4 Monaten eine LCD-Anzeige einen kritische Größe Wirbelkörper Defekt in der vierten und fünften lumbalen Wirbelkörper (L4-L5). Nach der Operation wird Bild die Ratten an Tag 1 und 2, 4, 8 und 12 Wochen nach Gründung defekt. Finden Sie defekt Margen auf dem Tag 1 Scan, neu orientieren Sie, eine standard-Position und definieren Sie einem zylindrischen Volumen von Interesse (VOI) zu. Die nachfolgenden µCT Scans (d. h., für 2, 4, 8 und 12 Wochen) jede Ratte an der Standardposition definiert für den entsprechenden Tag 1 Scan automatisch zu registrieren. Wenden Sie den Tag 1 VOI an die eingetragene Scans vordefiniert. Beurteilung der Knochendichte Volumen und scheinbare Dichte der VOIs.

1. Induktion von Osteoporose

  1. 4 Monate eine LCD-Anzeige, bestehend aus 0,01 % Kalzium und 0,77 % Phosphat sechs Wochen alten Athymic ovariectomized Ratten anziehen.
  2. Schalter zurück zu einer normalen Ernährung.
    Hinweis: Diese Ratten bezeichnet werden als " osteoporotischen Ratten " nachstehend.

2. Wirbelkörper defekt-Modell

Hinweis: das Timing ist 40-50 min pro Tier.

  1. Autoklav alle chirurgischen Instrumente vor der Operation.
  2. Bei mehreren Operationen, sterilisieren alle chirurgischen Werkzeuge.
    1. Der Werkzeuge zu waschen und legen Sie sie in einem Sonikator Bad für 5 min. Legen Sie sie in einem heißen Perle Sterilisator Set auf 250 ° C für 20 S. erlauben die Werkzeuge für 5 min. abkühlen lassen
  3. Induzieren Anästhesie.
    1. Ort befestigt die osteoporotische Ratte in der Induktion Kammer ein Anästhesiegerät mit einem zentralen scavenging-System. Anästhesie mit 5 % Isofluran in 100 % Sauerstoff zu induzieren und pflegen über Bugnase bei 2-3 % Isofluran. Tierarzt Salbe für die Augen verwenden, um Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
    2. Gelten einen Zehe-Prise Anreiz für angemessene Ebene der Narkose zu gewährleisten. Wenn keine Antwort vermerkt ist, Einleitung des Verfahrens.
  4. Die narkotisierten Ratte in dorsal liegen auf ein Heizkissen (37 ° C) und Strecken die Gliedmaßen mit einem magnetischen Fixateur Rücknahme System ( Abbildung 2A).
    Hinweis: Die Temperatur des Heizkissens ist wichtig zur Vermeidung von Hypothermie, da eine narkotisierten Ratte nicht in der Lage, ihre Körpertemperatur zu regulieren ist.
  5. Rasieren im Bauchbereich einen elektrischen Rasierer verwenden. Wischen Sie es mit Jod-basierten Antiseptikum und Chlorhexidin Gluconat 0,5 % gefolgt von 70 % igem Ethanol.
  6. Spritzen die Ratte mit Carprofen (5 mg/kg Körpergewicht (BW), subkutane (SQ)) vor Beginn des chirurgischen Verfahrens.
  7. Verwenden ein steriles Skalpell schneiden Sie die Haut. Den Schnitt 1 cm unter dem Xiphoid Prozeß zu beginnen und Durchtrennen der Mittellinie (~ 5-8 cm) ( Abb. 2 b).
  8. Chirurgische Scheren verwenden, um einen Schnitt von der Aponeurose durch die Linea Alba auf der Bauchhöhle ( Abbildung 2).
  9. Setzen die Bauchhöhle mit Retraktoren ( Abb. 2D).
  10. Lenken den Darm auf der rechten Seite der Ratte, der Bauchschlagader und die linke Niere ( Abb. 2E) aussetzen. Ertasten der Lendenwirbelsäule, bevor Sie fortfahren zu entlarven. Um Austrocknung zu vermeiden, verwenden Sie sterile getränkte Gazen mit steriler Kochsalzlösung, wickeln Sie die inneren Organe.
  11. Gebrauch Thermocautery zu entlarven in Schichten den vorderen Aspekt der lumbalen Wirbelkörper L4-5 und aus den umliegenden Bindegewebe und Muskulatur zu isolieren ( Abbildung 2F -G).
    Hinweis: Thermocautery sollten verwendet werden, um Steuern, Blutungen während der Dissektion.
  12. Verwenden einen sterilen Wattetupfer gesättigt mit steriler Kochsalzlösung, um Blut und Restmüll Gewebe aus den Wirbeln L4 zu entfernen. Verwenden Sie eine sterile Trephine Bohrer Bohrer (~ 2 mm im Durchmesser), ein 5 mm tiefen Knochendefekt in der Mitte der exponierten vorderen Aspekt des Wirbelkörpers zu bohren (Abbildung 2 H-ich).
    Hinweis: Minimal Druck durch nur dem ventralen Kortex und dem darunter liegenden trabekulären Knochen gebohrt; vermeiden Sie Bohren durch den dorsalen Cortex. Beachten Sie, dass die Wirbel von osteoporotischen Ratten sehr zerbrechlich sind. Verwenden Sie ein Wattestäbchen zum Reinigen des Mangels und Druck Blutstillung, falls vorhanden.
  13. Wiederholen Sie Schritt 2.11 auf der Wirbel L5 erstelle ich insgesamt 2 Fehler pro Ratte ( Abbildung 2J).
  14. Den Darm in den Bauchraum zurück.
  15. Verwenden eine Vicryl synthetische resorbierbare chirurgische Naht (3-0 Vicryl ungefärbt 27 " SH Kegel) in einem kontinuierlichen Muster, Naht der Aponeurose ( Abbildung 2 K).
  16. In der Nähe der Haut mit einer 4: 0 Monofilament Nylon nicht resorbierbaren Naht in einem einfachen unterbrochene Muster ( Abbildung 2 L).
  17. Gelten 100 µL topische Hautkleber auf die Hautnähte und zwischen ihnen, die vollständige Schließung der Haut zu gewährleisten.
  18. Spritzen die Ratte mit Warm (37 ° C) gesäugt Ringer ' s Lösung (1CC/100 g BW, SQ), Unterkühlung und Austrocknung zu verhindern.
  19. Die Ratte mit Buprenorphin (0,5 mg/kg BW, SQ) vor der Operation und alle 8-12 h für postoperative Schmerzlinderung zu injizieren, je nach Bedarf.
  20. Das Tier unbeaufsichtigt lassen, bis es ausreichend Bewusstsein zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen wiedererlangt hat. Auch nicht zurück, ein Tier, die Operation, um die Gesellschaft anderer Tiere durchlaufen hat, bis es vollständig erholt hat.
  21. Nachdem das Tier auf das Heizkissen erholt hat an seinem Käfig zurück.
    Hinweis: Haus der Ratten einzeln (d. h. in getrennten Käfigen) zur Verhinderung von Ratte zu Ratte Verstümmelung der Nähte und Wunde.
  22. Legen Sie Chow eingeweicht in Wasser in einer Petrischale auf den Boden für ein paar Tage nach der Operation zu helfen, die Ratten, die das Essen zu erreichen.
  23. Carprofen (5 mg/kg BW, SQ) 24 h nach der Operation zur Schmerzlinderung alle 24 h nach Bedarf zu verwalten.
  24. Die Hautnähte zu entfernen, während das Tier unter 2 % Isofluran Anästhesie 10-14 Tage nach der Operation.

