原位萨尔和 TOF-SIMS希瓦氏菌 oneidensis MR1 生物膜的表征

Chemistry

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Summary

这篇文章提出了不断增长的生物膜的原位飞行时间二次离子质谱的研究化学的映射在其水化状态下,由微流控反应器,在液体真空接口分析系统启用的方法。希瓦氏菌 oneidensis先生-1 与绿色荧光蛋白作为一种模型。

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Komorek, R., Wei, W., Yu, X., Hill, E., Yao, J., Zhu, Z., Yu, X. Y. In Situ Characterization of Shewanella oneidensis MR1 Biofilms by SALVI and ToF-SIMS. J. Vis. Exp. (126), e55944, doi:10.3791/55944 (2017).

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Abstract

细菌生物被膜表面相关的社区大大研究了解他们自身产生的胞外聚合物 (EPS) 和在环境微生物学中的作用。本研究概述了培养生物膜附着到对系统进行分析在液体真空接口 (萨尔) 和飞行时间二次离子质谱 (TOF-SIMS) 实现原位化学映射的生活生物膜的方法。这样做是通过培养细菌外和内萨尔维通道与我们专门的安装程序,并通过光学成像技术来检测生物膜的存在和 TOF-SIMS 分析前的厚度。我们的研究结果表明希瓦氏菌生物膜的特征峰在其自然的水合状态,突出其本地化的水群集环境中,以及 EPS 片断,它们是截然不同的同一生物膜脱水状态。这些结果表明基于真空化学成像仪原位生物膜成像允许的萨尔的突破能力。

Introduction

细菌生物被膜表面相关社区给细菌提供生存变不利的物理和机械刺激,其中细胞都能够重视,并在许多可能的环境中生存的防御随着时间推移逐渐形成了。1,2生物膜大大调查和在生物医学、 生物医学工程、 农业和工业研究和发展等很多领域有应用。1,2理解这些复杂的微生物群落,包括他们自身产生的胞外聚合物 (EPS) 和他们的当地水-群集环境中,化学图谱至关重要获得准确和详细其生物活动的描述。2

生物膜存在,但在高度水化状态的成长。这带来一个巨大的挑战,在使用基于真空的表面分析技术,如飞行时间二次离子质谱 (TOF-SIMS) 由于研究挥发性液体在真空中的困难。因此,基于真空的表面分析技术已几乎完全限于研究生物膜的样本,只是他们干的状态。然而,研究其干州生物膜抑制准确调查其真实的生物微环境。它常常引起 EPS 完整性和生物膜形态,比较干膜质谱结果到原位液体研究后证明了剧变。3,4这篇文章提出了一个解决方案利用我们的系统用于分析在液体真空接口 (萨尔),56微流控反应器研究生物膜内他们自然的水合状态,包含在其薄硅氮化 (SiN) 膜在微通道的聚二甲基硅氧烷 (精原细胞瘤),从而同时仍保持在真空内的液体矩阵的结构完整性提供直接访问二次离子探针光束下的液态分庭。7,8

S.oneidensis先生-1 突变表达绿色荧光蛋白 (GFP) 被选为模式生物的由于其代谢的多功能性和共同使用的环境和应用微生物学,基于此生物膜过程图很大程度上金属还原和胞外电子转移的独特能力。9,10,11此外,绿色荧光蛋白的存在允许容易连续生物膜-厚度监测通过荧光显微镜、 荧光素异硫氰酸酯 (FITC) 筛选器使用。我们以往的研究表明倾向于使用在原位荧光成像技术对生物膜的生长厚度达 100 微米的罪窗口的附件此细菌的证据。4,12虽然本文将只讨论通过荧光显微镜观察生物被膜的存在的确认,萨尔维是兼容其他光学超分辨成像方法荧光成像 (即结构照明显微镜 (SIM)9) 和共焦激光扫描显微镜 (CLSM) 成像4)。光学成像可以作为衡量生物膜厚度,并获取三维图像的生物膜的形状看来,确认其厚度和其附件罪窗口。9虽然 GFP 用于 SIMS 分析, S.oneidensis没有绿色荧光蛋白用作这唯一所需测量的光学密度的生长曲线,并不需要作任何荧光成像。一般来说的区别 GFP 标记和未加标签的造林树种生长曲线是微不足道。此外,虽然本议定书使用美国 oneidensis先生 1 GFP 作为模式生物来描述过程,此过程旨在为任何可能需要在萨尔内培养的细菌菌株。虽然鉴于菌株所需的知识,一些生长条件,如时间、 温度和氧气环境可能需要修改,以适应的菌株,用于。对于生长介质,此过程使用"纳米"中等、 胰酪胨大豆肉汤 (TSB) 葡萄糖,而胰酪胨大豆琼脂 (TSA) 葡萄糖不培养。"纳米"培养基的组成已专门制定了为增长和监测膜扩展和美国 oneidensis出现初具规模的小电线及培养基成分质已在以往的研究内设立。13,14

我们以前的协议,在原位上液体 TOF-SIMS 阐释了萨尔维已为蛋白质固定化和罪恶,以及 TOF-SIMS 分析和数据减少详细的议定书的附件提供的好处。12 ,而不是重申数据减少步骤,本文将有助于集中精力建立和培养生物膜内我们萨尔维微通道,以及成像的步骤来检测生物膜的存在和厚度事先的独特方法TOF-SIMS 分析。而生物膜有以前仅限于只干燥样品内室基于真空的表面分析技术,详细的 EPS 和生物膜化学映射的活生物膜现在可原位由于这一新功能。

