בחיי עיר אפיון Biofilms MR1 Shewanella oneidensis על ידי SALVI וסימס תוף

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

מאמר זה מציג שיטה לגידול ממבנה biofilm עבור בחיי עיר יון משני זמן-של-טיסה ספקטרומטר מסה למיפוי כימי במצב רטוב, מופעל על ידי כור microfluidic, מערכת לניתוח-הממשק ואקום נוזלי. מר Shewanella oneidensis -1 עם פלורסצנטיות ירוק חלבון שימשה כמודל.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Komorek, R., Wei, W., Yu, X., Hill, E., Yao, J., Zhu, Z., Yu, X. Y. In Situ Characterization of Shewanella oneidensis MR1 Biofilms by SALVI and ToF-SIMS. J. Vis. Exp. (126), e55944, doi:10.3791/55944 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Biofilms חיידקי הן קהילות השטח-הקשורים נלמדים במידה רבה להבין שלהם (EPS) מתוצרת עצמית חוץ-תאית חומרים פולימריים ותפקידיהם ב מיקרוביולוגיה סביבתית. מחקר זה מתאר שיטה לטפח biofilm המצורף למערכת לניתוח-ממשק נוזלי ואקום (SALVI) ולהשיג בחיי עיר מיפוי כימי של ממבנה biofilm חי על ידי יון משני זמן-של-טיסה ספקטרומטר מסה (תוף-SIMS). פעולה זו מתבצעת באמצעות culturing של חיידקים גם בחוץ וגם בתוך הערוץ SALVI עם ההתקנה המקצועית שלנו, כמו גם באמצעות טכניקות דימות אופטי כדי לזהות את הנוכחות biofilm ואת עובי לפני ניתוח תוף-סימס. התוצאות שלנו להראות הפסגות האופיינית של biofilm Shewanella רטוב במצבו הטבעי, סימון על מים מקומי אשכול הסביבה שלה, כמו גם EPS שאינם שונים באופן דרסטי של biofilm באותו מיובש המדינה. תוצאות אלה מדגימים את יכולת פריצת דרך SALVI המאפשר בחיי עיר biofilm הדמיה במכשיר מבוסס-ואקום כימי הדמיה.

Introduction

Biofilms חיידקי הן קהילות הקשורים השטח אשר התפתחו במשך הזמן כהגנה על חיידקים לשרוד משתנה לגירויים פיזיים ועל מכניים שלילית, שבו תאים מסוגלים לצרף ולשרוד בסביבות אפשריות רבות. 1 , 2 Biofilms נחקרות במידה רבה, יש יישומים בתחומים רבים כגון וההתערבות, הנדסה ביו-רפואית, חקלאות, תעשייה מחקר ופיתוח. 1 , 2 . הבנת המיפוי כימי של קהילות חיידקים אלה מורכבים, כולל שלהם (EPS) מתוצרת עצמית חוץ-תאית חומרים פולימריים וסביבתם מים מקומיים-אשכול, חיוני להשגת מדויקת ומפורטת תיאור הפעילות הביולוגית שלהם. 2

Biofilms להתקיים ולגדול בתוך מדינה מאוד רטוב. מהווה אתגר גדול באמצעות ניתוח משטח מבוססי וואקום טכניקות כגון יון משני זמן-של-טיסה ספקטרומטר מסה (תוף-SIMS) עקב הקושי בלימוד נוזלים נדיפים בואקום. כתוצאה מכך, טכניקות מבוססות ואקום ניתוח משטח היה מוגבל כמעט אך ורק ללמוד biofilm דגימות-רק מדינתם מיובשים. עם זאת, ללמוד ממבנה biofilm במצבו מיובשים מעכב החקירה מדויק של microenvironment הביולוגית האמיתית שלו. היא גורמת לעיתים קרובות שינויים דרסטיים EPS biofilm ובטחונו המורפולוגיה, אשר הוכח לאחר השוואת תוצאות המוני ספקטרלי biofilm יבש בחיי עיר ללימודי נוזלי. 3 , 4 מאמר זה מציג פתרון עבור הלומדים biofilms בתוך hydrated במצבן הטבעי על ידי העסקת את השימוש במערכת שלנו לניתוח-נוזלי ואקום ממשק (SALVI),5,6 כור microfluidic את זה מכיל נוזל תחת הממברנה ניטריד (חטא) שלו סיליקון דק ב- microchannel עשוי polydimethylsiloxane (כרונית), ובכך מספק גישה ישירה על הקורה בדיקה יון משני תוך שמירה על שלמות המבנה של המטריקס נוזלי בתוך ואקום . תא 7 , 8

Oneidensis ס מר-1 מוטציה לבטא חלבון פלורסצנטיות ירוק (GFP) נבחר כאורגניזם מודל להמחשה הליך זה biofilm בשל צדדיות מטבולית שלה שימוש נפוץ ב מיקרוביולוגיה סביבתית ושימושית, אשר היה מבוסס בכבדות על יכולת ייחודית שלה עבור הפחתת מתכת והעברת-אלקטרונים חוץ-תאית. 9 , 10 , 11 . בנוסף, הנוכחות של GFP מותרת עבור קל רציפה biofilm-עובי ניטור באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות, באמצעות מסנן isothiocyanate (FITC) fluorescein. מחקרים קודמים שלנו הראו עדות של חיידקים זה העדפה מצורף אל החלון חטא שימוש ב operando קרינה פלואורסצנטית הדמיה לצמיחה biofilm בעובי של עד 100 מיקרומטר. 4 , 12 בעוד מאמר זה ידון רק האישור של הנוכחות של biofilm דרך מיקרוסקופ פלורסצנטיות, SALVI הוא תואם עם שיטות דימות אופטי אחרות כגון סופר-רזולוציה קרינה פלואורסצנטית הדמיה (קרי, מובנית תאורה מיקרוסקופ (SIM)9) ו לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ (CLSM) הדמיה4). דימות אופטי יכול לשמש כדי למדוד את עובי biofilm, לקבל תמונה תלת-ממדית של, צורת biofilm כפי שהוא מופיע, המאשרת את עוביו ואת הקשר שלה אל החלון חטא. 9 בזמן GFP נעשה שימוש בניתוח סימס, S. oneidensis ללא GFP על עקומת הגדילה, שימש מדידה זו נדרשת רק של צפיפות אופטית, לא מחייבים כל הדמיה פלורסנט. בדרך כלל, ההבדל בין ה-GFP מתויג, מינים לא מתויגת בתוך עקומת גדילה נמצא חסר חשיבות. בנוסף, בעוד פרוטוקול זה משתמש oneidensis ס מר-1 GFP כאורגניזם מודל כדי לתאר את התהליך, הליך זה מיועד עבור כל זן חיידקי כי ייתכן שיהיה צורך לטיפוח בתוך SALVI. אמנם, לאור הידע של המתח חיידקי צריך, כמה תנאים לצמיחה כגון זמן, טמפרטורת הסביבה חמצן ייתכן שתצטרך להיות שונה כדי להתאים את המתח של חיידקים כדי לשמש. עבור מדיום הגידול, הליך זה משתמש "nanowires" בינוני, tryptic סויה מרק (TSB) ללא דקסטרוז, סויה tryptic אגר (TSA) ללא דקסטרוז culturing. ההרכב של "nanowires" בינוני כבר במיוחד ניסח עבור הצמיחה, ניטור של הרחבות של הקרום ומאז periplasm של oneidensis ס המופיעות לקחת את הצורה של חוטים קטנים, של הקומפוזיציה בינוני הוקם בתוך מחקרים קודמים. 13 , 14

הפרוטוקול הקודם שלנו בב באתרו ToF נוזלי-סימס יש מאויר היתרון שיש SALVI להציע עבור חלבון הנייח וקובץ מצורף החטא, כמו גם פרוטוקול מפורט על הפחתת ניתוח ונתונים תוף-סימס. 12 יותר מאשר לחזור על הצעדים להפחתת נתונים, הנייר הזה ישמש להתמקד במקום הגישה הייחודית של הגדרת וטיפוח biofilms בתוך microchannel SALVI שלנו, כמו גם את השלבים הדמיה לזהות נוכחות biofilm ועובי מוקדמת תוף-סימס לניתוח. בעוד biofilms היה מוגבל בעבר כדי רק מיובש דגימות בתוך התא של מבוססי וואקום את השטח בשיטות אנליטיות, מפורט EPS ו- biofilm כימי מיפוי של biofilms בשידור חי כעת ניתן להשיג בחיי עיר בגלל יכולת חדשה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנה של חומרים