3. Diese Scannen

Hinweis: das Timing ist 30-40 min pro Tier.

  1. Am Tag nach dem chirurgischen Eingriff, legen die osteoporotische Ratte in der Induktion Kammer an einem Anästhesiegerät mit einem zentralen scavenging-System angeschlossen. Anästhesie mit 5 % Isofluran in 100 % Sauerstoff zu induzieren und pflegen über Bugnase bei 2-3 % Isofluran.
  2. Scannen die Ratte mit einem in Vivo µCT-Scanner. Wiederholen Sie die longitudinale Analyse der Knochenregeneration werden gesucht.
    Hinweis: Stellen Sie sicher, dass alle Tiere mit den gleichen Einstellungen (z.B. Röntgenenergie, Medium, Intensität, Voxel-Größe und Auflösung scannen) geprüft werden und in einen gleichwertigenR-Orientierung. Zum Beispiel: Röntgenenergie, 55 "KVP"; Strom, 145 µA; Voxel Größe, 35 µm; Schritten, 115 µm; und Integrationszeit, 200 ms; mit den Proben mit PBS-Puffer. Beziehen sich auf Bouxtein Et al. 34 weitere Erläuterungen und Überlegungen Nagetier µCT Scannen für eine Bewertung der Mikrostruktur der Knochen beteiligt. Idealerweise würde die höchste Scan-Auflösung für alle Scans verwendet werden; jedoch höher aufgelöste Scans erfordern längere Aufnahmezeiten, großen Datenmengen zu generieren und die Tiere mehr ionisierende Strahlung aussetzen. Letzteres kann unerwünschte Effekte, darunter verminderte Frakturheilung einführen. Daher sollte ein Kompromiss zwischen der Zusatzdaten und Scan-Zeit sorgfältig berücksichtigt werden.