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Protocol

1.制备的材料

  1. 介质油管制备
    1. (一个需要每个生物膜文化和三个需要每生长曲线) 的血清瓶
      注: 引进、 任何成长所述中等适宜提供所需的感兴趣的菌株营养可以用于此过程;在这种情况下," 纳米线 " 媒体和 TSB 没有葡萄糖培养基被用于 美国 oneidensis 先生 1 GFP 的增长。 13
      1. 存款 20 毫升的增长中进了一个 70 毫升血清瓶,盖塞子和卷曲的瓶子。顶上,用一块干净无菌铝箔。
      2. 热压罐瓶与液体循环 30 分钟在 121 ° C.随后存储在室温无菌的血清瓶。
    2. 厌氧培养管
      1. 5 毫升的生长介质存入厌氧培养管空气顶空,穿上塞子,卷曲瓶。顶上,用无菌铝箔。
  2. 制备泡沫陷阱油管
    1. 仔细用 22 号针头,冲压一个洞通过血清橡胶瓶塞。
    2. 在 1/32 的削减 20 " 聚四氟乙烯 (PTFE) 管材用剃刀这样段管的一端是尖。
    3. 使用尖头,线程聚四氟乙烯管材通过顶部的橡胶塞的洞。推动管,直到大约 2 厘米是通过塞子,用一把剃刀,有平坦的端部切的聚四氟乙烯管尾端。
    4. 删除 5 毫升注射器柱塞和橡胶塞子从步 1.2.3 融入开放注射器末端。聚四氟乙烯管 2 厘米年底是注射器筒内。这是泡沫陷阱。
    5. 包装泡沫陷阱 (聚四氟乙烯管、 橡胶塞子和注射器) 在步 1.2.4 用铝箔和安全与高压釜磁带。高压釜的铝箔包消毒油管与重力循环在 121 ℃ 30 分钟存储在室温密封的铝箔包直到准备使用在步骤 2.4。
  3. 细菌生长曲线
    注: 此协议使用 美国 oneidensis 先生 1 GFP 作为模式生物生长的生物膜在萨尔维。然而,此过程可以调整,以适应日益增长的有氧或厌氧其他细菌。根据使用的应变,生长时间和环境可能需要作相应的调整。
    注:-80 ° C 细菌冰箱股票包括 1:1 混合而成的 TSB 没有葡萄糖和甘油。增长曲线示例 图 1 B 所示,制得 TSB 发酵用没有葡萄糖转移在各自 0.2 毫升数量三倍到 70 毫升血清瓶用 20 毫升 " 纳米线" 的介质去除 TSB 的痕迹。但是,本议定书假定只有一个生长介质将被使用,并不会进行后续转让,因为这通过这些特定的介质解决方案 S.oneidensis。尽管不在本议定书中概述了,像这样的额外转让建议因为最初沉积到丰富 TSB 细菌有助于恢复; 冻存的细胞和三个后续传送到 " 纳米线 " 确保所有 TSB 走了,和典型的生长动态正在发生。
    1. 接种发酵
      1. -80 ° C 冰箱去除细菌甘油股票和温暖与戴手套的手,尽可能快地解冻股票。这冰箱股票转向生物安全柜 (BSC)。
      2. 内平衡计分卡,使用附加到转移到含 5 毫升的生长介质与没有葡萄糖,准备在步 1.1.2 上限和卷曲的厌氧培养管中 0.1 毫升的冰箱股票 22 G 针 1 毫升注射器。处置的适当生物废物在一个容器中,再冷冻冰箱存货可能休克细胞。
      3. 孵育发酵在摇床/孵化器在 30 ° C 在 150 轮调,每分钟 (转速 rpm),一定要在 600 毫微米 (OD 600) 阅读时准备好使用光学密度。记录时间的增长和 OD 600 这样可以在相同的时间为每个后续的使用,这样的结果是可重现。作为一个例子,这种起动器文化是允许增长 15 个小时和在大约 1.0 OD 600 使用。
    2. 接种生长介质
      1. 把编写的步骤 1.1.1.2 及发酵制备 1.3.1.3,在三种血清瓶,带给两个平衡计分卡到。
      2. 内平衡计分卡,分别用 22g 针连接,起动器文化 0.1 毫升的溶液转移到每个血清瓶,无菌 1ml 注射器。
      3. 杀菌顶部的血清瓶用 70%乙醇中,盖上无菌的铝箔,相应,标识和转移到摇床在孵化器内。设置轨道振动筛为 150 rpm 并将孵化器设置为 30 ° C.孵育直到第一个 OD 600 数据点被内步 1.3.3。
    3. 获得 OD 600 数据点
      1. 备空白存放 100 μ L 过滤灭菌蒸馏水去离子 (DI) 的水入无菌试管。包装塑料石蜡膜周围的试管顶部的水会不会受到污染。储存在室温。使用此值为空与紫外/可见分光光度计在采取任何增长曲线的数据点通过插入试管,按之前 " 空白 ".
        注: 每 48 小时一个新空白应该准备避免不正确的阅读,因为好的做法是定期更换一片空白。
      2. 每个 OD 600 数据点,删除血清瓶准备步骤 1.3.2.3 节从孵化器和转移到无菌的平衡计分卡中。从每个血清瓶和存款分为三个分别标有不育小试管取 0.1 毫升的接种。
      3. 下料后, 插入试管包含着文化到紫外可见 (UV/Vis) 分光光度计读取 OD 600 人在一段时间,和记录该时间点的所有三个读数。
        注: 美国 oneidensis 先生-1,数据点分别在 1、 14、 28、 32、 41、 57、 81 和 105 h 后接种。当细菌已完成死亡阶段,增长已完成。如果有特定的生长时间和趋势在本议定书中使用的细菌是缺乏知识,应该相应地调整这些点。如果还有增长趋势的不确定性,点应收集的数据更加频繁,例如,第一次 12 小时,随后 36 h,以下 100 小时,每隔 12 小时和 24 小时间隔为最后 124 h.每六小时每三个 h
      4. 使用 OD 600 数据点为 y 轴,将时间作为 x 轴,绘制曲线与标准偏差误差线使用绘图软件的每个时间点采取三个点的平均值。S.oneidensis 先生-1 生长曲线显示在 图 1B 代表结果部分。
      5. 使用在步骤 1.3.3.4,准备的图表确定的生长曲线的日志阶段部分时间范围。对于 希瓦氏菌,这是增长的间 12 和 33 h;因此可以推断的是,在经济增长的 24 小时,希瓦氏菌 将内生长,其日志阶段假设将体外细菌培养使用同一媒体和治疗被用于生长曲线的使用前。