  1. הכנה של בינוני אבובים
    1. בקבוקים סרום (אחד צורך לכל שלוש זקוקים לכל עקומת גדילה והתרבות biofilm)
      הערה: כפי שצוין במבוא, צמיחה בינוני מתאים לספק את החומרים המזינים הדרושים המתח של חיידקים עניין יכול להיות מנוצל עבור הליך זה; במקרה זה, " nanowires " TSB ללא דקסטרוז מדיום ומדיה שימש לצמיחה של oneidensis ס מר-1 GFP. 13
      1. הפקדה 20 מ של מדיום הגידול לתוך בקבוק אחד של סרום 70 מ ל, כובע הפקק של ו crimp את הבקבוק. לכסות העליון בחתיכת נייר אלומיניום נקי סטרילי.
      2. אוטוקלב הבקבוק עם מחזור הנוזל למשך 30 דקות-121 מעלות C. Afterward, לאחסן את הבקבוק סרום סטיריליים בטמפרטורת החדר.
    2. אנאירובית צינורות תרבות
      1. להפקיד 5 מ של מדיום הגידול לתוך שפופרת תרבות אנאירובית עם קראוון אוויר, לשים את הפקק ו crimp את הבקבוק. לכסות העליון בנייר סטרילי.
  2. הכנת בועות השמנה אבובים
    1. באמצעות מחט מד 22, בזהירות לחורר דרך פקק גומי לבקבוק סרום.
    2. לחתוך-20 ב- 1/32 " טפלון (PTFE) צינורות בתער כזה את קצה אחד של המקטע של צינורות הוא הצביע.
    3. את הקצה המחודד, באמצעות חוט הצנרת PTFE דרך החור בחלק העליון של פקק הגומי. דחוף את הצינורית עד בערך 2 ס מ הוא דרך הפקק ולחתוך את הקצה המחודד של צינור PTFE עם סכין גילוח יש קצה שטוח-
    4. להסיר את הבוכנה של מזרק 5 מ ל, להכניס את פקק הגומי מהשלב 1.2.3 הקצה הפתוח של המזרק. 2 ס מ סוף צנור PTFE הוא בתוך הקנה של המזרק. זוהי המלכודת בועה.
    5. לעטוף את המלכודת בועה (PTFE אבובים פקק הגומי, מזרק) שנעשו בשלב 1.2.4 ברדיד אלומיניום ולאבטח עם קלטת אוטוקלב. אוטוקלב החבילה בנייר כסף כדי לחטא את הצנרור עם שדה כבידה מחזור ב 121 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לאחסן את החבילה רדיד אטומה בטמפרטורת החדר עד מוכן לשימוש בשלב 2.4.
  3. עקומת גידול חיידקים
    הערה: פרוטוקול זה משתמש oneidensis ס מר-1 GFP כאורגניזם מודל לגידול של biofilm ב SALVI. עם זאת, הליך זה ניתן להתאים כדי להכיל חיידקים אחרים גדל aerobically או anaerobically. תלוי איזה זן משמש, צמיחה זמן וסביבה עשויים צריכים להיות מותאמים בהתאם.
    הערה:-80 ° C מקפיא חיידקי מניות בג'אז תערובת 1:1 של TSB ללא דקסטרוז, גליצרול. הדוגמה עקומת גדילה שמוצג באיור 1 B הוכנה באמצעות תרבות starter של TSB אין דקסטרוז, הועבר בכמויות המתאימות 0.2 מ ל שלוש פעמים 70 mL בקבוקים סרום עם 20 מ ל " nanowires " בינוני כדי להסיר שאריות TSB. עם זאת, פרוטוקול זה מבוסס על ההנחה כי מדיום הגידול היחידי ישמש כי העברות עוקבות לא יבוצעו, כמו זה נעשה עם הפתרונות בינוני מסוים עבור ס oneidensis. למרות שאינם מפורטים לעיל בפרוטוקול זה, העברות נוספות כמו זה מומלץ שכן בתחילה הפקדת לחיידקים TSB עשיר מסייעת התאים קפוא לשחזר; שלוש העברות הבאים כדי " nanowires " מבטיחה כי כל TSB נעלם דינמיקה אופיינית גדילה מתרחשים.
    1. מזריקים את התרבות Starter
      1. להסיר את המניה גליצרול חיידקי מהמקפיא-80 ° C וחם המניה עם יד בכפפה להפשיר מהר ככל האפשר. לעבור את המניה מקפיא בטיחות ביולוגית cabinet (BSC).
      2. בתוך BSC, השתמש מזרק 1 מ"ל עם מחט 22 גרם מצורף כדי להעביר 0.1 מ"ל של מניות מקפיא צינור רצ'ט ותרבות אנאירובית crimped המכיל 5 מ של מדיום הגידול עם אין דקסטרוז, מוכן בשלב 1.1.2. השלך המניה מקפיא הנותרים בגורם המתאים ביולוגי פסולת, כמו הקפאת שוב יכולים לזעזע את התאים.
      3. דגירה התרבות starter ב שייקר/חממה ב 30 ° C-150 סיבובים לדקה (סל ד), קחו של צפיפות אופטית 600 nm (OD 600) בקריאת כאשר הוא מוכן לשימוש. רשום את הזמן של צמיחה ושל יתר 600 כזה כי זה יכול להיעשות באותה עת לשימוש כל הבאים, כך התוצאות הן לשחזור. כדוגמה, הייתה זו תרבות starter מותר לגדל עבור 15 h, שיקול של יתר 600 של 1.0.
    2. מדיום הגידול מזריקים
      1. לקחת את הבקבוקים סרום שלוש מוכן בשלב 1.1.1.2, ותרבות starter המבושלות 1.3.1.3, ולהביא את שניהם BSC.
      2. בתוך BSC, באמצעות מזרק 1 מ"ל סטרילי עם מחט 22 גרם מצורפים, העברת 0.1 מ"ל של פתרון מתרבות starter לכל אחד הבקבוקים סרום, בהתאמה.
      3. Sterilize העליון של הבקבוקים סרום עם 70% אתנול ומכסים ברדיד אלומיניום מעוקר, תווית כראוי, העברה תפקודי לב / נשימה בתוך אינקובטור. הגדר את תפקודי לב / סל ד 150 והגדר החממה 30 ° C. Incubate עד נקודת הנתונים 600 OD הראשון נלקח, במסגרת שלב 1.3.3.
    3. OD קבלת 600 נקודות נתונים
      1. להכין ריק על ידי הפקדת µL 100 של עיקור מסנן מזוקקים יונים (די) מים לתוך cuvette סטרילי. לעטוף פרפין פלסטיק הסרט סביב החלק העליון של cuvette כך שהמים לא להיות מזוהמים. לאחסן בטמפרטורת החדר. השתמש בריק זה עם ספקטרופוטומטרים UV/מול לפני נטילת כל נקודות נתונים על עקומת גדילה על-ידי הוספת את cuvette והקשה " ריק ".
        הערה: כל 48 שעות חדשה ריקה צריך להיות מוכן להימנע מקריאה שגויה, כפי בקביעות החלפת כרטיס ריק, זה אימון טוב.
      2. עבור כל נקודת נתונים 600 OD, להסיר את הבקבוקים סרום מוכן בשלב 1.3.2.3 חממה, העברה ל- BSC מעוקר. סעו 0.1 מ"ל של המדיום חוסנו כל בקבוק סרום, פיקדון לשלושה בנפרד עם התווית וואקום סטרילי.
      3. לאחר במבלט, להוסיף cuvette המכיל את התרבות לתוך ספקטרופוטומטרים אולטרה סגול (UV/Vis) גלוי, לקרוא את יתר 600 אחד בכל פעם ולהקליט כל שלוש קריאות לאותה נקודה בזמן.
        הערה: עבור מר ס oneidensis-1, נקודות הנתונים נלקחו ב- 1, 14, 28, 32, 41, 57, 81 ו- 105 h לאחר חיסון. הגידול הושלמה כאשר החיידקים השלימה שלב המוות. נקודות אלה צריך להיות מותאם בהתאם, אם יש חוסר הידע על גידול מסוים זמן ועל הנטייה של חיידקים בשימוש בפרוטוקול זה. אם יש חוסר וודאות לגבי הנטייה צמיחה, נתונים נקודות צריך להיות שנאספו בתדירות גבוהה יותר, לדוגמה, כל ה 3 עבור ה 12 הראשון, כל ה 6 עבור h 36 עוקבות, במרווחים של 12 שעות עבור ה 100 הבאים, במרווחים של 24 שעות עבור ה 124 הסופי
      4. באמצעות ה OD 600 נקודות נתונים כמו ציר ה-y, כמו ה-x, גרף עיקול של הממוצע של שלוש נקודות עם סטיית תקן בקווי שגיאה עבור כל נקודת זמן באמצעות תוכנה graphing. עקומת גדילה oneidensis ס מר-1 מוצגת באיור 1 B במקטע תוצאות נציג.
      5. באמצעות גרף מוכן בשלב 1.3.3.4, לזהות את פרק הזמן של המקטע יומן-פאזי של עקומת הגדילה. עבור Shewanella, זה בין 12 ו- 33 h של צמיחה; לכן שניתן להסיק כי ב 24 שעות של צמיחה, Shewanella יהיה בתוך שלו היומן-שלב הצמיחה, בהנחה כי החיידק להיות תרבותי תוך שימוש באותה מדיה ו טיפול לפני השימוש ששימש עקומת הגדילה.