4. Wirbelkörper Trennung

Hinweis: das Timing ist 20-30 min pro Probe.

  1. Kontur des Wirbels von Interesse, wie in Abbildung 3A-I. Stellen Sie sicher, alle Teile des Wirbels beim benachbarten Wirbeln gehörenden Teile ausschließen.
    1. Klicken Sie auf " µCT-Bewertungsprogramm " und wählen Sie das Beispiel aus dem Menü ".
    2. Contour jede Scheibe mit der Maus.
    3. Verwendung der " Z " Bar, bis zum nächsten Schnitt gehen.
  2. Geformten Wirbel als separate Datei zu speichern ( Abbildung 3J -K) durch Anklicken " Datei " → " sparen GOBJ " alle paar Scheiben.

5. Definition des VOI für längs-Quantitative Auswertung

Hinweis: die folgenden Schritte davon abhängen, ob der Scan vom 1. Tag nach der Operation (Referenz Wirbel) oder aus der späteren Zeit Punkte (ist Ziel der Wirbel).

  1. Referenz Wirbel.
    Hinweis: Das Timing ist 20-30 min pro Probe.
    1. Für Z-Rotation, messen den Winkel der Ränder mit einem XY-Scheibe aus der Mitte des Mangels ( Abbildung 4A -B).
      1. Auf der Z-Ebene, gehen in den Bereich des Wirbels, wo der Fehler den meisten klar und Bildschirm-Aufnahme ist, des Wirbels.
      2. In einer Präsentations-Software, bereiten Sie ein Rechteck-förmiges Objekt, das in den Defekt passt.
      3. Das Bild des Wirbels zu drehen, so dass der Defekt nach oben zeigt und die Gewinnmargen defekt sind parallel zu den Seiten des Rechtecks.
      4. Messen den Winkel der Drehung (mit der rechten Maustaste auf das Bild → " Formatabbildung " → " Größe ").
      5. Verwenden die gemessenen Winkel drehen des Wirbels ( Abbildung 4).
        1. Ein neues DECterm-Fenster öffnen (" Sitzungs-Manager " → " Anwendungen " → " DECterm ").
        2. Laufen " Ipl ":
        3. Ipl > turn3d
        4. -Eingabe [in] >
        5. -Ausgang [Out] >
        6. -Turnaxis_angles [0,000 90,000 90.000] > 90 90 0
        7. -Turnangle [0.000] > gemessenen Winkel
        8. -Img_interpol_option [1] >
    2. Für X-Rotation, messen den Winkel der Ränder mit einem YZ-Scheibe aus der Mitte des Mangels ( Abbildung 4 -E). Verwenden des gemessenen Winkels des Wirbels ( Abb. 4F) drehen.
      1. Klicken Sie auf " YZ " in " uCT Auswertungsprogramm " und wiederholen Sie die Schritte 5.1.1.1-5.1.1.5.2.
      2. Ipl > Isq
      3. -Aim_name [in] >
      4. -Isq_filename [Default_file_name] > Verzeichnis der ISQ einfügen (z. B. " DK0: [MICROCT. DATEN. GAZIT. MAXIM.80.DAY1]Z2102970. ISQ ")
      5. -pos [0 0 0] >
      6. -dim [-1-1-1] >
    3. Flip gedrehten Wirbel durch eine Änderung der XY-Ebene der ZX-Ebene.
      1. Ein neues DECterm-Fenster öffnen (" Sitzungs-Manager " → " Anwendungen " → " DECterm ").
      2. Laufen " Ipl ":
      3. Ipl > flip-
      4. -Eingabe [in] >,
      5. -Eingang [Out] > out2
      6. -New_xydir [Yz] > Zx
    4. VOI zu definieren.
      1. Draw Runde Kontur des Mangels mit einer Scheibe aus der Mitte des Mangels durch die Auswahl der Kontur Kreissymbol in " uCT Auswertungsprogramm " ( Abb. 6A). Kopie, Kontur und fügen Sie ihn auf allen Scheiben in den defekt ( Abb. 6 b).
        Hinweis: Da alle Mängel, die nach dem gleichen Verfahren erstellt wurden, analysieren die gleiche Anzahl von Scheiben und anschließend das Gesamtvolumen (TV) für alle Proben.
  2. Ziel Wirbel.
    Hinweis: Das Timing ist 10-20 min pro Probe.
    1. Last der DICOM-Dateien des Ziels und die Referenz-Wirbel in das Hauptfenster der Bildanalyse-Software.
      Hinweis: Ausgabe in Graustufen Wertänderungen zu vermeiden, definieren Sie die gleichen Datentyp wie die ursprünglichen DICOM-Dateien im Menü Last.
    2. Register zur Referenz Wirbel.
      1. Start der " 3-d-Voxel-Registrierung " Modul und geben Sie die Referenz-Wirbel als der " Base Volumen " und die Ziel-Wirbel als der " Match Volumen. " klicken Sie " registrieren " Wirbel zu registrieren ( Abbildung 5).
    3. Speichern die registrierte Datei mit die gleichen Daten geben und zu einer µCT-Umgebung zu importieren.
    4. Gelten die VOI.
      1. Übernehmen die VOI definiert für die Referenz Wirbel um die registrierten Ziel Wirbel durch Klicken auf " uCT Auswertungsprogramm " → " Datei " → " Last GOBJ " und wählen Sie die zuvor erstellte GOBJ. Überprüfen Sie, ob die VOI und mangels konzentrisch sind.