2。培养的细菌

  1. 第一天: 接种琼脂平板
    注: 本节的程序用琼脂糖解放军te 在日志阶段,而不是用于生长曲线的液体发酵剂文化采取一集落形成单位 (CFU)。这可以假设,没有葡萄糖 TSA 使用并随后转入重现相同的生长条件," 纳米线 " 介质中的生长曲线程序和 TSA 已包括 TSB 的成分相同。
    1. S.oneidensis 先生 1 GFPbacteria 股票去除-80 ° C 冰箱和地方入冰桶,放置这个水桶内消毒平衡计分卡。
    2. 内平衡计分卡,使用无菌接种 1 µ L 接种环表面的冷冻的细菌股票擦伤并使用循环到 T-条纹琼脂糖凝胶板的表面。
    3. 后密封塑料石蜡膜板的两侧,反转板并将存储在一个 30 ° C 的孵化器,为 24 小时,直到各自的殖民地出现。
  2. 二天: 接种血清瓶
    1. 从孵化器中删除板和在平衡计分卡内打开。
    2. 内平衡计分卡,清洁表面上制备的血清瓶橡胶塞从步 1.1.1 用 70%乙醇在 DI 水。
    3. 从琼脂平板选择单个菌落和使用无菌注射器与附加 22 标准尺的针、 存款足够增长媒体把盘子从殖民地没有触及任何相邻的殖民地和混合殖民地与介质的提示针.
      注: A 单独殖民地的选用应该是足够的距离其他细菌在盘子里,这样介质可以沉积到它没有触及任何其他殖民地。
    4. 使用相同的注射器,从板的表面提取液体。
    5. 后攻出注射器内的气泡,液体注入血清瓶,并将放置摇床内设置 150 rpm,24 h.30 ° C
      注: 攻丝泡出注射器是重要的为了避免引入更多的氧气,对血清瓶,瓶中引入更多的氧气能够改变实验条件,减少细菌的生长时间之间的一致性。
  3. 一天两个: 灭菌的萨尔维微通道
    注: 促进不育的油管系统,需要分离用新注射器从油管和更换注射器的步骤,应该做在平衡计分卡内。做到这一点,只需拧开金属注射器的持有人,分离从注射器泵注射器和注射器带附加到不育的平衡计分卡的油管。当油管系统提到在过程中,这是指含储液器,附聚醚醚酮 (PEEK) 喷油器到聚四氟乙烯管,附加到滴灌会议厅,具有拟合的聚醚醚酮注射器注射器连接到萨尔维进油管,以及萨尔维出口油管密封到出口集装箱。
    1. 使用一种新的萨尔装置和附加聚醚醚酮拟合和喷油器的聚四氟乙烯管一端。
      注: 萨尔维设备准备新鲜器件制造中前人研究成果和专利详细说明每个实验以下。 5 6 8 15
    2. 进注射器取 2 毫升的 70%乙醇和连接到聚醚醚酮拟合对萨尔维。后连接注射器注射器泵和附着一废瓶在萨尔的出路,使乙醇 DI 水解决方案通过在 20 µ L/分钟 1.5 h.萨尔运行
    3. 带 4 毫升的消毒 DI 水进一个注射器和连接到同一萨尔的入口。连接到注射泵的注射器之后, 允许水通过在 20 μ L/min 的至少 3 h.萨尔运行
    4. 内平衡计分卡,打开铝箔包步骤 1.2.5 中编写并连接拟合到年底 5 毫升注射器和不育聚醚醚酮配件 TFE 油管到无菌的聚醚醚酮注射。采取 ~ 3 毫升的注射器无菌培养基和重视 TFE 管。反转 5 毫升滴室和使用无菌注射器,注入生长介质滴灌室直到它达到总量为 1 毫升。
    5. 将 5 毫升注射器滴室的一端连接到入口的萨尔。
    6. 成一个消毒的注射器取 10 毫升生长的培养基和连接到的滴灌管入口处。连接到注射泵的注射器之后, 允许介质通过萨尔在 20 µ L/min 12 小时运行 (或在一夜之间)。使用胶带确保这些零件。包括出口瓶子,用铝箔或塑料石蜡膜,以尽量减少尘埃粒子和微生物载来污染介质的概率。此安装程序应该如何详细的描写可以发现在 图 1 A
      1. 允许滴灌管要垂直,意思,注射器泵应放在高架的表面滴注油管担保与磁带,和担保在平坦的表面下面的萨尔。
      2. 运行介质通过萨尔维 12 小时,以确保所有的乙醇痕迹已被删除从微通道和萨尔维前接种细菌油管。
      3. 额外的保护,在一个无菌培养皿内的萨尔维微室跟双方镜头切换到适合的入口和出口油管。此外,保持窗口保护罪膜和影像学分析渠道上总是磁带。
  4. 第三天: 萨尔维微通道接种
    1. 从注射器泵中删除整个油管系统 (注射器连接滴室连接到萨尔连接到废瓶),把它的消毒的平衡计分卡。此外,从步 2.2.5 从孵化器中移除血清瓶,把它的平衡计分卡。
    2. 血清瓶塞用 70%乙醇,以防止任何污染的表面清洗,然后使用无菌注射器附加的不育 22 G 针从瓶中提取的细菌 4 毫升。
    3. 分离从 5 毫升室滴注油管,萨尔和连接注射器接种中直接向萨尔的入口。离开滴灌管内无菌铝铝箔包或在平衡计分卡。
    4. 将注射器与萨尔和插座瓶附加到注射器泵在 20 µ L/min 为 3 h,以允许多个卷更改包含在萨尔维内的液体接种的萨尔,通道运行。
    5. 接种后,断开与萨尔维注射器注射器泵,使平衡计分卡。后从步骤 2.4.3 回 5 毫升滴室附加的萨尔入口,进一个消毒的注射器取 20 毫升生长的培养基和附着的滴灌管入口。
    6. 带附加到萨尔维从平衡计分卡与注射器泵油管和允许介质通过油管 2 µ L/分钟的速度为六至十天,或直到荧光成像技术 (在步骤 3 中讨论) 显示为有利的可见生物膜的生长TOF-SIMS 分析。补充新鲜的培养基中,因为它跑在平衡计分卡内用 10 毫升的生长介质填充一个新的无菌注射器并将连接到萨尔维后以前的生长介质已经耗尽。
      注: 后开始接种 2 µ L/分钟,流量应永远不会增加或减少,作为变化的流量会创建在海峡内剪应力和分离生物膜。至关重要的是,这种流量应该永远不会改变;为了准备前西姆斯这,~ 24 h,观察油管密切合作以确保有无气泡,这样就不需要推动更多的介质更快的速度在整个油管。
      1. 避免气泡在微通道,作为他们可以推通道生物膜。它是重要的是要格外小心的底部在哪里它连接到萨尔维油管 5 毫升滴注油管内的气泡。新鲜的培养基中可以注入聚醚醚酮喷油器,确保没有空气将被迫萨尔年底。