2. Culturing החיידק

  1. היום הראשון: מזריקים את צלחת אגר
    הערה: סעיף זה של ההליך היה בשימוש עם פלה agaroseטה לקחת יחידת המושבה יוצרי אחת (CFU) יומן-שלב, במקום התרבות starter נוזלי המשמש את עקומת הגדילה. זה יכול להניח להתרבות באותם התנאים לצמיחה, בשל העובדה כי TSA ללא דקסטרוז היה בשימוש, לאחר מכן הועבר " nanowires " בינונית הליך עקומת גדילה ולאחר TSA יש אותם מרכיבים של המרכיבים TSB.
    1. להסיר את סטוק GFPbacteria מר-1 oneidensis ס מ-80 מעלות צלזיוס מקפיא ומקום לתוך דלי קרח, למקם את הגרוטאה הזו בתוך BSC מעוקר.
    2. בתוך BSC, השתמש לולאה חיסון µL 1 סטרילי כדי לגרד את פני השטח של המניה חיידקים קפוא ולהשתמש הלולאה ל T-רצף של פני השטח של צלחת agarose.
    3. לאחר שחתמת את צידי לצלחת עם הסרט פלסטיק פרפין, להפוך את הצלחת ואחסן חממה של 30 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה, עד מושבות בודדות מופיעות.
  2. יום שני: מזריקים את הבקבוק סרום
    1. הסר את הלוחית של החממה ולפתוח בתוך BSC.
    2. בתוך BSC, לנקות את השטח של פקק הגומי על בקבוק הסרום מוכן מהשלב 1.1.1 עם 70% אתנול במים DI.
    3. של הפרט CFU מהצלחת אגר ולאחר, באמצעות מזרק סטרילי 22 המצורפת למדוד. את המחט, להפקיד מספיק מדיה צמיחה מכך המושבה מהצלחת בלי לגעת בכל המושבות השכנות, לערבב את המושבה עם המדיום עם קצה המחט.
      הערה: A ביחידים המושבה יש לבחור זה רחוק מספיק חיידקים אחרים בצלחת, כך בינוני ניתן להפקיד על זה בלי לגעת בכל מושבות אחרות.
    4. באמצעות המזרק אותו, לחלץ את הנוזל מפני השטח של הצלחת-
    5. לאחר טאפינג בועות בתוך המזרק, להזריק את הנוזל לתוך הבקבוק סרום, ומניחים על גבי תפקודי לב / נשימה בתוך 30 ° C שוכן בגובה 150 סל ד עבור ה 24
      הערה: הקשה את הבועות מתוך המזרק היא חשובה כדי להימנע מהחדרה יותר חמצן של הבקבוק סרום, כמו החדרת יותר חמצן של הבקבוק יכול לשנות את תנאי הניסוי ולהפחית עקביות בין זמני צמיחה של חיידקים-
  3. יום שני: עיקור של Microchannel SALVI
    הערה: כדי לקדם עקרות של מערכת צינורות, השלבים שדורשים ניתוק המזרק אבובים, החלפת עם מזרק חדש צריך להיעשות בתוך BSC. כדי לעשות זאת, פשוט לנתק את המזרק מהמשאבה מזרק ע י. סיבוב המחזיק מזרק מתכת, ולהביא את המזרק עם צינורות המחוברים BSC סטרילי. כאשר מערכת צינורות מוזכר בפרוצדורות, מתייחס המזרק המכיל המאגר נוזלי, מצורף עם מזרק polyetheretherketon (פיק) הצנרת PTFE, המחובר אל התא בטפטוף, שבו יש מזרק הצצה מתאים המצורפת כניסת SALVI אבובים, כמו גם מיכל עודפים זה לאורך צינור עודפים SALVI אטומה כדי.
    1. להשתמש במכשיר SALVI חדש ולצרף הצצה התאמה עם מזרק בקצה אחד של אבובים PTFE.
      הערה: התקנים SALVI מוכנות טריים עבור כל הבאים ניסוי הזיוף התקן המפורט בעלון המחקר הקודם ופטנטים. 5 , 6 , 8 , 15
    2. לקחת 2 מ של 70% אתנול לתוך מזרק ולהתחבר ההתאמה הצצה על SALVI. לאחר התחברות המזרק משאבת מזרק, הצמדת בשקע של SALVI בקבוק פסולת, לאפשר את הפתרון מים אתנול DI להריץ את SALVI ב µL/דקה 20 עבור ה 1.5
    3. לקחת 4 מ"ל של די סטיריליים מים לתוך מזרק וחבר לים של SALVI אותו. לאחר חיבור המזרק ל מזרק משאבה, לאפשר את המים כדי להריץ את SALVI ב μL/דקה 20 במשך לפחות 3 ח'
    4. בתוך BSC, פתח את המנה בנייר כסף מוכן בשלב 1.2.5 והתחבר זריקה הצצה סטרילי מתאים לסוף של מזרק 5 מ ל, אביזרי הצצה סטרילי עד הסוף של הצנרת מוסיקה. קח ~ 3 מ"ל של אמצעי סטרילי לתוך מזרק ולצרף הצינור מוסיקה. היפוך תא טפטוף מ ל ולהזריק, באמצעות מזרק סטרילי, מדיום הגידול אל החדר טפטוף עד שהוא מגיע הנפח הכולל של 1 מ"ל.
    5. חבר את הקצה של תא טפטוף של מזרק 5 מ ל לים של SALVI.
    6. קח 10 מ"ל של מדיום הגידול לתוך מזרק סטרילי וחבר לים צינורות טפטוף. לאחר חיבור המזרק ל מזרק משאבה, לאפשר המדיום להריץ את SALVI ב µL/דקה 20 במשך 12 שעות (או לילה). השתמש דבק כדי לאבטח את החלקים הבאים. מכסים את הבקבוק שקע עם נייר כסף או פרפין פלסטיק הסרט כדי למזער את ההסתברות של חלקיקי אבק ואורגניזמים הכלולים בו לזהם את המדיום. תיאור מפורט של איך צריך להיראות תוכנית התקנה זו ניתן למצוא איור 1 א'.
      1. לאפשר את צינורות טפטוף להיות אנכית, כלומר כי משאבת מזרק להניחה על משטח מוגבה עם טפטוף אבובים מאובטחת עם הקלטת, ועם את SALVI מאובטח על משטח שטוח שלהלן.
      2. לרוץ בינוני SALVI במשך 12 שעות על מנת להבטיח כי כל עקבות של אתנול הוסרו מן microchannel לצנרת של SALVI לפני מזריקים עם חיידקים.
      3. לקבלת הגנה נוספת, לשמור תא microchannel SALVI בתוך צלחת פטרי מעוקר, עם הצדדים לחתוך שתתאים את כניסת ו עודפים אבובים. בנוסף, לשמור את הקלטת תמיד על החלון כדי להגן על חטא ממברנה וערוץ לפני הדמיה ניתוח.
  4. היום שלושה: חיסון של Microchannel SALVI
    1. להסיר את המערכת כל צינורות (מזרק המחובר לטפטף קאמרית מחובר SALVI מחובר הבקבוק פסולת) משאבת מזרק ולהביא אותו BSC מעוקר. בנוסף, להסיר את המבחנה סרום שלב 2.2.5 מן החממה ולהביא אותו BSC.
    2. לנקות את השטח של פקק הבקבוק סרום עם 70% אתנול למנוע כל זיהום, ולאחר מכן השתמש מחט סטרילית עם מחט 22 גרם המצורפת כדי לחלץ 4 מ"ל של חיידקים מהבקבוק.
    3. לנתק את SALVI מן החדר 5 מ של לאורך צינור טפטוף, וחבר את המזרק בינונית חוסנו ישירות אל הים של SALVI. להשאיר את צינורות טפטוף בתוך מנה רדיד אלומיניום סטרילי או את BSC.
    4. לצרף את המזרק עם בקבוק SALVI ולשקע משאבת מזרק לפעול ב µL/דקה 20 עבור 3 h כדי לחסן את הערוץ של SALVI, תאפשר גם שינויים מרובים נפח הנוזל בתוך SALVI.
    5. לאחר חיסון, נתק את המזרק עם SALVI משאבת מזרק ולהביא את BSC. לאחר צירוף לים של SALVI בחזרה אל התא טפטוף מ ל מ שלב 2.4.3, קח 20 מ של מדיום הגידול לתוך מזרק סטרילי ולצרף לים צינורות טפטוף.
    6. להביא את הצנרור המצורפת את SALVI מ BSC המשאבה מזרק ולאפשר המדיום לעבור דרך הצנרת בשיעור של µL 2/דקה במשך שישה עד עשרה ימים, או עד הדמיה קרינה פלואורסצנטית (דנו בשלב 3) מציגה צמיחה חיובית biofilm גלוי ניתוח תוף-סימס. למלא בינוני טריים כמו שנגמר תוך BSC על ידי מחט סטרילית חדשה עם 10 מ"ל של מדיום הגידול וגם לצרף SALVI לאחר מדיום הגידול הקודם אזל.
      הערה: לאחר תחילת חיסון ב- µL 2/דקה, קצב הזרימה לא צריך להיות מוגברת או ירד, כמו שינוי קצב הזרימה ליצור הטיה-הלחץ בתוך הערוץ ולנתק את biofilm. זה קריטי כי זה קצב הזרימה לא צריך להיות שונה; כדי להתכונן לזה, ~ 24 h לפני סימס, להתבונן הצנרת מקרוב כדי לוודא שאין אין בועות כך שאין צורך לדחוף בינוני יותר בקצב מהיר יותר לאורך הצנרת.
      1. להימנע בועות במשחק microchannel, כפי שהם יכולים להגיד biofilm את התעלה. חשוב להיות זהירים של בועות בתוך התחתון של הצנרת טפטוף מ"ל 5 איפה זה מקשר הצנרור SALVI. בינוני טרי יכול להיות מוזרק לתוך סוף מזרק להציץ כדי להבטיח כי אין אוויר ייאלצו לתוך SALVI.