6. MicroCT Analyse

Hinweis: das Timing ist 10-20 min pro Probe.

  1. Send VOI für Auswertung über einen µCT-Auswertungsprogramm ( Abbildung 6).
    Hinweis: Stellen Sie sicher die gleichen Parameter verwenden, wenn alle VOIs zu analysieren. Stellen Sie sicher, den Schwellenwert ist hoch genug, um Hintergrundgeräusche mit minimalem Verlust an Knochenmasse zu vernachlässigen. Wenn röntgendichten Biomaterial verwendet wird, könnte eine Reihe von Strategien zum Analysieren der Knochenbildung. Wenn es einen Unterschied in der Dichte zwischen das Biomaterial und Knochen Gewebe gibt, konnte das Biomaterial, 35 , 36 segmentiert werden. Andernfalls könnte die Ermittler qualitativ bewerten die Unterschiede bei der Knochenbildung zwischen Versuchsgruppen.

7. Euthanasie

  1. PPlace die osteoporotische Ratte in der Induktion Kammer an eine Anästhesiegerät befestigt. Anästhesie mit 5 % Isofluran in 100 % Sauerstoff induzieren.
  2. Pflegen Anästhesie über Bugnase und Euthanasie ausführen durch Einritzen der Brusthöhle zur Herstellung einer bilateralen Pneumothorax 37.

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Representative Results

Mit diesem Protokoll, kann man Bild und quantifizieren die Regeneration von n = 8 modellierten osteoporotischen Wirbelkörper Mängel in verschiedenen Zeitpunkten. Die anatomische Übereinstimmung erhalten durch das Eintragungsverfahren ermöglicht die Analyse der gleichen VOI zu allen Zeitpunkten. Daraus resultiert eine hochgenaue längs 3D Histomorphometric Analyse, sogar am Rande des ursprünglichen Mangels nicht mehr erkennbar sind. Wir haben fünf Zeitpunkten (Tag 1, Woche 2, Woche 4, Woche 8 und 12. Woche) als Beispiel für die longitudinale Auswertung der Knochenregeneration (Abbildung 7). Regeneration kann sowohl durch die qualitative Bewertung der Querschnitte 2D und 3D Bilder (wie in Abbildung 7Adargestellt) der quantitativen Vergleich der Knochen Quantität (BVD) und Qualität (AD) (Abb. 7 b) ausgewertet werden. Die folgenden morphometrische Indizes für die neu gebildeten Knochen ermittelt werden: (i) TV, einschließlich Knochen und Weichgewebe Bände (TV, mm3); (Ii) Volumen der mineralisierten Gewebe (BV, mm3); (Iii) Volumen Knochendichte (BV/TV); und (iv) Knochenmineraldichte (BMD, mg Hydroxylapatit pro cm3). Insbesondere wurde minimal Knochenbildung (5 % Zunahme der Knochendichte Volumen) 2 Wochen nach Mangels Festlegung beobachtet. Nach zwei Wochen wurden keine signifikanten Unterschiede bei der Knochenbildung beobachtet, im Vergleich zu späteren Zeitpunkten. Insgesamt zwar ein gewisses Maß an Knochenbildung, mit einem Höchststand von rund 10 % von Woche 8, war es minimal genug, bis die Knochen im Laufe der Zeit ungültig zu erhalten.