3。光学成像在萨尔维微通道内生物膜的

    荧光显微镜成像

  1. 注: 希瓦氏菌 作为一种模式生物在此协议中突变表达绿色荧光蛋白; 因此,它不需要染色。如果细菌需要染色,这应该总是放在相同的流量 (例如,2 µ L/min) 以避免脱膜。此外,当细胞没有养分,他们将会分离。因此,如果任何额外的染色是必需的污渍应该注入到生长介质,而不是水供应,细胞染色前。
    1. 分离从滴灌管内平衡计分卡萨尔和附近萨尔拧聚醚醚酮配件手指收紧,聚醚醚酮联盟。
    2. 磁带的油管中安全地到玻璃幻灯片,萨尔维微室这样的窗口是完全平整,面临向上。从窗口中删除保护胶带。通过放置玻片之间在平台上舞台夹钳阶段的显微镜幻灯片。
    3. 低显微镜的阶段这样的萨尔顶部位于足够接近 10 X 目标,在那里调整焦点不会造成镜头触摸窗口末尾。
    4. 开关背光和查找使用 x 显微物镜 10 通过调整焦点的通道。在这个时候,请确保细菌吸附到罪窗口的萨尔维存在明显比没有接种细菌控制通道的窗口。近成像的细胞,切换到 20 x 目的。当与一个空的萨尔维渠道相比,附加到窗口的细菌的存在应该有强烈的绿色荧光。
    5. 关闭背光和开启显微镜汞源。等待 2-3 分钟,并切换到 FITC 筛选器设置在显微镜上为视图和捕获图像附加到窗口形成的生物膜。例如,准备就绪后,请参阅 图 1 C,成熟生物膜的外观。
    6. 轮关闭汞源和分离从幻灯片萨尔。如果需要将附加到 2 µ L/min 介质流量再次允许更多增长,再次,影像检查之前或将萨尔转移到 TOF-SIMS 分析的二次容器使用。如果生物膜厚度的结论不是是够厚的及 TOF-SIMS 分析前需要更多的时间增长,这就需要。要将附加到介质流量再一次,请参阅步骤 2.3.6。
      注意: 如果放回介质流量下,荧光成像应该做再 TOF-SIMS 分析。
      1. 给生物膜生长介质来喂它,直到可以进行 TOF-SIMS 分析。虽然不建议,如果需要封闭萨尔维可以一夜之间,存储在 4 ° C,但应允许在插入到 TOF-SIMS 真空室前加热到室温。然而,分析生物膜分离介质的流量,以减少脱膜后立即。

4。TOF-SIMS 数据采集

注: 本节作为概述,并描述吸附的蛋白质分子液体 SIMS 分析我们早些时候议定书范围内更详细地讨论了。 12

  1. 进入 TOF-SIMS Loadlock 室安装 SALVI
    注: 在所有时代当处理萨尔维设备并将其安装至 TOF-SIMS 都阶段以避免潜在的污染物在表面时应戴手套分析。
    1. 装载萨尔登上舞台,用几个螺丝固定。请确保罪窗口平通过调整螺杆密和插入硅片是件底部的 PDMS 微通道分庭。删除保护胶带从窗口中,然后装入 TOF-SIMS loadlock 分庭阶段。
    2. 打开 TOF-SIMS loadlock 举行,同时设置舞台水平上装卸平台,和 loadlock 把门关上。启动真空泵等以确保达到那合适的真空。
    3. 萨尔维进入主燃烧室,一旦真空稳定到 1 × 10 -7 毫巴。
  2. 深度分析和收集数据点
    1. 找到使用装备 TOF-SIMS 在光学显微镜下的微流控通道。
    2. 选择正面或负面模式之前数据采集。使用 25 keV Bi 3 + 梁作为所有测量中主要离子束和使用电子枪洪水来消除表面充电期间所有测量。
    3. 扫描双 3 + 梁 150 ns 脉冲宽度对圆面积直径 ~ 2 µ m 和 64 像素由 64 个像素的分辨率。冲 100 毫微米罪窗外之后, 继续扫描另一个 150 s 高强度为收集数据成像。冲床通过后计数会显著增加的深度剖析区域内。后稳定下来,这可以被称为高强度区域。
    4. 要获得更好的质量分辨率光谱的数据集合的
    5. 减少到 50 的脉冲宽度 ns。继续这次收购为另一个 200 左右 s.
    6. 用于收集至少三个积极和消极的数据点 3 个重复这些步骤。
      注意: 一定要这样罪窗口不会打破,进入从真空室泄漏损害窗口完整空间冲床通过地区。