3. אופטי הדמיה של Biofilm בתוך Microchannel SALVI

  1. קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ הדמיה
    הערה: Shewanella בשימוש כאורגניזם מודל בתוך פרוטוקול זה הוא מוטציה לבטא GFP; ככזה, הוא אינו דורש מכתים. אם החיידק מחייבים מכתים, זה תמיד צריכים להיעשות-flowrate אותו (למשל, µL 2/min) כדי להימנע biofilm ניתוק. בנוסף, כאשר תאים ללכת ללא זמינות חומרי הזנה, הם ינותקו. לכן, אם כל מכתים נוספים נדרשת, הכתם צריך להיות מוזרק את מדיום הגידול במקום מים לפני הספקת כדי להכתים את התאים.
    1. לנתק את SALVI מ הטפטפת אבובים בתוך BSC ולסגור את SALVI על ידי לדפוק את המדידות הצצה אצבע-להדק את האיחוד הצצה.
    2. להקליט את הצנרת של התא microchannel SALVI בצורה מאובטחת לשקופית זכוכית, כך החלון הוא שטוח לחלוטין, פונה כלפי מעלה. הסר את סרט המגן של החלון. תהדק את השקופית לשלב של המיקרוסקופ על-ידי הצבת השקופית זכוכית בין המלחצות הבמה על הרציף.
    3. נמוך השלב של המיקרוסקופ כך בראש SALVI ממוקם קרוב מספיק לקצה של המטרה X 10, היכן, התאמה של המוקד לא יגרום העדשה לגעת החלון.
    4. מתג על תאורה אחורית, מצאו הערוץ באמצעות 10 x מיקרוסקופ המטרה על ידי התאמת את המוקד. בשלב זה, ודא כי הנוכחות של חיידקים מצורף אל החלון החטא של SALVI בולטת לעומת החלון של ערוץ הבקרה עם חיידקים לא חוסנו. עבור הדמיה קרוב יותר של תאים, לעבור המטרה 20 x. בהשוואה לערוץ SALVI ריק, הנוכחות של חיידקים צמוד לחלון צריך פלורסצנטיות ירוק חזק.
    5. לכבות את התאורה האחורית והפעל את מקור כספית מיקרוסקופ. לחכות 2-3 דקות, להחליף את המסנן FITC מוגדר על המיקרוסקופ תמונות תצוגה וללכוד biofilm צמוד לחלון. כדוגמה מה biofilm התבגר ייראה כאילו. כשתהיה מוכן, עיין באיור 1 C.
    6. התור לנתק את SALVI משקופית לסירוגין את מקור כספית. אם יש צורך, לצרף 2 µL/min זרימה בינונית פעם נוספת כדי לאפשר את הצמיחה יותר לפני הדמיה שוב, או להעביר את SALVI לשימוש הבלימה משנית לניתוח תוף-סימס. זה דרוש אם עובי biofilm הסתיימה לא להיות עבה מספיק, יותר זמן לצמיחה נדרש לפני ניתוח תוף-סימס. כדי לצרף לזרימה בינונית שוב, עיין שלב 2.3.6.
      הערה: אם תחזיר תחת זרימה בינונית, קרינה פלואורסצנטית הדמיה צריך לגמור שוב לפני ניתוח תוף-סימס.
      1. לתת biofilm מדיום הגידול להאכיל אותו עד תוף-סימס ניתוח יכול להתבצע. בזמן אינו מומלץ, במידת הצורך, SALVI סגורה ניתן לאחסן בתוך 4 ° C בלילה, אך צריך להיות מותר לחמם לטמפרטורת החדר לפני הוספת לתא ואקום של תוף-סימס. עם זאת, לנתח את biofilm מיד לאחר מנותקת זרימה בינונית לצמצום biofilm ניתוק.

4. תוף-סימס קירור והקפאה

הערה: סעיף זה מהווה סקירה כללית ונדון בפירוט רב יותר בתוך פרוטוקול קודמות שלנו המתארת מולקולת חלבון הספוחה סימס לאנליזה. 12

  1. להתקין SALVI אל החדר Loadlock תוף-SIMS
    הערה: צריך ללבוש כפפות בכל עת כאשר טיפול ההתקן SALVI והתקנתו על גבי תוף-סימס שלב כדי להימנע מציג הפוטנציאליים בעת משטח ניתוח.
    1. הר SALVI לבמה לתקן את זה עם כמה ברגים. ודא שגודל החלון החטא הוא על ידי התאמת בורג ההידוק, הוספת הסיליקון וופל חתיכות בתחתית תא microchannel PDMS. הסר את סרט המגן של החלון ולאחר מכן טען הבמה אל החדר loadlock תוף-סימס.
    2. פתח את loadlock תוף-סימס, החזק, את הבמה בצורה אופקית לרציף ההעמסה ולאחר לסגור את הדלת loadlock. ליזום את משאבת ואקום ולא לחכות כדי להבטיח נחש מתאים מתמלאת.
    3. להעביר את SALVI אל החדר המרכזי לאחר הוואקום מתייצב כדי mbar -7 עונה 1 פרק 10-
  2. עומק פרופיל ונקודות נתונים איסוף
    1. למצוא את הערוץ microfluidic באמצעות מיקרוסקופ אופטי המצויד בתוף-סימס.
    2. בחר במצב חיובי או שלילי לפני רכישת נתונים. שימוש 25 קוו Bi 3 + לשגר כמו קרן יון ראשי בכל המדידות, ולהשתמש את האקדח המבול אלקטרון כדי לנטרל. את פני השטח טעינה במהלך כל המדידות.
    3. סריקה קרן 3 + Bi עם דופק 150 ns רוחב על שטח עגול בקוטר של ~ 2 מיקרומטר עם 64 פיקסלים על ידי 64 פיקסלים. לאחר ניקוב דרך החלון חטא 100 ננומטר, המשך לסרוק עוד 150 s כדי לאסוף נתונים בעוצמה גבוהה עבור הדמיה. לאחר ניקוב-דרך, הסעיפים יגדל באופן משמעותי בתוך עומק פרופיל האזור. לאחר ייצוב, זה יכול להיות המכונה האזור בעוצמה גבוהה.
    4. Ns
    5. הקטן רוחב 50 עבור אוסף נתוני לרכוש ספקטרה עם רזולוציה טובה יותר מסה. המשך רכישה זו עבור עוד 200 ס
    6. חזור על שלבים אלה עבור איסוף חיובית לפחות שלוש שלוש נקודות נתונים שליליים.
      הערה: הקפד שטח האזורים אגרוף-דרך כך החלון חטא לא ישברו, לדלוף לתוך התא של שואב האבק מן נפרץ חלון תקינות.