Figure 1
Abbildung 1: Protokoll Design. Die wichtigsten Schritte im Protokoll werden beschrieben. Erste, ovariectomized nackte Ratten auf vier Monate von einem niedrigen Kalzium-Diät (LCD) unterzogen wurden operiert, standard kritische Größe Mängel in zwei lumbalen Wirbelkörper zu schaffen. Die Ratten wurden an Tag 1 und 2, 4, 8 und 12 Wochen nach der Operation abgebildet. Tag 1-Scan wurde neu ausgerichtet, um eine standard-Position, und eine zylindrische VOI wurde mit defekt Ränder definiert. Nachfolgende µCT-Scans von jede Ratte wurden an der Standardposition definiert für den entsprechenden Tag 1 Scan automatisch registriert. Am Tag 1 VOI vordefiniert wurde dann an die eingetragene Scans angewendet. Die Knochendichte Volumen und scheinbare Dichte des VOI wurden zur Knochenneubildung zu beurteilen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Chirurgie der Wirbelsäule defekt. Die wichtigsten Schritte in der chirurgischen Generation der Wirbelkörper Mängel werden dargestellt. Zunächst wurden die Ratten auf ein Heizkissen (A) gesetzt. Ein Mittellinie Einschnitt erfolgte durch die Haut (B) und dann die Linea Alba (C), die Bauchhöhle (D) verfügbar zu machen. Der Darm spiegelten sich an um der hintere Bauchwand (E) verfügbar zu machen, und die Lendenwirbelsäule ausgesetzt war, mit Thermocautery (Pfeil, F-G). Mängel wurden in der vierten (H, Pfeil, den Bohrer; gebohrt. Ich, Pfeil zum Mangel) und fünften (J, Pfeile zu Defekten) lumbalen Wirbelkörper. Zu guter Letzt wurden die Aponeurose (K) und Haut (L) vernäht. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Wirbel Trennung. Die wichtigsten Schritte in der Konturierung eines Wirbels von Interesse werden angezeigt. (A-ich) Konturierte (grüne Linie) repräsentative 2D Scheiben entlang der Längsachse eines Wirbels werden angezeigt. Eine 3D-Darstellung der vollen Wirbelsäule (J) ist vergleichbar mit dem getrennten Wirbel (K). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Wirbel Positionierung zu verweisen. Repräsentative Scheiben in zwei Ebenen werden eines Wirbels vor und nach der Drehung um eine Standardposition angezeigt. Zunächst mit einem Mitarbeiter XY-Scheibe (A), Winkel (B, grün) benötigt, um den defekt (B, rotes Quadrat) parallel zur Y-Achse (B, gelb) zu drehen ermittelt und dann verwendet, um das gedrehte Bild (C erstellen ). Dann, mit einem Vertreter YZ-Scheibe (D), Winkel (E, grüne) benötigt, um den defekt (E, rotes Quadrat) parallel zur z-Achse (E, gelb) zu drehen ermittelt und dann verwendet, um das gedrehte Bild (F erstellen ). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Ziel Wirbel Anmeldung. Repräsentative Scheiben auf drei Ebenen der Ziel-Wirbel (grün markiert) und Referenz-Wirbel (rot markiert) vor (A-C) und nach (D-E) Registrierung werden angezeigt. Beachten Sie die gelbe Farbe zeigt Überschneidungen zwischen Ziel und Verweis Wirbel und die weißen Pfeile, die auf grünen Knochen nach der Regeneration, Knochenbildung angibt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6: VOI Analyse. Repräsentative Scheiben in zwei Ebenen mit der konturierten Volumen von Interesse werden angezeigt. Eine kreisförmige Kontur befindet sich in der Mitte des Defektes in einer Vertreter ZX-Scheibe (A). Nach Konturierung alle ZX-Scheiben, sehen das komplette Mangels Volumen in der XY-Ebene (B). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7: Längsschnittanalyse der Wirbelkörper defekt Regeneration. Qualitative und quantitative repräsentative Bone Regeneration Analyse-Ergebnisse werden angezeigt. (A) A repräsentative Wirbelkörper defekt zu verschiedenen Zeitpunkten wird in jeder Gruppe eine frontale 3D-Bild (Oberseite) mit Knochenbildung in der Leere in rot angegeben, eine sagittale 2D-Bild (Mitte Platte) und eine axiale 2D-Bild (Bodenplatte) dargestellt. Die Quantitative Analyse der Knochenbildung in die Hohlräume wurde durchgeführt. Knochen Volumen (B) und scheinbare Dichte (C) wurden berechnet und verglichen mit einem wiederholten misst zwei-Wege-ANOVA mit Bonferroni Korrektur für multiple Vergleiche. Die Fehlerbalken darzustellen SEM. ***-p < 0,0001. Bitte klicken sie hiere, um eine größere Version dieser Figur.