5。TOF-SIMS 数据分析

  1. 大众校准使用 IonToF 软件
    1. 打开 TOF-SIMS (测量资源管理器) 的分析软件,然后单击 " 配置文件 "," 谱 " 和 " 图像 " 按钮,分别对过程深度剖面,m/z 频谱和图像数据。
    2. 打开数据文件获得了全国 TOF-SIMS 数据采集各地。
    3. 选择分析感兴趣的数据的深度和重建根据深度剖面的时间序列谱。
    4. 新闻 " F3 " 打开 " 大规模校准 " 窗口。选择基于预计存在特定样品中的化合物的标定峰。
  2. 兴趣选择峰
    1. 为峰值选择作样品分析所需,确定的文学或其他先前的调查结果,根据样本的特征峰,如果有的话。比较的兴趣 m/z 谱峰的强度。如有必要,添加新的峰或删除干扰峰峰值列表中的。
    2. 点击上高峰,发现在左下的角窗口的红线。移动的红线包围了整座山峰。
    3. 选择峰值匹配的化学分子式主要谱在窗口中,然后再单击 " 添加峰 " 窗口上方的按钮。 < /李 >
  3. 校准数据导出大众
    1. 导出峰值列表,在 " 峰值列表 " 菜单上,选择 " 保存 … " 的峰值列表中 " itmil " 格式。
    2. 导出深度的配置文件,在 " 配置文件 " 窗口中,单击 " 文件 " 菜单,然后选择 " 出口 ",然后选择 " 另存为 " ".txt " 文件。
    3. M/z 频谱文件,导出在 " 谱 " 窗口中,单击 " 文件 " 菜单,然后选择 " 出口 ",然后选择 " 另存为 " ".txt " 文件。
    4. 要导出的图像文件,在 " 图像 " 窗口,打印屏幕并保存为图像文件。

6。TOF-SIMS 数据绘图和演示文稿

  1. 使用一种图形工具来导入数据。
  2. 使使用 m/z 作为 x 轴和峰值强度作为 y 轴显示重建的谱的情节。在 图 2 中给出了实例。
  3. 联合收割机重建二维 (2D) 图像的不同的 m/z 和窗体要显示或积极或消极的离子映射矩阵。 图 2 B 中给出了实例。

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Representative Results

这些代表性的结果,足以说明如何可以识别和解释,附生物膜的化学特征,如通过 TOF-SIMS 获得。后密谋从 TOF-SIMS 数据采集,在程序部分,简要地强调质谱峰值识别应进行将标识分配给每个各自的 m/z 值。这可以通过广泛的文献回顾对质谱在细菌和预计中研究了等各种水团簇、 脂肪酸和蛋白质片段的细菌可能存在的特定化学片段。16,17,18,19,20这些代表性的结果只显示消极的质谱图,采用美国 oneidensis先生-1 生物膜和 DI 水样品得到的计算。要按照积极谱解释类似的程序。

图 1A显示示意图设置根据本议定书时培养生物膜在萨尔维微通道。在左上角,注射器相连一注射器泵,保持在一个恒定的速率,在整个 PFTE 油管系统和微通道内介质流动。注射器泵放置上面滴会议厅,防止倒退到介质储层以防止游动的生物体从游泳上游的污染。介质从流入滴灌室储层直接萨尔维,将通过微通道和出口油管传递给密封的插座瓶 PFTE 油管。虚线从罪窗口指向图像成熟S.oneidensis先生 1 GFP 细胞荧光显微镜,详细步骤 3.1 中被捕获。图 1B显示示例建立此协议,美国 oneidensis先生-1 使用的模式生物的生长曲线。从这个图中的生长阶段,可以结束日志阶段的增长发生在这些特定的栽培条件下 15 32 h 之间。从这个图形的其他信息表明,0-15 h 是滞后期的增长,33-105 h 表示增长的固定阶段。图 1C是获取与显示示例的成熟生物膜的荧光显微镜图像。

图 2A显示负质谱的水合S.oneidensis先生 1 生物膜内的微流控通道,采用原位液体 TOF-SIMS 得到的计算。此图显示了示例选定质量范围 (m/z 100-350) 之间的比较生物被膜的S.oneidensis先生-1 和 DI 水,后者被获得作为系统控制。图 2B显示的二维图像的峰先生 1 生物膜和离子水所得 TOF-SIMS 兴趣的比较。一旦有趣的 m/z 值可以从学习质谱确定,潜在峰值识别的 m/z 值是正确归因于化学的片段,因为支持由 IonToF SIMS 软件图书馆和文献调查。图 2A感兴趣的山峰包括水分子簇 (即,m/z 107 (H2O)5-,125 (H2O)6-,143 (H2O)7-,161 (H2O)8-,179 (H2O)9-,197 (H2O)10-,215 (H2O)11--,233 (H2O)12哦 251(H2O)13-,269 (H2O)14-,287 (H2O)15-,323 (H2O)17-,341 (H2O)19-))9,作为由以上各峰的红线表示,感应相关化合物的生物标记物 (即,m/z 175 C10H9没有2-),EPS 副产品 (m/z 123 C2H44-,159 P2O8H-,216 个 Cr2O7-,285 octadecanoethiols、 325 极性化合物,C12极性化合物)151618和脂肪酸链片段 (即 m/z 127 [C2H3(CH2)3首席运营官]-,255 C16:0 脂肪酸,279 亚油酸,C18H31O2-,325 C21H40O2-,341 表面脂质,18 MEA 硫酯联动、 硬脂酸 C18H35O2-、 monoacylglyceryls 的棕榈酸 C19H17O6离子通过绑定-).16,19