5. ניתוח נתונים תוף-סימס

  1. כיול מסה באמצעות תוכנת IonToF
    1. לפתוח את התוכנה ניתוח של תוף-סימס (מדידה סייר) ולאחר מכן לחץ על " פרופילים ", " ספקטרה " ו " התמונה " לחצנים, בהתאמה, כדי תהליך עומק פרופיל, ספקטרום m/z ונתוני התמונה.
    2. פתח קבצי הנתונים שהושגו לאורך תוף-סימס חדרי קירור והקפאה-
    3. בחר את עומק פרופיל נתונים מעניינים, לבנייה מחדש של הספקטרום לפי הסדרה עומק פרופיל זמני.
    4. העיתונות " F3 " כדי לפתוח " המונית, כיול " חלון. לבחור פסגות לכיול בהתבסס על תרכובות כימיות אשר צפויים להתקיים במדגם מסוים.
  2. פיקס של עניין הבחירה
    1. כמו שיא הבחירה הוא הכרחי עבור דגימת, לקבוע פסגות האופיינית של המדגם על פי ספרות או ממצאים קודמים אחרים, אם בכלל. להשוות את עוצמת פסגות עניין ב ספקטרום m/z. אם יש צורך, להוסיף לשיאים חדשים או למחוק הפרעות פסגות ברשימה שיא.
    2. לחץ לשיא, למצוא את הקווים האדומים ליד החלון השמאלי התחתון. להזיז את הקווים האדומים כדי להקיף את פסגת כל.
    3. בחר לשיא תואמים את הנוסחה הכימית בחלון הראשי ספקטרום, ולאחר מכן לחץ על " להוסיף שיא " הכפתור מעל החלון. < /li >
  3. ייצוא של נתונים מכויל מסה
    1. כדי לייצא רשימה שיא, " שיא רשימת " בתפריט, בחר " להציל … " שיא ברשימה " itmil " תבנית.
    2. כדי לייצא פרופיל עומק, " פרופיל " חלון, לחץ על " קובץ " תפריט, ובחרו " לייצא ", ולאחר מכן בחר " שמירת " ". txt " קובץ.
    3. כדי לייצא קובץ ספקטרום m/z, " ספקטרה " חלון, לחץ על " קובץ " תפריט, ובחרו " לייצא ", ולאחר מכן בחר " שמירת " ". txt " קובץ.
    4. כדי לייצא קובץ תמונה, " התמונה " חלון, מסך להדפיס ולשמור בתור קובץ התמונה.

6. תוף-סימס התוויית נתונים והצגת

  1. להשתמש בכלי הגרפי כדי לייבא את הנתונים.
  2. להפוך מגרש באמצעות ז/ז כמו עוצמת x וציר שיא כמו ציר ה-y כדי להציג את הקשת המשוחזרת. דוגמה לכך ניתנת איור 2 א.
  3. לשלב שיחזר דו-ממדית (2D) תמונות של m שונה/z וטופס מטריצה להראות גם מיפוי יון חיובי או שלילי. דוגמה לכך ניתנת איור 2 B.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

התוצאות נציג לשרת כדי להראות איך לפרופיל כימי של biofilm המצורפת יכול להיות מזוהה לפרש, כפי שהושג דרך תוף-סימס. לאחר התוויית ספקטרה המונית של ייבוא נתונים תוף-סימס, מודגש בקצרה במקטע הליכים, זיהוי שיא וצריך להתנהל כדי להקצות זהויות לכל ערך מ בהתאמה/z. ניתן לבצע זאת באמצעות סקירת ספרות נרחבת על ספקטרומטר מסה על חיידקים, שברי כימית מסוימת כי צפויים להיות מתנה בתוך החיידק למד, כגון מים אשכולות שונים, חומצות שומן, חלבון שברי. 16 , 17 , 18 , 19 , 20 תוצאות נציג אלו מראות ספקטרום מסה שלילית בלבד כפי שהתקבל את biofilm oneidensis ס מר-1 ודגימת מים DI. פרשנות של ספקטרה חיובי בצע הליך דומה.

איור 1 א מציג את הכיוונון סכמטית לפי פרוטוקול זה כשמתרגלים ממבנה biofilm ב microchannel SALVI. בתפריט בצד שמאל למעלה, המזרק מחובר מזרק משאבה, אשר שומר בינוני זורם בקצב קבוע לאורך כל מערכת צינורות PFTE ובתוך את microchannel. משאבת מזרק ממוקמת מעל התא בטפטוף, אשר מונע לאחור זיהום למאגר בינוני כדי למנוע תאי האורגניזמים שוחה למעלה-stream. המדיום זורם מן המאגר קאמרית טפטוף ישירות לתוך הצנרת PFTE של SALVI, אשר מעביר את microchannel ולפנים לאורך צינור עודפים בקבוק אטום עודפים. הקווים המנוקדים הצבע מן החלון חטא על תמונה של התבגר oneidensis ס מר-1 GFP התאים שנתפסו על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, מפורט בשלב 3.1. איור 1 B מראה דוגמה של עקומת גדילה באמצעות האורגניזם מודל עבור פרוטוקול זה, מר ס' oneidensis -1. בין שלבי הצמיחה בגרף זה, ניתן להסיק שמקדם כי היומן-שלב הצמיחה מתרחשת בין 15-32 h בתנאים אלו הטיפוח-תרגול ספציפי. פרטים נוספים מן הגרף הזה מראה 0-15 h הוא שלב ההשהיה של צמיחה, 33-105 h מייצג את השלב נייח של צמיחה. איור 1 C היא תמונה רכשה עם מיקרוסקופ פלורסצנטיות המציג דוגמה ממבנה biofilm התבגר.

איור 2 א מציג את ספקטרום מסה שלילית של רטוב oneidensis ס מר-1 biofilm בתוך התעלה microfluidic, כפי שהתקבל ב באתרו נוזלי תוף-סימס. גרף זה מראה דוגמה של הטווח שנבחר המוני (מ/z 100-350) השוואה בין biofilm של מר S.oneidensis -1 ו- DI מים, האחרון היה מתקבל כפקד המערכת. איור 2 B מציגה השוואה של תמונות דו-ממד הפסגות של עניין מר-1 biofilm והמים DI מתקבל על ידי תוף-סימס. ברגע ניתן לזהות מעניין מ/z ערכים שכשלמדתי ספקטרום המוני, זיהוי פוטנציאל שיא של ערכים מ/z מיוחסות כראוי שברים כימי, נתמך על ידי סימס IonToF תוכנה ספרייה וספרות הסקר. פסגות עניין ב- איור 2A כוללים מים אשכולות (קרי, מ/z 107 (H2O)5או, 125 (H2O)6הו, 143 (H2O)7או-, 161 (H2 O)8או, 179 (H2O)9או, (H2O) 19710או, 215 (H2O)11או, 233 (H2O)12הו-, 251 (H2O) 13 או, 269 (H2O)14או, (H2O) 28715או, 323 (H2O)17או-, 341 (H2O)19או))9, כמו מסומן על ידי קווים אדומים מעל פסגות בהתאמה, חישת הקשורים תרכובות סמנים ביולוגיים (קרי, מ/z 175 C10H92), תוצרי לוואי EPS (מ/z 123 C2H4פו4-, P 159 2 O8H, 216 Cr2O7, 285 octadecanoethiols, תרכובות קוטבי 325, C12 קוטב תרכובות)15,16,18ולאחר שרשרת חומצת שומן קטעים (כלומר מ/z 127 [C2H3(CH2)3COO]-, חומצת שומן 255 C16:0, 279 חומצה לינולאית, C18H31O2, 325 C-21H-40O-2 -, 341 משטח שומנים, 18-MEA מאוגד באמצעות הצמדה thioester, חומצה סטארית C18H35O2, יונים של monoacylglyceryls של חומצה פלמיטית C-19H-17O-6 -). 16 , 19

מאז biofilm הוא hydrated, זה לא מפתיע כי כמה פסגות ראה במדגם biofilm דומים לאלה שנמצאו DI מים. בפסגות אשכול מים אלה מסומנים באמצעות קו אדום מעל כל שיא איור 2א, כולל מ/z 107, 125, 143, 161, 179, 197, 215, 233, 251, 269, 287, 323, ואת 341 המתאים (H2O)5או (H2O) 6 או (H2O)7או (H2O)8או (H2O)9או (H2O)10או (H2 O)11או (H2O)12או (H2O)13או (H2O)14או (H2O)15או- (H2O)17או (H2O)19הו-, בהתאמה. 9 מאחר השכיחות של אשכולות מים אופיינית רבים בספקטרום ההמוני הזה, התוצאה מספקת של ראיות חזקות של הסביבה אשכול מים כימית נוכח ממבנה biofilm רטוב. בנוסף, אשכול מים שאינם קשורים פסגות נצפו שני ספקטרה בדרך כלל ניתן לייחס כמו הפרעה פסגות, בדרך כלל מתוך PDMS, רכיב של הערוץ microfluidic. לדוגמה, פסגה הפרעה ידועה נפוצה אחת מן PDMS הוא ז/ז 137 במצב יון שלילי.