Schritte Problem Mögliche Ursache Lösung
2.3 Tier in Narkose keuchend Überschüssige Isofluran Lieferung Verringern Sie die Konzentration von Isofluran geliefert für das Tier.
Tier reagiert bis zu den Zehen Prise Unzureichende Isofluran Lieferung Erhöhen Sie die Konzentration von Isofluran.
2.7-2.12 Schwere Blutungen Vaskulären Schäden Verwenden Sie einen sterilen Wattetupfer Druck oder Cautery Blutstillung anzuwenden.
Das Tier hat Schwierigkeiten beim Atmen Die Membran wurde punktiert Einschläfern des Tieres um Erstickungsgefahr zu vermeiden.
Austritt von Darminhalt Der Magen-Darm-Trakt wurde punktiert Einschläfern des Tieres um weitere Komplikationen zu verhindern. Verhindern, dass es durch die Aufhebung der Aponeurose vom zugrunde liegenden Darm vor dem Schneiden.
Blut tritt aus der Bohrstelle Ein Blutgefäß durchstochen wurde Anwenden einer sterilen Wattetupfer bis die Blutung stoppt.
Tier schüttelt plötzlich während des Bohrens Der Bohrer ging zu tief und das Rückenmark beschädigt Einschläfern des Tieres um weitere Komplikationen zu verhindern.
Der Knochendefekt sieht unvollständig Der Bohrer gehen nicht tief genug. Der Bohrkopf in den Defekt zu positionieren und tiefer bohren
2.15-2.24 Naht-Pausen Die Naht war zu straff gezogen. Ersetzen Sie die gesamte Naht. Wenn brechen häufig auftritt, verwenden Sie eine Größe dickere Naht.
Tier ist langsam wieder aus der Narkose Das Tier ist unterkühlt Erhöhen Sie die Temperatur des Heizkissens oder wenden Sie eine zusätzliche Quelle der Heizung (z.B. Heizung Lampe).
Nähte sind offen Die Nähte wurden lose gelegt, oder das Tier hat anstrengende Tätigkeit Erneut die Fäden und wenden Dermabond direkt auf die Nähte und zwischen ihnen.
3 Gescanntes Bild erscheint mit niedriger Auflösung, laut oder Streulicht Scanparameter angepasst werden müssen Passen Sie die Parameter des Scan-Protokolls. Beziehen sich auf Bouxsein Et Al. weitere Richtlinien für das Scannen.
Gescanntes Bild verschwommen Das Tier bewegt während des Scanvorgangs Scannen Sie das Tier. Wenn Bewegung fortfährt, Isoflurane Konzentrationsfähigkeit zu erhöhen.
5 Die Registrierung von Ziel Wirbel war nicht erfolgreich Wirbelkörper Trennung war nicht richtig gemacht Laserbehandlung des Wirbels: Stellen Sie sicher, alle Teile der Wirbel enthalten sind, und alle angrenzenden Strukturen auszuschließen.
Große Unterschiede in der Positionierung der Wirbel Positionieren Sie die Ziel-Wirbel in die gleiche Ausrichtung wie die Referenz-Wirbel mit Drehungen und flip (Schritt 29A).
Analyse der Knochenstrukturen wird nicht richtig erkannt Beantragen Sie einen Schwellenwert in der Registrierung-Modul, die Geräuschkulisse von Knochenproben zu entfernen.
Die registrierten Wirbel sind anders Erstellen Sie 3D-Bilder Ihrer Proben und entsprechen Sie den richtigen Wirbel über die verschiedenen Zeitpunkten.
6 Das Gesamtvolumen (TV) unterscheidet zwischen Proben Entweder eine unterschiedliche Anzahl von Scheiben oder eine andere Kontur verwendet wurde Achten Sie darauf, immer die gleiche Kontur Größe und die gleiche Anzahl von Scheiben zu verwenden.
Bone Mineral Density (BMD) Wert ist nicht normal Unzureichende Kalibrierung des microCT Kalibrieren der MicroCT für richtige Hydroxylapatit-standards

Tabelle 1: Problembehandlung. Mögliche Probleme und Lösungen sind für verschiedene Schritte im Protokoll vorgestellt.

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Discussion

Osteoporose ist die häufigste Ursache der vertebralen Kompressionsfrakturen, verursacht durch eine erhöhte Belastung auf die Wirbelsäule und dazu führen, dass der Zusammenbruch des Wirbelkörpers. Allerdings ist es praktisch unmöglich, eine Verletzung in einem Nagetier zu generieren, die einen ähnlichen Wirbelkörper Zusammenbruch authentisch repliziert. Stattdessen erstellen Forscher eine zylindrische leere in der Mitte des Wirbelkörpers, OVCFs16,17,18,19,20,21,24 imitieren , 38 , 39. da gibt es keine Übereinstimmung in der Literatur in Bezug auf Defektgröße, ein kritische Größe defekt wurde definiert als eine, die nicht spontan vollständig ohne eine Intervention innerhalb 3 Monate post-Op16,17heilt.