由于生物膜水合,没什么值得惊讶看到生物膜样品中有些山峰是类似于那些在纯水中找到。这些水群集峰均标有红线上面图 2A,包括 m/z 中每个峰值,107、 125、 143、 161、 179、 197、 215、 233、 251、 269、 287,323,341 和相应 (H2O)5-(H2O)6- (H2O)7- (H2O)8- (H2O)9- (H2O)10- (H2O)11- (H2O)12- (H2O)13- (H2O)14- (H2O)15-哦(H2O)17- (H2O)19-,分别。9正流行这个大规模的光谱中的很多特征水分子簇,此结果提供化学水群集环境中水化膜存在的有力的证据。此外,非水分子簇相关峰观察在这两个谱可以通常归因作为干扰峰,通常从 PDMS 微流控通道的一个组成部分。例如,一个常见已知的干扰峰从聚二甲基硅氧烷是 m/z 137 中负离子模式。

当比较生物膜 SIMS 质谱的离子水,如图 2所示时,在 DI 水中,不存在有些山峰,可是它们在生物膜中出现。例如,在 m/z 255 峰值 ([CH3(CH2)14COO]-,棕榈酸) 是目前在高强度在生物膜样品,但根本不 DI 水样品中。这表明信号 come 从生物膜,最有可能的生物膜和/或其自我生成的 EPS。图 2A中确定了许多有趣的山峰。例如,EPS 相关的山峰包括 m/z 123-,发现是 C2H44-,159 (P2O8H-),216 (Cr2O7-),285 (octadecanoethiols) 和 325 (极性化合物,C12极性化合物)。17,18,20峰与脂肪酸被发现 127 ([C2H3(CH2)3首席运营官]-)、 255 ([CH3(CH2)14COO]-,棕榈酸),279 ([CH3(CH2)15首席运营官]-,亚油酸),317 (C21H33O2-)、 325 (C21H40O2-) 和 341 (表面脂质、 18 MEA 通过绑定硫酯联动,硬脂酸 C18H35O2-,离子的棕榈酸 C19H17O6-monoacylglyceryls)。16,19最后,喹诺酮类仲裁遥感信号相关峰值的 C10H9m/z 175 观察到没有2-

图 2B显示二维图像的离子分布的四个不同有趣S.oneidensis先生-1 生物膜 (首行) 与 DI 水 (下面一行) 之间。M/z 值 107 ((H2O)5-) 显示显著的强度内的样本中,m/z 值 175 水群集 (C10H9没有2-) 描绘了法定人数感应相关的信号,m/z 255是一种脂肪酸 ([CH3(CH2)14COO]-,棕榈酸),和 m/z 341 (C21H41O2-) 可能代表这两种脂质碎片和水簇 1 阿拉伯马格里布联盟大规模精度。9比较明亮区域的 2D 图片表明目前在图像中的分子离子较高的计数。不出所料,QS 信号复合,,脂类物质在内部的生物膜样品的数量大得多。虽然水分子簇 (m/z 107) 信号较强整个生物膜样品,它也是个在 DI 水样本中,目前的问题,按预期。最后,在 m/z 341 信号被发现要均匀内生物膜样品,但内部的 DI 水样品很弱。M/z 341 虽然水群集峰值,它也是代表的几个不同的脂肪酸和表面脂质。16内生物膜样品后数据归一化建议的脂质碎片存在远远大于水分子簇的存在其更强的存在。

Figure 1
图 1: 实验示意图。(A) 显示生物膜安装作为它的实验示意图出现在实验室内。开始在左上角,从注射器 (1) 介质流,这被附加到注射器泵 (2) 控制通过哪些液体移动的速率。箭头表示流向整个系统。通过拟合 TFE 油管 (4) (3) 聚醚醚酮喷油器连接注射器 (1)。介质流经滴灌室 (5) 为了避免污染,并最终通过萨尔 (6) 移动到密封的插座容器 (7)。注射器泵位于高架的表面 (9) 这样滴室 (5) 可以是垂直于平面 (8),强加给萨尔 (6)。(B) 生长曲线希瓦氏菌 oneidensis 先生 1"纳米"介质中。时间 0-15 h 代表滞后期,时间 15-33 h 表示日志阶段,时间 33 105 h 表示固定相和时间 105 h,或者再表示死亡阶段。误差线代表标准偏差。(C) 与荧光显微镜获得成熟生物膜的图片。请点击这里查看此图的大版本。

Figure 2
图 2: TOF-SIMS 比较负面的水合谱希瓦氏菌 oneidensis生物膜和萨尔维微通道中的先生 1 培养基。(A) m/z SIMS 质谱图希瓦氏菌 oneidensis生物膜对先生 1 培养基和去离子水。后者被用作控制。红线指示特征水群集峰的位置。(B) 2D 图像比较的生物膜和离子水之间利益的山峰。从左到右,图像显示水分子簇 (m/z 107 (H2O)5-),仲裁传感/激素信号 (m/z 175、 C10H9没有2-),一种脂肪酸 (m/z 255,[CH3(CH2)14COO]-,棕榈酸),和表面脂质或 EPS 片段 (m/z 341,18-MEA,C21H41O2-)。请点击这里查看此图的大版本。