כאשר משווים את biofilm סימס המוניים ספקטרה לזה של מים DI, כפי שמוצג באיור 2א, קצת. פסגות אינם נוכחים בתוך המים DI, אך הם מופיעים biofilm. לדוגמה, הפסגה-מ/z 255 (CH3(CH2)14COO]-, חומצה פלמיטית) נוכח בעוצמה גבוהה במדגם biofilm, אבל בכלל לא במדגם מים DI. זה הייתי מציע c אותותהביתה מן את biofilm, קרוב לוודאי את biofilm ו/או EPS עצמי שלה. פסגות מעניינות רבות אותרו איור 2א. לדוגמה, EPS הקשורים פסגות כוללים מ/z 123-, יימצא C2H4פו4-, 159 (P2O8H), 216 (Cr2O7), 285 (octadecanoethiols), 325 (קוטב תרכובות, C 12 תרכובות הקוטב). 17 , 18 , 20 פסגות הקשורים עם חומצות שומן נמצאו 127 ([C2H3(CH2)3COO]), 255 (CH3(CH2)14COO]-, חומצה פלמיטית), 279 ([CH3 (CH2)15COO]-, חומצה לינולאית), 317 (ג21H33O2), 325 (ג21H40O2), 341 (ליפידים משטח, 18-MEA מאוגד באמצעות thioester הצמדה, חומצה סטארית C18H35O2-, יונים של monoacylglyceryls של חומצה פלמיטית C19H17O6). 16 , 19 . לבסוף, quinolone אות quorum חישה אות הקשורים שיא של C10H92 נצפתה ב מ/z 175.

איור 2 B מציג תמונות דו-ממד של ההתפלגות של ארבעה יונים מעניינים שונים בין S. oneidensis מר-1 biofilm (שורה עליונה) די מים (השורה התחתונה). הערך מ/z 107 ((H2O)5או) מציג מקבץ מים בעוצמה משמעותית בתוך הדגימות, הערך מ/z 175 (10H ג92) מתאר של חישת אות קשורים, מ/z 255 היא חומצת שומן (CH3(CH2)14COO]-, חומצה פלמיטית), ו- m/z 341 (ג21H41O2) עשוי לייצג שני קטעים השומנים ומים אשכולות עקב הדיוק המוני אמו 1. 9 אזורים בהירים יותר של תמונות דו-ממדיות מציינים ספירה גבוהה יותר של יונים מולקולרית נוכח בתמונה. כצפוי, אותות עבור QS מורכבות, שומנים היו הרבה יותר כמות בתוך המדגם biofilm. בעוד האות האשכול מים (מ/z 107) היתה חזקה יותר לאורך כל המדגם biofilm, היה גם נוכח דגימת מים DI, כצפוי. לבסוף, נמצאה האות ב מ/z 341 להיות הומוגנית בתוך המדגם biofilm, אבל מאד חלש בתוך דגימת מים DI. מ/z 341 היה לשיא אשכול מים, היה גם נציג של מספר חומצות שומן שונות ושומנים משטח. 16 נוכחותו חזק בתוך המדגם biofilm לאחר הנורמליזציה של נתונים מרמז כי הנוכחות של השומנים שברי עולה בהרבה על הימצאות מים אשכולות.

Figure 1
איור 1 : מפרטים טכניים ניסיוני. (א) מציג הסכמה ניסיוני של ההתקנה biofilm כפי שהוא מופיע בתוך המעבדה. אשר החל בחלק העליון השמאלי זורם בינוני מן המזרק (1), מחוברת משאבת מזרק (2), שליטה הקצב איזה מהלכים נוזלי דרך. חיצים מציינים את כיוון הזרימה במערכת כולה. המזרק (1) מחובר באמצעות מזרק הצצה שראוי הצנרת מוסיקה (4) (3). בינוני זורם דרך תא טפטוף (5) כדי למנוע זיהום, בסופו של דבר עובר SALVI (6) לגורם עודפים אטום (7). משאבת מזרק ממוקם במשטח מוגבה (9) כך תא טפטוף (5) יכול להיות בניצב משטח שטוח (8) זה SALVI (6) מועלה. עקומת צמיחה (B) עבור Shewanella oneidensis מר-1 בינוני "nanowires". זמן 0-15 h מייצג שלב ההשהיה, זמן 15-33 h מייצג שלב יומן, הזמן 33-105 h מייצג שלב נייח, וזמן 105 h או יותר מייצג שלב המוות. קווי שגיאה לייצג סטיית תקן. (ג) א תמונה של ממבנה biofilm התבגר רכשה עם פלורסצנטיות מיקרוסקופ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : השוואות של תוף-סימס שלילי ספקטרום של רטוב biofilm Shewanella oneidensis , מר-1 בינוני microchannel SALVI. (א) ז/ז סימס ספקטרום המונית של biofilm Shewanella oneidensis מר-1 בינוני ובמים DI. האחרון שימש פקד. הקווים האדומים מצביעים על מיקומים של פסגות אשכול מים אופיינית. (B) תמונה דו-ממדית השוואה של פסגות עניין בין biofilm DI מים. משמאל לימין, להציג תמונות מקבץ מים (מ/z 107 (H2O)5או), אות חישה/הורמון קוורום (מ/z 175,10H ג92), חומצת שומן (מ/z 255, [CH3(CH 2)14COO]-, חומצה פלמיטית), מבליטות את שברי ליפידים/EPS (מ/z 341, 18-MEA, C21H41O2). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

לאחר מזריקים בשלב-יומן, חשוב לבחון את מספר ימים ואת הטמפרטורה שבה תגדל biofilm לפני שזה בריא ועבה מספיק עבור הדמיה, כפי שמתואר בשלב 3.1. הליך זה מכסה במפורש culturing oneidensis ס MR1 biofilm בטמפרטורת החדר; עם זאת שונים בטמפרטורות החדר יכול להשפיע על קצב גידול. לכן, חיוני להשתמש הדמיה אופטית כדי להבין אם biofilm יהיה מוכן לפני שתמשיך תוף-סימס לניתוח. באופן דומה, זנים שונים של חיידקים דורש תנאי גידול שונים ואורך כדי להשיג עובי רצוי לניתוח. בעוד עקומת גדילה איור 1b מתארת יומן שלב 200 של החיידק להיות 12-32 h, השתמשו ב- 24 שעות ביממה לאורך כל ההליך, חשוב לציין כי הפעם לא יכול לשמש כשלב-יומן עבור זנים אחרים של חיידקים מבלי לבסס את עקומת גדילה באופן עצמאי. בעוד שלב יומן היה בין 12 ו- 33 h של צמיחה oneidensis ס, 24 שעות ביממה נבחר בשל העובדה כי זה היה בחלק של צמיחה איפה החמצן התחיל כדי להגביל את שיעור הצמיחה של האורגניזם, לקראת סוף שלב יומן. ניסויים הראו שהיה זה התאים הזמן החלו לייצר nanowires, ובכך בשלה כדי ליצור biofilms מוצלח יכול לשרוד בסביבות חמצן נמוכה. 3 , 13 . כתוצאה מכך, הפעם בחרת להשתמש החיידקים בשלב יומן צריך להיות מושפע מחקר ידע וניסיון שנצבר מן הספרות על מחקר ניסיוני של החיידק נחקר. בנוסף, עקומת גדילה נפרד יש להקים להבין את היומן-השלב עבור כל זנים שונים של חיידקים אשר ישמשו לצמיחה biofilm שימוש בגישה זו. שיעור הצמיחה µL 2/min היה מחושב כל כך כמו שלא יעלה על מרבית-קצב הגידול oneidensis ס מר-1, ואת הזמן הכולל נבחר לצאת ממבנה biofilm בוגרת זה לא היה מגודל ונוטים ניתוק. המחירים הללו ניתן להתאים בהתאם לידע של חיידקים שונים לשימוש עם תוכנית התקנה זו.

כמה מגבלות לשימוש SALVI לצמיחה biofilm כוללים של ביופילמים בתוך התעלה, כמו גם את ההסתברות של חיידקים כדי לצרף הקירות שטוח של הערוץ. למרות הצמיחה בקצב קבוע, מומלץ להיות 2 µL דקות בתוך פרוטוקול זה, של ביופילמים יכול להתרחש עדיין אם biofilm מותר לגדל יותר מדי זמן. במקרה כזה, ללא אזהרה, biofilm יכול לנתק מן החלון ולצאת SALVI את כדי הכלילה עודפים. של ביופילמים יכול להתרחש גם פשוט על-ידי הוספת כוח מכני (כלומר, עובר) SALVI, אשר לא ניתן להימנע מכך. עם זאת, זה יכול להישמר בבדיקת על-ידי הצגת את הקובץ המצורף של biofilm החלון חטא לפני ניתוח תוף-סימס תחת מיקרוסקופ אור. מגבלה אחת כוללת את החלקות של microchannel PDMS אשר יכול להקשות על חיידקים מסוימים לצרף. עם זאת, זה יכול להשתנות בעיצוב של SALVI כדי להכיל על-ידי יצירת קצוות משונן לערוץ, אם המצורף של החיידק הוא בעיה. לבסוף, ספירת יכול להיעשות במקום600 קריאות OD נחישות עקומת הגדילה. לדוגמה, מחקרים הראו קורלציה ישירה ועקבית של ספירת כדי קריאות OD600 . 21 . לפיכך, OD600 נחשבת מספיקות להערכת biofilm צמיחה.