Obwohl die Methode der Kombination von Ovariectomy mit einem LCD schnell Osteoporose induzieren zuvor veröffentlichten1,13war, waren wir erstmals zeigen, dass die Anwendung dieses Ansatzes zu Athymic Ratten Ergebnisse in eine effiziente, schnelle und irreversible Abnahme der Wirbelkörper trabekulären Knochen Volumen und Mineral Dichte40. Dies ist ein reproduzierbares klein-Tier-Modell, das durch das Nagetier Immunsystem ungehindert und dass ist keine Notwendigkeit hinzugekommen Immunsuppression, wie von anderen24verwendet.

Unsere chirurgische Protokoll generiert mehrere identische kritische lumbalen Wirbelkörper Mängel40. Dies führt zu sehr konsistent und leicht vergleichbar und quantifizierbare Mängel über Tiere. Wir glauben, dass Mängel produziert mit diesem Ansatz überlegen Wirbelkörper defekt Modelle generiert im kaudalen Wirbel1,19,41 sind , da der Rattenschwanz biomechanische Kräften ausgesetzt ist, die deutlich anders als bei der Ratte Lendenwirbelsäule.

Wichtige Schritte innerhalb dieses Protokolls gehören die Vermeidung intraoperativer Unterkühlung und Einnahme Vorsicht beim Bohren die fragile Wirbel der ovariectomized nackte Ratten nach einem LCD. Nach dem Generieren des Wirbelkörper Defekts, wird es mittels einer zeitlichen Abfolge von in Vivo µCT-Scans zu festgelegten Zeitpunkten für die longitudinalen Beurteilung der Knochen Reparatur überwacht. Die gleiche Scan-Einstellungen ist entscheidend. Die Wirbel sind dann konturiert und getrennt vom Rest des Scans. Eine identische Gesamtvolumen für alle Scans eines Wirbels Konturierung und Vermeidung von Graustufen Wertänderungen sind entscheidend. Einem handelsüblichen mehrere Bild-Registrierung-Algorithmus ermöglicht die Gewinnung von anatomisch entsprechenden Baseline VOIs zu allen späteren Zeitpunkten. Schließlich sind diese VOIs für Knochenvolumen, scheinbare Dichte usw.analysiert. Es ist wichtig, alle mit den gleichen Parametern VOIs zu analysieren. Diese Technik bietet eine höchst präzise und einfache längs-3D µCT-Analyse, die nicht benutzerabhängig.

Diese Methode könnte auf eine längliche Knochen Regeneration Fehleranalyse angewendet werden. Das hier verwendete Wirbelkörper defekt-Modell ist ein praktisches Modell für diese Anwendung, da ihre Knochenstruktur einzigartig ist und leicht in die gleiche anatomische Position registriert werden kann. Jedoch konnten Knochenregeneration unter den gleichen Bedingungen analysiert werden, indem Sie richtig trennen den gleichen Knochen von Interesse in der Längsrichtung Scans. Es ist zwingend notwendig, um getrennte Knochenproben mit den gleichen anatomischen Merkmalen gehören. Dieses potentielle Problem und andere sind in Tabelle 1, sowie mögliche Ursachen und Lösungsvorschläge beschrieben. Die anatomische Übereinstimmung durch die Registrierung erhalten kann nur auftreten, wenn die Beispiele die gleiche anatomische Merkmale enthalten. Die Registrierung ermöglicht dem Benutzer alle verbleibenden Zeitpunkte, wodurch eine hochgenaue 3D Histomorphometric Analyse im Laufe der Zeit die genaue vordefinierte VOI des ersten Scans zuweisen. Knochendichte Volumen und scheinbare Dichte des VOI können zur Knochenneubildung zu beurteilen.

Während potenziell überall anwendbar, ist das hier vorgestellte Modell nicht ohne Einschränkungen. Die Verwendung von Athymic nackten Ratten konnte eine Einschränkung gelten, da es potentiell Maske könnte einige immun-vermittelte Prozesse, die für die Regeneration von Bedeutung sein können. Zweitens ist die Modellierung von Osteoporose durch eine Kombination von Ovariectomy und ein LCD bei jungen Ratten als zuvor veröffentlichten1,13, in seiner Fähigkeit, die Biologie der älteren Patientenpopulation imitieren begrenzt. Drittens wurden OVCFs durch einen chirurgischen Eingriff modelliert, da die nur andere Tiere, Osteoporose bedingte Knochenbrüche haben Primaten42sind. Schließlich, während die Ratte Lendenwirbelsäule ist das verfügbare Modell für menschliche Lendenwirbelsäule – wo die meisten Wirbelfrakturen entwickeln – die fehlende axiale Belastung der Nager Wirbelsäule ist auch eine Einschränkung.