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Discussion

后接种日志阶段,它是重要测试数天和在其中生物膜应成长之前它是健康和成像,够厚在第 3.1 步中所述的温度。此过程具体包括培养 S.oneidensis MR1 生物膜在室温;然而不同的室内温度可以影响率的增长。因此,使用光学成像来了解生物膜是否已准备好之前 TOF-SIMS 分析至关重要。同样,不同株细菌需要不同生长条件和长度来实现理想的厚度进行分析。图 1b 中的生长曲线描绘了这种细菌要 12-32 h 第 200 期日志,这用在整个程序中 24 h,很重要的地注意到,这次不能用作日志阶段为其它的细菌菌株没有建立生长曲线 独立。虽然日志阶段之间的增长为美国 oneidensis 12 和 33 h,24 h 被选,正是在那里氧气被开始限制的有机体,日志阶段年底的增长速率增长的部分。实验表明,这是时间细胞开始生产纳米线,从而引向窗体成功的生物膜,可以在低氧环境中生存。3,13因此,时间选择在日志阶段使用细菌应受研究的经验和知识获得从文学上的细菌正在研究的实验研究。此外,必须设立单独生长曲线了解日志相为所有不同株将用于使用这种方法的生物膜生长的细菌。2 µ L/min 的成长率计算,所以不能超过最大增长率 S.oneidensis 先生-1 和总时间被选中去成熟的生物膜,不杂草丛生,易于分离。这些费率可以作相应的调整对知识的不同的细菌,用此安装程序。

萨尔维用生物膜的生长具有一些限制条件包括生物粘泥内通道以及细菌附着在通道平整壁的概率。尽管增长以恒定速率,建议要在这份协议,2 µ L/min 污损生物仍会发生如果生物膜允许将增长太久。在这种情况下警告,生物膜可以分离窗口并没有退出萨尔维到插座遏制。污损生物也可以简单地通过添加机械力 (移动) 萨尔,无法避免。然而,这可以保持在检查通过查看生物膜附件罪前 TOF-SIMS 分析光镜下显示窗口。一个其他限制包括平整度的 PDMS 微这可以使它难要附加一些细菌。然而,这可以在萨尔的设计,以适应通过创建带肋的边缘到通道,如果细菌的附件问题中更改。最后,细胞计数可以代替生长曲线测定的 OD600读数。例如,研究表明直接和一致相关的细胞数 OD600读数。21所以,OD600被认为足以在评价生物膜的生长。

这种技术的局限性是几,作为萨尔维本质上有很多具有多功能性,在许多应用中,使用如厌氧内手套箱,或在任何温度控制的环境室的培养皿。一些轻微的限制包括无法控制的房间条件相对湿度、 温度、 阳光,附近安置等仍有可能容纳,为每个特定的细菌最佳生长条件。此外,这些技术的挑战与孵化器温度或 RH 调解功能在生物膜安装可以克服。

萨尔维是一个真空兼容微流控接口。在这项工作,200 × 300 微升微流控通道用于文化跟成像的光学和液体 SIMS 的生物膜。液体技术挑战研究采用真空的基础的技术,因为他们是动荡和困难,在真空中在液相中保留。因此 TOF-SIMS 真空技术仅限于传统上只干燥和低温样品。22此外,萨尔可用于不同的成像和光谱使用各种各样的显微镜和光谱技术。4,9我们集团一直致力于不断扩大各种萨尔维应用原位分析中的液体和液固界面。15,23,24我们最近努力有效地表明细菌罪膜的附件。9后初始附件,源源不绝地随着时间的推移介质表明成功培养生物膜直接的萨尔罪窗口。在 TOF-SIMS,初级离子束用于轰炸孔直径 2 微米。此维度是类似于附加到罪窗口,从而提供其自然水合的微环境中生物膜化学调剖的生物膜细胞的长度。当比较其水化状态与干样品中的生物膜,这是非常重要的生物膜化学身份差异、 EPS、 和群集环境中水的存在。9不用萨尔,TOF-SIMS 可能才会进行干燥和低温样品,提供化学映射所无法捕捉的化学的配置文件中其天然的水合状态的一个示例。

图 1所示,它是重要的是保持注射器泵以上滴灌管滴灌管要垂直于萨尔维微通道以便。此外,泡沫将不太可能成为被困在油管中的设备,如果插座 PFTE 油管 (内口瓶) 低于进口油管 (附着在滴灌室)。萨尔维生长的细菌培养的另一个关键步骤是首先获得将使用,特别是细菌菌株生长曲线在步骤 1.3 中所述。这可以通过获得与光密度测量的增长曲线。生长曲线,如图所示,在图 1B,是增长的重要的理解的细菌将内日志阶段,当可以假定这种细菌是增长的最健康的时间。在这一阶段的增长内利用细菌有利于创造一个健康的生物膜微环境,并确保生物膜将按预期的速度增长。萨尔维微通道是在室温下与 70%乙醇和去离子水,消毒,不能作蒸压消毒事先用 TOF-SIMS。这是,压力蒸汽灭菌可以既损害的萨尔维窗口又介绍水汽通道。经过几天的增长,微通道应检查用荧光显微镜来验证细菌附着。一个例子可以发现在图 1C,这张照片是要表明一个成熟的生物膜。由于介质的流动路径,这种细菌更有利地重视和沿边缘的微通道,随着此位置是流和剪力在哪里洛斯t。

总之,萨尔维是优秀的方法,为其对文化和研究生物膜使用原位化学的映射,因为它允许提供生活生物膜对其天然的水合状态到基于真空成像质谱仪。这种独特的方法可以对生物膜水群集的微环境,以及获得更深入地了解其 EPS 副产品提供更多信息。此信息可以用于了解生物膜的生物活性,并可用于各种应用,如在生物医学、 生物医学工程、 农业和工业研究和发展。

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Disclosures

作者没有透露。

Acknowledgments

我们非常感谢太平洋西北国家实验室 (单比) 地球和生物科学 (EBD) 特派团种子实验室指导研究与发展 (LDRD) 基金的支持。通过 W.R.威利环境分子科学实验室 (其) 一般用户建议提供了工具的访问。其是由办公室生物和环境研究 (BER) 在太平洋西北国家实验室主办全国科学用户设施。作者感谢丁博士曌校对手稿和提供有用的反馈。太平洋西北国家实验室是美国能源部下合同 DE-AC05-76RL01830 由巴特尔推行。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ToF-SIMS IONTOF TOF.SIMS 5 Resolution:>10,000 m/Δm for mass resolution;>4,000 m/Δm for high spatial resolution
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) Pacific Northwest National Laboratory N/A SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level.
-80°C Freezer New Brunswick Scientific N/A U410 Premium Energy Efficient Ultra-Low Temperature Freezer
4°C Refrigerator BioCold Scientific N/A COLDBOX1
Orbital Shaker New Brunswick Scientific N/A Innova 4900 Multi-Tier Environmental Shaker, set at 30 degrees Celsius for serum bottle and flask culturing, set at 150rpm.
Syringe Pump Cole-Parmer EW-74905-02 Cole-Parmer Syringe Pump, Infusion Only, Touchscreen Control 74905-02, used for injecting liquid into the tubing system and SALVI at a constant flowrate.
Incubator Barnstead International LT1465X3 Lab-Line incubator, set at 30 degrees Celsius for plate culturing.
Autoclave Getinge 533LS Used to sterilize PEEK fittings, tubing systems, serum vials, and medium. Model 533LS Vacuum Steam Sterilizer
Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific 4001-000 GENESYS 20 spectrophotometer for OD600 readings of cuvettes for growth curves.
Biological Safety Cabinet Thermo Fisher Scientific 1385 1300 Series AZ Biological Safety Cabinet
Fluorescence Microscope Nikon N/A Nikon OPTIPHOT-2 fluorescence microscope with camera and super high pressure mercury lamp power supply.
pH Meter Mettler Toledo 51302803 Used to test the pH of the “nanowires” medium after finished and before autoclaving.
PEEK Union Valco ZU1TPK For connecting the inlet and outlet of SALVI, the syringe to the tubing system, and the inlet of the SALVI to the drip chamber of the tubing system.
5 Axes Sample Stage IONTOF N/A Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS.
Barnstead Nanopure Water Purification System Thermo Fisher Scientific D11921 ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716)
Pipette Thermo Fisher Scientific 21-377-821 Range: 100 to 1,000 µL.
Pipette Tip Neptune 2112.96.BS 1,000 µL pipette tips
Razor Blade Handle Stanley N/A Stanley Bostitch Razor Blade Scraper with 5 Single-Edge Blades, used for cutting PTFE tubing
Syringe BD 309659 1 mL
Syringe BD 309657 3 mL
Syringe BD 309646 5 mL; Used for making the drip chamber
Syringe BD 309604 10 mL
Syringe BD 302830 20 mL
Disposable Pipette Thermo Fisher Scientific 13-678-11 25 mL Fisherbrand™ Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe, for filling serum bottles.
Electric Pipette Filler Pipet-aid P-57260 Vacuum pressure electric serological pipette filler
Serum Bottle Sigma 33109-U Holds approximately 69 mL of liquid for culture growth, optimum for use of 20mL culture per bottle.
Anaerobic Culture Tube VWR 89167-178 Anaerobic Tubes, 18 x 150 mm, Supplied with 20 mm Blue Butyl Rubber Stopper and Aluminum Seal.
Rubber Stopper Sigma 27235-U Silicone stopper, used for sealing serum bottles and for creating the tubing system/drip chamber.
Aluminum Crimp Seal (without septum) Sigma 27227-U Aluminum seal for top of serum bottle for use with serum bottle crimper.
Serum Bottle Aluminum Seal Crimper Wheaton 224307 30 mm crimper with standard seal.
PTFE Tubing Supelco 58697-U 1.58 mm OD x 0.5 mm ID 50 ft. PTFE Teflon tubing, used for creating the tubing system.
Disposable Cuvettes GMBH 759085D 1.5 Ml for use with spectrophotometer.
Needle BD 303015 22G; used for serum bottle injection.
Needle BD 305120 23G; used for punching-through rubber stopper to create drip tubing system.
Shewanella oneidensis MR-1 with GFP N/A N/A Matthysse AG, Stretton S, Dandie C, McClure NC, & Goodman AE (1996) Construction of GFP vectors for use in Gram-negative bacteria other than Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 145(1):87-94. 
Ethanol Thermo Fisher Scientific  S25310A 95% Denatured
TSA BD 212305 Tryptic soy agar for culturing the model organism (S. oneidensis) used in this protocol
PIPES Buffer Sigma P-1851 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Hydroxide Sigma S-5881 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Ammonium Chloride Sigma A-5666 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Potassium Chloride Sigma P-4504 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Phosphate Monobasic Sigma S-9638 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Chloride Thermo Fisher Scientific S271-3 Used for “nanowires” medium, and used to make mineral solution used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium lactate Sigma L-1375 60%(w/w) syrup @ 98% pure, d=1.3 g/mL, 7M, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Bicarbonate Sigma S-5761 Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nitrilotriacetic Acid Trisodium Salt Sigma N-0253 Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron (III) Chloride Sigma 451649 Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Magnesium Sulfate Sigma 208094 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Manganese (II) Sulfate Monohydrate Sigma M-7634 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron(II) Sulfate Heptahydrate Sigma 215422 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Calcium Chloride Dihydrate Sigma 223506 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Cobalt(II) Chloride Sigma 60818 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Zinc Chloride Sigma 229997 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Copper(II) Sulfate Pentahydrate Sigma C-8027 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Aluminum Potassium Sulfate Dodecahydrate Sigma 237086 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Boric Acid Sigma B-6768 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Molybdate Dihydrate Sigma 331058 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nickel(II) Chloride Sigma 339350 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Tungstate Dihydrate Sigma 14304 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Biotin Sigma 47868 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Folic Acid Sigma F-7876 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Pyridoxine Hydrochloride Sigma P-9755 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Riboflavin (B2) Sigma 47861 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thiamine Hydrochloride Sigma T-4625 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nicotinic Acid Sigma N4126 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Pantothenic Acid Hemicalcium Salt Sigma 21210 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Vitamin B12 Sigma V-2876 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
4-Aminobenzoic Acid Sigma A-9878 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thioctic Acid Sigma T-1395 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}

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References

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