המגבלות טכניקה זו הם מעטים, כמו SALVI משמש בעיקרו לצלחת תרבות שבו יש הרבה רב-תכליתיות לשימוש ביישומים רבים, כמו למשל anaerobically בתוך תיבת כפפה או בתוך תא סביבתיים בכל טמפרטורה מבוקרת. כמה מגבלות קלות כוללות חדר בלתי נשלט תנאים כגון לחות, טמפרטורה, מיקום ליד אור השמש, אשר עדיין ניתן יהיה לאכלס, תנאים לצמיחה אופטימלית של חיידקים ספציפיים לכל. בנוסף, חלק מן האתגרים הטכניים הללו ניתן להתגבר עם אינקובטור עם טמפרטורה או תכונות RH תיווך בכיוונון biofilm.

SALVI הוא ממשק התואם לואקום microfluidic. בעבודה זאת, השתמשו 200 x 300 µL microfluidic ערוץ תרבות biofilms ואחריו עם סימס אופטי ולא נוזלי הדמיה. נוזלים להציג אתגר טכני ללמוד באמצעות טכניקות בסיס ואקום, כי הם תנודתי וקשה לשמור בשלב נוזלי בואקום. ובכך ואקום טכניקות כגון תוף-סימס היה מוגבל באופן מסורתי הקפאה ויבש רק דוגמאות. 22 . בנוסף, SALVI יכול לשמש עבור הדמיה מגוונות וספקטרוסקופיה תוך שימוש במגוון טכניקות במיקרוסקופ וספקטרוסקופיה. 4 , 9 הקבוצה שלנו עבד להתרחב כל העת SALVI ביישומים שונים בחיי עיר ניתוח של נוזלים וממשקים נוזלי אחיד. 15 , 23 , 24 שלנו מאמץ זה התבצעה ביעילות הראו חיידקים מצורף למוח חטא. 9 לאחר מצורף הראשונית, זרימה מתמדת של בינוני במשך הזמן הוכח לטפח בהצלחה ממבנה biofilm ישירות על החלון החטא של SALVI. במהלך תוף-סימס, קרן יון ראשי משמש שיפציץ חורים של 2 מיקרומטר בקוטר. ממד זה דומה אורך תא biofilm צמוד לחלון חטא, ובכך לספק פרופיל כימי של biofilm ב microenvironment רטוב באופן טבעי שלה. זה מאוד חשוב בשל הפרש של זהות כימית ממבנה biofilm, נוכחות של EPS, וסביבה אשכול של מים בהשוואת biofilms במצבו רטוב עם דגימות מיובשים. 9 ללא שימוש SALVI, תוף-סימס יכול רק להתנהל על דגימות הקפאה ויבש, מתן מיפוי כימי נכשל כדי ללכוד את פרופיל כימי של מדגם hydrated במצבו הטבעי.

כפי שמוצג באיור 1א, חשוב לשמור את משאבת מזרק מעל לאורך צינור טפטוף תאפשר גם לאורך צינור טפטוף להיות בניצב microchannel SALVI. בנוסף, בועות יהיה פחות סביר להניח הופכים לכוד בתוך הצנרת של המכשיר, אם הצנרת PFTE עודפים (בתוך הבקבוק outlet) הוא נמוך יותר מאשר לאורך צינור כניסת (המחובר אל התא הטפטוף). עוד צעד קריטי של טיפוח החיידקים לצמיחה SALVI הוא קודם לקבל עקומת גדילה של המתח חיידקים מסוימים אשר ישמשו, כפי שמתואר בתוך שלב 1.3. ניתן לבצע זאת על ידי קבלת עקומות גדילה עם מדידות צפיפות אופטית. עקומת גדילה, כפי שמוצג באיור 1B, חשוב להבנת את מסגרת הזמן שבו חיידקים יהיו בתוך השלב-היומן של צמיחה, כאשר ניתן להניח כי החיידקים הם הבריא. ניצול חיידקים בתוך השלב הזה של הצמיחה מקלה על יצירת microenvironment biofilm בריא ומבטיחה biofilm יגדל בקצב הצפוי. Microchannel SALVI הוא מעוקר הטמפרטורה בחדר עם 70% אתנול ומים DI, כפי שהוא לא יכול להיות בלוק עבור עיקור לפני השימוש עם תוף-סימס. זה בשל העובדה כי autoclaving יכול לגרום נזק לחלון של SALVI והן להציג את אדי מים לערוץ. אחרי כמה ימים של צמיחה, יש לבדוק את microchannel עם פלורסצנטיות מיקרוסקופ כדי לאמת את הקובץ המצורף חיידקי. דוגמה לכך ניתן למצוא איור 1C, תמונה זו צולמה להראות ממבנה biofilm התבגר. בשל נתיב הזרימה של המדיום, החיידקים יותר בחיוב מצרף, גדל לאורך קצות microchannel, לפי מיקום זה הוא זרימת וכוחות הטיה איפה lowest.