Dieses Protokoll ist modular aufgebaut und kann daher leicht des Forschers Bedürfnissen geändert werden. Beispielsweise könnte Athymic ovariectomized Ratten verwendet werden, um andere Osteoporose bedingte Knochenbrüche zu studieren. Ein Forscher entscheiden sollten, unsere Herangehensweise an parallelisierter Bone Regeneration Analyse verwenden, könnte für jede Fraktur-Modell mit längs-strukturelle Bildgebung, nicht notwendigerweise Mikro-Computertomographie gelten. Darüber hinaus könnte zusätzliche Informationen gesammelt werden, gleichzeitig mithilfe zusätzliche bildgebende Verfahren wie der Magnet-Resonanz-Tomographie.

Das OVCF-Modell präsentiert in diesem Protokoll könnte verwendet werden, um neue therapeutische Ansätze zu diesem klinisch ungedeckten Bedarf zu studieren. Darüber hinaus kann unsere parallelisierter Analyseansatz erfolgreich eingesetzt werden, um eine ähnliche Analyse durchzuführen, die weniger benutzerabhängig und bietet besseren Genauigkeit als andere Methoden16. Besonders bemerkenswert ist die Tatsache, dass wir handelsüblichen Visualisierung und Analyse-Software verwendet, die von allen Forschern genutzt werden kann – Software, die zusätzliche bildgebende Verfahren wie Kernspintomographie und nukleare Darstellung unterstützt. Daher glauben wir, dass diese Methode höchst verallgemeinerbare ist und ist nur durch die Verfügbarkeit von in-Vivo imaging-Funktionen und Registrierung der Software begrenzt.

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Disclosures

Diese Forschung wurde durch einen Zuschuss aus dem California Institute für Regenerative Medizin (CIRM) (TR2-01780) unterstützt.

Acknowledgments

Die Forschung wurde durch einen Zuschuss aus dem California Institute für Regenerative Medizin (CIRM) (TR2-01780) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane MWI Animal Health, Pasadena, CA 501017
BetadineSolution MWI Animal Health, Pasadena, CA 4677
Chlorhexidine Gluconate 2% scrub MWI Animal Health, Pasadena, CA 510083
Isopropyl Alcohol 70%-quart MWI Animal Health, Pasadena, CA 501044
Carprofen MWI Animal Health, Pasadena, CA 26357
Buprenorphine 0.3 mg/mL MWI Animal Health, Pasadena, CA 56163
Ovariectomized Athymic nude rats Harlan Laboratories, Indianapolis, IN Hsd:RH-Foxn1 rnu
Low calcium food Newco Distributors, Inc., CA 1814948 (5AV8 AIN-93M w/low calcium)
Phosphate Buffered Saline Life Technologies Corporation 14190250
Dermabond J AND J ETHICON DHVM12
Anesthesia machine Patterson Scientific TEC 3EX
Slide Top Induction Chambers Patterson Scientific 78917833
ProStation Heated Workstation Patterson Scientific 78914731
Surgical drape HALYARD HEALTH INC 89101
Magnetic fixator retraction system Fine Science Tools, Inc., CA 18200-50
Dissecting Scissors, 10 cm, Curved, SS World Precision Instruments, FL 14394
Iris Scissors, 11.5 cm, 45 °Angle, Serrated, Sharp/Sharp World Precision Instruments, FL 503225
Forceps, no. 5 World Precision Instruments, FL 555048FT
Micro Mosquito Hemostatic Forceps World Precision Instruments, FL 503360
Sterile cotton gauze Medtronic, MINNEAPOLIS, MN 9024
Absorption Spears - Mounted/Sterile Fine Science Tools, CA 18105-01
Syringe, 1 mL TERUMO TERUMO MED SS-01T
Needle, 25 gauge BD MED SYS INJECTION SYS 305127
Laminar flow hood Baker SterilGARD e3-Class II Type A2 Biosafety Cabinet
Thermal Cautery Unit World Precision Instruments, FL 501292
Micro-Drill OmniDrill115/230V World Precision Instruments, FL 503598
Trephines for Micro Drill, 2 mm diameter Fine Science Tools, CA 18004-20
3-0 Vicryl undyed 27” SH taper J AND J ETHICON 1663G
4-0 Ethilon black 18” PC3 conventional cutting J AND J ETHICON 1954G
Conebeam in vivo microCT (vivaCT 40) Scanco Medical vivaCT 40
SCANCO Medical microCT systems software suite Scanco Medical vivaCT 40
Analyze software Biomedical Imaging, Mayo Clinic, Rochester, MN Analyze 12 Image analysis software
Veterenery eye ointment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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