לסיכום, SALVI הוא שיטה מצוינת עבורם כדי biofilms תרבות ולמידה באמצעות בחיי עיר מיפוי כימי, שכן היא מאפשרת למתן את החיים biofilm במצבו הטבעי רטוב מבוססי וואקום הדמיה ספקטרומטר מסה. גישה ייחודית זו יכול לספק מידע נוסף אודות ממבנה biofilm מים אשכול microenvironment, כמו גם באשר לרכוש הבנה מעמיקה יותר של תוצרי לוואי שלה EPS. מידע זה יכול לשמש כדי להבין ממבנה biofilm פעילויות ביולוגיות, והוא יכול להיות מנוצל ביישומים שונים כגון וההתערבות, הנדסה ביו-רפואית, חקלאות, תעשייה מחקר ופיתוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנחנו אסירי תודה לקרן של הארץ הפסיפי הלאומי מעבדה (PNNL), מדעי הביולוגיה (EBD) המשימה זרע מעבדה מכוונות למחקר, פיתוח (LDRD) עבור תמיכה גישה אינסטרומנטלית סופק באמצעות הצעה משתמש כללי W. R. ויילי סביבתיים מולקולרית מדעי מעבדה (EMSL). EMSL הוא מתקן משתמש מדעיים לאומיים בחסות את Office הביולוגיים ואת הסביבה מחקר (בער) ב- PNNL. המחברים תודה ד ר Yuanzhao דינג הוכחה לקרוא את כתב היד, מתן משוב שימושי. PNNL מופעל על ידי Battelle על האלמונית תחת חוזה דה-AC05-76RL01830.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ToF-SIMS IONTOF TOF.SIMS 5 Resolution:>10,000 m/Δm for mass resolution;>4,000 m/Δm for high spatial resolution
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) Pacific Northwest National Laboratory N/A SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level.
-80°C Freezer New Brunswick Scientific N/A U410 Premium Energy Efficient Ultra-Low Temperature Freezer
4°C Refrigerator BioCold Scientific N/A COLDBOX1
Orbital Shaker New Brunswick Scientific N/A Innova 4900 Multi-Tier Environmental Shaker, set at 30 degrees Celsius for serum bottle and flask culturing, set at 150rpm.
Syringe Pump Cole-Parmer EW-74905-02 Cole-Parmer Syringe Pump, Infusion Only, Touchscreen Control 74905-02, used for injecting liquid into the tubing system and SALVI at a constant flowrate.
Incubator Barnstead International LT1465X3 Lab-Line incubator, set at 30 degrees Celsius for plate culturing.
Autoclave Getinge 533LS Used to sterilize PEEK fittings, tubing systems, serum vials, and medium. Model 533LS Vacuum Steam Sterilizer
Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific 4001-000 GENESYS 20 spectrophotometer for OD600 readings of cuvettes for growth curves.
Biological Safety Cabinet Thermo Fisher Scientific 1385 1300 Series AZ Biological Safety Cabinet
Fluorescence Microscope Nikon N/A Nikon OPTIPHOT-2 fluorescence microscope with camera and super high pressure mercury lamp power supply.
pH Meter Mettler Toledo 51302803 Used to test the pH of the “nanowires” medium after finished and before autoclaving.
PEEK Union Valco ZU1TPK For connecting the inlet and outlet of SALVI, the syringe to the tubing system, and the inlet of the SALVI to the drip chamber of the tubing system.
5 Axes Sample Stage IONTOF N/A Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS.
Barnstead Nanopure Water Purification System Thermo Fisher Scientific D11921 ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716)
Pipette Thermo Fisher Scientific 21-377-821 Range: 100 to 1,000 µL.
Pipette Tip Neptune 2112.96.BS 1,000 µL pipette tips
Razor Blade Handle Stanley N/A Stanley Bostitch Razor Blade Scraper with 5 Single-Edge Blades, used for cutting PTFE tubing
Syringe BD 309659 1 mL
Syringe BD 309657 3 mL
Syringe BD 309646 5 mL; Used for making the drip chamber
Syringe BD 309604 10 mL
Syringe BD 302830 20 mL
Disposable Pipette Thermo Fisher Scientific 13-678-11 25 mL Fisherbrand™ Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe, for filling serum bottles.
Electric Pipette Filler Pipet-aid P-57260 Vacuum pressure electric serological pipette filler
Serum Bottle Sigma 33109-U Holds approximately 69 mL of liquid for culture growth, optimum for use of 20mL culture per bottle.
Anaerobic Culture Tube VWR 89167-178 Anaerobic Tubes, 18 x 150 mm, Supplied with 20 mm Blue Butyl Rubber Stopper and Aluminum Seal.
Rubber Stopper Sigma 27235-U Silicone stopper, used for sealing serum bottles and for creating the tubing system/drip chamber.
Aluminum Crimp Seal (without septum) Sigma 27227-U Aluminum seal for top of serum bottle for use with serum bottle crimper.
Serum Bottle Aluminum Seal Crimper Wheaton 224307 30 mm crimper with standard seal.
PTFE Tubing Supelco 58697-U 1.58 mm OD x 0.5 mm ID 50 ft. PTFE Teflon tubing, used for creating the tubing system.
Disposable Cuvettes GMBH 759085D 1.5 Ml for use with spectrophotometer.
Needle BD 303015 22G; used for serum bottle injection.
Needle BD 305120 23G; used for punching-through rubber stopper to create drip tubing system.
Shewanella oneidensis MR-1 with GFP N/A N/A Matthysse AG, Stretton S, Dandie C, McClure NC, & Goodman AE (1996) Construction of GFP vectors for use in Gram-negative bacteria other than Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 145(1):87-94. 
Ethanol Thermo Fisher Scientific  S25310A 95% Denatured
TSA BD 212305 Tryptic soy agar for culturing the model organism (S. oneidensis) used in this protocol
PIPES Buffer Sigma P-1851 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Hydroxide Sigma S-5881 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Ammonium Chloride Sigma A-5666 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Potassium Chloride Sigma P-4504 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Phosphate Monobasic Sigma S-9638 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Chloride Thermo Fisher Scientific S271-3 Used for “nanowires” medium, and used to make mineral solution used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium lactate Sigma L-1375 60%(w/w) syrup @ 98% pure, d=1.3 g/mL, 7M, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Bicarbonate Sigma S-5761 Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nitrilotriacetic Acid Trisodium Salt Sigma N-0253 Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron (III) Chloride Sigma 451649 Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Magnesium Sulfate Sigma 208094 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Manganese (II) Sulfate Monohydrate Sigma M-7634 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron(II) Sulfate Heptahydrate Sigma 215422 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Calcium Chloride Dihydrate Sigma 223506 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Cobalt(II) Chloride Sigma 60818 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Zinc Chloride Sigma 229997 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Copper(II) Sulfate Pentahydrate Sigma C-8027 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Aluminum Potassium Sulfate Dodecahydrate Sigma 237086 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Boric Acid Sigma B-6768 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Molybdate Dihydrate Sigma 331058 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nickel(II) Chloride Sigma 339350 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Tungstate Dihydrate Sigma 14304 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Biotin Sigma 47868 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Folic Acid Sigma F-7876 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Pyridoxine Hydrochloride Sigma P-9755 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Riboflavin (B2) Sigma 47861 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thiamine Hydrochloride Sigma T-4625 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nicotinic Acid Sigma N4126 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Pantothenic Acid Hemicalcium Salt Sigma 21210 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Vitamin B12 Sigma V-2876 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
4-Aminobenzoic Acid Sigma A-9878 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thioctic Acid Sigma T-1395 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Renner, L. D., Weibel, D. B. Physicochemical regulation of biofilm formation. MRS Bull. 36, (5), 347-355 (2011).
  2. Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8, (9), 623-633 (2010).
  3. Aldeek, F., et al. Patterned hydrophobic domains in the exopolymer matrix of Shewanella oneidensis MR-1 biofilms. Appl Environ Microbiol. 79, (4), 1400-1402 (2013).
  4. Hua, X., et al. In situ molecular imaging of a hydrated biofilm in a microfluidic reactor by ToF-SIMS. Analyst. 139, (7), 1609-1613 (2014).
  5. Yu, X. Y., Yang, L., Cowin, J. P., Iedema, M., Zhu, Z. Systems and methods for analyzing liquids under vacuum. US Patent. (2013).
  6. Yu, X. Y., Liu, B., Yang, L., Zhu, Z., Marshall, M. J. Microfluidic electrochemical device and process for chemical imaging and electrochemical analysis at the electrode-liquid interface in situ. US Patent. (2014).
  7. Yang, L., Yu, X. Y., Zhu, Z. H., Thevuthasan, T., Cowin, J. P. Making a hybrid microfluidic platform compatible for in situ imaging by vacuum-based techniques. J Vac Sci Technol A. 29, (6), (2011).
  8. Yang, L., Yu, X. Y., Zhu, Z. H., Iedema, M. J., Cowin, J. P. Probing liquid surfaces under vacuum using SEM and ToF-SIMS. Lab Chip. 11, (15), 2481-2484 (2011).
  9. Ding, Y., et al. In Situ Molecular Imaging of the Biofilm and Its Matrix. Anal Chem. (2016).
  10. Yang, J., Ghobadian, S., Montazami, R., Hashemi, N. Proceedings of the Asme 11th Fuel Cell Science, Engineering, and Technology Conference, 2013. (2013).
  11. Yu, F., Wang, C. X., Ma, J. Applications of Graphene-Modified Electrodes in Microbial Fuel Cells. Materials. 9, (10), (2016).
  12. Yu, J., Zhou, Y., Hua, X., Zhu, Z., Yu, X. Y. In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS. J Vis Exp. (108), e53708 (2016).
  13. Hill, E. A. Effects of Electron-Transport-System Impairment on Hydrogen Gas Production by the Bacterium Shewanella oneidensis MR-1. Washington State University. Master's thesis (2007).
  14. McCormick, A. J., et al. Biophotovoltaics: oxygenic photosynthetic organisms in the world of bioelectrochemical systems. Energy Environ Sci. 8, (4), 1092-1109 (2015).
  15. Liu, B., et al. In situ chemical probing of the electrode-electrolyte interface by ToF-SIMS. Lab Chip. 14, 855-859 (2014).
  16. Keune, K., Hoogland, F., Boon, J. J., Peggie, D., Higgitt, C. Evaluation of the "added value" of SIMS: A mass spectrometric and spectroscopic study of an unusual Naples yellow oil paint reconstruction. Int J mass Spectrom. 284, (1-3), 22-34 (2009).
  17. Lee, M. Mass Spectrometry Handbook. John Wiley & Sons Inc. 988 (2012).
  18. Petrovic, M., Barcelo, D. Determination of anionic and nonionic surfactants, their degradation products, and endocrine-disrupting compounds in sewage sludge by liquid chromatography/mass spectrometry. Anal Chem. 72, (19), 4560-4567 (2000).
  19. Vickerman, J. C. Molecular Imaging and Depth Profiling by Mass Spectrometry--Sims, MALDI or DESI. Analyst. 136, (11), (2011).
  20. Weng, L. T., Bertrand, P., Stonemasui, J. H., Stone, W. E. E. Tof Sims Study of the Desorption of Emulsifiers from Polystyrene Latexes. Surf Interface Anal. 21, (6-7), 387-394 (1994).
  21. Peñuelas-Urquides, K., et al. Measuring of Mycobacterium tuberculosis crowth. A correlation of the optical measurements with colony forming units. Braz J Microbiol. 44, (1), 287-289 (2013).
  22. Dohnalkova, A. C., et al. Imaging hydrated microbial extracellular polymers: comparative analysis by electron microscopy. Appl Environ Microbiol. 77, (4), 1254-1262 (2011).
  23. Yang, L., et al. In situ SEM and ToF-SIMS analysis of IgG conjugated gold nanoparticles at aqueous surfaces. Surf Interface Anal. 46, 224-228 (2013).
  24. Yu, J. C., et al. Capturing the transient species at the electrode-electrolyte interface by in situ dynamic molecular imaging. Chem Commun. 52, (73), 10952-10955 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics